楊樹抗菌化合物的制備及作為殺菌劑的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：：楊樹抗菌化合物的制備及作為殺菌劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及楊樹具抗菌活性化合物的制備、化合物的結(jié)構(gòu)鑒定及其抗菌活性，屬于農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：楊樹(戶opu/usspp.)是楊柳科(Salicaceae)楊屬植物的統(tǒng)稱。中國有楊樹60余種，此外還有很多變種和引種的品種，主要分布在北方和西南地區(qū)，遍及全國，資源豐富，是中國綠化、造林的主要樹種。楊樹具有抗旱、耐寒、生長快、輪伐期短、纖維品質(zhì)髙等特點，在防風(fēng)固沙、環(huán)境保護、水土保持、農(nóng)田改良等方面起著十分重要的作用，在工業(yè)和生活上具有多種用途。同時，楊樹還具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用。在民間，楊樹可用來治療風(fēng)濕、高血壓等疾病。迄今為止，已從楊樹植物中分離到黃酮、有機酸、三萜等多種化學(xué)成分，植物抗菌化合物(plantantimicrobialcompounds)是一類由植物產(chǎn)生的具抗菌活性的化合物，包括組成性抗菌化合物和誘導(dǎo)性抗菌化合物。迄今，尚未見從楊樹中追蹤分離抗菌化合物的報道。本發(fā)明著重于歐美107楊樹枝條抗菌化合物的制備。歐美107楊為意大利楊樹栽培研究所Sekawin博士于1973年春人工控制雜交選育的歐美楊品種，系歐洲黑楊(Popu/usn,^raLinn.)和美洲黑楊(戶o/w/wrfe/toWesMarsh.)的雜交種，1984年引入到中國，編號為84-1-74,在國際楊樹委員會登錄注冊品種種加詞為Neva,命名為戶i^M/usxcawodbw紐Moench"Neva'。本發(fā)明同時測定了歐美107楊樹化合物對植物病原細菌和病原真菌的抑制活性，為新型植物源殺菌劑的研究與開發(fā)，楊樹資源的有效利用提供依據(jù)。為了保護環(huán)境，保護人類及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，急需進行高效、低毒、低殘留的環(huán)境相容型農(nóng)藥的研制。本發(fā)明的目的之一是提供楊樹抗菌化合物的制備方法；另一個目的是提供楊樹抗菌化合物作為高效抗菌劑的例子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及用于抑制植物病原菌的楊樹抗菌化合物及其制備方法，提供如下的技術(shù)方法。1、楊樹乙酵粗提物以及不同極性提取物的制備取歐美107楊樹枝條，室內(nèi)晾干，粉碎，用95%乙醇提取，減壓濃縮得乙醇粗提物(得率為6.76%)。將乙醇粗提物用蒸餾水加熱溶解制成混懸液，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，將乙酸乙酯層、正丁醇層，以及剩余的水層減壓濃縮，分別得乙酸乙酯部分(得率為4.21%)、正丁醇部分(得率為1.34%)和水部分(得率為1.05°/。)。2、楊樹抗菌化合物的追蹤分離特征取歐美107楊樹枝條，室內(nèi)晾干，粉碎，經(jīng)95%乙醇提取，乙醇粗提物用水混懸，然后用乙酸乙酯和正丁醇萃取，獲得具有較好抗菌活性的乙酸乙酯萃取部分，反復(fù)進行常壓正相硅膠柱層析、常壓反相硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析、中壓正相或反相硅膠柱層析，得4個抗菌化合物。3、楊樹抗菌化合物的結(jié)構(gòu)特征追蹤分離得到的4個抗菌化合物，經(jīng)結(jié)構(gòu)解析，分別為對羥基肉桂酸脂肪烷酵酷(1〉、5茶基-7-甲氧基黃酮(2)、5,7-二羥基黃酮(3)、5,7-二羥基黃酮醇(4)。4、楊樹粗提物以及不同極性提取物的抗苗活性特征采用帶毒平板菌絲生長擴展法測定，歐美107楊樹枝條乙酵粗提物及不同極性提取物對植物病原真菌和細菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，尤其是對小麥赤霉病菌(/Won'ttmgro^恥an卵)、黃瓜枯萎病菌(尸usoW柳ojg/wrwwf鄰.cuc鵬eriw鵬)、棉花枯萎病菌(Fttsw'鵬oxysporawf鄰vas一c/wn)、番菊早疫病菌"fte/7Kirid>/。/)、番茄枯萎病菌(Fasar/wwcttysponanf.sp./>oo/jersfc/)、小麥紋枯病菌(勸izoc/o"iacereo/紐)等菌絲生長表現(xiàn)出較強的抑制作用。不同極性提取物中，以乙酸乙酯萃取部分的抗菌活性最強。采用薄層層析-生物自顯恭MTT法測定，歐美107楊樹枝條乙醇粗提物和乙酸乙酯萃取部分對番茄疫痂病菌和番茄青枯病菌均表現(xiàn)出一定的抑制活性*5、楊樹抗苗化合物的抗苗,特征從歐美107楊樹枝條中追蹤分離的4個抗菌活性成分對稻瘟菌(Mjgn^wr^c)孢子萌發(fā)、植物病原細菌黃瓜角斑病菌(尸sewcto附ow(3s/acA7jw咖)、番茄青枯病菌(/Jafatom'aso/。加ceanfln)、番茄疫痂病菌Qfawf/KwmwjasvM&atorto)的生長均表現(xiàn)出一定的抑制活性。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明首次明確了歐美107楊樹枝條中具有廣譜的抗植物病原菌活性的成分，其中的黃酮類成分是歐美107楊樹的主要抗菌活性成分。本發(fā)明的目的是利用楊樹資源，以求獲得抗菌活性成分，為植物源農(nóng)藥的研究與開發(fā)，為探討植物抗菌化合物的生理生態(tài)功能提供依據(jù)。為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合本發(fā)明的實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。具體實施例方式實施例1:楊樹不同極性提取物的小規(guī)模制備取歐美107楊樹枝條，在室內(nèi)晾干，粉粹，取900g,用95%乙醇(樣品:乙醇=1:5,g/mL)于80°C下回流提取3次，每次lh,合并3次乙醇提取液，減壓濃縮得乙醇粗提物(60.81g,得率為6.76%)*取乙醇粗提物52.93g，用蒸餾水加熱溶解制成混懸液，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，將乙酸乙酸層、正丁醇層、最后剩余的水層減壓濃縮，分別得乙酸乙酯部分(32.95g，得率為4.21%)、正丁醇部分(10.53g,4得率為1.34°/。)和水部分(8.21g,得率為1.05%)。實施例2:楊樹抗菌化合物的追蹤分離與制備取歐美107楊樹枝條，室內(nèi)晾干，粉碎，取5.79kg,用95%乙醉(樣品:乙醇=1:5,g/mL)于抑"C下回流提取3次，每次1h,合并3次乙酵提取液，減壓濃縮得乙醇粗提物(430.16g)。取乙醇粗提物420.00g,用蒸餾水加熱溶解制成混懸液，依次用乙酸乙酯和正丁酵萃取，將乙酸乙酯層、正丁酵層、最后剰余的水層減壓濃縮，分別得乙酸乙酯部分(236.32g)、正丁醇部分(135.70g)和水部分(46.23g)。對具有較好抗菌活性的乙酸乙酯萃取部分進一步進行活性成分的追蹤分離，反復(fù)進行常壓正相或反相硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析、中壓正相或反相硅膠柱層析，得4個抗菌化合物，得率分別為化合物l為80mg;化合物2為20mg;化合物3為15mg;化合物4為8mg。實施例3:對羥基肉桂酸脂肪嫁酵酯(1〉的結(jié)構(gòu)鑒定按實施例2所述的方法制備到一白色粉末(氣仿)，用石油醚:丙酮(2:1，Wv)系統(tǒng)進行正相硅膠板展開后，在254nm紫外光下可見單一的醣斑(Rf=0.70),硫酸顯色劑顯暗黃色斑點。'HNMR(CDCl3，300MHz)，芳香區(qū)&7.63ppm(lH,<!，■/=15.96Hz)和6.30ppm(1H，4/=15-%Hz)的信號說明分子中存在一個反式雙鍵；&7.43ppm(2H，m)和6.83ppm(2H，m)說明分子中存在一個對位取代的苯環(huán)；在<5:5.22ppm(lHbrs)處的寬單峰說明苯環(huán)中有一個羥基取代，13CNMR(CDC13，75MHz)，&157.5ppm的信號也驗證了苯環(huán)中有一個羥基取代；111^1^!1離場區(qū)的質(zhì)子信號<5:4.19ppm(21^^=6.75Hz)說明分子中存在一個與氧原子和一個亞甲基相連的亞甲基；&1.67ppm(2H，m)、1.25ppm(約52個Hm)和0.88ppm(311^/=6.48Hz)說明分子中存在著長鏈脂肪烷醉.13CNMR數(shù)據(jù)，&16X5ppm說明分子中存在有羧基基團，因此此物質(zhì)可以鑒定為對羥基肉桂酸酯。BCNMR數(shù)據(jù)&144.2ppm和115.8ppm可歸屬為對羥基肉桂酸的反式雙鍵碳信號；&157.5ppm、129.9ppm、127.5ppm、115.9ppm為對位取代的苯環(huán)信號；&64.7ppm為長鏈烷醇與氧相連的碳，&31.9卯m、29.7ppm、28.8ppm、26.0ppm、22.7ppm、14.1ppm可以歸屬為長鏈烷醇的碳信號；從NMR譜圖中長鏈烷烴質(zhì)子信號&1.25ppm出現(xiàn)多重峰，以及'3CNMR譜圖中&29.7ppm的譜線變寬，說明化合物1可能為一系列不同長度的烷基酯混合物。EI陽MS給出了ot/z:472、486、500、528、542、556、570、584等一系列的信號，說明化合物1烷基的長度分別為C22、C23、C24、Cm、C27、C28、C29、C30。將化合物1的波譜數(shù)據(jù)與文獻[(1)李滿飛等。流蘇石斛化學(xué)成分的研究.中草藥，1992，23(5):227-228;(2)裴月湖等。仙鶴草根芽中新異香豆精甙的結(jié)構(gòu)研究.藥學(xué)學(xué)報，19粉，24(11):837-840;(3)FangS-C,efa/..Isoprenylatedflavonolsofformosan5TO咖oweft'apqy"々ra.尸AytocA柳&^7，1995,38(2):535-537。]進行對照，基本一致，所以化合物1被鑒定為長鏈垸基(C22~24,C2fr_M)-對羥基肉桂酸脂肪烷醇酯(Alkyl-p-hydroxy-frfOTs《innamates)?；衔?碳譜和氫譜數(shù)據(jù)見表1'結(jié)構(gòu)式如下、(CH2>iCH389n-20-22;2冬28表1化合物1的'HNMR和BCNMR的化學(xué)位移",ppm)數(shù)據(jù)碳位'HNMR(300MHz)a13CNMR(75MHz)a1-167.526.30(4盧15.96)115.837.63(d^l5鄰)144.24-127.557.43(m)129.966.83(m)115.97-157.586.83(m)"5.997.43(m)129.9104.19(t^.75)64.770H5.25(brs)-l卜20or291.25(s)31.9~22.7■CH314.1a溶劑為CDQ3*實施例4:5^>7-甲氣基黃翻(2)的結(jié)構(gòu)鑒定按實施例2所述的方法制備到一黃色片狀結(jié)晶(氣仿)，mp.161-162*C:用石油醚:丙翻(2:1,v/v)系統(tǒng)進行正相硅膠板展開后，在可見光下可見一黃色斑點(Rf=0.68):EI-MS/m/z:268[M]+,結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，確定其分子式為C16H1204;'HNMR譜(CDC13，300MHz),芳香區(qū)&&38ppm(lH,U=2_25Hz)、6.50ppm(1H,(!,/=2.26Hz),可歸屬為兩個苯環(huán)間位取代的質(zhì)子；&7.89ppm(2H,m)、7.52ppm(3H,m)，可歸屬為單取代苯環(huán)上的5個質(zhì)子；&6.67ppm(lH，s),為黃酮類化合物3位特征性的質(zhì)子信號從芳香區(qū)信號分析可以初步判斷化合物2為一個在A環(huán)上具有間位取代的黃酮類化合物；在最低場&12.71ppm(1H,s)處有一可歸屬為活潑質(zhì)子的氣信號，可以判斷此化合物在5位具有一個與4位羰基相耦合的羥基質(zhì)子在&3.89ppm(3H,s)處給出一個與氧原子相連的甲基信號，說明在7位有一個甲氧基取代。將化合物2的理化數(shù)據(jù)和波譜數(shù)據(jù)與文獻[(1)周立東等。北京蜂膠的黃酮類成分。1999,24(3):162-164;(2)ParkY,"a/..SpectralassignmentsandreferencedatacompleteassignmentsofNMRdataof13hydroxymethoxyflavones.Afagwert'c及ejoiwwicei'"CAem&fty,2007，45(12):1072-1075.]比較，基本一致，確定化合物2為5-羥基-7-甲氧基黃酮(5-Hydroxy-7-methoxy-flavone),又稱為柚木楊素(Tectochrysin)?；衔?碳譜和氨譜數(shù)據(jù)見表2，結(jié)構(gòu)式如下表2化合物2的'HNMR和BCNMR的化學(xué)位移(<5，ppm)數(shù)據(jù)碳位'HNMR(300MHz)a13CNMR(75MHz)a2-164.036.67(s)、105.94-182.5-162.3698.27'165.686.50(492.79-157.810-105.8r-131,42,7.89(m)126.33,7.53(m)129.14,7.53(m)131.25,7.53(m)129.16'7.89(m)126.37"OCH33.89(s)55-85-OH12,71(s)—溶劑為CDC13。實施例S:S,7-二羥基黃醑(3)的制備和結(jié)構(gòu)鑒定按實施例2所述的方法制備到一黃色粉末(丙酮)，mp.270-272°C;用石油醚:丙酮(2:1,Wv)系統(tǒng)進行正相硅膠板展開后，在可見光下可見一黃色斑點(Rf=.63);'HNMR譜(C5D5N,300MHz),芳香區(qū)&6.75ppm(1H，2.1Hz沐6.80ppm(lH，d，J-2.1Hz>，可歸屬為兩個苯環(huán)間位取代的質(zhì)子&7.45ppm(3H，m)和7.92ppm(2H,m)，可歸屬為單取代苯環(huán)上的5個質(zhì)子；&6.97ppm(1H，s),為黃酮類化合物3位特征性的質(zhì)子信號；在低場&13.56ppm(lH，s)處的單一質(zhì)子信號可歸屬為5位羥基質(zhì)子；7位羥基峰消失是由于所用気代試劑中活潑質(zhì)子將其取代所致。將化合物3的理化數(shù)據(jù)和波譜數(shù)據(jù)與文獻[(1)周珊等。山楊的化學(xué)成分研究.2002，14(5):4345;(2)PopovaV,Wa/..Chtysinanditsderivativesinplantsofthegenus&i/te//arto.CAe加/s/iyq/Wirfwra/Co/n/wnd!j，1976,12(6):656-660.1比較，基本一致，確定化合物3為5,7-二輕基黃酮(5，7-Dihydoxyflavone)，又稱為柯因(Chiysin)。化合物3的氧譜數(shù)據(jù)見表3,結(jié)構(gòu)式如下表3化合物3的'HNMR的化學(xué)位移ppm)數(shù)據(jù)碳位^NMR(300MHz)'2-36.97(s)4--66.7瓶片1)7-86.抑(d，月.1)9-10-1，-2,7.92(m)3,7.45(m)4,7.45(m)5，7.45(m)6，7.92(n05力H13.56(s)TOH-溶劑為C5D5N。實施例6:5,7-二羥基黃爾酵(4)的制備和結(jié)構(gòu)鑒定按實施例2所述的方&H!l備到一黃色針狀結(jié)晶(丙酮)，mp.213-215"C:用石油醚:丙翻(2:1,Wv)系統(tǒng)進行正相硅膠板展開后，在可見光下可見一黃色斑點(1"=0.57);"HNMR譜(Acetone^,300MHz),芳香區(qū)&6.29ppm(lH，d^-2.04Hz)和6.56ppm(lH,4J-2.04Hz)可歸屬為兩個苯環(huán)間位取代的質(zhì)子信號；&7.54ppm(3H，m)和8.24ppm(2H，m)可歸屬為單取代苯環(huán)上的5個質(zhì)子信號；在低場&12.09ppm單一質(zhì)子信號歸屬為5位羥基質(zhì)子3位和7位羥基峰消失是由于所用気代試劑中活潑質(zhì)子將其取代所致。將化合物4的理化數(shù)據(jù)和波譜數(shù)據(jù)與文獻[(1)周珊等。山楊的化學(xué)成分研究。2002,14(5):4345;(2)FacundoVAsuk!SMMot^sSM.Constituentsof尸:]pera/^reomwi(Piperaceae).歷0c/1emica/辦W抓a/jcson^￡^0/0化2003，31:111-113.比較，基本一致，確定化合物4為5,7-二羥基黃酮醇(5,7"dihydroxyflavonol),又稱為髙良姜精(Ga，angin)?；衔?氫譜數(shù)據(jù)見表4，結(jié)構(gòu)式如下86.29(4/=2.0)6.56(4^=2.0)04(m)7.54(m)7.54(m)7.54(m)8.24(m)12.09(s)*溶劑為Acekie"<4<實施例7:楊樹粗提物以及不同極性提取物對細菌生長的抑制活性(1)TLC板的制作10cmxl0c加玻璃板，薄層層析硅膠(GF2M):0.3%羧甲基纖維素鈉溶液-1.0:2.5(g/mL)。稱取一定量的薄層層析硅膠(GF254)倒入研缽中，按照比例向研缽中加入定量的羧甲基纖維素鈉溶液，接著按照一定方向(如順時針)研磨至均勻粘稠液。然后用勺子取適量研磨好的硅膠液鋪至玻璃板上，輕輕振動，使其均勻一致，隔夜，待水分揮發(fā)，硅膠與玻璃板結(jié)合.最后將制備好的薄層板置于100-ll(TC烘箱中烘烤活化lh，待自然冷卻后即可。(2)樣品的準(zhǔn)備用分析天平稱取一定量(待檢測提取物)的樣品，轉(zhuǎn)入西林瓶中，向其中加入一定量的有機溶劑(甲醇)，然后用超聲助溶，完全溶解即可。(3)點樣用點樣毛細管(內(nèi)徑0.5mm)吸取一定量的樣品溶液，點在薄層板上，點樣要均勻(少量多次)，每個點的直徑約為5mm為宜，相鄰兩點之間的距離大于或等于lcm(防止擴散干擾)，溶劑用電吹風(fēng)或讓其自然揮干即可。(4)培養(yǎng)基LB瓊脂培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基。LB瓊脂培養(yǎng)基配方如下每升培養(yǎng)基中含氯化鈉5g、蛋白胨10g、酵母浸裔5g、瓊脂15g。LB液體培養(yǎng)基配方除不加瓊脂外，同于LB瓊脂培養(yǎng)基的配方。(5)供試細菌的準(zhǔn)備活性測定的細菌菌株有黃瓜角斑病菌(Aeiftfo附o^/oc/tf>7miM)、番茄青枯病菌(ia/加wto加/awacearuffi)、番笳疫痂病菌(Xaw/Ao/nonasvaw'cator/。)。上述供試細菌長期保存在4"C下。在活性測定前，霜要在LB培養(yǎng)基平板上對供試細菌進行活化培養(yǎng)(28°C，暗)48h，然后挑取單菌落，接種于25mLLB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩搖床中(28°C，150rpm),培養(yǎng)24h,菌的濃度一般應(yīng)為10Scfij/mL,即可用于活性測定。(6)加菌及培養(yǎng)往LB瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂濃度為0.3%)中加入一定量準(zhǔn)備好的菌液(45mLLB+5mL菌液，將其濃度調(diào)至約10gCFU/mL，振蕩、均勻。接著用無菌槍頭吸取該菌液加到TLC板上，輕輕振動，使其均勻一致。待其凝固后，將該板放入培養(yǎng)皿中(四層吸水紙加入適量無菌水，以便保濕培養(yǎng))，轉(zhuǎn)入4。C冰箱中放置2h(有助于化合物的擴散)，然后將其轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱中(28€)培養(yǎng)12-16h即可。(7)MTT顯色取出培養(yǎng)好的TLC板后，向其上面噴入適量的0.5mg/piL的MTT溶液，約10min左右，即可根據(jù)板上顏色和抑菌園的大小來判斷樣品對供試菌抗菌活性能力的大小。(8)結(jié)果觀察發(fā)現(xiàn)歐美107枝條的乙酵提取物及乙酸乙酯萃取部分對三種供試細菌的生長均有一定的抑制活性。實施例8:楊樹粗提物以及不同極性提取物對真菌菌絲生長的抑制活性(1)配制馬鈴墓葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配制1L的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potatodextrose堪ar，PDA)的步驟為將洗凈去皮的馬鈴蕃200g,切成小塊，加去離子水1000mL,煮沸30min,過濾，取濾液，加瓊脂20g和葡萄糖20g，加熱使瓊脂融化后，趁熱用紗布過濾，然后加去離子水定容至1000mL。121T濕熱滅菌20min。(2)供試的植物病原真苗番茄早疫病菌U/termiVi抑/om')、玉米彎孢(Cwrra/flHaAmato)、楊樹潰瘍病菌(丑o/yasp/!aertfl！ato決itfea)、小麥赤霉病菌(FMsar/u/ngra>jean/m)、黃瓜枯萎病菌(尸asan'鵬cc9_porMwf鄰.cuc鵬er/"um)、番燕枯蔞病菌(Fuson'i/moagprjf鄰./^o戸由')、棉花枯萎病菌(Fwsori鵬oxjw/wwmf鄰vosJ^c咖)、小麥紋枯病菌(5tooctoi'acem/&)(>上述病原真菌長期保存在4T石蠟油中，在活性測定前，需要在PDA平板上對供試真菌進行活化培養(yǎng)(28"C,暗)1-2代。(3)帶毒培養(yǎng)基的制備針對不同的病原菌，溶解提取物或萃取部分的有機溶劑不同。針對小麥紋枯病菌、番茄早疫病菌、番茄枯蔞病菌，用丙酮溶解；針對小麥赤霉病菌、玉米彎孢、楊樹潰瘍病菌，用乙醇溶解；針對棉花枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌，用二甲基亞砜溶解。在PDA培養(yǎng)基未凝固前(約50"C)，將供試樣液1mL加入到100mL培養(yǎng)基中，使供試樣品在培養(yǎng)基中的濃度為0.00mg/mL和2.00mg/mL，搖勻后迅速倒入培養(yǎng)皿(O=90mm)中，每皿15mL，放置待其凝固后待用。由于乙醇粗提物對小麥赤霉病菌、黃瓜枯蔞病菌、棉花枯蔞病菌菌絲生長具有較好的抑制作用，故選用上述三種真菌為選供試菌，測定枝條和葉不同極性萃取部分對真菌菌絲生長的抑制作用，選取合適的溶劑溶解樣品，在PDA培養(yǎng)基未凝固前(約50°0,將供試樣液lmL加入到lOOmL培養(yǎng)基中，使供試樣品在培養(yǎng)基中的濃度分別為O.OOmg/mL、0.25mg/mL、1.00mg/mL、2.00mg/mL,搖勻后迅速倒入培養(yǎng)皿(<I>=90mm)中，每皿15mL,放置待其凝固后待用，實驗設(shè)空白對照和陽性對照U0jig/mL多菌靈)，每個處理三個重復(fù)。(4)制備菌餅制備菌餅應(yīng)在無菌條件下進行，用打孔器(<D=5mm)在培養(yǎng)好的菌落外緣切下帶菌培養(yǎng)基柱-菌餅。這種來自菌落外緣的菌餅接在新鮮培養(yǎng)基上的生長速率的差異較小。(5)移植苗餅用接種針或消毒的攝子將菌餅反面(有菌絲的一面向下和培養(yǎng)基貼合)移植到帶毒培養(yǎng)基上，一個培養(yǎng)皿中央接一個菌餅。(6)結(jié)果觀察和數(shù)據(jù)處理待空白對照菌落接近培養(yǎng)皿邊緣時觀察結(jié)果，取出培養(yǎng)皿用卡尺測量菌落直徑，每個菌落釆用十字交叉法測兩次直徑。用下述公式計算抑制率(計算抑制率時用^^0作對照)菌落擴展直徑(mm)=測量菌落的平均擴展直徑(mm)-5(菌餅直徑mm)知甜油翻農(nóng)-對照菌落擴展直徑-處理菌落擴展直徑xl/vw鵬制*--對照,擴展直徑-。試驗結(jié)果采用MicrosoftExcel軟件進行數(shù)據(jù)處理。釆用菌絲生長速率抑制法測定歐美107楊樹枝條乙醇粗提物對番茄早疫病菌、玉米彎孢、楊樹潰瘍病菌、小麥赤霉病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌、小麥紋枯病菌等8種植物病原真菌的抑制作用(結(jié)果見表5),其中對小麥赤霧病菌、黃瓜枯蔞病菌、棉花枯蔞病菌表現(xiàn)具有較好的抑制作用。表5歐美107楊樹枝條乙醇粗提物對真菌菌絲生長的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注楊樹枝條乙酵粗提物、多菌靈濃度分別為2.00mg/mL和10.00fig/mL。由于乙醇粗提物對小麥赤霉病菌、黃瓜枯萎病菌、棉花枯蔞病菌菌絲生長具有較好的抑制作用，故選用上述H種真菌為供試菌，測定楊樹乙醇粗提物及其不同極性萃取部分在不同濃度下對真菌菌絲生長的抑制作用，結(jié)果見表6。乙酸乙酯萃取部分抗菌活性最強，且具有較好的量效關(guān)系，濃度為2.00mg/mL時，對小麥赤審病菌、黃瓜枯萎病菌、棉花枯萎病菌菌絲生長的抑制率分別為4129%、29.10%*129.93%,正丁醇萃取部分活性次之，水層部分活性最低。表6歐美107楊樹枝條乙醇粗提物和各萃取部分對真菌菌絲生長的抑制作用處理<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注多菌靈濃度分別為10.00Mg/mL,對供試真菌菌絲生長的抑制率為100%。實施例9:對羥基肉桂酸脂肪烷醉酶(1)，蜜苗孢子萌發(fā)的抑制活性(1〉培養(yǎng)基采用燕麥西紅柿培養(yǎng)基(Oat-tomatoagarmediumOTA〉，配制1L的燕麥西紅柿培養(yǎng)基的步驟為將成熟的西紅梯切碎，用榨汁機榨汁，汁液用四層紗布過濾，取已過濾的汁液150BlL待用，同時，稱取燕麥片30g,如入10OOmL去離子水，煮沸30min，注意邊煮邊攪拌，煮好的燕麥片用兩層紗布過濾。收集濾液，然后往濾液中加入已準(zhǔn)備好的番茄汁150mL和20g瓊脂，加熱融化，趁熱用紗布過濾，然后加去離子水定容至1000mL,分裝后121T濕熱滅菌20min。該培養(yǎng)基用于稻瘟菌的培養(yǎng)。(2〉供試的植物病原真苗稻瘟菌(A/agnapor勸e￡>0^加)*(3〉稻瘟苗活化培養(yǎng)用滅菌的接種針從保存菌種的試管中挑取少量菌絲，接種到燕麥番茄汁培養(yǎng)基平板上，用封口膜封好，25T下培養(yǎng)。(4)稻瘟菌繼代培養(yǎng)倒燕麥番茄汁培養(yǎng)基平板，每皿倒培養(yǎng)基約40mL。用移液槍在稻瘟菌菌落中央滴加無菌水lmL,然后用滅菌后的接種針輕輕擦洗菌落表面，注意用力要輕，以免擦破培養(yǎng)基表面。待無菌水變渾濁后，再用移液槍吸取100nL滴加到倒好的燕麥番茄汁培養(yǎng)基平板表面，然后用玻璃涂棒將其涂散均勻。待培養(yǎng)基表面水分揮干后，蓋好倒置25。C下培養(yǎng)。(5)機械刺激誘導(dǎo)產(chǎn)孢接種活化的稻瘟菌室溫下培養(yǎng)48h后，在其表面滴加無菌水約3mL,然后用滅菌后的棉簽輕輕擦洗菌絲，將菌絲機械擦斷，連續(xù)擦洗兩次，待灰色菌落變?yōu)楹谏蠹纯?，將表面的水倒掉，然后倒扣于滅菌后的吸水紙上，晾干水分，用三層滅菌后的紗布將皿口封住，置于fli有光的條件下培養(yǎng)48h后，誘導(dǎo)產(chǎn)孢，即可得到稻瘟菌孢子，(6)配制化合物母液稱取待測化合物l.OOmg到Eppendorf管中，加入乙醇溶解，配成2mg/mL的母液，然后稀釋成含20%乙醇的母液濃度梯度400ng/mL、300M/mL、200Mg/mL、100ng/mL、50嗎/mL、25pg/mL。陽性對照采用多菌靈(Aldrich),稱取多菌靈1.0mg到Eppendorf管中，向其中加入純乙酵溶液1.0mL,振蕩溶解，得到1.0mg/mL的多菌靈母液。然后將多菌靈母液配制成系列濃度為30pg/mL、20ng/mL、16Hg/mL、10ng/mL、4jig/mL、2pg/mL、1jig/mL,溶劑為20%乙醇的溶液。(7)配制孢子懸浮液在機械誘導(dǎo)產(chǎn)孢好的平板上滴加無菌水3.0mL，然后用無菌棉簽輕輕擦洗菌落表面，洗下孢子，將孢子洗液裝到1.0mL的離心管中，離心3次(離心力8000g,每次離心10min)。然后配制孢子懸液，利用血球記數(shù)板測定孢子濃度，將孢子濃度配制為2W(^個/mL。(8)進行活性測定準(zhǔn)備潔凈培養(yǎng)皿，然后在每個培養(yǎng)皿中放上四層吸水紙，進行滅菌。滅菌后，往每皿中加無菌水5.0mL,使紙濕潤，在吸水紙上平行放置兩根無菌牙簽。另準(zhǔn)備好凹玻片，用75%的乙醇浸泡24h,然后晾干。在每個凹洞上滴加25fiL配制好的稻瘟菌孢子懸浮液(2xl06個/imL)和25系列濃度梯度的待測化合物溶液(滴加前應(yīng)在振蕩器上充分振蕩，以保證孢子懸浮液和藥劑溶液充分混勻)，這樣得到對羥基肉桂酸脂肪烷醇酯的檢測終濃度分別為:200jig/mL、150ng/mL、100Mg/mL、50ng/mL、25Mfi/mL、12.5jig/mL。而陽性對照的檢測終濃度分別為15jig/kiiL、10jtg^iL、8ng/mL、5jig/mL、2Mfi/mL、1Mg/mL、0.5ng/mL。同時設(shè)空白對照和溶劑對照(10%乙醉)，每個處理3個重復(fù)。然后將凹玻片放在培養(yǎng)皿中的牙簽上，室溫下培養(yǎng)7h后進行觀察孢子的萌發(fā)情形。(9)觀察記錄實驗結(jié)果和孢子萌發(fā)率的計算在顯微鏡10x10(目鏡x物鏡)倍下觀測每一凹玻片上的孢子萌發(fā)情況，選擇3個不同的視野，每個視野中IOO個以上孢子，共數(shù)3個視野(即300個孢子)，用計數(shù)器記下萌發(fā)的孢子數(shù)，計算孢子萌發(fā)率(％)。溶劑對照萌發(fā)率，處理萌發(fā)率孢子萌發(fā)抑制率(％)=_xlOO溶劑對照萌發(fā)率(10)數(shù)據(jù)處理和半抑制濃度的計算試驗結(jié)果采用MicrosoftExcel軟件進行數(shù)據(jù)整理，在分析中，供試樣品濃度取對數(shù)(X),抑制率換算成生物統(tǒng)計機率值(10,求得抑制活性回歸方程(y-"+b)，從而可以求得半抑制濃度(IC鄰)。實驗設(shè)空白對照和溶劑對照(10%乙醇，v/v)，每個處理3個重復(fù)。(11)實驗結(jié)果對羥基肉桂酸脂肪烷醇酷(1)在濃度為200ng/mL時，對稻瘟菌孢子萌發(fā)的抑制率為加.88%,抑制作用相對較弱。陽性對照多菌靈對稻瘟菌孢子萌發(fā)半抑制濃度(IC知)為2.11jtg/mL。實施例10:5^基-7-甲氣基黃酮(2)對稻瘟菌孢子萌發(fā)的抑制活性(1〉培養(yǎng)基同實施例9。(2>供試的植物病原真茵同實施例9。(3〉稻癍苗活化培養(yǎng)同實施例9。(4)稻瘟菌繼代培養(yǎng)同實施例9。(S〉機械刺激誘導(dǎo)產(chǎn)孢同實施例9*(6)配制化合物母液同實施例9。(7)配制孢子懸浮液同實施例9，(8)進行活性擁定同實施樹9。(9)觀察記錄實驗結(jié)果和孢子萌發(fā)率的計算同實施例9。(10)數(shù)據(jù)處理和^U制濃度的計算同實施例9，(11)實驗結(jié)果5茶基-7-甲氧基黃酮(2)對稻瘇菌孢子萌發(fā)的回歸方程為1^3.60421-1_3143,由"反應(yīng)率-幾率值轉(zhuǎn)換值表"可以查得，當(dāng)抑制率幾率值J^5時，所對應(yīng)的抑制率為50%,此時可以通過回歸方程求出義=1.7519,再求7的反對數(shù)，得出濃度值為56.禍jtg/mL，此濃度值即為抑制中濃度(IC50),所以5-羥基-7-甲氣基黃酮對稻瘟菌孢子萌發(fā)半抑制濃度(ICso)為56.幼jig/mL。陽性對照多菌靈對稻瘟菌孢子萌發(fā)的IC鄰為2.11pg/mL。實施例11:!Mg基7-甲艉基黃闞(2)對植物病原細苗的最低抑鵬度(1)培養(yǎng)基LB瓊脂培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基。LB瓊脂培養(yǎng)基配方如下每升培養(yǎng)基中含氯化鈉5g、蛋白胨10g、酵母浸裔5g、瓊脂15g。LB液體培養(yǎng)基配方除不加瓊脂外，同于LB瓊脂培養(yǎng)基配方。(2)供試的植物病原細菌黃瓜角斑病菌(/^eidb/oc—a附)、番茄育枯病菌(JZa/Won^加/anaceoriflM)、番茄瘡癡病菌Q53HJfewiOTtaives&aton'a)。上述供試細菌長期保存在4下，在活性測定前，需要在LB平板上對供試細菌進行活化培養(yǎng)(28C,暗)48h，然后挑取單菌落，接種于25mLLB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩搖床中(28"C,150rpm),培養(yǎng)24h,菌的濃度一般應(yīng)為109cfij/mL,即可用于活性測定。(3)測試禪品母液的配制取3mg單體化合物溶于lmL20%的乙醇中，配成3mg/mL的藥液，然后，取500fiL3mg/mL藥液，用20%的乙醇溶液將其稀釋，配得濃度分別為3000ng/mL、2500ng/mL、2000ng/mL、1500ftg/mL、1(X)Ojig/mL、500ng/mL、300ng/mL、250ng/mL、200fig/mL、150fig/mL、100tig/mL、50ng/mL、25jig/mL、12.5ng/mL、5.0ng/mL、2.5ng/mL。陽性對照選用硫酸鏈霉素(SERVA公司產(chǎn)品),其母液濃度分別為1000Mfi/mL、800pg/mL、600jig/mL、400ng/mL、200ng/mL、100pg/mL、80ng/mL、60ng/mL、40ng/mL、20jig/mL、10ng/mL的溶液。MTT用pH7.20.2mol/L的磷酸緩沖液(PBS)配制成5mg/mL的溶液，過濾除菌待用。(4)最低抑制濃度的測定采用多孔板-MTT顯色法測定其最低抑制濃度(MIC)。具#作步驟如下在潔凈無菌的96孔培養(yǎng)板中加入濃度為10、fo/mL的供試菌液90ML,不同濃度梯度的18試樣品母液IOnL,溶劑(乙醇)終濃度為2.0%。同時設(shè)空白對照和溶劑對照(2.0%乙醇)，每個處理3個重復(fù)。將96孔板于28。C下培養(yǎng)24h后每孔中加入MTT溶液(5mg/mL)10jiL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后，在1500g下離心20min，去上清，每孔加入DMSO100nL終止反應(yīng)，振蕩(15rpm)30min,以助其溶解.肉眼即可觀察判斷化合物的MIC值，即培養(yǎng)基中剛好無藍色物質(zhì)生成的藥劑濃度。為了進一步驗證MIC值，從多孔板每個孔中吸取10HL培養(yǎng)液涂布到LB平板上，在37aC下培養(yǎng)24h后觀察統(tǒng)計于板菌落數(shù)即可。(5)實驗結(jié)果5名基-7-甲氧基黃酮(2)對番癡痛痂病菌的最低抑制濃度為250jig/mL;在最大濃度為300ng/mL時，未檢測出對黃瓜角斑病菌和番茄靑枯病菌的最低抑制濃度。陽性對照硫m霧素對3種供試細菌的最低抑制濃度均為8pg/mL。實施例12:5"羥基-7-甲氧基黃酮(2)對植物病原細菌的半抑制濃度(1)培養(yǎng)基同實施例ll。(2)供試的植物病原鲴苗同實施例ll。(3)測試樣品母液的配制同實施例ll。u)半抑制濃度的獮定采用多孔板-MTT比色法測定其半抑制濃度(ICm)。具體操作步驟如下在潔凈無菌的鄰孔培養(yǎng)板中加入濃度為106cfa/mL的供試菌液90^L,不同濃度梯度的測試樣品母液10fiL,溶劑(乙醇)終濃度為2.0%。同時設(shè)空白對照和溶劑對照(2.0%乙醇)，每個處理重復(fù)3次。將鄰孔板于28°C下培養(yǎng)24h后每孔中加入MTT溶液(5mg/mL)10fiL,繼續(xù)培養(yǎng)4h后，在1500g下離心20min,去上清，每孔加入DMSO100jiL終止反應(yīng)，振蕩(15rpm)30min，以助其溶解，在1500g下離心20min，將上清(IOOhLDMSO)轉(zhuǎn)移至另一干凈的96孔板中，采用多孔板閱讀器(Bio-Rad*550,USA)測定590nm處的光吸收值，按下式計算供試藥物(化合物)的抑制率(％):』,*,、無藥對照孔OZ^90nm-藥液孔OD59(to抑制率(％)i--xioo無藥對照孔OD590nm根據(jù)抑制率，査機率值表，可得抑制率機率值(jo,將藥液濃度(Mg/mL)換算成濃度對數(shù)(;r),即可求出線性方程y-aX+b,根據(jù)線性方程可求山半抑制濃度(ICM)。(S〉實驗結(jié)果僅測定出5-羥基-7-甲氡基黃酮(2)對番茄瘡痂病菌生長的半抑制濃度，回歸方程為r=0.86943.091,由"反應(yīng)率-幾率值轉(zhuǎn)換值表"可以査得，當(dāng)抑制率幾率值}^=5時，所對應(yīng)的抑制率為50%，此時可以通過回歸方程求出JT-1.909,再求X的反對數(shù)，得出半抑制濃度值(IC5c)為156.95實施例13:S，7-二羥基黃頃(3)對植物病屎細菌的最低抑制濃度(1〉培養(yǎng)基同實施例ll。(2〉供試的植物病原細苗同實施例ll,(3)測試樣品母液的配制同實施例ll,不同之處在于所用溶劑DMSO代替了乙醉。(4)最低抑制濃度的猁定同實施例ll。(S〉實驗結(jié)果5,7-二羥基-黃酮對黃瓜角斑病菌、番茄靑枯病菌、番恭瘡痂病菌的雖低抑制濃度均為25lig/mL,陽性對照硫酸鏈每素對3種供試細菌的最低抑制濃度均為8MgAnL。實施例14:S,7-二羥基黃翻(3)對植物病原細苗的半抑度(1〉培養(yǎng)基同實施例n。(2)供試的植物病原細菌同實施例ll。(3>測試樣品母液的配制同實施例ll，不同之處在于所用溶劑DMSO代替了乙醇。(4)半抑制自的獮定同實施例11*(5)實驗結(jié)果5,7-二羥基黃酮對黃瓜角斑病菌、番茄青枯病菌、番茄痛痂病菌的半抑制濃度(見表7)分別為17.725ftg/mL、11.666ng/mL和14.556ng/mL,表7多孔板-MTT比色法測定5,7-二羥基黃翻(3)的抗細菌活性供試細菌抑制活性回歸方程相關(guān)系數(shù)(及)IC5fl(jig/mL)黃瓜角斑病菌r=0.7462JT十4.06830.954617.725番茄青枯病菌r=1.05073.87900.%訴11.666番茄痊痂病菌r=0.87031+3.訴780.955814.556實施例15:S,7-二羥基黃兩醇(4)對番茄青枯病菌的抑制活性U)培養(yǎng)基同實施例ll。(2)供試的植物病原細菌番茄青枯病菌(/ofeto"ia:rotoKJceflrMW)。(3〉測試樣品母液的配制同實施例ll,不同之處在于所用溶劑丙酮代替了乙醇。(4)抗菌活性的測定同實施例11。(5)實驗結(jié)果5,7-二羥基黃酮酵對番茄青枯病菌的抑制活性見表8，在濃度為15ng/mL和30iig/mL時，抑制率分別為75.6%和抑.6%。表8多孔板-M1T比色法測定5，7-二羥基黃酮醉(4)對番茄青枯病菌的抑制活性藥劑濃度對細菌生長的抑制率(Hg/mL)(%)CK-(2%丙酮)00化合物4153075.6肌6CK+(硫酸鏈蓽素)1530權(quán)利要求1、采用活性追蹤分離方法制備楊樹提取物和抗菌化合物。2、一種按權(quán)利要求1所述的追蹤分離方法是指在分離化合物的同時，進行抗菌活性檢測，分離化合物的方法包括常壓正相硅膠柱層析、常壓反相硅膠柱層析、SephadexLH-20凝膠柱層析、中壓正相或反相硅膠柱層析，抗菌活性檢測包括帶毒平板菌絲生長擴展法、薄層層析-生物自顯影-MTT法。3、一種按權(quán)利要求1所述的楊樹為歐美107楊(/>qp/itfxcaacfera&MoenchWeva')，該楊樹為歐洲黑楊(尸opw/wsWgraLinn.)和美洲黑楊(fctpw/Mscfe/to&fcMareh.)的雜交種。4、一種按權(quán)利要求1所述的制備楊樹提取物的方法是指楊樹枝條室內(nèi)晾干后，粉碎，用乙酵提取，減壓濃縮得乙醇粗提物，將乙醇粗提物用蒸餾水加熱溶解制成混懸液，依次用乙酸乙酯和正丁酵萃取，將乙酸乙酯層、正丁醇層，以及剩余的水層減壓濃縮，分別得乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分，粗提物或提取物對植物病原菌表現(xiàn)出抑制活性。5、一種按權(quán)利要求2所述的追蹤分離對羥基肉桂酸脂肪烷醉酯的方法是指采用多種層析分離手段，并結(jié)合抗菌活性測定進行，該化合物對植物病原菌具有抑制活性。6、一種按權(quán)利要求2所述的追蹤分離5-羥基-7-甲氧基黃兩的方法是指采用多種層析分離手段，并結(jié)合抗菌活性測定進行，該化合物對植物病原菌具有抑制活性，7、一種按權(quán)利要求2所述的追蹤分離5，7-二羥基黃酮的方法是指采用多種層析分離手段，并結(jié)合抗菌活性測定進行.該化合物對植物病原菌具有抑制活性。8、一種按權(quán)利要求2所述的追蹤分離5，7-二羥基黃酮醇的方法是指采用多種層析分離手段，并結(jié)合抗菌活性測定進行，該化合物對植物病原菌具有抑制活性。全文摘要本發(fā)明涉及楊樹抗菌化合物的制備及作為殺菌劑的應(yīng)用。本發(fā)明所述的抗菌化合物是從歐美107楊樹枝條中追蹤分離出來的，經(jīng)結(jié)構(gòu)解析分別為對羥基肉桂酸脂肪烷醇酯、5-羥基-7-甲氧基黃酮、5，7-二羥基黃酮、5，7-二羥基黃酮醇。本發(fā)明首次明確了黃酮類化合物是楊樹中的主要抗菌活性成分，同時明確了歐美107楊樹提取物及其抗菌成分對多種植物病原菌具有明顯的抑制活性，可用于植物病害防治。文檔編號A01P3/00GK101423507SQ20081022472公開日2009年5月6日申請日期2008年12月10日優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日發(fā)明者周亞明,周立剛,彭友良,王明安,鐘靈允,陳源泉,鵬隋,黃永富申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)