一種菘藍的組培快繁方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種菘藍的組培快繁方法，包括菘藍無菌苗的獲得、叢生芽的獲得、生根培養(yǎng)、煉苗等步驟。本發(fā)明由于采用剝?nèi)ネ馄さ妮克{種子為實驗材料，縮短了出苗時間，增加了出苗率。以MS+ 1.3-1.7 mg/L 6-BA + 0.5-1.0 mg/L NAA為叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，縮短了叢生芽誘導(dǎo)時間，提高了叢生芽誘導(dǎo)率，為在短時間內(nèi)獲得大量叢生芽提供了保障。以1/2 MS + 0.3-0.7 mg/L IBA為生根培養(yǎng)基，獲得了大量細長健壯的根系，為幼苗存活奠定了基礎(chǔ)。由于煉苗時以蛭石、草炭、珍珠巖的混合物為培養(yǎng)介質(zhì)，保證了幼苗成活率。
【專利說明】一種菘藍的組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥用植物組織培養(yǎng)和快速繁殖領(lǐng)域，具體地說，涉及十字花科菘藍屬 植物菘藍的組織培養(yǎng)和快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 菘藍（J1Saii1SifltZigoiica Fortune),十字花科兩年生草本植物，原產(chǎn)我國，有著悠 久的栽培歷史，北方大部分地區(qū)都有栽培，南方相對較少。菘藍的根、葉均供藥用，有清熱解 毒、涼血消斑、利咽止痛的功效。葉還可提取藍色染料；種子榨油，供工業(yè)用。菘藍的根稱為 板藍根（/fei/ijr isaiii/is)，為我國傳統(tǒng)中藥材，史載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，1985年起錄入《中 國藥典》。板藍根味苦、性寒，歸心、胃經(jīng)。主治流感、流腦、乙腦、肺炎、癢腮、丹毒、瘡疹和咽 喉腫痛等癥。板藍根具有廣泛的藥理活性，不僅對特異性免疫、非特異性免疫、體液免疫和 細胞免疫有一定的促進作用，還有降血脂、抗內(nèi)毒素、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌、清除自由 基等作用。其使用也越來越廣泛，以板藍根為主要原料的產(chǎn)品層出不窮，如板藍根沖劑、板 藍根針劑、三九感冒靈、康必得等感冒和抗病毒類中成藥等，因此對板藍根藥材的需求量日 益增多。
[0003] 組織培養(yǎng)技術(shù)是藥用植物育種過程中一項基本技術(shù)，是組織脫毒和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研 究的基礎(chǔ)。關(guān)于菘藍的組織培養(yǎng)，開展過一些研究，主要內(nèi)容集中于外植體的選擇、不同培 養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)和再生植株分化的影響。如客紹英等以菘藍幼葉為外植體，對其誘導(dǎo) 培養(yǎng)過程中細胞啟動、脫分化、組織分化和器官（芽和根）發(fā)生，進行了石蠟切片觀察和分 析。李連華等以菘藍愈傷組織為試驗材料，分析比較了不同培養(yǎng)基對菘藍愈傷組織增殖和 分化的影響。由于這些研究選用的試驗材料不同、實驗方法不同，因此得出的結(jié)論也不一 致。目前存在的缺點在于出苗誘導(dǎo)率較低，不能滿足常規(guī)實驗、生產(chǎn)需求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明公開的菘藍的組培快繁方法主要解決的是：提供一種能更快繁殖出菘藍幼 苗、且誘導(dǎo)率更高、移栽成活率更高的菘藍組培快繁方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的記述內(nèi)容： 一種菘藍的組培快繁方法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 菘藍無菌苗的獲得： 取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S,倒出乙醇,加入2. 5%的次氯酸鈉溶液,消毒10-15min,倒出次氯酸鈉,無菌水沖 洗5遍，取出種子放于IOOmL已滅菌的裝有20mLMS培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶放于25°C 光照培養(yǎng)箱中，光強12001uX，每天光照16小時，3-4天后，種子發(fā)芽，約30天后，菘藍苗長 至 IOcm ; (2) 叢生芽的獲得： 在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長Icm的小段放于滅菌的裝有20mL叢生芽培養(yǎng)基 (MS+ I. 3-1. 7 mg/L 6-BA (6-芐氨基嘌呤）+ 0· 5-1. O mg/L NAA (萘乙酸）的 IOOmL 三角 瓶中，將三角瓶放置于22± I°C光照培養(yǎng)箱中，光強12001ux，每天光照16小時，25天后，長 出大量叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率達到97%，40天后，叢生芽高度達到l-2cm ; 誘導(dǎo)率（％) =出現(xiàn)叢生芽的外植體數(shù)/總外植體數(shù)X 100 (3) 生根培養(yǎng)： 在超凈工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 0.3-0. 7 mg/L IBA (吲哚丁酸）的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23±1°C光照培養(yǎng)箱 中，光強12001ux，每天光照16小時，20天后，長出大量根，生根率達到95%。40天后，株商 達到IOcm ; 生根率（％) =生根的芽數(shù)/總芽數(shù)X 100 (4) 煉苗： 將步驟（3)中生根并已長至10-15cm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗3-5天，洗去 根部培養(yǎng)基，移入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合介質(zhì)中， 放置于溫室中，上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。其中的 MS培養(yǎng)基是組培通用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(常規(guī)培養(yǎng)基)。
[0006] 本發(fā)明主要考查了如下的內(nèi)容： (1) 菘藍無菌苗的獲得技術(shù)； (2) 獲得菘藍叢生芽的適宜培養(yǎng)基、光照條件及溫度條件； (3) 菘藍叢生芽生根的最佳條件，包括培養(yǎng)基、溫度和光照； (4) 菘藍組培苗移栽適宜條件。
[0007] 本發(fā)明公開的菘藍的組培快繁方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于： (1)本發(fā)明采用剝?nèi)ネ馄さ妮克{種子為實驗材料，縮短了出苗時間，增加了出苗率。其 中的消毒過程包括75%酒精消毒和2. 5%次氯酸鈉消毒兩個步驟，使得消毒更加徹底，為無 菌苗的獲得奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0008] (2)本發(fā)明由于以優(yōu)選的無菌、幼嫩的菘藍葉片為外植體，為組培快繁的成功提供 了材料保證。特別是以剪切的菘藍幼嫩葉片為外植體進行叢生芽誘導(dǎo)，使得誘導(dǎo)培養(yǎng)更容 易成功，保證了誘導(dǎo)效果。
[0009] (3)本發(fā)明以 MS+ L 3-1. 7 mg/L 6-BA + 0· 5-1. 0 mg/L NAA 為叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基，縮短了叢生芽誘導(dǎo)時間，提高了叢生芽誘導(dǎo)率，采用1/2 MS + 0.3-0. 7 mg/L IBA為生 根培養(yǎng)基，保證了生根率，為獲得健康的組培苗奠定了基礎(chǔ)，為在短時間內(nèi)獲得大量組培苗 提供了保障。每天光照16小時，充分保證了光照需求，誘導(dǎo)更容易成功。
[0010] (4)本發(fā)明在煉苗時以蛭石、草炭、珍珠巖的混合物為培養(yǎng)介質(zhì)，保證了幼苗成活 率。煉苗時，每天通風(fēng)2次，保證了幼苗對空氣和濕度的需求，提高了幼苗成活率。
【具體實施方式】
[0011] 以下結(jié)合較佳實施例，對本發(fā)明做進一步的描述，特別加以說明的是，菘藍種子有 市售。MS培養(yǎng)基指的是植物組織培養(yǎng)通用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(有市售），其他的試劑6-芐氨基嘌 呤、萘乙酸等均由市售。
[0012] 實施例1. (1)菘藍無菌苗的獲得： 取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸鈉溶液，消毒lOmin，倒出次氯酸鈉，無菌水沖洗 5遍，取出種子放于IOOmL已滅菌的裝有20mLMS培養(yǎng)基的三角瓶中。將三角瓶放于25°C光 照培養(yǎng)箱中，光強12001u X，每天光照16小時。3天后，種子發(fā)芽，約30天后，菘藍苗長至 IOcm0
[0013] (2)叢生芽的獲得： 在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長Icm的小段放于滅菌的裝有20mL叢生芽培養(yǎng)基 (MS+ 1.3 mg/L 6-BA + 0. 5 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于22±1°C光照 培養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時。大約25天后，長出大量叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率 達到97%，40天后，叢生芽高度達到lcm。
[0014] (3)生根培養(yǎng) 在超凈：工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 0.3 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23土 TC光照培養(yǎng)箱中，光強 12001ux，每天光照16小時。大約20天后，長出大量根，生根率達到95%。40天后，株高達 到 10cm。
[0015] (4:丨煉苗： 3中生根并已長至IOcm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗3天，洗去根部培養(yǎng)基，移 入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合介質(zhì)中，放置于溫室中， 上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。
[0016] 實施例2. (1)菘藍無菌苗的獲得： 取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸鈉溶液，消毒llmin，倒出次氯酸鈉，無菌水沖洗 5遍，取出種子放于IOOmL已滅菌的裝有20mLMS培養(yǎng)基的三角瓶中。將三角瓶放于25°C光 照培養(yǎng)箱中，光強12001u X，每天光照16小時。4天后，種子發(fā)芽，約30天后，菘藍苗長至 IOcm0
[0017] (2)叢生芽的獲得： 在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長I. 5cm的小段放于滅菌的裝有20mL叢生芽培養(yǎng)基 (MS+ 1.4mg/L 6-BA + 0. 6 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于22±1°C光照培 養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時。大約25天后，長出大量叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率達 到97%，40天后，叢生芽高度達到2cm。
[0018] (3)生根培養(yǎng)： 在超凈工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 0.4 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23土 TC光照培養(yǎng)箱中，光強 12001ux，每天光照16小時。大約20天后，長出大量根，生根率達到95%。40天后，株高達 到 10cm。
[0019] (4)煉苗： 將3中生根并已長至Ilcm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗4天，洗去根部培養(yǎng)基， 移入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合介質(zhì)中，放置于溫室 中，上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。
[0020] 實施例3. (1)菘藍無菌苗的獲得： 取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸鈉溶液，消毒12min，倒出次氯酸鈉，無菌水沖洗 5遍，取出種子放于IOOmL已滅菌的裝有20mLMS培養(yǎng)基的三角瓶中。將三角瓶放于25°C光 照培養(yǎng)箱中，光強12001u X，每天光照16小時。3天后，種子發(fā)芽，約30天后，菘藍苗長至 IOcm0
[0021] (2)叢生芽的獲得： 在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長2 cm的小段放于滅菌的裝有20mL叢生芽培養(yǎng)基 (MS+ 1.5 mg/L 6-BA + 0. 7 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置22±1°C光照培 養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時。大約25天后，長出大量叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率達 到97%，40天后，叢生芽高度達到lcm。
[0022] (3)生根培養(yǎng)： 在超凈工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 0.5 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23土 TC光照培養(yǎng)箱中，光強 12001ux，每天光照16小時。大約20天后，長出大量根，生根率達到95%。40天后，株高達 到 10cm。
[0023] (4)煉苗： 將3中生根并已長至12cm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗5天，洗去根部培養(yǎng)基， 移入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合介質(zhì)中，放置于溫室 中，上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。。
[0024] 實施例4. (1)菘藍無菌苗的獲得： 取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸鈉溶液，消毒13min，倒出次氯酸鈉，無菌水沖洗 5遍，取出種子放于IOOmL已滅菌的裝有20mLMS培養(yǎng)基的三角瓶中。將三角瓶放于25°C光 照培養(yǎng)箱中，光強12001u X，每天光照16小時。3天后，種子發(fā)芽，約30天后，菘藍苗長至 IOcm0
[0025] (2)叢生芽的獲得： 在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長Icm的小段放于滅菌的裝有20mL叢生芽培養(yǎng)基 (MS+ 1.6 mg/L 6-BA + 0. 8 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于22±1°C光照 培養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時。大約25天后，長出大量叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率 達到97%，40天后，叢生芽高度達到l-2cm。
[0026] (3)生根培養(yǎng)： 在超凈工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 0.6 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23土 TC光照培養(yǎng)箱中，光強 12001ux，每天光照16小時。大約20天后，長出大量根，生根率達到95%。40天后，株高達 到 10cm。
[0027] (4)煉苗： 將3中生根并已長至13cm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗3天，洗去根部培養(yǎng)基， 移入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合介質(zhì)中，放置于溫室 中，上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。
[0028] 實施例δα) 菘藍無菌苗的獲得： 取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸鈉溶液，消毒14min，倒出次氯酸鈉，無菌水沖洗 5遍，取出種子放于IOOmL已滅菌的裝有20mLMS培養(yǎng)基的三角瓶中。將三角瓶放于25°C光 照培養(yǎng)箱中，光強12001u X，每天光照16小時。4天后，種子發(fā)芽，約30天后，菘藍苗長至 10cm。
[0029] (2)叢生芽的獲得： 在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長I. 5 cm的小段放于滅菌的裝有20mL叢生芽培養(yǎng)基 (MS+ 1.9 mg/L 6-BA + 0. 9 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于22±1°C光照 培養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時。大約25天后，長出大量叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率 達到97%，40天后，叢生芽高度達到l-2cm。
[0030] (3)生根培養(yǎng)： 在超凈工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 0.7 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23土 TC光照培養(yǎng)箱中，光強 12001ux，每天光照16小時。大約20天后，長出大量根，生根率達到95%。40天后，株高達 到 10cm。
[0031] (4)煉苗： 將3中生根并已長至14cm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗4天，洗去根部培養(yǎng)基， 移入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合介質(zhì)中，放置于溫室 中，上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。
[0032] 實施例θα) 菘藍無菌苗的獲得： 取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸鈉溶液，消毒15 min，倒出次氯酸鈉，無菌水沖洗 5遍，取出種子放于IOOmL已滅菌的裝有20mL，MS培養(yǎng)基的三角瓶中。將三角瓶放于25°C 光照培養(yǎng)箱中，光強12001uX，每天光照16小時。3天后，種子發(fā)芽，約30天后，菘藍苗長至 IOcm0
[0033] (2)叢生芽的獲得： 在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長Icm的小段放于滅菌的裝有20mL叢生芽培養(yǎng)基 (MS+2. 0 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于22±1°C光照培 養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時。大約25天后，長出大量叢生芽，叢生芽誘導(dǎo)率達 到97%，40天后，叢生芽高度達到2cm。
[0034] (3)生根培養(yǎng)： 在超凈工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根培養(yǎng)基（1/2 MS + 0.6 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23土 TC光照培養(yǎng)箱中，光強 12001ux，每天光照16小時。大約20天后，長出大量根，生根率達到95%。40天后，株高達 到 10cm。
[0035] ⑷煉苗 將3中生根并已長至15 cm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗5天，洗去根部培養(yǎng) 基，移入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合介質(zhì)中，放置于溫 室中，上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。
[0036] 實施例7 對比試驗：
【權(quán)利要求】
1. 一種菘藍的組培快繁方法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 菘藍無菌苗的獲得：取菘藍種子，剝?nèi)シN皮，在超凈工作臺上放入滅菌的50mL三角 瓶中，加入10mL75%的乙醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸鈉溶液，消毒10-15min， 倒出次氯酸鈉，無菌水沖洗5遍，取出種子放于lOOmL已滅菌的裝有20mLMS培養(yǎng)基的三角 瓶中，將三角瓶放于25°C光照培養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時，3-4天后，種子發(fā) 芽，約30天后，菘藍苗長至10cm ; (2) 叢生芽的獲得：在超凈工作臺上將菘藍葉片剪成長lcm的小段放于滅菌的裝有 20mL叢生芽培養(yǎng)基MS+ 1.3-1.7 mg/L 6-BA + 0.5-1.0 mg/L NAA 的 lOOmL三角瓶中，將三 角瓶放置于22±1°C光照培養(yǎng)箱中，光強12001UX，每天光照16小時，25天后，長出大量叢 生芽，40天后，叢生芽高度達到l-2cm ; (3) 生根培養(yǎng)：在超凈工作臺上用滅菌剪刀剪下叢生芽，放置于滅菌的裝有20mL生根 培養(yǎng)基1/2 MS + 0.3-0. 7 mg/L IBA的lOOmL三角瓶中，將三角瓶放置于23 ±1°C光照培養(yǎng) 箱中，光強12001ux，每天光照16小時，20天后，長出大量根，40天后，株高達到10cm ; (4) 煉苗：將步驟（3)中生根并已長至10-15cm的幼苗，打開封口膜置于溫室中煉苗3-5 天，洗去根部培養(yǎng)基，移入滅菌處理過的體積份數(shù)比為蛭石：草炭：珍珠巖=15 :5 :2的混合 介質(zhì)中，放置于溫室中，上面覆薄膜，每天敞開薄膜，通風(fēng)2次，20天后，幼苗成活率達96%。
【文檔編號】A01H4/00GK104488724SQ201410832705
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月29日
【發(fā)明者】劉玉堂, 岳東霞, 趙憲爭, 尉萬聰, 楊迎霞, 周祥明, 宋兆偉 申請人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心