專利名稱：一類間苯酚環(huán)融入的大環(huán)內(nèi)酯化合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類間苯酚環(huán)融入的大環(huán)內(nèi)酯化合物及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
松樹的松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus(Steiner &Buhrer)Nickle)寄生在松屬樹種(Pinus sp.)體內(nèi)取食營養(yǎng)而導(dǎo)致樹木迅速死亡的一種的特大毀滅性病害，屬國際重要檢疫對象，列為森林病蟲害之首，被稱為“無煙的森林火災(zāi)”。該病自1905年發(fā)現(xiàn)、1934年被報道以來，現(xiàn)已廣泛分布于日本、美國、韓國、加拿大、墨西哥、希臘、葡萄牙和中國等。日本每年用于該病的防治費(fèi)用占森林病蟲害防治費(fèi)用的93.6％，占林業(yè)總投資的20％，但每年因該病損失木材仍然達(dá)100萬m3左右。我國于1982年發(fā)現(xiàn)該病以來，現(xiàn)已擴(kuò)展到江蘇、浙江、安徽、廣東、山東、湖北、上海、香港和臺灣等地，發(fā)生面積已超過7.3×10hm2，死亡松樹2×107株，造成林業(yè)經(jīng)濟(jì)、森林生態(tài)上的巨大損失和自然景觀的嚴(yán)重破壞，并對我國廣大適生區(qū)的松林構(gòu)成嚴(yán)重威脅。80年代以來，對松材線蟲的防治方法主要有1.施用能夠殺死松材線蟲的傳播媒介蟲——松墨天牛(Monochamusalternatus)的殺蟲劑殺螟松(MEP)、倍硫磷(MPP)、甲氨甲酸萘酯(NAC)等。這種防治方法的特點(diǎn)是一種依靠殺死傳病媒介來保護(hù)松樹的被動防治方法，它并不能有效地控制病情的大發(fā)生，并對地面植被有相當(dāng)程度的化學(xué)藥品污染。
2.直接向樹體內(nèi)注入殺線蟲劑(mesulfenphos，tartalicacid)來防治松材線蟲。這種方法只適用于保護(hù)珍貴樹木，而且效果不理想，并且對人畜毒性大。
目前防治松材線蟲病的方法主要以噴灑殺蟲劑控制松墨天牛為主，但由于松墨天牛成蟲期長，抗藥性強(qiáng)，防治效果很不理想。至今尚沒有研究出能實(shí)際應(yīng)用的殺松材線蟲的高效低毒專用農(nóng)藥，也未見有兼治松材線蟲和松墨天牛的藥劑或方法的研究報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類間苯酚環(huán)融入的大環(huán)內(nèi)酯化合物及其應(yīng)用。
本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為Caryospora carllicarpa ZD2，該菌株已于2003年7月28日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏號為CGMCCNo.0983。
本發(fā)明的一類具有毒殺松材線蟲活性的結(jié)構(gòu)骨架為間苯酚環(huán)融入的大環(huán)內(nèi)酯化合物是從生產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)物中提取分離得到3種新化合物，該3種化合物的結(jié)構(gòu)式分別如下所示(以下分別簡稱為化合物1-3)
化合物1 化合物2 化合物3本發(fā)明的活性化合物1-3的物化常數(shù)、氫譜數(shù)據(jù)和碳譜數(shù)據(jù)分別見表1、表2。
表1.化合物1-3的物化常數(shù)
表2.化合物1-3的NMR(丙酮)
本發(fā)明的活性化合物在液體浸泡法的抗線蟲活性測試中，在處理時間為36小時、化合物1-3對松材線蟲的半致死率分別為100，80，80ug/mL。因此，本發(fā)明的化合物可作為制備農(nóng)藥殺線劑應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1化合物1-3的分離制備a.真菌Caryospora carllicarpa ZD2的種子培養(yǎng)改良的PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母提取物1.0g，甘油6.0g，瓊脂17g，醫(yī)用復(fù)合維生素B和C各1片，水1000mL，制成平板，挑取菌株接入平板，25℃培養(yǎng)15天；b.將上述培養(yǎng)好的C.carllicarpa ZD2的菌絲體凍干，再用任選地的有機(jī)溶劑(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氫呋喃，乙腈)冷浸提取4次，將濃縮的粗提物吸收在固體吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高嶺土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒狀硅膠，氧化鋁等)上，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，干法上樣，以石油醚/乙酸乙酯＝0-100％為洗脫劑梯度洗脫。
c.收集80％-90％的石油醚/乙酸乙酯洗脫液，減壓濃縮。
d.將上述濃縮液經(jīng)Sephedex-LH20的甲醇或丙酮凝膠柱分離，即可獲得化合物1-3。
實(shí)施例2采用常規(guī)的液體浸入法檢測本發(fā)明化合物的抗線蟲活性的試驗(yàn)。
1、試驗(yàn)用藥劑將試驗(yàn)用樣品先溶于少量有機(jī)試劑DMSO，再加入一定濃度的吐溫水溶液分別制備如表3所示濃度的樣品測試溶液。在該溶液中，DMSO的終濃度＜3％、吐溫的終濃度＜5‰。另將相同濃度的DMSO溶解于含有0.5％(V/V)的吐溫-20的水溶液作為對照。
2.松材線蟲的培養(yǎng)與制備松材線蟲B.xylophilus的培養(yǎng)方法將灰葡萄孢(Botrytis cinerea)接入PDA平板，在25℃下培養(yǎng)至長滿平板，接入一塊帶有B.xylophilus的培養(yǎng)基，在25℃下培養(yǎng)至菌絲消失，線蟲長滿平板。
使用時將載有線蟲的培養(yǎng)基挑出，放到線蟲分離器中，用無菌水將線蟲洗出后，離心濃縮，制備成線蟲懸液(每毫升500條左右)。
3.試驗(yàn)方法將本發(fā)明化合物200ppm、100ppm、80ppm、50ppm濃度供試藥液2ml置于直徑為5cm的培養(yǎng)皿中，再加入活線蟲20ul(約300條)線蟲的懸液，輕輕混勻后將培養(yǎng)皿放置于25℃的培養(yǎng)箱中。分別于12，24和48小時檢查計(jì)算線蟲的死亡率。并在雙目顯微鏡下觀察，觀察線蟲體壁變化情況。
鑒定線蟲死亡的方法為在處理平板中加入1-5滴5％NaCl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
死亡率％＝死線蟲數(shù)/總線蟲數(shù)×100以未加樣品的測試溶液為對照，整個實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取三次平均值計(jì)算出平均死亡率。
4.試驗(yàn)結(jié)果表3.樣品對松材線蟲的毒殺活性測試結(jié)果
結(jié)果表明本發(fā)明的化合物1-3對松材線蟲都有較好的毒殺作用，可用于制備農(nóng)藥殺線劑用。
權(quán)利要求
1.一類間苯酚環(huán)融入的大環(huán)內(nèi)酯化合物，由生產(chǎn)菌株，采用常規(guī)固體發(fā)酵及提取分離的方法得到，其特征在于a.生產(chǎn)菌株為Caryospora carllicarpa ZD2，菌株保藏日期2003年7月28日，保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏號為CGMCC No.0983；b.該類活性化合物包括3種化合物，其中化合物1的結(jié)構(gòu)式為 化合物2的結(jié)構(gòu)式為 化合物3的結(jié)構(gòu)式為
2.權(quán)利要求1所述的間苯酚環(huán)融入的大環(huán)內(nèi)酯類化合物的應(yīng)用，其特征在于該類化合物可應(yīng)用于制備生物殺線劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類間苯酚環(huán)融入的大環(huán)內(nèi)酯化合物及其應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該類活性化合物由生產(chǎn)菌株、通過固體發(fā)酵及提取分離的方法得到。其生產(chǎn)菌株為Caryospora carllicarpa ZD2，該菌株已于2003年7月28日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏號為CGMCC No.0983；該類活性化合物包括3種化合物，該類活性化合物能有效地毒殺松材線蟲，可應(yīng)用于制備生物殺線劑。
文檔編號C12P7/40GK1861593SQ200610010849
公開日2006年11月15日 申請日期2006年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月26日
發(fā)明者董錦艷, 張克勤, 周薇 申請人:云南大學(xué)