專利名稱：：減毒的分枝桿菌的新引發(fā)-加強(qiáng)組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：總的來說，本發(fā)明涉及了針對病原性分枝桿菌對宿主進(jìn)行預(yù)防接種的方法。具體來說，本發(fā)明提供了預(yù)防接種的方法，其中給宿主連續(xù)使用了活的、減毒的分枝桿菌的腸胃外和粘膜劑型，產(chǎn)生了針對活的、減毒的分枝桿菌的全身性和粘膜性免疫反應(yīng)。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病(TB)在發(fā)展中國家是巨大的和致死的問題，每年有數(shù)以百萬計(jì)的人在他們生命的早期被殺死。在感染HIV的個體(11,15,16，43,44)和育齡婦女(61,63,65)中它是主要的死亡原因。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，每年有8百萬新增TB病例，有2百萬人死于TB(5，24)。在傳染病中，只有HIV和腹瀉病殺死更多的人。1993年，WHO指定TB為全球公共衛(wèi)生突發(fā)事件(1，3)。每年估計(jì)的2百萬TB死亡病例中的99%和新增8百萬病例中的95%發(fā)生在占世界人口85%的低等和中等收入的國家(5,11,15,16,24，43，44)。盡管廣泛使用了DOTs(短期直接觀察療法)和卡介苗(BCG〉，在發(fā)展中國家TB現(xiàn)在仍是嚴(yán)重疾病和死亡的主要原因(2，26，59)。在發(fā)展中國家，不受控制的TB流行由于許多原因正被惡化，這些原因包括廣泛流行的HIV、戰(zhàn)爭和政策不穩(wěn)定性、藥物抗性以及不斷增加的貧困(5,11,15,16,24,43,44)。盡管TB可以使用藥物進(jìn)行治療，但基本的治療方案需要至少6個月才能完成，并且需要服用多達(dá)4種不同的藥物。與藥物治療相結(jié)合，針對TB的中等有效的疫苗可以顯著地降低疾病的負(fù)載。目前得到許可的TB疫苗BCG，自從20世紀(jì)早期就開始使用，用于全世界數(shù)以百萬計(jì)的新生兒；它被認(rèn)為在生命的前幾年針對嚴(yán)重的TB疾病是有效的。但是TB流行仍然未被遏制的事實(shí)(2,26,59)表明迫切需要更好的TB疫苗。通過使用基因組學(xué)(17-19)和蛋白質(zhì)組學(xué)(4，22,51,58,64，66)，已經(jīng)出現(xiàn)了許多通過預(yù)防接種提高針對TB的保護(hù)作用的策略。這些策略可以被置于三種主要的類別中。類別1:修飾的重組BCG或活的減毒的Mtb本類別是基于這樣的想法，即BCG是中度有效的，因此可以作為改進(jìn)TB疫苗的基礎(chǔ)。發(fā)展了三種方法來改進(jìn)BCG。第一種方法最初由Horwitz及其同事開發(fā)(33，35)，需要擴(kuò)增BCG中免疫原性抗原的所有組成成分。因此，Rv1886c(也被稱為"抗原85B")在BCG中的增加的表達(dá)增加了BCGTice的保護(hù)性質(zhì)(33，35)。這個觀察與其他人報(bào)告一致，這些報(bào)告顯示出在實(shí)驗(yàn)動物中，表達(dá)被擴(kuò)增的抗原所有組成成分的重組BCG菌株比相應(yīng)的親本BCG菌株提供了更好的保護(hù)作用(40,50,53)。第二種方法是基于這樣的想法，即對宿主-BCG的相互作用進(jìn)行修飾將提高獲得的重組BCG所能提供的保護(hù)作用。該方法的例子包括具有修飾的表達(dá)的重組BCG菌株(25)以及被工程改造以失去了內(nèi)涵體的菌株(29，31)。在兩種情況下，據(jù)信獲得的菌株都通過交叉呈遞途徑增加了抗原的運(yùn)輸，從而喚起了針對疫苗抗原的增強(qiáng)的免疫反應(yīng)(25，29)。此外，，這些策略在小鼠中增強(qiáng)了針對低劑量氣溶膠激惹的保護(hù)作用(25)。該類別中的第三種方法是基于這樣的想法，即牛分枝桿菌的衍生物BCG中不存在結(jié)核分枝桿菌(Mtb，TB的病原體)在感染期間所表達(dá)的全套抗原，兩株細(xì)菌共同具有的這些抗原表現(xiàn)出某些等位基因多態(tài)性。因此，有討論認(rèn)為使用減毒的Mtb，其中將呈遞出與在Mtb感染的個體中表達(dá)的相同的一套基因，將優(yōu)于使用BCG(32，56，57)。盡管這種方法已經(jīng)產(chǎn)生了在動物模型中表現(xiàn)出比BCG更大保護(hù)作用的TB疫苗，減毒的Mtb在免疫缺陷的動物模型中已經(jīng)被證明比BCG更安全(32,56，57)。類別2:亞基和載體疫苗第二個類別是源自于這樣的發(fā)現(xiàn)，即某些TB蛋白當(dāng)作為亞基疫苗使用時顯示出能夠在動物模型中喚起保護(hù)性免疫。在誘導(dǎo)保護(hù)作用的抗原中，ESAT-6和所謂的抗原85復(fù)合物受到最大份額的關(guān)注(12,36:37，42,47-49,62,67)。最近，有證據(jù)表明某些含有兩個或多個候選TB疫苗抗原的融合蛋白比單獨(dú)的成分更為有效。這個類別中的主要候選物是Hybrid-l，含有ESAT6和Rv1886c的融合蛋白(42,48);Hyvac-4，含有Rv0288和Rv1886c的融合蛋白(21);以及72f，含有Rv0125和Rvll96的融合蛋白(14,38,60)。這些融合蛋白，當(dāng)用適合的佐劑配制時，已經(jīng)在動物模型中被證明能夠提供有效的保護(hù)作用(12,14，21,37,38,42，47，48，60,62,67)。類別3:異源的引發(fā)-加強(qiáng)疫苗策略不論是作為單劑使用還是在引發(fā)-加強(qiáng)策略中，上述的策略依賴于單個疫苗的狀態(tài)，其目標(biāo)是誘導(dǎo)長時間有潛力的Mtb特異性的免疫。但是，已經(jīng)廣泛認(rèn)可了兩劑BCG或減毒Mtb不能使效能提高到超過單劑的這些疫苗所能提供的效能(54)，盡管比單劑BCG更安全和更具有免疫原性(6，23)。此外，多劑的亞基或病毒載體疫苗可能太昂貴了，不能在TB流行的發(fā)展中國家中得到實(shí)用。因此，第三種策略最近受到了關(guān)注，其中使用了異源的加強(qiáng)疫苗來加強(qiáng)由引發(fā)疫苗(prime)引發(fā)的免疫。事實(shí)上，初免BCG的個體在使用含有修飾的為Mtb的抗原85A(在本文中稱為"Ag85A";也被稱為Rv3804c)編碼的疫苗Ankara(MVA)的異源性加強(qiáng)疫苗后，發(fā)展出了可觀的細(xì)胞免疫反應(yīng)(28，45，46);相比之下，未接觸抗原的個體對MVA-Ag85A疫苗發(fā)展出相對不可觀的反應(yīng)(45，46)。此外，在小鼠中，在提供保護(hù)作用方面，BCG初免MVA-Ag85A加強(qiáng)的策略顯示出比單獨(dú)使用BCG更加有效(28)。此外，包含了亞基加強(qiáng)疫苗以加強(qiáng)BCG的異源引發(fā)-加強(qiáng)策略也已經(jīng)被證明比單獨(dú)使用BCG更為有效(34)。盡管上面所述的研究沒有鑒定出保護(hù)作用的相關(guān)物，但總體來說，在實(shí)驗(yàn)動物中的實(shí)驗(yàn)研究表明異源引發(fā)-加強(qiáng)策略比單劑或同源引發(fā)-加強(qiáng)策略更有優(yōu)勢。但是，盡管有了這些顯著的進(jìn)展，仍繼續(xù)存在著開發(fā)對于最需要的人來說能夠負(fù)擔(dān)得起的免疫接種策略的需求。因此，盡管異源引發(fā)-加強(qiáng)策略在動物模型中已經(jīng)被證明有效并值得在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步評估，但從疫苗遞送的觀點(diǎn)來說，單劑疫苗或兩種形式是同樣的疫苗比異源的引發(fā)-加強(qiáng)策略更加容易。這些疫苗要求cGMP生產(chǎn)、填裝、包裝、投放、兩種不同成分的穩(wěn)定性測試，這增加了推動這些疫苗進(jìn)入大規(guī)模臨床試驗(yàn)和建造大規(guī)模生產(chǎn)工廠所需的投資和疫苗策略的成本。此外，活的減毒的分枝桿菌疫苗固有地比現(xiàn)在討論的加強(qiáng)疫苗的生產(chǎn)成本更低。既然目前由政府、非盈利的和合作組織進(jìn)行的投資水平較低，因此只有當(dāng)?shù)土囊l(fā)-加強(qiáng)策略可以使用時，在發(fā)展中國家通過公共衛(wèi)生疫苗干預(yù)計(jì)劃成功地控制TB才有可能成為現(xiàn)實(shí)。因此現(xiàn)有的工藝遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能提供這種成本效果合算的有效的策略。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的引發(fā)-加強(qiáng)策略，用于引發(fā)針對病原性分枝桿菌的免疫反應(yīng)。該策略包括了連續(xù)給用兩種不同的活的減毒的分枝桿菌疫苗劑型，其中一種被配制成用于腸胃外給用。另一種被配制成用于粘膜給用。使用的第一種劑型是"引發(fā)物"，使用的第二種劑型是"加強(qiáng)物"。腸胃外劑型被設(shè)計(jì)主要用來引發(fā)針對劑型中的抗原的全身性免疫反應(yīng)，而粘膜劑型被設(shè)計(jì)主要用來引發(fā)針對制劑中的活的、減毒的分枝桿菌的粘膜性免疫反應(yīng)。這兩種免疫反應(yīng)(全身性的和粘膜性的)合在一起，提供了針對帶有與劑型中的活的、減毒的分枝桿菌所帶有的相同或類似的抗原的分枝桿菌所引起的感染和/或疾病癥狀的發(fā)展的完全的、有效的保護(hù)作用。本發(fā)明提供了在宿主中同時引發(fā)針對活的、減毒的分枝桿菌或針對分枝桿菌抗原的全身性和粘膜性免疫反應(yīng)的方法。該方法包括步驟1)給該宿主腸胃外給用第一種抗原性組合物，其含有該活的、減毒的分枝桿菌或該分枝桿菌抗原、或帶有為該分枝桿菌抗原編碼的核酸的載體或細(xì)菌；以及2)給該宿主粘膜給用第二種抗原性組合物，其含有該活的、減毒的分枝桿菌或該分枝桿菌抗原、或帶有為該分枝桿菌抗原編碼的核酸的載體或細(xì)菌；該第二種抗原性組合物與該第一種抗原性組合物不同。腸胃外給用和粘膜給用的步驟導(dǎo)致在該宿主中同時誘導(dǎo)了針對該活的、減毒的分枝桿菌或該分枝桿菌抗原的全身性和粘膜性免疫反應(yīng)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，活的、減毒的分枝桿菌從含有結(jié)核分枝桿菌(M戸6aC應(yīng)勵e酒/(w")、牛分枝桿菌(AfycoZ)acZe"-賺6ov&)、BCG、鳥分枝桿菌復(fù)合物(嶺co6a"e"'畫complex)、堪薩斯氏分枝桿菌fM.^z"j"w"、摩爾分枝桿菌^/.m"/moe證J、猿分枝桿菌fMw'mz'—、蘇爾力口分枝桿菌(M，/ga^、蟾分枝桿菌「M;cewopt)、瘰痢分枝桿菌fM."n/w/aceM附J、膿腫分枝桿菌fM.a6scessw"、龜分枝桿菌(M.c/ie/o騰j、嗜血分枝桿菌fMAaemop/n7,J、潰瘍分枝桿菌「Mw/cera—或海分枝桿菌(Mma"'wwmj的組中選擇。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，帶有為分枝桿菌抗原編碼的核酸的細(xì)菌是志賀氏菌屬細(xì)菌。在另一個實(shí)施方案中，為該分枝桿菌抗原編碼的載體是腺病毒載體。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，活的、減毒的分枝桿菌含有為從下面的組中選擇的成分編碼的DNA:外源免疫原、內(nèi)源免疫原、佐劑、細(xì)胞因子、前凋亡因子和過量表達(dá)的Mtb抗原。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，口服完成的粘膜給用步驟被用于"引發(fā)"，即在腸胃外用藥的"加強(qiáng)"步驟之前。圖l:疫苗制造方法的.示意流程圖；圖2:自殺載體pAF102的圖譜。每個DNA片段的符號如下L-flank和R-flank:分別為weC基因的5，引物和3'引物末端附近的區(qū)域；p/^4G137Q編碼了突變形式的perfringolysinO(GenBank登記號BA000016)，在137位有單個氨基酸取代，用谷氨酰胺代替了甘氨酸(即G137Q);LPPAg85B是為抗原85B(即Rv1886c)的前導(dǎo)序列編碼的DNA序列；PAg85A是抗原85A基因(即Rv3804c)的啟動子序列；a;/z是氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank登記號X06402)，賦予質(zhì)?？敲顾乜剐?；OriE是pUC質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)(GenBank登記號AY234331);編碼Zeocin抗性(GenBank登記號L36850);雄5編碼蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(GenBank登記號Y489048)，賦予對蔗糖的敏感性；Phsp60是熱休克蛋白基因Rv0440的啟動子序列；MCS是用于指示的限制性酶的多克隆位點(diǎn)；圖3:抗原過量表達(dá)載體pAF105的圖譜。每個DNA片段的符號如下PRv3130是抗原Rv3130c的啟動子序列；PAg85B是Rvl886c的啟動子序列。表達(dá)盒中的基因是Rv0288(10.4)、Rvl886c和Rv3804c;印A是氨基葡萄糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank登記號X06402)，賦予質(zhì)?？敲顾乜剐裕籓riE是pUC質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)(GenBank登記號AY234331);/ewD是編碼3-異丙基蘋果酸脫水酶的基因(即Rv2987c);oriM是分枝桿菌中的復(fù)制原點(diǎn)(GenBank登記號M23557);圖4:使用標(biāo)準(zhǔn)BCG疫苗與本發(fā)明的雙組分TB疫苗進(jìn)行預(yù)防接種的比較。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本發(fā)明是基于這樣的認(rèn)識，即引發(fā)針對病原性分枝桿菌的保護(hù)性免疫的最佳策略涉及到同時產(chǎn)生針對分枝桿菌的全身性和粘膜性免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明提供了多組分的預(yù)防接種方法(系統(tǒng)、策略、方案)，其中引發(fā)藥劑和加強(qiáng)藥劑在它們的配方上不同，一種被最優(yōu)化用于腸胃外給用，另一種用于粘膜給用。兩種配方都含有活的、減毒的分枝桿菌。腸胃外劑型被設(shè)計(jì)主要用來誘導(dǎo)針對劑型中的抗原的全身性免疫反應(yīng)，而粘膜劑型被設(shè)計(jì)主要用來引發(fā)針對制劑中的活的、減毒的分枝桿菌的粘膜性免疫反應(yīng)。一旦完成了系統(tǒng)的用藥步驟(引發(fā)和至少一次加強(qiáng))，就同時發(fā)展出了針對活的、減毒的分枝桿菌的全身性和粘膜性免疫反應(yīng)。這兩種反應(yīng)合在一起，從而提供了針對帶有與劑型中存在的抗原、即活的、減毒的分枝桿菌的抗原相同或類似的抗原的病原性分枝桿菌所引起的感染和/或疾病癥狀的發(fā)展的完全的、有效的保護(hù)作用。具體來說，本發(fā)明提供了針對結(jié)核病(TB)的病原體結(jié)核分枝桿菌對宿主預(yù)防接種的方法。到目前為止，還沒有現(xiàn)有的技術(shù)描述了含有一個組分被配制成腸胃外給用、另一個組分被配制成粘膜給用的雙組分TB疫苗。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于這種新的疫苗劑型的組合能夠同時誘導(dǎo)粘膜和全身免疫。在以前的活的減毒分枝桿菌疫苗用于引發(fā)-加強(qiáng)預(yù)防接種策略的情況下，引發(fā)物和加強(qiáng)物被制備成同樣的劑型，通過同樣的途徑使用(6,23，54)。但是，實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明預(yù)先存在的對BCG的免疫干擾了加強(qiáng)物，導(dǎo)致與單獨(dú)使用引發(fā)物所提供的保護(hù)水平相比，從加強(qiáng)物沒有獲得可測量到的益處(13，20)。相反，本發(fā)明在引發(fā)-加強(qiáng)策略中使用了腸胃外和粘膜劑型的組合。.正如在下面的例子中將更詳細(xì)顯示的那樣，令人吃驚的是，由引發(fā)成分誘導(dǎo)的預(yù)先存在的免疫不干擾這種新的雙組分TB疫苗的加強(qiáng)成分。不受理論的束縛，據(jù)信缺少干擾的基礎(chǔ)可能是由于這樣的事實(shí)，即腸胃外疫苗在粘膜區(qū)中僅誘導(dǎo)相對低的T細(xì)胞反應(yīng)，針對粘膜激惹只能夠提供部分的甚至可忽略的保護(hù)作用(7-10，30，39，41,55)。因此，腸胃外疫苗不誘導(dǎo)粘膜T細(xì)胞反應(yīng)，不干擾隨后在粘膜組織中加強(qiáng)疫苗的集群現(xiàn)象。被使用的制劑含有活的、減毒的分枝桿菌。這些"活的、減毒的分枝桿菌"包括但不限于減毒的菌株例如BCG、重組的遺傳修飾的分枝桿菌生物體等。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，引發(fā)和加強(qiáng)成分含有同樣的活的、減毒的分枝桿菌，但是可以進(jìn)行不同的配制，腸胃外制劑以適合于腸胃外給用的方式配制，粘膜制劑以適合于粘膜給用的方式配制，正如下文描述的那樣。但是，在其它的實(shí)施方案中使用了異源系統(tǒng)，其中在腸胃外劑型中的某些或全部的減毒分枝桿菌與粘膜制劑中的不同。此外，腸胃外制劑(或粘膜制劑)可以含有一種以上的活的、減毒的分枝桿菌類型或菌株的混合物。此外，在某些情況下，制劑可以含有編碼或投送分枝桿菌抗原的實(shí)體。例子包括但不限于各種不同質(zhì)粒、病毒載體(例如腺病毒載體)，以及被遺傳工程改造以編碼分枝桿菌抗原的非分枝桿菌屬細(xì)菌(例如志賀氏菌)等。這樣的實(shí)體可以包含在劑型中以代替活的、減毒的分枝桿菌，或者與活的、減毒的分枝桿菌一起包含在劑型中。一旦使用后，本文描述的制劑引發(fā)了針對可能是病原性的分枝桿菌的免疫反應(yīng)。使用"引發(fā)免疫反應(yīng)"，我們是指抗原(一種或多種類型的活的、減毒的分枝桿菌)的使用導(dǎo)致了抗體的合成和/或CD4+或CD8+T細(xì)胞的增殖，和/或通過細(xì)胞外細(xì)胞因子染色、ELISA或其它本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知的方法測定的細(xì)胞因子的分泌。制劑也可以用作疫苗。使用"疫苗"我們是指制劑引發(fā)了免疫反應(yīng)，導(dǎo)致在被接種的宿主中針對帶有與制劑中的活的、減毒的分枝桿菌的抗原相同或類似的抗原的分枝桿菌(例如病原性菌株)的激惹的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用與沒有預(yù)防接種(例如只使用佐劑)的對照生物體相比，完全或部分地防止或阻止了與感染相關(guān)的癥狀的發(fā)生。在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的制劑可以只含有活的、減毒的分枝桿菌，或者制劑也可以含有不同的抗原性成分的混合物或"雞尾酒"。例如，活的、減毒的分枝桿菌可以在還含有其它己知的疫苗成分、例如用于針對脊髓灰質(zhì)炎、白喉、百日咳等的預(yù)防接種的成分、的制備物中使用。此外，制劑可以與其它的治療方式結(jié)合使用，例如強(qiáng)化免疫系統(tǒng)的物質(zhì)、各種不同的化療藥劑、其它的疫苗等。腸胃外和粘膜給用的制劑的制備對于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說是眾所周知的，其進(jìn)一步的具體方法將在下面討論。一般來說，這樣的制劑被制備成液體溶液或懸浮于，但是固體形式例如片劑、丸劑、粉末等也可以考慮。也可以制備適合于在使用前溶解或懸浮在液體中的固體形式。制備物也可以被乳化?；钚猿煞挚梢耘c可藥用的并且與活性成分相容的賦形劑混合。適合的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖水、甘油、乙醇等，或其組合。此外，制劑可以含有少量的輔助物質(zhì)例如增濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等。本發(fā)明的疫苗制備物還可以含有佐劑，適合的例子包括但不限于Seppic、QuilA、Alhydrogel等。如果需要服用口服形式的制劑，可以加入各種不同的增稠劑、香料、稀釋劑、乳化劑、分散輔助劑或粘合劑等。本發(fā)明的制劑可以含有任何這樣的輔助成分以便為制劑提供適合于使用的形式。配方中活的、減毒的分枝桿菌的最終量可以變化。但是，總的來說，配方中的量應(yīng)該為大約0.01-99%重量體積比。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，首先使用腸胃外制劑，而粘膜制劑在后來使用作為加強(qiáng)劑。但是，這個次序可以被顛倒，即可以首先使用粘膜制劑，而腸胃外制劑被用作加強(qiáng)劑。此外，在某些實(shí)施方案中，可以進(jìn)行多次的加強(qiáng)，加強(qiáng)可以是腸胃外的也可以是粘膜的，或者二者同時。每輪用藥之間的時間間隔的最優(yōu)化在下面討論。一般來說，本發(fā)明的疫苗策略被用于免疫哺乳動物例如人類。但是，獸醫(yī)應(yīng)用也可以考慮?；畹臏p毒的分枝桿菌屬菌株在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，新的雙組分TB疫苗的每個組分都含有活的減毒的分枝桿菌。具體的活的減毒的分枝桿菌屬菌株對于本發(fā)明來說不是關(guān)鍵的，可以從任何分枝桿菌屬的菌株中選擇，包括但不限于結(jié)核分枝桿菌CDC1551株(參見例如Griffith等，Am.J.Respir.Crit.CareMed.Aug;152(2):808;1995)、結(jié)核分枝桿菌北京株(Soolingen等，1995)、結(jié)核分枝桿菌H37Ra株(ATCC#:25177)、結(jié)核分枝桿菌H37Rv株(ATCC#:25618)、牛分枝桿菌(ATCC#:19211和27291)、偶發(fā)分枝桿菌(M/oma7wm)(ATCC弁:15073)、恥垢分枝桿菌(M.畫g顧一(ATCC#:12051禾n12549)、胞內(nèi)分枝桿菌(M,z旨ac函/歸)(ATCC存:35772和13209)、堪薩斯氏分枝桿菌(ATCC#:21982和35775)、鳥分枝桿菌(ATCC#:19421和25291)、雞分枝桿菌(Mg威離畫)(ATCC弁:19711)、牛匕牛分枝桿菌(M爾，)(ATCC#:15483禾口23024)、麻風(fēng)分枝桿菌(M./叩rae)(ATCC#:)、M.man'"flm(ATCC#:11566禾口11567)以及M.m/cro"f(ATCC#:11152)。減毒的分枝桿菌屬菌株的例子包括但不限于結(jié)核分枝桿菌泛酸鹽營養(yǎng)缺陷型菌株(Sambandamurthy，Nat.Med.20028(10):1171;2002)、結(jié)核分枝桿菌rpoK突變型菌株(Collins等，ProcNatlAcadSciUSA.92(17):8036;1995)、結(jié)核分枝桿菌亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(Hondalus等，Infect.Immun.68(5):2888;2000)、BCG丹麥株(ATCC#:35733)、BCG日本株(ATCC弁35737)、BCG芝加哥株(ATCC#27289)、BCG哥本哈根株(ATCC#:27290)、BCG巴斯德株(ATCC#:35734)、BCGGlaxo株(ATCC#:35741)、BCGConnaught株(ATCC#:35745)、BCG蒙特利爾株(ATCC#:35746)。此外，下面的美國專利，其中每個的全部內(nèi)容在此因?yàn)閰⒖?，列出了可以用于本發(fā)明的實(shí)踐的抗原Andersen等的US6,991,797;Gennaro等的US6,596,281;Reed等的US6,350,456;Reed等的US6,290,969;Content等的美國專利5,955,356;以及Content等的美國專利US5,916,558。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，雙組分TB疫苗可以含有攜帶過客核苷酸序列("PNS"，即源自另一個生物體的異源的或外源的核苷酸序列)的減毒的分枝桿菌屬菌株。PNS可以編碼一個或多個內(nèi)體水解蛋白，例如李斯特菌溶胞素(GenBank登記號CAA59919或CAA42639)、大腸桿菌溶血素(GenBank登記號AAC24352或CAA0535)以及Perfringolysin(GenBank登記號P19995或AAA23271)，產(chǎn)生了降解內(nèi)體的能力，或者部分導(dǎo)致了抗原泄漏到細(xì)胞質(zhì)中，或者達(dá)到了內(nèi)體破裂的程度，使分枝桿菌屬逸出該亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并駐留在細(xì)胞質(zhì)中(Hess等，ProcNatlAcad.Sci"95:5299-5304;1998;Grode等，ClinInvest.,115:2472-2479;2005)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，減毒的分枝桿菌屬菌株被修飾以增加凋亡，其中這樣的菌株誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)。凋亡是程序化細(xì)胞死亡，在其誘導(dǎo)與結(jié)果方面與壞死性細(xì)胞死亡有顯著的不同。事實(shí)上，含有抗原的細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致誘導(dǎo)了潛在的細(xì)胞免疫的過程被稱為交叉引發(fā)(Heath等，ImmunolRev199;2004;Gallucci等，NatureBiotechnology.5:1249;1999;Albert等，Nature392:86;1998)。導(dǎo)致增加的抗原特異性的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的凋亡的誘導(dǎo)有幾種機(jī)制。Caspase8介導(dǎo)的凋亡導(dǎo)致了抗原特異性的細(xì)胞免疫保護(hù)作用(Sheridan等，Science277:818;1997)。因此，本發(fā)明的另一個實(shí)施方案提供了顯示出增強(qiáng)的前凋亡性質(zhì)的減毒的分枝桿菌屬菌株，例如但不限于secAl分泌的缺少來自沙門氏桿菌(Sa/mo"e〃ae^enWto)(GenBank登記號1068147)、大腸桿菌(GenBank登記號1250070)或弗氏志賀氏菌〈67zz'ge〃fl/7e;c"e(GenBank登記號1079977)的前導(dǎo)序列的SodA，或者也可以是天然不分泌的SodA蛋白，例如來自單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(丄WeWawo"oc聲oge"e。EGD-e(GenBank登記號986791)的SodA。這樣的減毒的分枝桿菌屬菌株不產(chǎn)生細(xì)胞外Sod,因此不抑制宿主的免疫反應(yīng)，而且它們表達(dá)細(xì)胞內(nèi)Sod，從而使它們可以存活(Edwards等，Am.J.Respir.Crit.CareMed.164(12):2213-9;2001)。此外，顯示出增強(qiáng)的前凋亡性質(zhì)的減毒的分枝桿菌屬菌株還可以攜帶失活的Rv3238c基因。此外，Sa/mo"e〃flSopE(GenBank登記號AAD54239、AAB51429或AAC02071)或caspase-8(GenBank登記號AAD24962或AAH06737)被減毒的分枝桿菌在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，在該減毒的分枝桿菌表達(dá)抗原的情況下是誘導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡的有力的方法，喚起了高水平的抗原特異性細(xì)胞免疫。死亡受體-5(DR-5)、也被稱為TRAIL-R2(TRAIL受體2)和TNFR-SF-10B(腫瘤壞死因子超家族成員10B),也介導(dǎo)caspase8介導(dǎo)的凋亡(Sheridan等，1997)。呼腸弧病毒誘導(dǎo)的凋亡由TRAIL-DR5介導(dǎo)，導(dǎo)致隨后對病毒的清除(Clarke等，J.Virol.74:8135;2000)。DR-5、例如人類的DR-5(GenBank登記號BAA33723)、皰疹病毒-6(HHV-6)的DR-5同源物(GenBank登記號CAA58423)等、在本發(fā)明的減毒的分枝桿菌中的表達(dá)，為誘導(dǎo)針對Mtb抗原的抗原特異性的細(xì)胞免疫提供了有力的輔助效果。此外，宿主的抗原呈遞細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)也能夠通過Fas連接被誘導(dǎo)以經(jīng)歷凋亡，F(xiàn)as連接是誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的一種強(qiáng)的刺激物(Chattergoon等，Nat.Biotechnol.18:974;2000)。因此，表達(dá)Fas或Fas細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域/CD4胞外結(jié)構(gòu)域融合蛋白的減毒的分枝桿菌將誘導(dǎo)凋亡并增強(qiáng)抗原特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)。概括來說，促進(jìn)凋亡的誘導(dǎo)的減毒的分枝桿菌屬菌株，為導(dǎo)致Mtb感染的細(xì)胞的免疫介導(dǎo)的細(xì)胞破壞、以及隨后的Mtb感染的消除、減緩或防止的細(xì)胞反應(yīng)的誘導(dǎo)，提供了有力的工具。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，雙組分的TB疫苗可以包括過量表達(dá)至少一種分枝桿菌抗原的減毒的分枝桿菌屬菌株，該抗原包括但不限于Rv0125、Rv0203、Rv0287、Rv0288、Rv0603、Rvl196、Rvl223、Rvl271c、Rvl733c、Rvl738、Rvl謝c、Rvl886、Rv2031、Rv2032、Rv2253、Rv2290、Rv2389c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2779c、Rv2873、Rv2875、Rv3017c、Rv3407、Rv3804c、Rv3810或Rv3841。此外，過量表達(dá)的分枝桿菌抗原可以采用融合蛋白的形式，含有一種或多種該分枝桿菌融合蛋白，例如Mtb72f(14,60)、Hybrid-1(42,48)、Hyvac-4(21)等。本發(fā)明可以應(yīng)用于針對病原性分枝桿菌的疫苗的開發(fā)以及抗原投送疫苗載體的開發(fā)中。分枝桿菌載體在本文中被定義為任何被遺傳工程改造的能夠表達(dá)至少一種過客核苷酸序列(本文中稱為"PNS")的分枝桿菌，該P(yáng)NS含有DNA或RNA，并且為任何下面提出的抗原、免疫調(diào)節(jié)因子或佐劑的組合編碼?？梢允褂帽?br>技術(shù)領(lǐng)域：
現(xiàn)有的制劑和方法(Jacobs等，Nature327:532-535;1987;Barletta等，ResMicrobioU41:931隱939;1990;Kawahara等，ClinImmunol.105:326-331;2002;Lim等，AIDSResHumRetroviruses.13:1573-1581;1997;Chujoh等，Vaccine,20:797-804;2001;Matsumoto等，Vaccine,14:54-60;1996;Haeseleer等，MolBiochemParasitol.，57:117-126;1993)將PNS導(dǎo)入染色體中或作為表達(dá)載體的一部分。在本發(fā)明中，分枝桿菌載體可以帶有為免疫原編碼的PNS，該免疫原可以是來自病毒、細(xì)菌和寄生病原體的外源免疫原，也可以是內(nèi)源的免疫原，例如但不限于自身免疫抗原或腫瘤抗原。免疫原可以是全長的天然蛋白、外源免疫原與內(nèi)源蛋白或模擬物之間的嵌合融合子、來自病毒、細(xì)菌和寄生病原體的免疫原的一個或多個片段。本文中使用的"外源免疫原"是指正常情況下不在受體動物的細(xì)胞或組織中表達(dá)的蛋白或其片段，例如但不限于病毒蛋白、細(xì)菌蛋白、寄生蟲蛋白、細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑或治療藥劑。"內(nèi)源免疫原"是指自然情況下存在于受體動物的細(xì)胞或組織中的蛋白或其一部分，例如但不限于內(nèi)源細(xì)胞蛋白、免疫調(diào)節(jié)劑或治療藥劑?？蛇x的或另外的，免疫原可以由合成的基因編碼，可以使用本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知的常規(guī)的重組DNA方法來構(gòu)建。外源免疫原可以是任何病毒、細(xì)菌或寄生病原體在進(jìn)入、定居在它們的動物宿主中或在宿主中復(fù)制之前或期間所表達(dá)的任何分子分枝桿菌載體可以表達(dá)源自于病毒、細(xì)菌或寄生病原體的免疫原或其部分。這些病原體在人類、馴養(yǎng)動物或野生動物宿主中可能是有傳染性的。作為病毒抗原的來源的病毒病原體(即它們在天然條件下存在于的以及它們源自于的病原體)，包括但不限于正粘病毒例如流感病毒(分類學(xué)ID:59771)，逆轉(zhuǎn)錄病毒例如RSV、HTLV-1(分類ID:39015)、以及HTLV-II(分類學(xué)ID:11909)，皰疹病毒例如EBV(分類學(xué)ID:10295)、CMV(分類學(xué)ID:10358)或單純皰疹病毒(ATCC#:VR-1487),慢病毒例如HIV-1(分類學(xué)ID:12721)和HIV-2(分類學(xué)ID:11709)，桿狀病毒例如狂犬病毒，小核糖核酸病毒例如脊髓灰質(zhì)炎病毒(分類學(xué)ID:12080)，痘病毒例如痘苗病毒(分類學(xué)ID:10245)，輪狀病毒(分類學(xué)ID:10912)，以及細(xì)小病毒例如腺伴隨病毒1(分類學(xué)ID:85106)。病毒抗原的例子可以在包括但不限于下列抗原的組中發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒抗原Nef(國立過敏性和傳染性疾病研究所HIV儲存目錄號183;GenBank登記號AF238278)、Gag、Env(國立過敏性和傳染性疾病研究所HIV儲存目錄號2433;GenBank登記號U39362)、Tat(國立過敏性和傳染性疾病研究所HIV儲存目錄號827;GenBank登記號M13137)、Tat的突變衍生物例如Tat-D31-45(Agwale等，Proc.Natl.Acad.Sci.已付印，7月8日；2002)、Rev(國立過敏性和傳染性疾病研究所HIV儲存目錄號2088;GenBank登記號L14572)、以及Pol(國立過敏性和傳染性疾病研究所HIV儲存目錄號238;GenBank登記號AJ237568)，以及T和B細(xì)胞抗原決定簇gpl20(Hanke和McMichael,AIDSImmunolLett.,66:177;1999)(Hanke等，Vaccine,17:589;1999)(Palker等，J.Immunol.,142:3612-3619;1989)、fflV-1Env和gpl20的嵌合衍生物例如但不限于gpl20與CD4之間的融合(Fouts等，J.Virol"74:11427-11436;2000)、截短的或修飾的HIV-1env的衍生物例如但不限于gpl40(Stamatos等，JVirol，72:9656-9667;1998)或HIV-1Env和/或gpl40的衍生物(Binley等，JVirol,76:2606-2616;2002)(Sanders等，JVirol，74:5091-5100;2000)(Binley等，JVirol,74:627-643;2000)、乙肝表面抗原(GenBank登記號AF043578)(Wu等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:472674730;1989)、輪狀病毒抗原例如VP4(GenBank登記號AJ293721;Mackow等，Pro"Natl.Acad.Sci.，USA，87:518-522;19卯)和VP7(GenBank登記號AY003871;Green等，J.Virol"62:1819-1823;198S)、流感病毒抗原例如凝血素(GenBank登記號AJ404627;Pertmer和Robinson，Virology,257:406;1999)或核蛋白(GenBank登記號AJ289872;Lin等，Proc.Natl.Acad.Sci.,97:9654-9658;2000)、單純皰疹病毒抗原例如胸腺嘧啶激酶(GenBank登記號AB047378;Whitley等，NewGenerationVaccines,825-854;2004)。作為細(xì)菌抗原的來源的細(xì)菌病原體包括但不限于分枝桿菌屬菌株、幽門螺旋桿菌、沙門氏菌屬菌株、志賀氏菌屬菌株、大腸桿菌、立克次氏體屬菌株、利斯特氏菌屬菌株、嗜肺軍團(tuán)菌、假單胞菌屬菌株、弧菌屬菌株和博氏疏螺旋體。細(xì)菌病原體的保護(hù)性抗原的例子包括產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的菌體抗原例如CFA/I傘毛抗原(Yamamoto等，Infect.Immun.,50:925-928;1985)和熱不穩(wěn)定毒素的無毒性的B亞基(Klipstein等，Infect.Immun.，40:888-893;1983)、百日咳桿菌的pertactin(Roberts等，Vacc.，10:43-48;1992)、百日咳桿菌的腺甘酸環(huán)化酶-溶血素(Guiso等，Micro.Path.,11:423-431;1991)、破傷風(fēng)梭菌的破傷風(fēng)毒素的C片段(Fairweather等，Infect.Imimm.，58:1323-1326;1990)、博氏疏螺旋體的OspA(Sikand，等，Pediatrics,108:123-128;2001;Wallich,等，InfectImmun，69:2130-2136;2001)、普氏立克次氏體和斑疹傷寒立克次氏體的保護(hù)性的類結(jié)晶表面層蛋白(Carl，等，ProcNatlAcadSciUSA，87:8237-8241;1990)、單核細(xì)胞增多性利斯特氏菌的李斯特菌溶胞素(也稱為"LIo"和"Hly")和/或超氧化物歧化酶(也稱為"SOD"和"p60")(Hess,等，Infect.Imimm.65:1286-92;1997;Hess,等，Proc.Natl.Acad.Sci.93:1458-1463;1996;Bouwer,等，J.Exp.Med.175:1467-71;1992)、幽門螺旋桿菌的脲酶(Gomez-D窗te，等，Vaccine16,460-71;1998;Corthesy-Theulaz,等，Infection&Immunity66,581-6;1998)以及炭疽桿菌的致命毒素和/或保護(hù)性抗原的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Price，等，Infect.Immun.69,4509-4515;2001)。作為寄生蟲抗原的來源的寄生蟲病原體包括但不限于瘧原蟲屬菌株例如鐮狀瘧原蟲(ATCC&30145)、錐蟲屬菌株例如克氏錐蟲(ATCC存:50797)、賈第鞭毛蟲屬菌株例如蘭氏賈第鞭毛蟲(ATCC#:30888D)、方頭蜱屬菌株、巴貝蟲屬菌株例如田鼠巴貝蟲(ATCC#:30221)、內(nèi)變形蟲屬菌株例如痢疾內(nèi)變形蟲(ATCC#:30015)、艾美耳球蟲屬菌株例如巨型艾美耳球蟲(ATCC#40357)、利什曼原蟲屬菌株(分類學(xué)ID:38568)、血吸蟲屬菌株、布魯格氏絲蟲屬菌株、Fasciaspp.、惡絲蟲屬菌株、吳策線蟲屬菌株和盤尾絲蟲屬菌株。寄生蟲病原體的保護(hù)性抗原的例子包括瘧原蟲屬菌株的環(huán)子孢子抗原(Sadoff等，Science240:336-337;1988)例如尸.^rgen'/的環(huán)子孢子抗原或鐮狀瘧原蟲的環(huán)子孢子抗原、瘧原蟲屬菌株的裂殖性孢子表面抗原(Spetzler等，Int.J.Pept.Prot.Res"43:351-358;1994)、痢疾內(nèi)變形蟲的半乳糖特異性外源凝集素(Mann等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,88:3248-3252;1991)、利什曼原蟲屬菌株的gp63(Russell等，J.Immunol"140:1274-1278;1988;Xu禾ULiew，Immunol"84:173-176;1995)、碩大利什曼原蟲的gp46(Handman等，Vaccine,18:3011-3017;2000)、馬來絲蟲的副肌球蛋白(Li等，Mol.Biochem.Parasitol.，49:315-323;1991)、曼氏血吸蟲的磷酸丙糖異構(gòu)酶(Shoemaker等，Proc.Natl,Acad.Sci.，USA,89:1842-1846;1992)、蛇形毛圓線蟲分泌的類似珠蛋白的蛋白(Frenkel等，Mol.Biochem.Parasitol.,50:27-36;1992)、肝片血吸蟲(Hillyer等，Exp.Parasitol.,75:176-186;1992)、牛血吸蟲和日本血吸蟲(Bashir等，Trop.Geog.Med.，46:255-258;1994)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、以及牛血吸蟲和日本血吸蟲的KLH(Bashir等，同上，1994)。正如以前提到的那樣，分枝桿菌載體可以帶有為內(nèi)源免疫原編碼的PNS，內(nèi)源免疫原可以是任何可以在受體細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞蛋白、免疫調(diào)節(jié)劑或治療藥劑或其部分，包括但不限于腫瘤、移植和自身免疫免疫原、或腫瘤、移植和自身免疫免疫原的片段和衍生物。因此，在本發(fā)明中，分枝桿菌載體可以帶有編碼腫瘤、移植或自身免疫免疫原或其部分或片段的PNS。此外，分枝桿菌載體也可以帶有編碼腫瘤特異性、移植或自身免疫抗原或其部分的合成的PNS(如上所述)。腫瘤特異性抗原的例子包括前列腺特異性抗原(Gattuso等，HmnanPathol"26:123-126;1995)、TAG-72和CEA(Guadagni等，Int.J.Biol.Markers,9:53-60;1994)、MAGE-1和酪氨酸酶(Coulie等，J.Immunothera.,14:104-109;1993)。最近，在小鼠中已經(jīng)顯示，使用表達(dá)腫瘤抗原的非惡性細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防接種提供了疫苗的效果，也幫助動物建立起免疫反應(yīng)以清除表達(dá)同樣抗原的惡性腫瘤細(xì)胞(Koeppen等，Anal.N.Y.Acad.Sci"690:244-255;1993)。移植抗原的例子包括T細(xì)胞上的CD3分子(Alegre等，Digest.Dis.Sci.，40:58-64;1995)。使用針對CD3受體的抗體進(jìn)行治療，已經(jīng)顯示出快速地清除了循環(huán)系統(tǒng)中的T細(xì)胞，并逆轉(zhuǎn)了細(xì)胞介導(dǎo)的移植排斥(Alegre等，同上，1995)。自身免疫抗原的例子包括IASb鏈(Topham等，Proc.Natl.Acad.Sci"USA,91:8005-8009;1994)。用來自IAS/3鏈的18個氨基酸的肽接種小鼠，已經(jīng)被證實(shí)為患有實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎的小鼠提供了保護(hù)和治療(Topham等，同上，1994)。表達(dá)佐劑的分枝桿菌載體構(gòu)建帶有為免疫原和佐劑編碼的PNS的分枝桿菌載體是可行的，可用于引發(fā)增強(qiáng)的針對載體和PNS編碼的免疫原的宿主反應(yīng)。此外，構(gòu)建帶有為佐劑編碼的PNS的分枝桿菌"配對"載體也是可行的，該載體與另一個帶有為至少一個免疫原編碼的PNS的分枝桿菌載體混合在一起使用，以增強(qiáng)對該另一個分枝桿菌載體編碼的免疫原的宿主反應(yīng)。插入在該分枝桿菌載體中的PNS編碼的具體的佐劑對于本發(fā)明來說不是關(guān)鍵的，可以是來自任何經(jīng)典的霍亂弧菌(例如霍亂弧菌菌株395,ATCC#39541)或ElTor霍亂弧菌(例如霍亂弧菌菌株2125,ATCC#39050)的菌株的霍亂毒素的A亞基(即CtxA;GenBank登記號X00171、AF17570S、D30053、D30052)或其部分和/或突變的衍生物(例如Ctx的A亞基的Al結(jié)構(gòu)域(即CtxAl;GenBank登記號K02679))。此外，任何屬于細(xì)菌腺嘌呤二磷酸核糖基化外毒素家族的成員的細(xì)菌毒素，也可以被用來代替CtxA，例如產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌的熱不穩(wěn)定的毒素的A亞基(在本文中稱為EltA)(GenBank登記號M35581)、百日咳毒素的SI亞基(例如ptxSl，GenBank登記號AJ007364、AJ007363、AJ006159、AJ006157等);作為另一個可選方案，佐劑可以是百日咳博德特氏菌(ATCC#8467)、支氣管炎博德特氏菌6VTCC#7773)或副百日咳博德特氏菌(ATCC#15237)的腺苷酸環(huán)化酶-溶血素之一，例如百日咳博德特氏菌(GenBank登記號X14199)、副百日咳博德特氏菌(GenBank登記號AJ249835)或百日咳博德特氏菌(GenBank登記號Z37112)的cyaA基因。表達(dá)免疫調(diào)節(jié)劑的分枝桿菌載體還有另一種方法需要使用帶有至少一個為免疫原和細(xì)胞因子編碼的PNS的分枝桿菌載體，用來引發(fā)增強(qiáng)的對PNS編碼的免疫原分枝桿菌載體的宿主反應(yīng)。此外，構(gòu)建帶有單獨(dú)為該細(xì)胞因子編碼的PNS的分枝桿菌載體是可能的，該載體與至少一個帶有為免疫原編碼的PNS的分枝桿菌載體混合在一起使用，以增加針對配對的分枝桿菌載體表達(dá)的PNS編碼的免疫原的宿主反應(yīng)。分枝桿菌載體編碼的具體的細(xì)胞因子對于本發(fā)明來說不是關(guān)鍵的，包括但不限于白介素-4(在本文中稱為"IL-4";GenBank登記號AF352783(鼠IL-4)或NM—000589(人類IL-4))、IL-5(GenBank登記號NM—010558(鼠IL-5)或NM_000879(人類IL-5))、IL-6(GenBank登記號M20572(鼠IL-6)或M29150(人類IL-6))、IL-10(GenBank登記號NM—010548(鼠IL-10)或AF418271(人類IL-10))、IL-12p40(GenBank登記號NM—008352(鼠IL-12p40)或AY008847(人類IL-12p40))、IL-12p70(GenBank登記號NM—008351/NM—008352(鼠IL-12p35/40)或AF093065/AY008847(人類IL-12p35/40))、TGFb(GenBank登記號NM_011577(鼠TGFbl)或M60316(人類TGFM))以及TNFa(GenBank登記號X02611(鼠TNFa)或M26331(人類TNFa))。分枝桿菌菌株的構(gòu)建與繁殖上述的分枝桿菌菌株可以使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來制造例如，限制性內(nèi)切酶(在本文中稱為"REs";NewEnglandBiolabsBeverly,MA)、T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)禾QTaq聚合酶(LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)按照制造商的說明書使用；質(zhì)粒DNA使用小規(guī)模(QiagenMiniprep⑧試劑盒，SantaClarita,CA)或大規(guī)模(QiagenMaxiprep⑥試劑盒，SantaClarita,CA)質(zhì)粒DNA純化試劑盒按照制造商的說明書(Qiagen,.SantaClarita，CA)制備；無核酸梅的分子生物學(xué)級的milli-Q水、Tris-HCl(pH7.5)、EDTApH8.0、1MMgCl2、100%(v/v)乙醇、超純瓊脂糖以及瓊脂糖凝膠電泳緩沖液從LifeTechnologies,Gaithersburg,MD購買。RE消化、PCR、DNA連接反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳按照眾所周知的方法進(jìn)行(Sambrook,等，MolecularCloning:ALaboratoryManual.《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》1，2,3;1989;Straus等，ProcNatlAcadSciUSA.Mar;87(5):1889-93;1990)。在下面部分中描述的用于證實(shí)每個重組質(zhì)粒的DNA序列的核苷酸測序通過常規(guī)的自動化DNA測序技術(shù)使用373A型AppliedBiosystems自動測序儀來進(jìn)行。PCR引物可以從供應(yīng)商例如Sigma(St.Louis,MO)購買，以及使用AppliedBiosystemsDNA合成儀(373A型)來合成。PCR引物的使用濃度為150-250mM，PCR反應(yīng)的退火溫度使用克隆管理@軟件4.1版(ScientificandEducationalSoftwareInc.,Durham,NC)來確定。PCRs在400880型StrategeneRobocycler(Strategene,LaJolla,CA)中進(jìn)行。用于擴(kuò)增的PCR引物使用克隆管理@軟件4.1版(ScientificandEducationalSoftwareInc.,Durham,NC)來設(shè)計(jì)。該軟件能夠設(shè)計(jì)PCR引物，并鑒定與被操作的具體的DNA片段相容的RE位點(diǎn)。PCRs在熱循環(huán)儀裝置例如400880型StrategeneRobocycler(Strategene)中進(jìn)行，在PCRs中引物的退火、延伸和變性的時間按照標(biāo)準(zhǔn)方法來設(shè)置(Straus等，同上，1990)。RE消化和PCRs隨后通過瓊脂糖凝膠電泳使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行分析digestionsandthePCRsaresubsequentlyanalyzedbyagarosegelelectrophoresisusingstandardprocedures(Straus等，同上，1990;Sambrook等，同上，1989)。陽性克隆被定義為顯示出適合的RE圖譜和/或PCR圖譜的克隆。通過該過程鑒定的質(zhì)?？梢允褂蒙厦婷枋龅臉?biāo)準(zhǔn)的DNA測序步驟來進(jìn)一步評估。大腸桿菌菌株例如DH5a和ToplO，可以從Invitrogen(Ga池ersburg，MD)購買，用作在下面的實(shí)施例中描述的重組質(zhì)粒的起始宿主。重組質(zhì)粒使用高壓電脈沖裝置例如GenePulser(BioRadLaboratories,Hercules,CA)通過電穿孔導(dǎo)入到大腸桿菌中，電脈沖裝置正如描述的那樣設(shè)置為跳200W、15-25mF和1.0-2.5kV(Ausubel等，同上)。通過確定產(chǎn)生每個細(xì)菌每毫克DNA的最大轉(zhuǎn)化率時的設(shè)置來鑒定最適的電穿孔條件。實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌菌株生長在胰蛋白酶消化的大豆瓊脂培養(yǎng)基(Difco,Detroit,MI)或胰蛋白酶消化的大豆液體培養(yǎng)基(Difco，Detroit,MI)中，這些培養(yǎng)基按照制造商的指導(dǎo)制作。除非說明，否則所有的細(xì)菌到生長在37。C在、5%<:02環(huán)境中，輕輕搖動。在適當(dāng)?shù)臅r候可以在培養(yǎng)基中添加抗生素(Sigma,St.Louis,MO)。細(xì)菌菌株以大約每毫升1()S克隆形成單位(在本文中稱為"cfu")的量懸浮在含有30。/。甘油(v/v;Sigma,St.Louis,MO)中(Difco)，儲存在-80。C下?，F(xiàn)有的技術(shù)也教授了將改變的等位基因?qū)敕种U菌菌株中的方法，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將能夠解釋和執(zhí)行該方法(Parish等，Microbiology,146:1969-1975;2000)。一種新的產(chǎn)生等位基因交換質(zhì)粒的方法需要使用合成的DNA。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是質(zhì)粒產(chǎn)物具有高度確定的歷史，符合21CFR(21CFR207.31，607)，而以前使用的方法盡管有效，但具有難以證明的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)記錄，因此不可能符合21CFR。如果產(chǎn)品需要獲得美國和歐洲管制機(jī)構(gòu)的許可用于人類，則符合該規(guī)范是必需的(21CFR601.2,600-680)。用于分枝桿菌中進(jìn)行等位基因交換的自殺載體是能夠在大腸桿菌中復(fù)制、但是不能在分枝桿菌例如Mtb和BCG中復(fù)制的質(zhì)粒。在本發(fā)明的等位基因交換步驟中使用的具體的自殺質(zhì)粒不是非常重要的，可以從學(xué)術(shù)(Parish等，同上，2000)和商業(yè)來源獲得的自殺質(zhì)粒中選擇.優(yōu)選的用于等位基因交換的自殺質(zhì)粒的涉及顯示在圖2中。質(zhì)粒含有下列的DNA片段用于質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制的oriE序列(GenBank登記號L09137)，用于在大腸桿菌和分枝桿菌中的篩選的卡那霉素抗性序列(GetiBank登記號AAM97345)以及其它的抗生素選擇標(biāo)記(例如zeocin抗性基因(GenBank登記號AAU06610))，它在分枝桿菌的啟動子(例如hp60啟動子)控制之下。第二個抗生素抗性標(biāo)記不是必需的，但是包含它可以進(jìn)行雙倍選擇，以防止在等位基因交換過程中自發(fā)的卡那霉素抗性分離株的自然的發(fā)生(Garbe等，Microbiology.140:133-138;1994)。這樣的自殺載體的構(gòu)建可以使用本文描述的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來進(jìn)行。但是，現(xiàn)有的管理標(biāo)準(zhǔn)(例如21CFR)提高了人們對引入從暴露于含有傳染性海綿狀腦病(BSE)朊粒的牛產(chǎn)品的材料獲得的朊粒的恐懼。因此，為了避免將材料(例如DNA序列)引入未知來源的靶菌株，優(yōu)選情況下所有自殺載體中的DNA都是通過商業(yè)來源(例如Picoscript,Inc.)合成制造的。因此，構(gòu)建自殺載體的優(yōu)選方法是使用DNA軟件(例如CloneManager)匯集出DNA序列的藍(lán)圖，然后在付費(fèi)服務(wù)的基礎(chǔ)上通過任何提供這種服務(wù)的商業(yè)化供應(yīng)者(例如Picoscript，Inc.)合成DNA。自殺載體帶有為至少一個用于部分二倍體的陽性選擇的抗生素選擇標(biāo)記編碼的序列。為了在等位基因交換的移除期中進(jìn)行陰性篩選，包含了賦予蔗糖敏感性表現(xiàn)型的sacB基因(GenBank登記號AAA22724或AAA72302),以富集含有經(jīng)歷了最后的DNA重組步驟并完成了等位基因交換的菌株的培養(yǎng)物。分枝桿菌菌株的培養(yǎng)將選出的分枝桿菌菌株培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，例如Middlebrook7H9或Saulton合成培養(yǎng)基中，優(yōu)選在37°C下。菌株可以被維持作為靜止或攪拌培養(yǎng)物。此外，BCG的生長速度可以通過加入油酸(0.06%v/v;ResearchDiagnostics,目錄號01257)和去污劑例如Tyloxapol(0.05%v/v;ResearchDiagnostics,目錄號70400)來增加。分枝桿菌培養(yǎng)物的純度可以通過在3.5英寸的含有25-30ml的固體培養(yǎng)基例如Middlebrook7H10培養(yǎng)基的平板上，均勻地涂布100mcl用磷酸鹽緩沖液(在本文中稱為PBS)稀釋的分枝桿菌培養(yǎng)物無菌稀釋液(例如每個步驟稀釋10倍，到10'8)的等份試樣來評估。此外，培養(yǎng)物的純度還可以使用在21CFR610.12中描述的可商購的培養(yǎng)基例如硫代乙醇酸培養(yǎng)基(www.sciencelab.com,目錄號1891)和大豆-酪蛋白培養(yǎng)基(BD，目錄號211768)來進(jìn)一步評估。分枝桿菌種子以0.1-2x107cfu/ml的密度儲存在-80。C。液體培養(yǎng)物一般在相對無菌對照的光密度(600mn處)為0.2-4.0時收獲；將培養(yǎng)物放置在適當(dāng)大小的離心管中，菌體在8,000xg離心5-10min。丟棄上清液，將菌體以0.1-2x107cfu/ml的密度重新懸浮在由含有10-30%甘油的Middlebrook7H9構(gòu)成的儲存溶液中。將這些懸浮液分裝到無菌的1.5ml的硼硅酸鹽冷凍管中，每個含有l(wèi)ml等份試樣，然后放置在-80。C。雙組分TB疫苗的生產(chǎn)i)主培養(yǎng)前種子的定性在生產(chǎn)主培養(yǎng)種子庫(被定義為來自在液氮的液體或蒸汽相中冷凍保存的等份試樣中的單個組織或細(xì)胞的組分一致的細(xì)胞集合體)之前，通過在8.75cm的含有25-30ml的固體培養(yǎng)基(Middlebrook7H10)的平板上均勻地涂布lOOmd用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的培養(yǎng)物無菌稀釋液(例如每個步驟稀釋10倍，到10'8)的等份試樣來重新評估分枝桿菌疫苗的純度。培養(yǎng)物的純度也可以使用商業(yè)化購買的試劑盒來評估。PCR、質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切酶分析以及DNA雜交被用于證實(shí)在每個分枝桿菌分離株中所需的基因型的存在。所有的PCR產(chǎn)生的DNA片段都將通過自動化的雙脫氧核苷酸測序技術(shù)進(jìn)行測序，以證實(shí)全長基因的存在。候選的分枝桿菌屬菌株過量表達(dá)TB抗原或表達(dá)外源抗原的能力按照下面的描述進(jìn)行檢測。菌株按照上面的描述進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到對數(shù)期中期-靜止期時，按照以前的描述(31)制備全細(xì)胞裂解液，將培養(yǎng)上清液通過0.2-mm的膜過濾器進(jìn)行過濾。將全細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)物濾液蛋白(CFPs)在10-15%SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，用PfoA特異性兔血清(在PBS中稀釋1000到5000倍)染色，使用化學(xué)發(fā)光的免疫檢測技術(shù)來顯示。通過在10-15%SDS-PAGE凝膠上分離全細(xì)胞裂解液和CFPs、轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上、用特異性針對所需蛋白的mAbs進(jìn)行染色、然后使用化學(xué)發(fā)光的免疫檢測技術(shù)進(jìn)行顯示，來評估抗原的表達(dá)。為了評估候選的分枝桿菌疫苗菌株的內(nèi)體水解蛋白例如Llo和PfbA的分泌，按照上面的描述挑取菌落并培養(yǎng)到對數(shù)期中期。按照描述制備全細(xì)胞裂解液(Anacker等，J.Immunol.,98:1265-73;1967;Calaco等，BiochemSocTrans.,32:626-8;2004)，然后按照以前的描述(31)收集這些培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液，并通過0.2mm的膜過濾器進(jìn)行過濾。將全細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)物濾液蛋白在10-15%SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到尼龍濾膜上，用PfoA特異性兔血清(在PBS中稀釋1000到5000倍)染色，使用化學(xué)發(fā)光的免疫檢測技術(shù)進(jìn)行顯示。PfoA蛋白為大約56kDa，在來自rBCG-Pfo+菌株的培養(yǎng)物的上清液中可以檢測到。此外，rBCG-Pfo+上清液和全細(xì)胞懸浮液在含有0.1%BSA的PBS中的連續(xù)稀釋液中的溶血活性，使用綿羊紅細(xì)胞按照以前的描述(27)進(jìn)行證實(shí)。該分析中的陽性結(jié)果與內(nèi)體泄漏的表現(xiàn)型相關(guān)(27，52)。ii)主培養(yǎng)種子的制備主培養(yǎng)種子在C級潔凈室中生產(chǎn)。所有將用于生產(chǎn)主培養(yǎng)種子的設(shè)備將被批準(zhǔn)。小瓶、搖瓶等的開關(guān)在生物安全柜(級別100)中操作。被批準(zhǔn)的蒸汽滅菌器(高壓蒸汽滅菌器)被用于培養(yǎng)基、搖瓶和發(fā)酵罐部件的滅菌。主培養(yǎng)前種子的等份試樣被用于接種5個每個含有500ml修改的Middlebrook培養(yǎng)基的2升搖瓶。在轉(zhuǎn)速設(shè)置為120rpm的回轉(zhuǎn)搖床中在37。C下進(jìn)行培養(yǎng)。在完成主培養(yǎng)種子的生長之后，加入甘油至終濃度為10%(v/v)，1ml的等份試樣置于冷凍管中于-80。C儲存。iii)主培養(yǎng)種子的定性用于定性和QC主培養(yǎng)種子的分析方法顯示在下表中。表1.rBCG-HIV主培養(yǎng)種子的QC和交付<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>iv)臨床實(shí)驗(yàn)材料的cGMP生產(chǎn)雙組分TB疫苗制造工藝的概要顯示在圖1中。廠房設(shè)備的設(shè)計(jì)符合從I期臨床到產(chǎn)品下線的所有管制要求。換衣間和氣鎖為人員進(jìn)入廠房和將設(shè)備移進(jìn)和移出劃定的區(qū)域提供了關(guān)卡。制造廠房中的生物安全柜(級別100)被用于在制造廠房的級別100000的房間中無菌轉(zhuǎn)移接種物。小瓶、搖瓶等的開關(guān)在生物安全柜(級別100)中操作。被批準(zhǔn)的蒸汽滅菌器(高壓蒸汽滅菌器)被用于培養(yǎng)基、搖瓶和發(fā)酵罐部件的滅菌。廠房和環(huán)境監(jiān)控系統(tǒng)被證實(shí)有效。在制造I期臨床實(shí)驗(yàn)材料之前，環(huán)境監(jiān)控以及衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)操作步驟(SOPs)被證實(shí)有效。此外，通過在疫苗生產(chǎn)過程的模擬無菌生產(chǎn)操作的不同階段使用胰蛋白酶水解的酪蛋白-大豆液體培養(yǎng)基作為轉(zhuǎn)移液體進(jìn)行了三份平行試驗(yàn)，來證實(shí)無菌過程是有效的。接種物在C級潔凈室中中制備，在接種物制備期間培養(yǎng)物的接種在級別100的生物安全柜中進(jìn)行。為了制備接種物，將細(xì)菌主培養(yǎng)種子在37°C的搖床中從lml擴(kuò)增到50ml，然后到500ml。然后將500ml的培養(yǎng)物用于接種20L發(fā)酵罐。發(fā)酵在IOL培養(yǎng)基(參見上面)中進(jìn)行，該培養(yǎng)基在接種前在被批準(zhǔn)的高壓蒸汽滅菌器中于121°C滅菌1小時。在發(fā)酵過程中溫度被控制在37°(:,通過以100-300rpm運(yùn)行的帶有兩個6個扁平葉片的攪拌器來進(jìn)行混合，攪拌以及適當(dāng)?shù)耐馑俣扔糜趯l(fā)酵罐中的細(xì)菌培養(yǎng)物中的溶解氧比率維持在20%。發(fā)酵罐中培養(yǎng)液的pH使用無菌的pH電極來監(jiān)控，該電極與pH控制器相連，設(shè)置點(diǎn)的范圍為pH6.8-7.2。通過外周泵的開-關(guān)/PID激活通過加入HC1或NaOH來自動控制pH。為了監(jiān)控生物量，在發(fā)酵運(yùn)行過程中每天取樣，通過在540nm測量光密度來確定生物量。在無細(xì)胞細(xì)菌培養(yǎng)基中的甘油、葡萄糖和其它成分的水平通過Biolyzer測定。v)收獲完成發(fā)酵罐中的生產(chǎn)之后，將培養(yǎng)液無菌收集在無菌的離心管中，并離心收集生物體。將生物體重新懸浮在清洗緩沖液中，然后通過離心收獲。將一部分洗過的細(xì)菌以5x105cfu/ml的濃度重新懸浮在制劑溶液中。剩余部分作為大批材料儲存在含有10%(v/v)甘油的培養(yǎng)基中。vi)產(chǎn)品的無菌填充和冷凍干燥雙組分TB疫苗被配制(參見下面的詳細(xì)情況)并進(jìn)行QC測試，然后無菌填充和冷凍干燥。使用被批準(zhǔn)的填充方法和質(zhì)量控制，將懸浮在制劑溶液中的含有一劑人用疫苗的1ml等份試樣人工轉(zhuǎn)移到2mLI型琥珀色玻璃管中。冷凍干燥按照描述單批制作(Hubeau等，Clin.Exp.Allergy,33:386-93;2003;Kawahara等，Clin.Immunol.,105:326-31;2002;Gheorghiu等,DevBiolStand,，87:251-261;1996)。密封使用帶槽的氯丁橡膠塞，用20mm的中心可沿虛線撕開的鋁密封蓋加固。每個小瓶含有可抽取的單劑產(chǎn)品。Vii)候選疫苗的質(zhì)量控制和交付用于分枝桿菌疫苗的基本實(shí)驗(yàn)要求由美國FDA、歐洲國家(EMEA)規(guī)定，并進(jìn)一步按照世界衛(wèi)生組織的指南進(jìn)行國際化指導(dǎo)。希望雙組分TB疫苗能夠進(jìn)行目前所有對BCG疫苗來說所要求的實(shí)驗(yàn)。。也希望雙組分TB疫苗能夠進(jìn)行對于疫苗表達(dá)的抗原來說規(guī)定需要進(jìn)行的功能性實(shí)驗(yàn)。此外，雙組分TB疫苗還應(yīng)該能夠進(jìn)行美國FDA和EMEA目前要求的研究性安全性實(shí)驗(yàn)。在雙組分TB疫苗的生產(chǎn)中建議的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃被設(shè)計(jì)用于滿足目前對于下述方面的良好的生產(chǎn)實(shí)踐的要求1)質(zhì)量控制；2)對于BCG疫苗的管制實(shí)驗(yàn)要求；3)其它的對于表達(dá)的酶/抗原的實(shí)驗(yàn)要求；以及滿足4)對于I期臨床實(shí)驗(yàn)的所有研究性藥物安全性實(shí)驗(yàn)的要求。表2.冷凍的大批產(chǎn)品的交付測試<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表3.最終產(chǎn)品的交付測試<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表4.臨床實(shí)驗(yàn)材料的交付測試<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>配制策略i)腸胃外制劑本文使用的"腸胃外制劑"是指適合用于例如皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥的制劑。這樣的給藥可以通過本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所熟知的任何方法來進(jìn)行，例如使用針頭、氣槍、旋轉(zhuǎn)刺血針、"Mono-vacc"類型的裝置或任何其它適合的裝置等注射。疫苗配制的策略是在對生產(chǎn)過程中的存活率和穩(wěn)定性進(jìn)行確定的研究的基礎(chǔ)上建立的。這包括使用各種通常用于培養(yǎng)分枝桿菌的培養(yǎng)基、該培養(yǎng)基中添加了甘油、糖、氨基酸和去污劑或鹽、來確定在培養(yǎng)過程中最大的生物體存活率(活的比死的)。培養(yǎng)后通過離心或切向流過濾收獲細(xì)胞，然后將細(xì)胞重新懸浮在使得細(xì)胞在冷凍、冷凍干燥或泡沫干燥過程中得到保護(hù)的穩(wěn)定化的培養(yǎng)基中。常用的穩(wěn)定劑包括谷氨酸鈉、或氨基酸或氨基酸衍生物、甘油、糖或常用的鹽。最終的制劑將提供足夠的活的生物體用于通過真皮內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)投送，具有足夠的穩(wěn)定性以維持足夠的儲存期限用于分發(fā)和使用。ii)粘膜制劑本文使用的"粘膜制劑"是指適合用于口部(例如通過口攝取液體或固體形式、或者通過攝取含有抗原性成分的食物制品)、鼻部(例如通過吸入或滴加)、直腸(例如通過栓劑或液體)等給藥的制劑。粘膜制劑的配制依賴于靶粘膜給藥路線。粘膜制劑一般情況下與可藥用的載體或稀釋劑一起使用。具體的使用的可藥用的載體或稀釋劑對本發(fā)明來說不是關(guān)鍵的。稀釋劑的例子包括磷酸鹽緩沖液、用于緩沖胃中的胃酸的緩沖液、例如含有蔗糖的檸檬酸緩沖液(pH7.0)、單獨(dú)的碳酸氫鹽緩沖液(pH7.0)(Levine等，J.Clin.Invest.，79:888-902;1987;Black等，J.Infect.Dis.，155:1260-1265;1987)、或含有抗壞血酸、乳糖和可選的阿斯巴甜的碳酸氫鹽緩沖液(pH7.0)(Levine等。Lancet,11:467-470;1988)。載體的例子包括蛋白例如在脫脂奶中發(fā)現(xiàn)的蛋白、糖例如蔗糖、或聚乙烯吡咯垸酮。典型情況下這些載體的使用濃度為大約0.1-90%(w/v)，但是優(yōu)選在l-10。/。(w/v)的范圍內(nèi)。此外，口服制劑可以包含可商購的產(chǎn)品，例如CeraVacx(CeraInc，BaltimoreMaryland)，它已知可以增加活的口服細(xì)菌疫苗在口服后的存活力(Cohen等，Infect.Immun.,70:1965-1970;2002;Sack等，InfectImmun.,65:2107-2111;1997)。此外，口服制劑可以在腸包被膠囊中投送以通過胃部。TB疫苗制劑的臨床前評估i)通用安全性試驗(yàn)使用2xl06CFU的所需的分枝桿菌屬菌株和類似的父本菌株腹膜內(nèi)感染每組6只BALB/c小鼠。在感染后14天監(jiān)控動物的總的健康狀況和體重。接受了分枝桿菌的動物保持了健康，在觀察期間即沒有體重減輕也沒有顯示出疾病的明顯的征兆。ii)新的分枝桿菌屬菌株在具有免疫能力的小鼠中的毒力每組15只具有免疫能力的BALB/c小鼠用2xl06cfu分枝桿菌屬菌株進(jìn)行靜脈內(nèi)接種。在感染后第一天，每組中的3只小鼠被處死，分析脾臟、肺臟和肝臟中的CFU以確保每只動物具有相等的感染劑量。在感染后4、8、12和16周，每組3只小時被處死，并獲得脾臟、肺臟和肝臟中的CFU以評估分枝桿菌屬菌株與父本分枝桿菌屬菌株相比的體內(nèi)生長。預(yù)期分枝桿菌屬菌株將顯示出比野生型分枝桿菌降低的毒力。iii)在無免疫應(yīng)答的小鼠中的嚴(yán)格安全性試驗(yàn)每組IO只具有SCID(重度聯(lián)合免疫缺損)的無免疫應(yīng)答的小鼠分別用2xl06CFU的分枝桿菌屬菌株和野生型分枝桿菌屬菌株進(jìn)行靜脈內(nèi)感染。在感染后第一天，每組中的3只小鼠被處死，評估脾臟、肝臟和肺臟中的CFU以證實(shí)接種劑量。每個組中剩余的7只小鼠被監(jiān)測總的健康情況和體重。這些小鼠的存活被跟蹤，如果分枝桿菌感染的小鼠的存活期被延長超過了野生型菌株接種的小鼠的存活期，則證實(shí)了毒力的降低。iv)豚鼠安全性試驗(yàn)減毒的分枝桿菌屬菌株的安全性也在豚鼠模型中與BCG(例如BCG哥本哈根株)相比進(jìn)行了評估，后者在人類中已經(jīng)具有建立好的安全性輪廓。首先，研究了疫苗對動物的總的健康狀況、包括體重增加的影響。使用107(IOO倍的預(yù)防接種劑量)cfu的重組和父本菌株肌肉內(nèi)免疫豚鼠，在6周內(nèi)監(jiān)測動物的總的健康狀況和體重。對于在6周的時間結(jié)束之前死亡的動物進(jìn)行了尸體解剖。在感染后6周結(jié)束的時候?qū)⑺械膭游锾幩?，進(jìn)行宏觀病理學(xué)檢驗(yàn)。在6周的尸體檢驗(yàn)時沒有體重減輕、沒有異常的行為，所有的器官表現(xiàn)正常。分枝桿菌屬菌株被認(rèn)為是減毒的，因?yàn)樵谟迷摐p毒的分枝桿菌屬菌株接種的動物中沒有觀察到對健康不利的效應(yīng)i并且動物與用對照的BCG菌株接種的動物相比，以正常的速度增加體重。同時，監(jiān)測了在動物器官中的活的細(xì)菌的數(shù)量。豚鼠用BCG或減毒的分枝桿菌屬菌株免疫接種。在接種后2、4、6、8和10周，每組5只動物被安樂死，收獲組織包括區(qū)域性(腹股溝)淋巴結(jié)、肺臟、脾臟和肝臟，勻漿，通過以前描述的(Turner等，Infect.Immun.,68:3674-3679;2000;McMu呵等，Infect.Immun.50:555-559;1985;Wiegeshaus等，Am.Rev.Respir.Dis.，102:422-429;1970)平板計(jì)數(shù)來確定話的BCG或減毒的分枝桿菌的數(shù)量。V)毒性試驗(yàn)為了評估減毒的分枝桿菌屬菌株的毒性，每組12只豚鼠分別用一劑4倍高于、一劑等于、以及一劑4倍低于單劑人類劑量的減毒的分枝桿菌屬菌株、BCG或鹽水進(jìn)行內(nèi)皮內(nèi)預(yù)防接種。接種后3天，每組6只動物被處死，以評估減毒的分枝桿菌對這些動物的急性影響。在接種后28天，每組中剩余的6只動物被處死，以評估減毒的分枝桿菌對動物的慢性影響。在兩個時間點(diǎn)，獲得了每只動物的體重；并檢驗(yàn)了宏觀病理學(xué)和注射位點(diǎn)的外觀。取血用于血液化學(xué)，并進(jìn)行內(nèi)部器官和注射位點(diǎn)的組織病理學(xué)檢驗(yàn)。如果減毒的分枝桿菌屬菌株的毒性等于或小于BCG的毒性，則該菌株被視為安全的。疫苗效價的定性i)皮膚延遲類型的超敏性(DTH)的誘導(dǎo)不含特定病原體(SPF)的豚鼠用103減毒的分枝桿菌或BCG進(jìn)行真皮內(nèi)預(yù)防接種。接種后9周，將動物背部的毛剃掉，真皮內(nèi)注射溶于100/il磷酸鹽緩沖液的10MgPPD。24小時后，測量硬結(jié)的直徑。減毒的分枝桿菌屬菌株被預(yù)計(jì)能夠誘導(dǎo)與參比的BCG菌株誘導(dǎo)的相比相等的或更多的DTH。ii)鼠保護(hù)研究為了確定新的雙組分TB疫苗針對Mtb激惹的效價，每組13只C57B1/6小鼠(雌性，5-6周齡)用雙組分TB疫苗的引發(fā)組分、BCG或鹽水進(jìn)行預(yù)防接種。典型情況下，10、fu的引發(fā)組分和BCG對照被真皮內(nèi)給藥。但是，引發(fā)組分也可以通過粘膜接種途徑進(jìn)行給藥，優(yōu)選口服，劑量為104-109cfu，優(yōu)選106-107Cfu?？诜l(fā)組分的配方在上面和別處有描述(Adwell等，Vaccine,22:70-76;2003;Buddie等，Vaccine,23:3581-3589;2005)。引發(fā)后6到24周、優(yōu)選10到17周、最優(yōu)選17周后，用雙組分TB疫苗的引發(fā)組分接種的小鼠用雙組分TB疫苗的加強(qiáng)組分進(jìn)行加強(qiáng)。接受腸胃外引發(fā)的動物通過粘膜途徑、優(yōu)選口服途徑進(jìn)行加強(qiáng)；而接受粘膜引發(fā)的動物通過腸胃外途徑進(jìn)行加強(qiáng)。腸胃外加強(qiáng)組分通過皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥，優(yōu)選真皮內(nèi)給藥，劑量為106Cfu。粘膜加強(qiáng)組分通過粘膜接種途徑給藥，優(yōu)選為口服途徑，劑量為104-109cfu，優(yōu)選106-107cfu。最后一次接種后10周，小鼠用MtbErdman菌株(或H37Rv卡那霉素抗性菌株)激惹，激惹用從10ml含有總共107cfu的激惹菌株的單細(xì)胞懸浮液產(chǎn)生的氣溶膠進(jìn)行，該劑量給每個動物的肺部投送100個活的細(xì)菌，正如以前描述的那樣(Turner等，Infect.Immun.，68:3674-3679;2000;McMurray等，Infect.Immun.50:555-559;1985;Wiegeshaus等，Am.Rev.Respir.Dis.，102:422-429;1970)。試驗(yàn)動物與未激惹的動物一起被監(jiān)測存活。在激惹之后，也監(jiān)測動物的體重減輕和總體健康。在激惹后第一天，每組3只小鼠被處死，檢測肺部cfu以證實(shí)激惹劑量，l只被處死，用于脾臟和肺部組織病理學(xué)檢測。然后在激惹5周后，每組9只動物被處死，迸行動物的組織病理學(xué)和微生物學(xué)分析。對來自6只小鼠的肺臟和脾臟組織進(jìn)行cfu計(jì)數(shù)評估(帶有選擇添加物的平板被用于辨別疫苗菌株和激惹菌株)。如果用H37Rv-kan抗性菌株激惹，Kan或TCH被用于辨別激惹菌株與疫苗菌株。如果用MtbErdman菌株激惹，TCH被用于辨別疫苗菌株與激惹菌株(BCG是易感的，但是Mtb天然具有抗性)。iii)豚鼠激惹研究為了進(jìn)一步對減毒的分枝桿菌疫苗針對Mtb激惹的效價進(jìn)行定性，每組12只豚鼠(年輕的成年SPFHartley,250-300克，雄性)用雙組分TB疫苗的引發(fā)組分、BCG或鹽水進(jìn)行預(yù)防接種。典型情況下，1(^cfu的引發(fā)組分和BCG對照被真皮內(nèi)給藥。但是，引發(fā)組分也可以通過粘膜接種途徑進(jìn)行給藥，優(yōu)選口服，劑量為104-109cfu，優(yōu)選106-107cfu?？诜l(fā)組分的配方在上面和別處有描述(Adwell等，Vaccine,22:70-76;2003;Buddie等，Vaccine,23:3581-3589;2005)。引發(fā)后6到24周、優(yōu)選10到17周、最優(yōu)選17周后，用雙組分TB疫苗的引發(fā)組分接種的豚鼠用雙組分TB疫苗的加強(qiáng)組分進(jìn)行加強(qiáng)。接受腸胃外引發(fā)的動物通過粘膜途徑、優(yōu)選口服途徑進(jìn)行加強(qiáng)；而接受粘膜引發(fā)的動物通過腸胃外途徑進(jìn)行加強(qiáng)。腸胃外加強(qiáng)組分通過皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥，優(yōu)選真皮內(nèi)給藥，劑量為106cfu。粘膜加強(qiáng)組分通過粘膜接種途徑給藥，優(yōu)選為口服途徑，劑量為104-109cfu，優(yōu)選106-107cfu。最后一次接種后10周，小鼠用MtbErdman菌株(或H37Rv卡那霉素抗性菌株)激惹，激惹用從10ml含有總共107cfu的激惹菌株的單細(xì)胞懸浮液產(chǎn)生的氣溶膠進(jìn)行，該步驟給每個動物的肺部投送100個活的細(xì)菌，正如以前描述的那樣(Brodin等，2004)。激惹之后，動物與健康組的為接種、未激惹的動物一起被監(jiān)測存活。在激惹之后，也監(jiān)測動物的體重減輕和總體健康。在激惹后10天每組6只動物被處死，每組的剩余6只動物在激惹后70周被處死，用于長期評估。在兩個時間點(diǎn)都進(jìn)行動物的組織病理學(xué)和微生物學(xué)分析。對肺臟和脾臟組織進(jìn)行組織病理學(xué)和cfu計(jì)數(shù)評估(帶有選擇添加物的平板被用于辨別疫苗菌株和激惹菌株)。如果用H37Rv-kan抗性菌株激惹，Kan或TCH被用于辨別激惹菌株與疫苗菌株。如果用MtbErdmari菌株激惹，TCH被用于辨別疫苗菌株與激惹菌株(BCG是易感的，但是Mtb天然具有抗性)。假免疫的動物預(yù)計(jì)在激惹后將死得最快。相反，用新的雙組分TB疫苗接種的動物比用BCG接種的動物存活得更長。iv)靈長類安全性和激惹研究恒河猴可以用作有用的模型以評估針對Mtb的疫苗。人類與非人類靈長動物之間的遺傳相似性、以及TB在這些物種中相似的臨床和病理學(xué)表現(xiàn)，使得該模型對于TB疾病和疫苗效能的實(shí)驗(yàn)研究來說更具有吸引力。該模型、其特點(diǎn)是肺部空泡的發(fā)生、表現(xiàn)出適用于人類TB。感染的疾病的過程通過X-射線和體重減輕、以及各種溶血測試來跟蹤，溶血測試包括紅細(xì)胞沉降速度(ESR)、外周血單核細(xì)胞(PBMC)增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性以及抗體反應(yīng)。用Mtb感染后，猴子發(fā)展出具有特征性損傷的肺部病理學(xué)，并且依賴于激惹的劑量，死于在感染后4到6個月內(nèi)發(fā)生的急性呼吸系統(tǒng)感染。本研究的目的是評估BCG標(biāo)準(zhǔn)疫苗與本發(fā)明的雙組分TB疫苗的效能的比較。本研究包括了3個組，每組10只動物，設(shè)計(jì)如下使用BCG、雙組分TB疫苗和鹽水各一組。106cfu的雙組分TB疫苗的引發(fā)組分和BCG對照的接種物進(jìn)行腸胃外給藥，給藥通過肌肉內(nèi)、皮下或真皮內(nèi)，優(yōu)選真皮內(nèi)。但是，引發(fā)組分也可以通過粘膜接種途徑給藥，優(yōu)選為口服，劑量為104-109cfu，優(yōu)選106-107cfu?？诜l(fā)組分的配方在上面和別處有描述(Adwell等，Vaccine,22:70-76;2003;Buddie等，Vaccine,23:3581-3589;2005)。引發(fā)后6到24周、優(yōu)選10到17周、最優(yōu)選17周后，用雙組分TB疫苗的引發(fā)組分接種的恒河猴用雙組分TB疫苗的加強(qiáng)組分進(jìn)行加強(qiáng)。接受腸胃外引發(fā)的動物通過粘膜途徑、優(yōu)選口服途徑進(jìn)行加強(qiáng)；而接受粘膜引發(fā)的動物通過腸胃外途徑進(jìn)行加強(qiáng)。腸胃外加強(qiáng)組分通過皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥，優(yōu)選真皮內(nèi)給藥，劑量為106cfu。粘膜加強(qiáng)組分通過粘膜接種途徑給藥，優(yōu)選為口服途徑，劑量為104-109cfu，優(yōu)選106-107cfu。加強(qiáng)后10周，每組動物用含有低劑量的MtbErdman菌株的氣溶膠激惹，通過測量激惹后16周或動物死亡時細(xì)菌載荷的減少了測量保護(hù)作用。操作和激惹恒河猴的方法在別處有記載(Capuano等，Infect.Immun.，71:5831-5844;2003)。通過在淋巴細(xì)胞剠激試驗(yàn)中測量增殖和IFN-7的分泌來評估抗原特異性免疫。產(chǎn)生IFN-7的淋巴細(xì)胞的頻率通過酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISPOT)來確定，使用Versteegen等的方法(J.Immunol.Methods111:25-29;1988)，進(jìn)行了Miyahira等的修改(J.Immunol.Methods181:45-54;1995),或按照描述通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色已經(jīng)熒光激活的細(xì)胞分揀(FACS)來確定(Chattopadhyay等，NatureMedicine11,1113-1117;2005;Tritel等，J.Immunol"171:2538-47;2003;Hanekom等，J.Immunol.Methods"291:185-95;2004;Berhanu等，J.Immunol.Methods279，199-207;2003;DeRosa等，NatureMedicine7,245-248;2001)。在相對于最初的接種的第0、4、8、12、16、20和24周時抽取血樣。在最后一次免疫后10周，動物通過氣管內(nèi)安裝結(jié)核分枝桿菌Erdman株進(jìn)行激惹(在3mlPBS中含有1,000cfu)。所有的動物在同一天用同樣的制備物進(jìn)行激惹。感染的過程通過監(jiān)測體重、直腸溫度和ESR來評估。在激惹后每隔1個月以及在激惹后26周時的最后的尸體檢驗(yàn)中，進(jìn)行胸部X-射線以檢測與肺部TB相符的異常。TB載體和疫苗的臨床評估i)安全性和毒性研究美國食品和藥品聯(lián)合會準(zhǔn)則和CFR21要求的臨床安全性和毒性研究，按照上面的描述進(jìn)行。在這些研究之后，進(jìn)行了人類安全性研究。這些研究首先在健康的TB陰性成年人中進(jìn)行，然后將年齡降低到兒童和新生兒。使用本發(fā)明的腸胃外組分進(jìn)行的人類腸胃外預(yù)防接種，是通過皮下注射含有3x104到3x107cf\i，、優(yōu)選1x105到1x106的減毒的分枝桿菌屬菌株例如減毒的Mtb、BCG或重組BCG來進(jìn)行的。使用本發(fā)明的粘膜組分進(jìn)行的人類口服預(yù)防接種，可以通過使用以前描述的方法來進(jìn)行(Miller等，CanMedAssocJ.121(l):45-54;1979)。本發(fā)明的口服使用的活的、減毒的分枝桿菌屬菌株的量依賴于接受者的物種以及正被治療的疾病或癥狀而變化。一般來說，使用的劑量大約為103到1011活生物體，優(yōu)選大約105到109或生物體。實(shí)施例實(shí)施例1.過量表達(dá)TB抗原并逸出內(nèi)體的重組BCG菌株的構(gòu)建為了產(chǎn)生逸出內(nèi)體的菌株，我們開發(fā)了表達(dá)perfringolysinO(Pfo)的BCG1331衍生株，這是通常情況下由產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的細(xì)胞溶素，由基因編碼(GenBank登記號CPE0163)。PfoA在梭菌中以及在枯草芽孢桿菌中表達(dá)時介導(dǎo)了從吞噬體的逸出(52)。但是，與Llo不同，PfoA在pH5.0和pH7.0下都具有活性(52)。為了限制Pfo的細(xì)胞毒性，使用了帶有G137Q取代(PfoAG137Q)的該蛋白的突變形式，因?yàn)樵摼暝谒拗骷?xì)胞細(xì)胞液中具有短的半衰期，并且也能在寬的pH范屈內(nèi)介導(dǎo)內(nèi)體的逸出(52)。為了研究PfoAG137Q的用處，我們構(gòu)建了分泌該蛋白的重組的BCG，命名為AFV102(即BCG1331weC:.7/"G137Q)。該菌株通過與weC基因進(jìn)行等位基因交換而構(gòu)建。結(jié)果，在Rvl886c啟動子控制之下的pfoAG137Q基因表達(dá)盒取代了"reC，使得PfoA能夠在染色體上穩(wěn)定地表達(dá)。等位基因交換質(zhì)粒被命名為pAF102(圖2)，含有下列的DNA片段1)用于質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制的oriE序列；2)用于在大腸桿菌和靶BCG菌株中進(jìn)行選擇的卡那霉素抗性基因序列；3)weC上游1kb(L-flank)和下游1kb(R-flank)附近的序列；以及4)在插入到ureC鄰近序列基因之間的Rvl886c啟動子控制之下的;7/(^G137Q。值得注意的是，Rvl886的前導(dǎo)肽序列被用來代替了野生型的PfoA的信號序列，用于使重組BCG分泌PfoA。所有這些成分由PicoscriptInc(Houston,TX)合成和裝配，產(chǎn)生了質(zhì)粒pAF102(圖2)。pAF102的序列按照上面的描述通過自動化雙脫氧核苷酸測序進(jìn)行證實(shí)。為了制備靶菌株，將BCG丹麥株1331(BCG1331)在添加有10%w/v油酸-白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(OADC;BDGibco)和0.05%(v/v)的Tyloxapol(ResearchandDiagnosticLabInc.)的7H9培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到對數(shù)期時(550nm處光密度為4-5)，將細(xì)菌收集，按照以前的描述制備用于電穿孔(Sun等，Mol.Microbiol.52:25-38;2004)。為了產(chǎn)生部分二倍體，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法(Sun等，2004)將5個微生物的純化的pAF102DNA導(dǎo)入新鮮制備的BCG1331電穿孔感受態(tài)細(xì)胞。電穿孔后，將細(xì)胞在添加有10%(v/v)OADC和0.05。/。(v/v)的Tyloxapol的7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后將細(xì)胞在添加了50mcg/ml卡那霉素的7H10平板上、在37°C和5%v/vC02的條件下培養(yǎng)30天。將獲得的部分二倍體菌落轉(zhuǎn)移到含有10%(w/v)蔗糖(Sigma，StLouisMO)的7H9培養(yǎng)基中，在37T和5。/。v/vC02的條件下繼續(xù)培養(yǎng)30天。一個在蔗糖平板上生長起來的菌落、被命名為AFV102，被發(fā)現(xiàn)是脲酶陰性的，表明"reC基因已經(jīng)被PfoA表達(dá)盒代替。進(jìn)行了下面的試驗(yàn)以證實(shí)AFV102是UreC陰性和PfoA陽性的。首先，使用脲酶測試試劑盒按照制造商的說明書(Difco)篩選菌株AFV102缺少脲酶活性。簡單來說，將lmm接種環(huán)滿環(huán)的AFV102細(xì)菌(大約105cfu)重新懸浮在透明管中的制造商提供的測試緩沖液中。同樣量的BCG1331被用作脲酶陽性對照，只含有緩沖液的管被用作陰性對照。反應(yīng)混合物在室溫保溫30分鐘，根據(jù)制造商的說明書來判斷結(jié)果。該分析顯示AFV102不具有脲酶活性，證實(shí)了PfoA表達(dá)盒已經(jīng)替換了該等位基因的假設(shè)。其次，使用PCR來證實(shí)AVF102中的"reC.vp/oJ基因型。在標(biāo)準(zhǔn)的PCR分析中使用了200mM的PCR正向引物[acggctaccgtctggacat](SEQIDNO:1)和反向引物[cgatggcttcttcgatgc](SEQIDNO:2)，以通過在wreC基因鄰近的序列中起始PCR來擴(kuò)增pfoA等位基因。PCR的參數(shù)如下步驟l:95。C4分鐘，l個循環(huán)；步驟2:95。Cl分鐘、60°Cl分鐘、然后72。CI分鐘，總共30個循環(huán)；步驟3:72。C10分鐘，1個循環(huán)；步驟4:4。C儲存。獲得的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，使用自動化的雙脫氧核苷酸測序技術(shù)進(jìn)行測序，這證實(shí)了在AFV102中全長的pfoA基因代替了ureC基因(即weC:://a4)的存在。因此，PCR的結(jié)果顯示出AFV102產(chǎn)生了重組的"wC::戶/0^(等位基因的預(yù)計(jì)分子量2180bp的DNA條帶，而父本菌株BCG1331在同樣的PCR條件下產(chǎn)生1967bp的條帶。AFV102的PCR產(chǎn)物被凝膠純化，并由約翰霍普金斯大學(xué)(Baltimore,MD)的商業(yè)化測序機(jī)構(gòu)進(jìn)行測序。測序結(jié)果證實(shí)了重組的"^C::p/a4等位基因的存在。此外，定向擴(kuò)增AFV102菌株的卡那霉素抗性基因和sacB基因的PCR不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未顯示)，表明AFV102已經(jīng)經(jīng)歷了最后的等位基因交換步驟。為了評估PfoAG137Q的分泌，將AFV102和BCG1331按照上面的描述培養(yǎng)到對數(shù)期中期，通過離心移除細(xì)菌后收集培養(yǎng)上清液。為了測試上清液中PfoA的活性，將體積100mcl的不同稀釋度的培養(yǎng)上清液在96孔板中與100mcl1。/。(v/v)的綿羊紅細(xì)胞合并，輕輕混合。將板在37。C搖動保溫1小時。為了產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，將溶血素活性已知的a-溶血素(Sigma)連續(xù)稀釋液加到同樣的板中，如上進(jìn)行保溫。在保溫結(jié)束時，將板在500xg離心15分鐘。將從V形底的板獲得的上清液轉(zhuǎn)移到無菌的平底96孔板的同樣位置中，測量光密度(450nm處的吸收值減去540nm處的吸收值)。PfoA分子的溶血素活性通過測量光密度來定量，被測量的顏色強(qiáng)度與紅細(xì)胞裂解的量成正比，因此與溶血素的量成正比。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線通過內(nèi)推計(jì)算樣品中的溶血素單位值。溶血素單位被定義為50%的綿羊紅細(xì)胞被裂解的樣品的稀釋度。該分析的結(jié)果顯示出AFV102在每105個細(xì)菌中產(chǎn)生2-10個單位的溶血素活性。與PCR數(shù)據(jù)合在一起，我們得出結(jié)論，AFV102在ureC位置帶有/)/0J基因，能夠分泌Pf0A作為有功能的溶血素。此外，熒光顯微鏡顯示出PfoAG137Q能夠使重組的BCG菌株AFV102逸出內(nèi)體。首先，按照描述(Sun等，2004)通過測定被感染的巨噬細(xì)胞中的分枝桿菌克隆形成單位(cfu)測試了重組BCG菌株AFV102在J774A.1巨噬細(xì)胞類的細(xì)胞中的原位生長，感染時的重復(fù)數(shù)為10個AFV102cfu對1個J774A.1巨噬細(xì)胞。通過在J774A.1細(xì)胞感染后3小時測試細(xì)胞內(nèi)cfu的計(jì)數(shù)，確定了細(xì)胞吞噬作用的效率。隨后按照以前的描述(Sim等，2004)通過裂解細(xì)胞釋放出細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌以進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定了長期的細(xì)胞內(nèi)存活率。結(jié)果顯示，AFV102和BCG1331在J774.1細(xì)胞中顯示出難以辨別的攝入和存活率，表明PfoAG137Q的表達(dá)沒有明顯改變在巨噬細(xì)胞中的短期細(xì)胞內(nèi)存活率。此外，按照制造商的說明書使用"96孔水相細(xì)胞滴定板單溶液細(xì)胞增殖分析"試劑盒(Promega，目錄號G3580)通過測量感染的細(xì)胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH)，確定了重組菌株對J774A.1巨噬細(xì)胞(ATCCNo.ATIB-67)的細(xì)胞毒性。因此，在J774.1細(xì)胞感染后的不同時間，測量上清液中釋放的LDH的量。未感染的正常細(xì)胞被用作陰性對照。根據(jù)感染的細(xì)胞與陰性對照細(xì)胞(100%的細(xì)胞存活率)釋放的LDH的量的比值計(jì)算出活細(xì)胞的百分率。結(jié)果顯示AFV102與BCG1331的細(xì)胞毒性不能區(qū)別。最后，使用了熒光顯微鏡來確定AFV102駐留的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室，這使用了與以前描述的類似的方法(Armstrong和Hart,J.Exp.Med.，134:713-40;1971;Hasan等，MolMicrobiol25:427;1997;Via等，JBiolChem.,272:13326-13331;1997;Sun等，Mol.Microbiol.52:25-38;2004)。在感染前，按照制造商的說明書將細(xì)菌細(xì)胞與PBS中的AlexaFluor568琥珀酰亞胺酯(MolecularProbes,Eugene,OR)在室溫保溫1-1.5小時。該染料與位于細(xì)菌表面上的一級胺形成穩(wěn)定的酰胺鍵。因此，將10ml的AFV102和BCG1331培養(yǎng)物收集沉淀，重新懸浮在25mls0.625ug/ml溶于P3S(pH7.2)的AlexaFluor568中，在室溫保溫1-1.5小時以標(biāo)記細(xì)菌。然后將標(biāo)記的細(xì)菌用PBS洗3次，重新懸浮在7H9生長培養(yǎng)基中，在冰箱中儲存過夜。J774A.1細(xì)胞在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中在人類纖連蛋白包被的蓋玻片上按照以前的描述在DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(Sun等，2004)。細(xì)胞以3xl()S個細(xì)胞/孔的密度接于板中，在37。C溫箱中在5。/。C02和加濕條件下培養(yǎng)2天。在感染過程中，標(biāo)記的細(xì)菌被收集，重新懸浮在DMEM+10。/。FBS培養(yǎng)基中，以每個孔為10的感染重復(fù)數(shù)(MOI)直接加入到J774A.1細(xì)胞中。20分鐘、8小時和24小時后，細(xì)胞用室溫(RT)的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)清洗。然后用溶于PBS(pH7.2)的2%的多聚甲醛將細(xì)胞在室溫固定20分鐘。然后將固定的細(xì)胞用溶于PBS(pH7.2)的0.1%TritonX-100在室溫通透處理10分鐘，然后用PBS(pH7.2)洗兩次。阻斷在室溫進(jìn)行至少2小時或在4°C進(jìn)行過夜，使用溶于PBS(pH7.2)的3%牛血清白蛋白(BSA)、5%正常山羊血清(NGS)和0.5%疊氮化鈉。除去阻斷緩沖液，然后加入用含有1%的BSA、3%的NGS和0.5%疊氮化鈉的PBS(pH7.2)稀釋50倍的大鼠抗小鼠轉(zhuǎn)移受體-FITC(USBiological,Swampscott,MA)，然后在室溫保溫至少1小時。然后將細(xì)胞用PBS洗2-3次，用vectsheild固定介質(zhì)固定在玻璃載玻片上，使用NikonTE2000倒置顯微鏡以1500倍的放大倍數(shù)進(jìn)行分析，該顯微鏡裝備有RetigaEXI單色、12bit冷光、IR過濾的數(shù)字相機(jī)用于成像。結(jié)果顯示，在J744.1巨噬細(xì)胞(ATCCno.TIB-67)感染后24小時，75%的AFV102細(xì)菌被觀察到位于內(nèi)體之外，而只有少部分的BCG細(xì)菌被觀察到在內(nèi)體外的區(qū)室中。這些數(shù)據(jù)表明AFV102以及該菌株的衍生株將比BCG和重組的BCG-Llo+(Hess等，ProcNatlAcadSci.,95:5299-5304;1998;Grode等，ClinInvest.,115:2472-2479;2005)誘導(dǎo)更強(qiáng)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。為了在重組BCG菌株AFV102中過量表達(dá)TB抗原，與編碼Rv3804c(也稱為Ag85A)、Rvl886(也稱為Ag85B)和Rv0288(也稱為TB10.4)的序列功能上連接的為Rv3031啟動子編碼的序列被插入到pAF100的PacI位點(diǎn)中。獲得的質(zhì)粒pAF105(圖3)然后用限制性內(nèi)切酶Ndel消化以除去大腸桿菌復(fù)制子和卡那霉素抗性基因，用T4連接酶連接重新環(huán)化。該DNA(l-2mg)通過電穿孔導(dǎo)入到重組BCG菌株AFV102中。細(xì)菌在含有25-30ml固體培養(yǎng)基(Middlebrook7H10)的8.75cm平板上培養(yǎng)。在用PCR預(yù)篩以檢測帶有抗原表達(dá)質(zhì)粒的菌落之后，PfoA陽性并帶有TB抗原表達(dá)盒的選出的重組BCG菌落，被命名為AFR0-1，并在37°C下在搖動的液體培養(yǎng)基(Middlebrook7H9)中擴(kuò)增到500ml。一旦培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)后期，在500ml培養(yǎng)物中加入甘油到終濃度為10%(v/v)，主培養(yǎng)前的種子以5ml的等份試樣儲存在-80oC。BCG和重組BCG培養(yǎng)物的純度可以通過在8.75cm的含有25-30ml的固體培養(yǎng)基(Middlebrook7H10)的平板上，均勻地涂布100mcl用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的BCG培養(yǎng)物無菌稀釋液(例如每個步驟稀釋10倍，到10—s)的等份試樣來評估。質(zhì)粒DNA的PCR和限制性內(nèi)切酶分析被用于證實(shí)所需的基因型存在于每個重組BCG分離株中。此外，PCR產(chǎn)生的DNA片段通過自動化的雙脫氧核苷酸測序技術(shù)來測序，以證實(shí)全長基因的存在。為了評估帶有TB抗原表達(dá)質(zhì)粒的AFV102和AFRO-l的PfoA分泌，按照上面的描述將兩個菌株培養(yǎng)到對數(shù)期中期。按照以前的描述(Hess等，Proc.Natl.Acad.Sci.,95:5299-304;1998)收集這些培養(yǎng)物的培養(yǎng)上清液，通過0.2mm的膜過濾器進(jìn)行過濾。然后按照上面的描述評估培養(yǎng)液濾液蛋白的溶血活性。結(jié)果顯示AFV102和AFRO-I顯示出相同水平的溶血活性，AFRO-l保有"wC.v/7/《WG137Q等位基因并表達(dá)功能性PfoA蛋白。最后，評估了在10-15%的SDS-PAGE凝膠上分離的培養(yǎng)物上清液蛋白中的TB抗原的表達(dá)。結(jié)果顯示出Rv3804c和Rvl886的增加的表達(dá)。因?yàn)镽v028S預(yù)計(jì)不會在培養(yǎng)上清液中過量表達(dá)，該與Rv3804c和Rvl886在同樣的mRNA上表達(dá)的10kDa蛋白的過量表達(dá)是從Rv3804c和Rvl886被過量表達(dá)的現(xiàn)象中推斷出來的。作為一個整體，本實(shí)施例證明了產(chǎn)生既表達(dá)PfoA又過量表達(dá)TB抗原的重組BCG菌株是可能的。這樣的菌株具有用作第二代TB疫苗的潛能。實(shí)施例2.口服重組BCG疫苗配方和劑量的最優(yōu)化在測試新的雙組分TB疫苗之前，進(jìn)行了研究以確定最適的口服制劑和劑量。含有16只BALB/c小鼠的組通過胃部插管進(jìn)行接種，如表5中所示。接種后72小時，每組3只小鼠被處死，通過上述的直接平板計(jì)數(shù)法對腸、集合淋巴小結(jié)、肺和脾中的活的AFV102細(xì)菌的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。該實(shí)驗(yàn)顯示，含有包括了胃部中和成分的CeraVacx的口服制劑比不含有它們的制劑在投送活的生物體到粘膜性組織的能力方面更加有效。接種后6周，每組中的5只動物被處死，通過流式細(xì)胞分析測量了對Rv3804c、Rvl886和Rv0288的免疫反應(yīng)。簡單來說，小鼠通過頸部錯位處死，在無菌條件下通過用無菌鑷子仔細(xì)地除去附著的脂類組織收集脾臟。將脾臟在含有10mL完全RPMI培養(yǎng)基(R10;含有10%FBS(HyClone)、55/xM2-巰基乙醇、lOtnMHEPES、2mML-谷氨酰胺和lx青霉素-鏈霉素溶液(都來自Gibco)的RPMI1640)的15ml錐形紙管中清洗，通過將脾臟壓過70/mi的細(xì)胞濾器(Falcon)制備單細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞重新懸浮在15ml不完全RPMI中，以520rcf在4°C離心5分鐘。剩余的紅細(xì)胞使用每個脾臟lmlACK裂解緩沖液(BioWhittacker)在室溫裂解2分鐘。在用9mLR10培養(yǎng)基再次清洗之后，細(xì)胞被重新懸浮在3mlR10中，再次通過70/mi的細(xì)胞濾器過濾到新的15ml管中。細(xì)胞被計(jì)數(shù)，然后以15x106個細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮在R10培養(yǎng)基中。用于評估細(xì)胞因子生產(chǎn)的刺激如下進(jìn)行二甲亞砜(DMSO，Sigma)作為陰性對照，肽儲存庫在含有1/ig/mLCD28和CD49d的RIO培養(yǎng)基(LifeTechnologies)中預(yù)先稀釋。終濃度為2/zg肽/mL。佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸(O.ljug/mL)/離子霉素(4pg/mL)(PMA/I;都從Sigma購買)被用作陽性對照。在替換了96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板的適當(dāng)孔中的100Ad溶液后，加入100m1細(xì)胞懸浮液，在37°c和5%C02下保溫1小時。加入25^Golgi-Plug(在R10培養(yǎng)基中1:25稀釋)后，板再保溫4-5小時。保溫之后，將板在4。C儲存過夜，直到進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。板在4。C以350xg離心3分鐘。丟棄上清液，重新懸浮細(xì)胞，用100/ilPBS/孔清洗，在4。C以350xg離心3分鐘。在丟棄上清液并通過仔細(xì)地渦旋振蕩板來重新懸浮細(xì)胞后，在所有的孔中加入50jxl含有11FcR阻斷物(BD)的PBF(即PBS+0.5%FBS)，在冰上保溫10分鐘。用50/d含有預(yù)先滴定的抗CD4-PC5或抗CD8-PC5(BD)抗體的PBF緩沖液在4。C于暗處將細(xì)胞染色30分鐘。保溫后，細(xì)胞用150plPBF緩沖液洗兩次。為了使細(xì)胞通透化，在每個樣品孔中加入100plCytofix/Cytoperm緩沖液(BD)，在4。C于暗處保溫20分鐘。然后將板離心，用150mlPerm/清洗緩沖液(BD)清洗細(xì)胞。為了進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，將抗IFN-7(AlexaFluor488)、抗TNF-a-PE和抗IL-2-APC(都來自BD)預(yù)先在Perm/清洗緩沖液中稀釋40倍，每個孔中加入50ml，在4。C于暗處保溫30分鐘。保溫后，用150/illxPerm/清洗緩沖液將細(xì)胞清洗2次，在4°C以350xg離心3分鐘。丟棄上清液后，通過加入220ml含有1%甲醛(Sigma)的PBS將細(xì)胞固定。為了分析，在CyFlowML(Partec，Germany)流式細(xì)胞儀上從每個樣品收集100,000個靶細(xì)胞事件。所有的樣品分析使用FlowJo軟件TreeStarInc.,USA)進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)學(xué)使用Prism軟件(GraphPad，USA.)確定。每個組中剩下的8只動物在接種IO周后用MtbErdman菌株激惹，激惹通過從總共含有107cfu的激惹菌株的10ml單細(xì)胞懸浮液制成的氣溶膠來進(jìn)行。這導(dǎo)致了每個動物的肺部IOO個活細(xì)菌的劑量(Turner等，Infect.Immun.,68:3674-3679;2000;McMurray等，Infect,Immun.50:555-559;1985;Wiegeshaus等，Am,Rev.Respir.Dis.，102:422-429;1970)。激惹后，動物與未激惹的對照動物一起監(jiān)測存活率。動物也被監(jiān)測體重減輕和總體健康。激惹后5周，每組中的動物被處死用于組織病理學(xué)和微生物學(xué)分析。來自小鼠的肺和脾臟組織通過cfu計(jì)數(shù)進(jìn)行評估。因?yàn)镸tbErdman菌株被用于激惹，在培養(yǎng)基中加入TCH以辨別對TCH敏感的的疫苗菌株與激惹菌株。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了含有CeraVacx的口服制劑能夠有效提供針對Mtb激惹的保護(hù)作用。成功完成本研究之后，使用最少的疫苗生物體就能誘導(dǎo)相同的或更好的很對Mtb的免疫反應(yīng)和保護(hù)作用的疫苗被選做最適的配方和劑里。表5.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>實(shí)施例3.預(yù)防接種策略的最優(yōu)化本實(shí)驗(yàn)的目的是最優(yōu)化候選的減毒的分枝桿菌疫苗菌株AFRO-l(實(shí)施例l)在SPF雄性Hartley豚鼠(250-300克)中的引發(fā)-加強(qiáng)策略。因此，每組10只動物按照圖6中的顯示進(jìn)行預(yù)防接種，以便評估10、14和17周的引發(fā)-加強(qiáng)間隔。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>引發(fā)以0.1ml10%甘油中含有106cfu的劑量通過真皮內(nèi)給藥來進(jìn)行。對照小鼠只真皮內(nèi)給藥O.lml10%甘油。引發(fā)14周后，用雙組分TB疫苗的加強(qiáng)組分加強(qiáng)豚鼠。在第5組中，加強(qiáng)以0.1mll0。/。甘油中含有10^cfu的劑量通過真皮內(nèi)給藥來進(jìn)行。在第4和第6組中，加強(qiáng)以0.5ml10%(v/v)甘油中懸浮有107cfu并含有50%(v/v)CeraVacx的劑量通過胃內(nèi)插管來進(jìn)行。在最后一次接種后10周，動物用MtbErdman菌株的氣溶膠進(jìn)行激惹，激惹通過從總共含有107cfu的Mtb的10ml單細(xì)胞懸浮液制成的氣溶膠來進(jìn)行。該步驟象以前描述的那樣在每個動物的肺部投送了大約100個活細(xì)菌(Brodin等，2004)。激惹后5周，每個組中的動物被處死，收集肺和脾臟進(jìn)行組織學(xué)和微生物學(xué)分析。在后一種情況下，對來自豚鼠的肺和脾臟組織通過cfu計(jì)數(shù)進(jìn)行評估。因?yàn)镸tbErdman菌株被用于激惹，在培養(yǎng)基中加入TCH以辨別對TCH敏感的的疫苗菌株與激惹菌株。該研究的結(jié)果鑒定了雙組分TB疫苗的引發(fā)和加強(qiáng)組分之間的時間間隔。實(shí)施例4.在豚鼠中誘導(dǎo)保護(hù)作用為了測定候選的減毒的分枝桿菌疫苗菌株AFRO-l(實(shí)施例1)針對Mtb激惹的效能，每組8只年輕到成年的SPFHartley豚鼠(250-300克)使用表7中顯示的雙組分TB疫苗的引發(fā)成分、BCG或鹽水進(jìn)行預(yù)防接種。表7.豚鼠激惹研究設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>引發(fā)以0.1ml10%甘油中含有106cfu的劑量通過真皮內(nèi)給藥來進(jìn)行。對照小鼠只真皮內(nèi)給藥O.lml10%甘油。引發(fā)14周后，用雙組分TB疫苗的加強(qiáng)組分加強(qiáng)豚鼠。在第5組中，加強(qiáng)以0.1mll0。/。甘油中含有1(^cfii的劑量通過真皮內(nèi)給藥來進(jìn)行。在第4和第6組中，加強(qiáng)以0.5ml10%(v/v)甘油中懸浮有107cfu并含有50%(v/v)CeraVacx的劑量通過胃內(nèi)插管來進(jìn)行。在最后一次接種后14周，動物用Mtb氣溶膠進(jìn)行激惹，激惹通過從總共含有107cfu的Mtb的10ml單細(xì)胞懸浮液制成的氣溶膠來進(jìn)行；該步驟象以前描述的那樣在每個動物的肺部投送了大約100個活細(xì)菌(Brodin等，2004)。激惹后，動物與未接種的未激惹的健康動物組一起監(jiān)測存活率。動物也被監(jiān)測體重減輕和總體健康。本研究的結(jié)果證實(shí)了假接種的動物在激惹后最快死亡，用BCG真皮內(nèi)接種但沒有加強(qiáng)的動物顯示出中等的平均死亡時間，用新的雙組分TB疫苗接種的動物存活時間最長。實(shí)施例5.在非人類靈長動物中的保護(hù)作用正如以前討論的那樣，恒河猴被用作有用的模型來評估針對Mtb的疫苗。為了證實(shí)腸胃外引發(fā)之后粘膜(口服)加強(qiáng)疫苗的用處，評估了在BCG接種的非人類靈長動物中通過用口胃管投送志賀氏菌來加強(qiáng)所引發(fā)的免疫反應(yīng)，該志賀氏菌帶有為Ag85A-Ag85B-TB10.4(MSTBS3)融合蛋白編碼的重組核衣殼。恒河猴通過真皮內(nèi)使用2xl05CFU的BCG來引發(fā)，通過胃內(nèi)使用lxl01QCFU的MSTBS3來加強(qiáng)。在加強(qiáng)后2周抽取血液，用肝素處理，與特異性肽儲存庫(Ag85A/B和TB10.4)保溫7天。保溫后，細(xì)胞用針對CD4和CD8的表面特異性抗體來染色，固定在1。/。PFA中，用于流式細(xì)胞儀分析。樣品分析使用FlowJo軟件(TreeStarInc.,USA)進(jìn)行。刺激后成淋巴細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比率使用Prism軟件(GraphPad,USA.)進(jìn)行計(jì)算和分析。結(jié)果顯示在圖4中，表明BCG/MSTBS3預(yù)防接種的猴子發(fā)展除了針對Ag85A/B和TB10.4肽儲存庫和志賀氏菌全細(xì)胞裂解物(SWCL)的特異性。08+和CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，而沒有預(yù)防接種的動物沒有發(fā)展出可測量到的T細(xì)胞反應(yīng)。實(shí)施例6.標(biāo)準(zhǔn)的BCG與雙組分疫苗的比較下面描述的研究的目的是證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)的BCG疫苗與本發(fā)明的雙組分TB疫苗的效能的比較。研究包括了表8中顯示的6個組，每組10只動物。表8.非人類靈長動物中的研究<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>口服引發(fā)組分的配方在別處描述了(Adwell等，Vaccine,22:70-76;2003;Buddie等，Vaccine,23:3581-3589;2005)。加強(qiáng)在引發(fā)后17周進(jìn)行。腸胃外加強(qiáng)組分通過皮下、真皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給藥，優(yōu)選真皮內(nèi)給藥，劑量為106cfu。粘膜加強(qiáng)組分通過粘膜接種途徑給藥，優(yōu)選為口服，劑量為104-109cfu，，優(yōu)選為106-107cfu。加強(qiáng)后10周，每個組中的動物用低劑量的結(jié)核分枝桿菌Erdman菌株進(jìn)行氣溶膠激惹，通過測量在激惹后16周或動物死亡時細(xì)菌載荷的減少了測量保護(hù)作用。操作和激惹恒河猴的方法在別處有記載(Capuano等，Infect,Immun.，71:5831-5844;2003)。最后一次接種后10周，通過氣管內(nèi)安置結(jié)核分枝桿菌Erdman菌株(在3mlPBS中含有1,000cfu)來激惹動物。所有的動物在同一天用同樣的制備物進(jìn)行激惹。感染的過程通過監(jiān)測體重、直腸溫度和ESR來評估。在激惹后每隔l個月以及在激惹后26周時的最后的尸體檢驗(yàn)中，進(jìn)行胸部X-射線以檢測與肺部TB相符的異常。本研究的結(jié)果證實(shí)了假免疫的動物發(fā)展出了肺部TB(組l)，用BCG真皮內(nèi)接種兩次的動物(組2)顯示出了肺部TB的嚴(yán)重性的中等的降低，用新的雙組分TB疫苗接種的動物(組3)存活時間最長。參考文獻(xiàn)1.1993.Tuberculosis:aglobalemergency.(結(jié)核病全球的緊急事件)WorldHealthForum14:438.2.2004.WHOandUNAIDScallforjointHIV-tuberculosisaction.(WHO和UNAIDS呼吁HIV-肺結(jié)核的聯(lián)合行動)BullWorldHealthOrgan82:810.3.1993.WHOdeclarestuberculosisaglobalemergency.(WHO宣布肺結(jié)核為全球緊急事件)SozPraventivmed38:251-2,4.Arthur,丄W.,andM.R.Wilkins.2004.Usingproteomicstominegenomesequences.(使用蛋白質(zhì)組學(xué)探測基因組序列)JProteomeRes3:393-402.5.Aziz,M.A.，andA.Wright.2005.TheWorldHealthOrganization/InternationalUnionAgainstTuberculosisandLungDiseaseGlobalProjectonSurveillanceforAnti-TuberculosisDrugResistance:amodelforotherinfectiousdiseases.(世界衛(wèi)生組織/國際反結(jié)核病和肺部疾病聯(lián)盟監(jiān)督抗結(jié)核病藥物抗性的全球計(jì)劃其它傳染性疾病的模型)ClinInfectDis41Suppl4:S258-62.6.Barbosa，T.，S.Arruda，B.D.Fernandes，L.P.Carvalho,S.Cardoso,S.Cunha,M.L.Barreto,S.M.Pereira，L.C.Rodrigues,andM.Barral-Netto.2003.BCG(BacilleofCalmette-Guerin)revaccinationleadstoimprovedinvitroIFN-gammaresponsetomycobacterialantigenindependentoftuberculinsensitizationinBrazilianschool-agechildren.(在巴西的學(xué)齡兒童中BCG(卡介苗)的再次接種導(dǎo)致了不依賴于結(jié)核菌素敏化的體外針對分枝桿菌抗原的IFN-7反應(yīng)的增強(qiáng))Vaccine21:2152-60.7.Belyakov，I.M.,J.D.Ahlers，B.Y.Brandwein，P.Earl，B.L.Kelsall,B.Moss,W.Strober,andJ.A.Berzofsky.1998.TheimportanceoflocalmucosalHIV-specificCD8(+)cytotoxicTlymphocytesforresistancetomucosalviraltransmissioninmiceandenhancementofresistancebylocaladministrationofIL-12.(局部的粘膜的HIV特異性的CD8(+)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對于小鼠中對粘膜性病毒傳播的抗性和通過局部使用IL-12增強(qiáng)抗性的重要性)J.Clin.Invest.102:2072-2081.8.Belyakov,I.M.，M.A.Derby,J.D.Ahlers，B.L.Kelsall,P.Earl，B.Moss,W.Strober,andJ.A.Berzofsky.1998.MucosalimmunizationwithHIV-lpeptidevaccineinducesmucosalandsystemiccytotoxicTlymphocytesandprotectiveimmunityinmiceagainstintrarectalrecombinantHIV-vacciniachallenge.(使用HIV-1肽疫苗進(jìn)行粘膜接種在小鼠中誘導(dǎo)了粘膜和全身性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和針對直腸內(nèi)用重組HIV-牛痘進(jìn)行的激惹的保護(hù)性免疫)Proc.Natl.Acad.Sci.95:1709-1714.9.Belyakov,I.M.，Z.Hel，B.Kelsall,V.A.Kuznetsov,J.D.Ahlers，J.Nacsa,D.I.Watkins，T.M.Allen,A.Sette，J.Altman，R.Woodward,P.D.Markham，J.D.Clements,G.Franchini,W.Strober,andJ.A.Berzofsky.2001.MucosalAIDSvaccinereducesdiseaseandviralloadingutreservoirandbloodaftermucosalinfectionofmacaques.(粘膜AIDS疫苗在粘膜感染恒河猴后減輕了疾病并降低了內(nèi)臟儲存庫和血液中的病毒載荷)Nat.Med.7:1320-1326.10.Belyakov,I.M.,B.Moss,W.Strober，andJ.A.Berzofsky.1999.Mucosalvaccinationovercomesthebarriertorecombinantvacciniaimmunizationcausedbypreexistingpoxvirusimmunity.(禾占膜預(yù)P方接禾中克服了由預(yù)先存在的痘病毒免疫所引起的重組牛痘免疫接種的障礙)ProcNatlAcadSciUSA96:4512-7.11.Boyton,R.J.2005.InfectiouslungcomplicationsinpatientswithHIV/AIDS.(在患有HIV/AIDS的病人中的傳染性肺部并發(fā)癥)CurrOpinPulmMed11:203-7.12.Brandt,L.，MElhay,I.Rosenkrands，E.B.Lindblad，andP.Andersen.2000.ESAT-6subunitvaccinationagainst腳co6ac&n'應(yīng)fw&emi〖0^.(ESAT—針對結(jié)核分枝桿菌的6個亞基的疫苗)InfectImmun68:791-5.13.Brandt,L.，J.FeinoCunha，A.WeinreichOlsen,B.Chilima,P.Hirsch,R.Appelberg,andP.Andersen.2002.FailureoftheM少coZjfl"en'謂Z頻'jBCGvaccine:somespeciesofenvironmentalmycobacteriablockmultiplicationofBCGandinductionofprotectiveiimnimitytotuberculosis.(牛分枝桿菌BCG疫苗的失敗環(huán)境中的分枝桿菌的某些種類阻斷了BCG的繁殖和對結(jié)核病的保護(hù)性免疫的誘導(dǎo))InfectImmun70:672-8.14.Brandt,L.，Y.A.Skeiky,M.R.Alderson，Y.Lobet,W.Dalemans,O.C.Turner,R.J.Basaraba,A.A.Izzo，T.M.Lasco，P.LChapman,S.G.Reed,andI.M.Orme.2004.TheprotectiveeffectoftheMycobacteriumbovisBCGvaccineisincreasedbycoadministrationwiththeMjcoZmcfm'ww勵ercw/o"'s72-kilodaltonfusionpolyproteinMtb72FinM.tuberculosis-infectedguineapigs.(在結(jié)核病感染的豚鼠中牛分枝桿菌BCG疫苗的保護(hù)性效果被同時給藥結(jié)核分枝桿菌的72Kda的融合同基因多蛋白Mtb72F所增強(qiáng))InfectImmun72:6622-32.15.Chadha,V.K.2005.TuberculosisepidemiologyinIndia:areview.(印度的結(jié)核病流行病學(xué)綜述)IntJTubercLungDis9:1072-82.16.Chintu，C.，andP.Mwaba.2005.Tuberculosisinchildrenwithhumanimmunodeficiencyvirusinfection.(,患有人類免疫缺i5自病毒感染的兒童中的結(jié)核病)InUTubercLungDis9:477-84.17.Cole,S.T.2002.Comparativemycobacterialgenomicsasatoolfordrugtargetandantigendiscovery.(分枝桿菌的比較基因組學(xué)作為藥物靶和抗原發(fā)現(xiàn)的工具)EurRespirJSuppl36:78s-86s.18.Cole,S.T.，R.Brosch,J.Parkhm，T.Gamier,C.Churcher，D.Harris,S.V.Gordon,K.Eiglmeier,S.Gas,C.E.Barry，3rd，F(xiàn).Tekaia,K.Badcock，D.Basham,D.Brown,T.Chillingworth，R.Connor,R.Davies,K.Devlin,T.Feltwell,S.Gentles，N.Hamlin,S.Holroyd，T.Hornsby,K.Jagels，A.Krogh,J,McLean,S.Moule,L.Murphy,K.Oliver,J.Osborne,M.A.Quail,M.A.Rajandream,J.Rogers,S.Rutter，K.Seeger,J.Skelton:R.Squares,S.Squares,J.E.Sulston,K.Taylor,S.Whitehead,andB.G.Barrell.1998.DecipheringthebiologyofM少co^c&n'簡似&ercw/c^/sfromthecompletegenomesequence.(從全基因組序列解譯結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué))Nature393:537-44.19.deJonge，M.I.，R.Brosch，P.Brodin，C.Demangel，andS.T.Cole.2005.Tuberculosis:fromgenometovaccine.(結(jié)核病從基因組到疫苗)ExpertRevVaccines4:541-51.20.Demangel，C.，T.Gamier,I.Rosenkrands,andS.T.Cole.2005.DifferentialeffectsofpriorexposuretoenvironmentalmycobacteriaonvaccinationwithAfycoZ^Cen',Zov;^BCGorarecombinantBCGstrainexpressingRD1antigens.(預(yù)先暴露于環(huán)境分枝桿菌對牛分枝桿菌BCG或表達(dá)RDl抗原的重組BCG菌株的預(yù)防接種的不同的影響)InfectImmun73:2190-6.21.Dietrich,J,，C.Aagaard，R.Leah，A.W.OIsen,A.Stryhn,T.M.Doherty，andP.Andersen.2005.ExchangingESAT6withTB10.4inanAg85Bfusionmolecule-basedtuberculosissubunitvaccine:efficientprotectionandESAT6-basedsensitivemonitoringofvaccineefficacy.(在基于Ag85B融合分子的結(jié)核病亞基疫苗中用TB10.4交換ESAT6:有效的保護(hù)作用和對于疫苗效能的基于ESAT6的敏感性監(jiān)測)JImmunol174:6332-9.22.Dobos,K.M.，J.S.Spencer，I.M.Orme,andJ.T.Belisle.2004.Proteomicapproachestoantigendiscovery.(抗原發(fā)i見的蛋白質(zhì)組學(xué)方法)MethodsMolMed94:3-17.23.Dourado，I.，M.H.Rios，S.M.Pereira，S.S.Cunha,M.Y.Ichihara，J.C.Goes,L.C.Rodrigues,A.L.Bierrenbach,andM.LBarreto.2003.RatesofadversereactionstofirstandseconddosesofBCGvaccination:resultsofalargecommunitytrialinBrazilianschoolchildren.(第一和第二劑BCG預(yù)防接種的負(fù)反應(yīng)比率在巴西學(xué)齡兒童中的大社區(qū)試驗(yàn)的結(jié)果)IntJTubercLungDis7:399-402.24.Dye,C.,C.J,Watt,D.M.Bleed,S.M.Hosseini,andM.C.Raviglione.2005.Evolutionoftuberculosiscontrolandprospectsforreducingtuberculosisincidence,prevalence,anddeathsglobally.(結(jié)核病控制的演進(jìn)以及全球性降低結(jié)核病發(fā)病率、流行性和死亡率的前景)Jama293:2767-75.25.Edwards,K.M.，M.H.Cynamon,R.K.Voladri,C.C.Hager，M.S.DeStefano,K.T.Tham，D.L.Lakey，M.R.Bochan,andD.S.Kernodle.2001.Iron-cofactoredsuperoxidedismutaseinhibitshostresponsestoAfyco^"en'wm^>em^o&.(鐵作為輔助因子的超氧化物歧化酶抑制宿主對結(jié)核分枝桿菌的反應(yīng))AmJRespirCritCareMed164:2213-9.26.Elzinga,G.,M.C.Raviglione,andD.Maher.2004.Scaleup:meetingtargetsinglobaltuberculosiscontrol,(規(guī)模放大在全球結(jié)核病控制中遇到了目標(biāo))Lancet363:814-9.27.Gentschev，I.,Z.Sokolovic,H.丄Mollenkopf,J.Hess，S.H.Kaufma叫M.Kuhn,G.F.Krohne,andW.Goebel.1995.Salmonellastrainsecretingactivelisteriolysinchangesitsintracellularlocalization.(沙門氏菌屬菌株分泌的活性李斯特菌溶胞素改變了它的細(xì)胞內(nèi)定位)Infect.Immun.63:4202-4205.28.Goonetilleke，N.P.，H.McShane，C.M.Hannan,R.丄Anderson,R.H.Brookes,andA.V.Hill.2003.EnhancedimmunogenicityandprotectiveefficacyagainstMycobacteriumtuberculosisofbacilleCalmette-GuerinvaccineusingmucosaladministrationandboostingwitharecombinantmodifiedvacciniavirusAnkara,(使用重組修改的牛痘病毒安卡拉株進(jìn)行粘膜給藥和加強(qiáng)增加了針對卡介苗疫苗的結(jié)核分枝桿菌的免疫原性和保護(hù)性效能)JImmunol171:1602-9.29.Grode，L.,M.Kursar，J.Fensterle,S.H.Kaufmann，andJ.Hess.2002.Cell-mediatedimmunityinducedbyrecombinantMycobacteriumbovisBacilleCalmette-Guerinstrainsagainstanintracellularbacterialpathogen:importanceofantigensecretionormembrane-targetedantigendisplayaslipoproteinforvaccineefficacy.(重組牛分枝桿菌卡介苗菌株誘導(dǎo)的針對細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原體的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抗原分泌或膜定位的抗原展示作為脂蛋白對于疫苗效能的重要性)JImmunol168:1869-76.30.Herremans，T.M.,J.H.Reimerink，A.M.Buisman，T.G.Kimman，andM.P.Koopmans.1999.Inductionofmucosalinununitybyinactivatedpoliovinisvaccineisdependentonpreviousmucosalcontactwithlivevirus.(通過失活的痘病毒疫苗誘導(dǎo)粘膜免疫依賴于以前與活的病毒的粘膜接觸)J.Immunol.162:5011-5018.31.Hess,J.,D.Miko,A.Catic,V.Lehmensiek,D.G.Russell,andS.H.Kaufmann.1998.M少co6a"e"'"w6ovhBadlleCalmette-GuerinstrainssecretingIisteriolysinof"/en'"zwo"oc,ge"ey.(分泌單核細(xì)胞增多性李斯特桿菌的李斯特菌溶胞素的牛分枝桿菌卡介苗菌株)ProcNatlAcadSciUSA95:5299-304.32.Hondalus，M.K.,S.Bardarov，R.Russell,J.Chan,W.R.Jacobs,Jr.，andB.R.Bloom.2000.AttenuationofandprotectioninducedbyaleucineauxotrophofMyco&acfm'wmfw6ercw/os〖s.(結(jié)核分枝桿菌的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型的減毒作用和誘導(dǎo)的保護(hù)作用)InfectImmun68:2888-98.33.Horwitz，M.A.，andG.Harth.2003.Anewvaccineagainsttuberculosisaffordsgreatersurvivalafterchallengethanthecurrentvaccineintheguineapigmodelofpulmonarytuberculosis.(針對結(jié)核病的新疫苗在肺結(jié)核豚鼠模型中比現(xiàn)有疫苗在激惹后提供了更高的存活率)InfectImmun71:1672-9.34.Horwitz,M.A.,G.Harth，B.J.Dillon,andS.Maslesa隱Galic.2005.EnhancingtheprotectiveefficacyofMycoZ)a"e"'Mm6oWsBCGvaccinationagainsttuberculosisbyboostingwiththeMyco6"Ce/7'w"Aercw/os&majorsecretoryprotein.(通過用結(jié)核分枝桿菌的主要分泌蛋白進(jìn)行加強(qiáng)來增加牛分枝桿菌BCG預(yù)防接種對結(jié)核病的保護(hù)性效能)InfectImmun73:4676-83.35.Horwitz，M.A.，G.Harth,B.J.Dillon,andS.Maslesa-Galic.2000.Recombinantbacilluscalmette-guerin(BCG)vaccinesexpressingtheM少co6aCm'蘭勵em/Zo^30-kDamajorsecretoryproteininducegreaterprotectiveimmunityagainsttuberculosisthanconventionalBCGvaccinesinahighlysusceptibleanimalmodel.(表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的30kDa的主要分泌蛋白的重組卡介苗(BCG)疫苗在高度易感的動物模型中誘導(dǎo)了比常規(guī)的BCG疫苗更高的針對結(jié)核病的保護(hù)性免疫)ProcNatlAcadSciUSA97:13853-8.36.Horwitz，M.A.，B.W.Lee,B.J.Dillon,andG.Harth.1995.Protectiveimmunityagainsttuberculosisinducedbyvaccinationwithmajorextracellularproteinsof綺o6fl"m'謂勵e7-CM/oi(使用結(jié)核分枝桿菌的主要細(xì)胞外蛋白進(jìn)行預(yù)防接種誘導(dǎo)的針對結(jié)核病的保護(hù)性免疫)ProcNatlAcadSciUSA92:1530-4.37.Huygen,K.,J.Content,O.Denis,D.L.Montgomery,A.M.Yawman,R.R.Deck,C.M.DeWitt，I.M.O應(yīng)，S.Baldwin,C.D'Souza,A.Drowart，E.Lozes，P.Vandenbussche，J.P.VanVooren，M.A.Liu，andJ.B.Ulmer.1996.ImmunogenicityandprotectiveefficacyofatuberculosisDNAvaccine.(結(jié)核病DNA疫苗的免疫原性和保護(hù)性效能)NatMed2:893-8.38.Irwin，S.M.，A.A.Izzo，S.W.Dow,Y.A.Skeiky，S.G.Reed，M.R.Alderson，andI.M.Orme.2005.Trackingantigen-specificCD8TlymphocytesinthelungsofmicevaccinatedwiththeMtb72Fpolyprotein.(在用Mtb72F同基因多蛋白預(yù)防接種的小鼠的肺中跟蹤抗原特異性CD8T淋巴細(xì)胞)InfectImmun73:5809-16.39.Kantele,A.，M.Hakkinen，Z.Moldovea叫A.Lu，E.Savilahti，R.D.Alvarez,S.Michalek，andJ.Mestecky.1998.DifferencesinimmuneresponsesinducedbyoralandrectalimmunizationswithiS"fl/mowe〃a妙A(yù)/Ty21a:evidenceforcompartmentalizationwithinthecommonmucosalimmunesysteminhumans.(用傷寒沙門氏菌Ty21a進(jìn)行口部和直腸接種誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)的差別人類中共同粘膜免疫系統(tǒng)中的區(qū)域化的證據(jù))Infect.Immun.66:5630-5635.40.Kita，Y.,T.Tanaka，S.Yoshida,N.Ohara,Y.Kaneda,S.Kuwayama，Y.Muraki，N.Kanamaru,S.Hashimoto,H.Takai，C.Okada,Y.Fukunaga，Y.Sakaguchi,I.Furukawa,K.Yamada，Y.Inoue,Y.Takemoto,M.Naito,T.Yamada，M.Matsumoto，D.N.McMurray，E.C.Cruz，E.V.Tan,R.M.Abalos，J.A.Burgos，R.Gelber,Y.Skeiky,S.Reed,M.Sakatani，andM.Okada.2005.NovelrecombinantBCGandDNA-vaccinationagainsttuberculosisinacynomolgusmonkeymodel.(在食蟹猴模型中針對結(jié)核病的新的重組BCG和DNA疫苗接種)Vaccine23:2132-5.41.Kutteh,W.H.，A.Kantele，Z.Moldoveanu,P.A.Crowley-Nowick，andJ.Mestecky.2001.InductionofspecificimmuneresponsesinthegenitaltractofwomenafteroralorrectalimmunizationandrectalboostingwithSi3/附owe〃(2妙/u'Ty21avaccine.(在用傷寒沙門氏菌Ty21a疫苗口部和直腸免疫和直腸加強(qiáng)后在婦女的生殖道中特異性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo))JReprodImmunol52:61-75.42.Langermans，J.A.，T.M.Doherty，R.A.Verveime，T.vanderLaan，K.Lyashchenko,R.Greenwald,E.M.Agger，C.Aagaard，H.Weiler,D.vanSoolingen，W.Dalemans，A.W.Thomas,andP.Andersen.2005.ProtectionofmacaquesagainstMyco6a"紹'聽勵ercw/c^infectionbyasubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85BandESAT-6.(基于抗原85B和ESAT-6的融合蛋白的亞基疫苗對恒河猴針對結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)作用)Vaccine23:2740-50.43.Maher，D.，A.Harries,andH.Getahun.2005.TuberculosisandHIVinteractioninsub-SaharanAfrica:impactonpatientsandprogrammes;implicationsforpolicies.(撒哈拉以南非洲的結(jié)核病與HIV的相互作用對病人和計(jì)劃的影響；對政策的暗示)TropMedIntHealth10:734-42.44.Maher，D.,andM.Raviglione.2005.Globalepidemiologyoftuberculosis.(結(jié)核病的全球流行病學(xué))ClinChestMed26:167-82,v.45.McShane,H.，A.A.Pathan，C.R.Sander,N.P.Goonetilleke,H.A.Fletcher,andA.V.Hill.2005.BoostingBCGwithMVA85A:thefirstcandidatesubunitvaccinefortuberculosisinclinicaltrials.(用MVA85A加強(qiáng)BCG:臨床實(shí)驗(yàn)中的第一個用于結(jié)核病的候選亞基疫苗)Tuberculosis85:47-52.46.McShane,H.，A.A.Pathan，C.R.Sander,S.M.Keating,S.C.Gilbert,K.Huygen，H.A.Fletcher,andA.V.Hill.2004.RecombinantmodifiedvacciniavirusAnkaraexpressingantigen85AboostsBCG-primedandnaturallyacquiredantimycobacterialimmunityinhumans.(表達(dá)抗原85A的重組修改的牛痘病毒安卡拉株在人類中加強(qiáng)了BCG引發(fā)的和天然獲得的抗分枝桿菌免疫)NatMed10:1240-4.47.Olsen，A.W.，P.R.Hansen,A.Holm,andP.Andersen.2000.EfficientprotectionagainstMycobacteriumtuberculosisbyvaccinationwithasinglesubdorainantepitopefromtheESAT-6antigen.(使用來自ESAT-6抗原的單一亞顯性抗原決定簇進(jìn)行預(yù)防接種產(chǎn)生的針對結(jié)核分枝桿菌的有效的保護(hù)作用)EurJImmunol30:1724-32.48.Olsen,A.W.,A.Williams,L.M.Okkels,G.Hatch,andP.Andersen.2004.Protectiveeffectofatuberculosissubmiitvaccinebasedonafusionofantigen85BandESAT-6intheaerosolguineapigmodel.(基于抗原85B和ESAT-6的融合蛋白的結(jié)核病亞基疫苗在氣溶膠豚鼠模型中的保護(hù)性效果)InfectImmun72:6148-50.49.Pal,P.G.，andM.A.Horwitz.1992.ImmunizationwithextracellularproteinsofMycobacteriumtuberculosisinducescell-mediatedimmuneresponsesandsubstantialprotectiveimmunityinaguineapigmodelofpulmonarytuberculosis.(使用結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞外蛋白進(jìn)行預(yù)防接種在肺結(jié)核豚鼠模型中誘導(dǎo)了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和基本上保護(hù)性的免疫)InfectImmun60:4781-92.50.Palendira,U,,J.M.Spratt,W.J.Britton,andJ.A.Triccas.2005.ExpandingtheantigenicrepertoireofBCGimprovesprotectiveefficacyagainstaerosolM少co6a"en'薩勵ercw/os^infection.(擴(kuò)增BCG的抗原儲存庫增加了針對氣溶膠結(jié)核分枝桿菌感染的保護(hù)性效能)Vaccine23:16S0-5.51.Park,H.D.,K.M.Guinn，M.I.Harrell，R.Liao,M.I.Voskuil,M.Tompa，G.K.Schoolnik，andD.R.Sherman.2003.Rv3133c/dosRisatranscriptionfactorthatmediatesthehypoxicresponseofM_yco6<3de"'wm(Rv3133c/dosR是介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌的低氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子)MolMicrobiol48:833-43.52.Portnoy,D.A.,R.K.Tweten,M.Kehoe，andJ.Bielecki.1992.CapacityoflisteriolysinO，streptolysinO,andperfringolysinOtomediategrowthof5ac飾51withinmammaliancells.(李斯特菌溶胞素O、鏈球菌溶血素O和perfringolysinO介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中枯草芽孢桿菌的生長的能力)InfectImmun60:2710-7.53.Pym,A.S.，P.Brodin，L.Majlessi，R.Brosch，C.Demangel,A.Williams,K.E.Griffiths,G.Marchal,C.Leclerc，andS.T.Cole.2003.RecombinantBCGexportingESAT-6confersenhancedprotectionagainsttuberculosis.(輸出ESAT-6的重組BCG賦予了針對結(jié)核病的增強(qiáng)的保護(hù)作用)NatMed9:533-9.54.Rodrigues，L.C.，S.M.Pereira，S.S.Cunha,B.Genser，M.Y.Ichihara,S.C.deBrito，M.A.Hijjar,I.Dourado,A.A.Cruz,C.Sant'Anna,A.L.Bierrenbach,andM.L.Barreto.2005.EffectofBCGrevaccinationonincidenceoftuberculosisinschool-agedchildreninBrazil:theBCG-REVACcluster-randomisedtrial.(BCG重新接種在巴西學(xué)齡兒童中對結(jié)核病發(fā)病率的影響B(tài)CG-REVAC的分組隨機(jī)化試驗(yàn))Lancet366:1290-5.55.Russell,M.W.,Z.Moldoveanu,P.L.White,G.J.Sibert,丄Mestecky，andS.M.Michalek.1996.Salivary,nasal，genital,andsystemicantibodyresponsesinmonkeysimmunizedintranasallywithabacterialproteinantigenandtheCholeratoxinBsubunit.(在用細(xì)菌蛋白抗原禾口霍亂毒素B亞基進(jìn)行鼻內(nèi)接種的猴子中的唾液、鼻、生殖道和全身性抗體反應(yīng))InfectImmun64:1272-83.56.Sambandamurthy,V.K.，X.Wang，B.Chen,R.G.Russell,S.Derrick,F.M.Collins,S.L.Morris,andW.R.Jacobs,Jr.2002.ApantothenateauxotrophofM;/coZ)i3cfm'謂fw&ercw/057jishighlyattenuatedandprotectsmiceagainsttuberculosis.(泛酸鹽營養(yǎng)缺陷型結(jié)核分枝桿菌是高度減毒的并針對結(jié)核病保護(hù)小鼠)NatMed8:1171-4.57.Sampson,S.L.,C.C.Dascher，V.K.Sambandamurthy，R.G.Russell,W.R.Jacobs,Jr.，B.R.Bloom,andM.K.Hondalus.2004.ProtectionelicitedbyadoubleleucineandpantothenateauxotrophofA(yco6ac加,鵬f由rcw/os^inguineapigs.(結(jié)核分枝桿菌的亮氨酸禾口泛酸鹽雙重營養(yǎng)缺陷型在豚鼠中引發(fā)的保護(hù)作用)InfectInnmm72:3031-7.58.Schnappinger,D.，S.Ehrt，M.I.Voskuil,Y.Liu,J.A.Mangan,I.M.Monahan，G.Dolganov,B.Efron，P.D.Butcher,C.Nathan,andG.K.Schoolnik.2003.TranscriptionalAdaptationofAfyco6flc/eW畫勵exw/osfswithinMacrophages:InsightsintothePhagosomalEnvironment.(結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄適應(yīng)性對吞噬體環(huán)境的了解)JExpMed198:693-704,59.Sharma，D.C.2004.Tuberculosiscontrolgoalsunlikelytobemetby2005.(到2005年不可能達(dá)到結(jié)核病的控制貝標(biāo))Lancet363:1122.60.Skeiky，Y.A"M.R.Alderson,P.J.Ovendale，J.A.Guderian,L.Brandt,D.C.Dillon,A.Campos-Neto，Y.Lobet,W.Dalemans,I.M,Orme，andS.G.Reed.2004.Differentialimmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedbycomponentsofatuberculosispolyproteinvaccine,Mtb72F，deliveredasnakedDNAorrecombinantprotein.(以裸露的DNA或重組蛋白的形式投送的結(jié)核病同基因多蛋白疫苗Mtb72F的組分誘導(dǎo)的不同的免疫反應(yīng)和保護(hù)性效能)JImmunol172:7618-28.61.Taelman，H.，J.Batungwanayo，J.Clerinx,A.Kagame,J.Bogaerts,S.Alien,andP.VandePerre.1991.RiskoftuberculosisamongwomenofchildbearingagewithHIVinfectioninZaire.(扎伊爾被HIV感染的育齡婦女中結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn))AmRevRespirDis144:1219-20.62.Tanghe，A.，S.D'Souza,V.Rosseels,O.Denis,T,H.Ottenhoff，W.Dalemans，C.Wheeler,andK.Huygen，2001.ImprovedimmunogenicityandprotectiveefficacyofatuberculosisDNAvaccineencodingAg85byproteinboosting.InfectImmun69:3041-7.63.Thillagavathie，P.2000.Currentissuesinmaternalandperinataltuberculosis:impactoftheHIV-1epidemic.(母親和圍產(chǎn)期結(jié)核病中的當(dāng)前問題HIV-1流行的影響)SeminNeonatol5:189-96.64.Urquhart,B.L.，T.E.Atsalos,D.Roach,D.J.Basseal，B.Bjellqvist,W.L.Britton，andI.Humphery-Smith.1997.'Proteomiccontigs'ofAf少coZj(3cfen'w附fw6ercw/os/sandAfyco6acfenfw附6ow's(BCG)usingnovelimmobilisedpHgradients.(使用新的固定的pH梯度的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌(BCG)的"蛋白質(zhì)組毗連序列群")Electrophoresis18:1384-92.65.Vallejo，J.G.,andJ.R.Starke.1992.Tuberculosisandpregnancy.(結(jié)核病與妊娠)ClinChestMed13:693-707.66.Voskuil，M.I.，D.Schnappinger,R.Rutherford,Y.Liu，andG.K.Schoolnik.2004.RegulationoftheMycofca"m'簡fw6ercw/os7'sPE/PPEgenes.(結(jié)核分枝桿菌的PE/PPE基因的調(diào)控)Tuberculosis(Edinb)84:256-62.67.WeinrichOlsen，A.，L.A.vanPinxteren，L.MengOkkels，P.BirkRasmussen,andP.Andersen.2001.Protectionofmicewithatuberculosissubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85bandesat-6.(基于抗原85b和esat-6的融合蛋白的結(jié)核病亞基疫苗對小鼠的保護(hù)作用)InfectImmun69:2773-8.盡管已經(jīng)根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將會意識到，本發(fā)明可以在權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行.修改而仍然能夠?qū)崿F(xiàn)。因此，本發(fā)明不應(yīng)該被限制于上述的實(shí)施方案，而應(yīng)該進(jìn)一步包括在本文提供的描述的精神和范圍內(nèi)的所有修改及其等效物。權(quán)利要求1.在宿主中引發(fā)針對活的、減毒的分枝桿菌或分枝桿菌抗原的全身性和粘膜性免疫反應(yīng)的方法，包括下列步驟給該宿主腸胃外給用第一種抗原性組合物，其含有該活的、減毒的分枝桿菌或該分枝桿菌抗原、或帶有為該分枝桿菌抗原編碼的核酸的載體或細(xì)菌；以及給該宿主粘膜給用第二種抗原性組合物，其含有該活的、減毒的分枝桿菌或該分枝桿菌抗原、或帶有為該分枝桿菌抗原編碼的核酸的載體或細(xì)菌，該第二種抗原性組合物與該第一種抗原性組合物不同；其中該腸胃外給用和粘膜給用的步驟導(dǎo)致在該宿主中同時誘導(dǎo)了針對該活的、減毒的分枝桿菌或該分枝桿菌抗原的全身性和粘膜性免疫反應(yīng)。2.權(quán)利要求l中的方法，其中該活的、減毒的分枝桿菌選自牛分枝桿菌(M_ycoZa"en'wm6ow's)、BCG、鳥分枝桿菌復(fù)合物(M少co6fl"e"'謹(jǐn)avf謹(jǐn)complex)、堪薩斯氏分枝桿菌(MA:aw51057》、摩爾分枝桿菌r"M.ma/moe"",猿分枝桿菌「M^rn'ae,蘇爾加分枝桿菌fM^M/ga!;;、蟾分枝桿菌fM;ce"叩z;;、瘰痢分枝桿菌卩M■ycro/w/iaceMm^)、胺月中分枝桿菌廣M.a6sce5^iwj、龜分枝桿菌fM.cAe/o"ae,嗜血分枝桿菌fM./^emc^/2//"/^、潰瘍分枝桿菌^f.w/cem"^，和海分枝桿菌「Mmfl"'打wm入3.權(quán)利要求1中的方法，其中該帶有為該分枝桿菌抗原編碼的核酸的細(xì)菌是志賀氏菌屬細(xì)菌。4.權(quán)利要求l中的方法，其中該為該分枝桿菌抗原編碼的載體是腺病毒載體。5.權(quán)利要求l中的方法，其中該活的、減毒的分枝桿菌含有為選自以下的部分編碼的DNA:外源免疫原，內(nèi)源免疫原，佐劑，細(xì)胞因子，前凋亡劑，和過量表達(dá)的Mtb抗原。6.權(quán)利要求l中的方法，其中該粘膜給用的步驟是在該腸胃外給用的步驟之前通過口服完成的。全文摘要本發(fā)明提供了用于有效地誘導(dǎo)針對病原性分枝桿菌的粘膜和全身性免疫的疫苗組合物。提供了預(yù)防接種的方法，其中給宿主使用了腸胃外的和粘膜的疫苗劑型。腸胃外的和粘膜的疫苗劑型含有活的、減毒的分枝桿菌。文檔編號C12N1/20GK101432016SQ200680052602公開日2009年5月13日申請日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日發(fā)明者大衛(wèi)·邁克爾·霍恩,杰拉爾德·C·薩多夫申請人:Aeras全球Tb疫苗基金會