專利名稱：玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程和遺傳育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
玉米淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，其中直鏈淀粉約占24％，直鏈淀粉約占76％。玉米淀粉是重要工業(yè)原料，用途廣泛，涉及到食品、醫(yī)療、紡織、造紙、包裝、石油、環(huán)保、光纖、電子芯片等行業(yè)。
淀粉在不同領(lǐng)域中的應(yīng)用取決于其分子結(jié)構(gòu)。淀粉分子結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)包括直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例；直鏈淀粉的聚合度；支鏈淀粉分支鏈長及分布等等，這些參數(shù)影響淀粉加工的理化和功能特性。其中，直/支比是淀粉分子結(jié)構(gòu)最重要的分子結(jié)構(gòu)參數(shù)，一般普通玉米淀粉直/支比為1∶3，直/支比大于1的是高直鏈淀粉。高直鏈淀粉具有更快的凝膠化作用，凝膠強(qiáng)度高，作為食品添加劑在改善食品的質(zhì)地和結(jié)構(gòu)方面具有獨特的效果。許多類型的膠卷中使用高直鏈淀粉，是因為其具有獨特的透明性、柔韌性、拉伸強(qiáng)度及防水性。目前人們對環(huán)保日益關(guān)注，高直鏈淀粉生產(chǎn)的可再生、可降解塑料膜可以減少工業(yè)廢氣及減弱溫室效應(yīng)氣體的釋放，是解決目前嚴(yán)重的“白色污染”的有效途徑，正日益引起人們的興趣。支鏈淀粉具有更好的黏性，可增加膨化食品的體積，作為食品添加劑具有不同于直鏈淀粉的效果，在粘合劑領(lǐng)域具有較多的應(yīng)用。此外，那些介于直鏈淀粉和支鏈淀粉之間的中間成分，其淀粉分支鏈的長度和分支程度等物理參數(shù)有所不同，可能會有不同的理化性質(zhì)，因而有著不同的用途。當(dāng)天然淀粉滿足不了某一功能需求時，就需要對淀粉實行化學(xué)改性，而這些加工過程會增加耗費、加重環(huán)境污染。另一產(chǎn)生具有不同理化特性淀粉的途徑就是從遺傳上改變淀粉的代謝途徑。隨著淀粉合成過程中相關(guān)酶基因的克隆以及各種植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的相繼建立，使利用基因工程調(diào)控淀粉合成過程，改良淀粉品質(zhì)成為可能，為創(chuàng)造新型淀粉提供有效的手段。
玉米籽粒直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成過程受到一系列酶的調(diào)控。淀粉分支酶(SBE)是淀粉生物合成過程中的一個關(guān)鍵酶，它催化葡萄糖以α-(1，6)鍵連接，形成分支結(jié)構(gòu)。玉米SBE有三種同工酶SBE I、SBE IIb主要在胚乳中存在，SBE IIa主要在葉片中存在，也在胚乳中存在，它們共同參與支鏈淀粉的合成。雖然SBE IIa和SBE IIb分子量接近80KD，氨基酸組成及酶切圖譜也相似，但因SBE IIa含有49個氨基酸的N端延伸和基本序列區(qū)的差異而與SBE IIb有所差異。正是結(jié)構(gòu)的差異使它們在支鏈淀粉合成中起不同作用。SBE I作用的底物是直鏈淀粉，它能使較長的糖苷鏈轉(zhuǎn)移到直鏈淀粉上，但轉(zhuǎn)移到支鏈淀粉上的能力很弱。SBE I在直鏈上產(chǎn)生分支的效率是在支鏈上產(chǎn)生分支的十倍以上；與之相反，SBE II作用的底物是支鏈淀粉，能使較短的糖苷鍵轉(zhuǎn)移到支鏈淀粉上，而且SBE IIa的活性大大高于SBE IIb，其編碼基因的突變(玉米ae突變體)可使玉米胚乳中直鏈淀粉的含量達(dá)到50％。玉米sbe IIa基因在不同遺傳背景下對直鏈淀粉的含量的效應(yīng)明顯不同，可以使直鏈淀粉的含量達(dá)到20％到70％。
玉米直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量比例影響著淀粉粒的結(jié)構(gòu)和特點，進(jìn)而影響著淀粉的質(zhì)量、功能和應(yīng)用領(lǐng)域，改變淀粉結(jié)構(gòu)有著很多潛在的應(yīng)用價值。高支鏈、低直鏈或低支鏈、高直鏈的淀粉都有著廣泛的工業(yè)用途。利用活體方法產(chǎn)生的新淀粉類型，收割后無需化學(xué)或酶法處理，如淀粉分支點的去除、糖鏈的水解及化學(xué)修飾。因此，在新品種選育時，這已成為育種工作者考慮的重要方面。
RNA干擾作用(RNA interference，RNAi)是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引起與其同源的mRNA特異性降解，因而抑制其相應(yīng)基因表達(dá)的過程，是基因轉(zhuǎn)錄后沉默作用(posttranscriptional gene silencing，PTGS)的重要機(jī)制之一。
RNA干擾的主要過程可分為兩個階段第一階段是起始階段，由于RNA病毒感染，轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄和外源導(dǎo)入基因表達(dá)等原因，生物體細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙鏈dsRNA，dsRNA在一種具有RNaseIII活性的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(dsRNAspecific endonuclease，Dicer)作用下，切割成21-25nt的小干涉RNA(smallinterfering RNA，或short interfering RNAs，siRNA)。近來研究發(fā)現(xiàn)，siRNA是RNAi賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。它具有特殊性結(jié)構(gòu)即siRNA的序列與所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基。此外，每條單鏈的3′端均有2-3個突出的非配對的堿基。
第二階段是效應(yīng)階段，目前認(rèn)為該階段存在兩種假說模式。一種假說模式認(rèn)為siRNA作為向?qū)蛄?，與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA induced silencingcomplex，RISC)的無活性前體結(jié)合，在ATP參與下siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋誘導(dǎo)形成有活性的RISC，活性RISC隨即與同源性靶向mRNA結(jié)合，在與siRNA反義鏈配對區(qū)域的中部切斷同源性靶向mRNA，使其降解，從而達(dá)到干擾基因表達(dá)作用；另一種假說模式認(rèn)為隨機(jī)降解性多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(random degradativePCR)，即siRNA作為針對靶向mRNA特殊引物，在RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)的作用下以靶mRNA為模板合成dsRNA，然后在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA，新的siRNA又進(jìn)入上述過程，反復(fù)循環(huán)，從而使靶mRNA漸進(jìn)性減少，呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。RdRp一般只對所表達(dá)的靶mRNA發(fā)揮作用，這種在RNAi過程中對靶mRNA的特異性擴(kuò)增作用有助于增強(qiáng)RNAi的特異性基因監(jiān)視功能，每個細(xì)胞只需要少量dsRNA即能完成關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)；可見RNAi過程具有生物催化反應(yīng)的基本動力學(xué)特征。
隨著多國科學(xué)家參與的人類全基因組計劃進(jìn)入尾聲，一個以揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能為重點的后基因組時代業(yè)已拉開序幕。由于RNAi可以使特異基因mRNA發(fā)生降解，從而獲得特定蛋白功能喪失或降低的突變株。因此，RNAi作為一種新的、強(qiáng)有力的研究工具，在功能基因組學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景，使得RNAi成為當(dāng)今研究領(lǐng)域最引人注意的話題之一。相對于基因敲除技術(shù)(knockout)，RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點，被稱為基因抑制(knock down)技術(shù)，是研究特定基因功能的有效方法，在某種程度上可以替代操作復(fù)雜和費用昂貴的基因敲除技術(shù)?？傊?，RNAi是一種有效、快捷和成本相對低廉的基因功能研究手段，與基因芯片等高通量基因篩選技術(shù)相結(jié)合，在基因組學(xué)功能研究中將起重要作用，其應(yīng)用前景不亞于PCR技術(shù)。
淀粉合成途徑的改造是創(chuàng)造新特性、新應(yīng)用淀粉的重要手段。由于RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)提供了直接有效的人為控制基因表達(dá)的方法，所以，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)來抑制淀粉合成的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而控制淀粉的合成途徑，實現(xiàn)應(yīng)用基因工程手段改良淀粉品質(zhì)，以滿足工業(yè)生產(chǎn)和人民生活的各種不同需求，這是常規(guī)育種所無法達(dá)到的，顯示出在植物品種改良中具有廣闊的應(yīng)用前景。中科院上海植物生理生態(tài)研究所已利用基因工程技術(shù)將反義Wx基因?qū)?個高直鏈淀粉含量的秈型雜交稻重點親本，部分轉(zhuǎn)基因水稻T1和T2代種子中的直鏈淀粉含量已有不同程度的下降，最低的已下降至7％左右，與未轉(zhuǎn)化對照相比下降了18.39％。
我國沒有高直鏈淀粉玉米品種，也沒有高直鏈淀粉玉米的種植和淀粉生產(chǎn)。運用基因工程技術(shù)抑制某一特定SBE同工酶的表達(dá)，能夠提高玉米直鏈淀粉的含量，生產(chǎn)出消費者喜愛的品種，可獲得巨大的經(jīng)濟(jì)價值和社會效益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體，通過利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)封閉玉米淀粉分支酶基因sbe IIa的表達(dá)，降低玉米淀粉分支酶的活性，提高玉米直鏈淀粉含量，培育高直鏈淀粉玉米。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是包括下列步驟一、克隆玉米淀粉分支酶基因sbe IIa片段(1)淀粉分支酶基因片段的PCR擴(kuò)增RNA的提取使用TRIzoL試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)從玉米葉片及子粒提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在20μL的反應(yīng)體系中，總RNA9.5μL，5×緩沖液4.0μL，d NTP(10mM)2.0μL，RNA酶抑制劑0.5μL，引物(100pmol/μL)2.0μL，反轉(zhuǎn)錄酶2.0μL。(上述試劑均購于TaKaRa公司)引物設(shè)計根據(jù)GenBank發(fā)表的序列(U65948)，采用DNAMAN軟件設(shè)計兩對引物，利用PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)片段(562bp)。引物序列如下5′CGTGT AAAGA TACGG ATGGA C3′5′ATAGG CGAGA ATCCC ACAT 3′PCR反應(yīng)體系在50μL的反應(yīng)體系中，10×緩沖液5.0μL(TaKaRa公司)，dNTP4.0μL(TaKaRa公司)，引物各50pmol/L(賽百盛生物有限公司)，模板0.1μg，Taq酶0.3μL(TaKaRa公司)，以ddH2O補(bǔ)足50μL。
PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，73℃延伸90s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
(2)淀粉分支酶基因片段的克隆、篩選及鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳。得到約560bp大小，特異性強(qiáng)，單一的擴(kuò)增帶。
目的DNA片段的回收按DNA片段凝膠回收試劑盒(V-Gene公司)經(jīng)改良的方法進(jìn)行。回收的DNA片段，置-20℃冰箱保存。
目的DNA片段與克隆載體的連接回收的PCR產(chǎn)物，其中含有反義或正義的目的片段，與pMD18-T-vector以3∶1的濃度比例，加緩沖液4.0μL混勻，16℃反應(yīng)過夜，得到重組載體含有反義目的基因片段的pW1、和含有正義目的基因片段的pW2。(pMD18-T-vector購于TaKaRa公司)。
重組載體的轉(zhuǎn)化按Maniatis的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，冰浴30min，同時做對照管。以42℃熱激90s，冰上放置2min。每管加入800μL LB液體培養(yǎng)基，37℃溫育45min，140rpm/min。涂在含氨芐青霉素(100μg/mL)、×-gal(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、IPTG(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)的LB培養(yǎng)基平板上選擇培養(yǎng)過夜(37℃)。挑取白斑用堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，得到重組克隆。
(3)淀粉分支酶基因片段的序列分析由大連寶生物公司完成，核酸序列分析用DNASIS軟件，562bp的序列如SEQ ID NO.1所述二、克隆淀粉分支酶基因的種子特異啟動子種子特異啟動子TSPsbe(934bp)序列如SEQ ID NO.2所述引物序列如下Primer15′TCT CTC CAA CCC CTT CAA TC 3′；Primer25′GAC CGC AAG AGC GAA ATC 3′；由賽百盛生物有限公司合成，該啟動子由本實驗室克隆保存。
三、克隆綠色熒光蛋白基因從改造的p1300質(zhì)粒(p1300-GFP)上直接擴(kuò)增，并得到克隆載體(pW3)。質(zhì)粒p1300-GFP由本實驗室保存。
綠色熒光蛋白序列如SEQ ID NO.3所述引物序列如下
Primer15′ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3Primer25′TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA3′由賽百盛生物有限公司合成。
四、構(gòu)建siRNA表達(dá)載體(1)目的片段與表達(dá)載體的反向連接將含有反義目的基因片段的克隆質(zhì)粒(pW1)和表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301分別用Sal I、Sac I進(jìn)行雙酶切，電泳分離酶切片段，分別回收目的基因片段和載體大片段，然后以3∶1的濃度比例，加連接液4.0μL混勻，16℃反應(yīng)過夜，得到重組質(zhì)粒(pAsbe IIa)；(2)重組質(zhì)粒pAsbe IIa與正向目的片段的連接將上述重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I、Xho I酶切，分離載體大片段；克隆質(zhì)粒(pW2)經(jīng)Sac I和Xho I酶切，分離目的基因片段，用T4DNA連接酶連接到重組質(zhì)粒(pAsbe IIa)上，得反義+正義片段的表達(dá)質(zhì)粒pA-Ssbe IIa。
(3)種子特異啟動子與表達(dá)載體pA-Ssbe IIa的連接將pCAMBIA1301質(zhì)粒用Sph I、Sal I酶切，插入種子特異啟動子，得到pTSPsbe IIa。
(4)綠色熒光蛋白GFP與GUS基因的替換將克隆的綠色熒光蛋白基因的重組質(zhì)粒(pW3)用Bgl II和BstE II進(jìn)行雙酶切，與同樣雙酶切的pTSPsbe IIa載體進(jìn)行連接，得到最終的表達(dá)質(zhì)粒pTSPsbe IIa-GFP。該表達(dá)載體就是構(gòu)建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表達(dá)載體。
(5)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出3個重組克隆。通過限制性內(nèi)切酶Sac I和Sal I酶切鑒定，得到一條約560bp的特異帶，電泳圖譜表明目的片段確實插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301的種子特異啟動子下游，成功地構(gòu)建了siRNA的表達(dá)載體pTSPsbe IIa-GFP。
本發(fā)明玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體在培育高直鏈淀粉玉米自交系中的應(yīng)用。
本發(fā)明構(gòu)建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表達(dá)載體充分利用了表達(dá)載體pCAMBIA1301上的多克隆位點，將玉米淀粉分支酶種子特異啟動子基因插入Sph I、Sal I兩個酶切位點之間，玉米淀粉分支酶基因反義片段插入上述啟動子下游Sal I、Sac I之間，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，SBE IIa基因的正義片段被插入到Sac I、Xho I之間，最后對pTSPsbe IIa進(jìn)行Bgl II和BstE II雙酶切，用綠色熒光蛋白基因(GFP)替換GUS基因。本載體在分子生物學(xué)領(lǐng)域有較高的可操作性、實用性其中可利用的酶切位點有Sph I、Sal I、Sac I、Xho I、Bgl II和BstE II，可以插入四個目的基因片段，可供一般的載體構(gòu)建使用。去除潮霉素抗性基因，使用綠色熒光蛋白基因進(jìn)行篩選，解決食品安全性問題。
本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)點和有益的效果是，構(gòu)建了玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表達(dá)載體。利用該表達(dá)載體，可以對玉米淀粉分支酶基因功能進(jìn)行有效的鑒定，也可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效封閉玉米淀粉分支酶基因sbe IIa的表達(dá)，降低玉米淀粉分支酶的活性，提高玉米直鏈淀粉含量，培育高直鏈淀粉玉米或創(chuàng)造新的高直鏈玉米淀粉種質(zhì)資源。
附圖是構(gòu)建后的pTSPsbe IIa-GFP質(zhì)粒簡圖。
具體實施例方式
一種玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體，利用表達(dá)載體pCAMBIA1301上的多克隆位點，將玉米淀粉分支酶種子特異啟動子基因插入Sph I、Sal I兩個酶切位點之間，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa反義片段插入上述啟動子下游Sal I、Sac I之間，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa的正義片段被插入到Sac I、Xho I之間，在Bgl II和BstE II兩個酶切位點之間插入綠色熒光蛋白基因GFP。
玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法一、克隆玉米淀粉分支酶基因sbe IIa片段(1)淀粉分支酶基因片段的PCR擴(kuò)增RNA的提取使用TRIzoL試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)從玉米葉片及子粒提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在20μL的反應(yīng)體系中，總RNA9.5μL，5×緩沖液4.0μL，d NTP(10mM)2.0μL，RNA酶抑制劑0.5μL，引物(100pmol/μL)2.0μL，反轉(zhuǎn)錄酶2.0μL。(上述試劑均購于TaKaRa公司)引物設(shè)計根據(jù)GenBank發(fā)表的序列(U65948)，采用DNAMAN軟件設(shè)計兩對引物，利用PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)片段(562bp)。引物序列如下5′CGTGT AAAGA TACGG ATGGA C3′5′ATAGG CGAGA ATCCC ACAT 3′PCR反應(yīng)體系在50μL的反應(yīng)體系中，10×緩沖液5.0μL(TaKaRa公司)，dNTP4.0μL(TaKaRa公司)，引物各50pmol/L(賽百盛生物有限公司)，模板0.1μg，Taq酶0.3μL(TaKaRa公司)，以ddH2O補(bǔ)足50μL。
PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，73℃延伸90s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
(2)淀粉分支酶基因片段的克隆、篩選及鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳。得到約560bp大小，特異性強(qiáng)，單一的擴(kuò)增帶。
目的DNA片段的回收按DNA片段凝膠回收試劑盒(V-Gene公司)經(jīng)改良的方法進(jìn)行。回收的DNA片段，置-20℃冰箱保存。
目的DNA片段與克隆載體的連接回收的PCR產(chǎn)物，其中含有反義或正義的目的片段，與pMD18-T-vector以3∶1的濃度比例，加緩沖液4.0μL混勻，16℃反應(yīng)過夜，得到重組載體含有反義目的基因片段的pW1、和含有正義目的基因片段的pW2。(pMD18-T-vector購于TaKaRa公司)。
重組載體的轉(zhuǎn)化按Maniatis的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，冰浴30min，同時做對照管。以42℃熱激90s，冰上放置2min。每管加入800μL LB液體培養(yǎng)基，37℃溫育45min，140rpm/min。涂在含氨芐青霉素(100μg/mL)、×-gal(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、IPTG(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)的LB培養(yǎng)基平板上選擇培養(yǎng)過夜(37℃)。挑取白斑用堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，得到重組克隆。
(3)淀粉分支酶基因片段的序列分析由大連寶生物公司完成，核酸序列分析用DNASIS軟件，562bp的序列如SEQ ID NO.1所述二、克隆淀粉分支酶基因的種子特異啟動子種子特異啟動子TSPsbe(934bp)序列如SEQ ID NO.2所述引物序列如下Primer15′TCT CTC CAA CCC CTT CAA TC 3′；Primer25′GAC CGC AAG AGC GAA ATC 3′；由賽百盛生物有限公司合成，該啟動子由本實驗室克隆保存。
三、克隆綠色熒光蛋白基因從改造的p1300質(zhì)粒(p1300-GFP)上直接擴(kuò)增，并得到克隆載體(pW3)。質(zhì)粒p1300-GFP由本實驗室保存。
綠色熒光蛋白序列如SEQ ID NO.3所述引物序列如下Primer15′ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3′Primer25′TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA3′由賽百盛生物有限公司合成。
四、構(gòu)建siRNA表達(dá)載體(1)目的片段與表達(dá)載體的反向連接將含有反義目的基因片段的克隆質(zhì)粒(pW1)和表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301分別用Sac I、Xho I進(jìn)行雙酶切，電泳分離酶切片段，分別回收目的基因片段和載體大片段，然后以3∶1的濃度比例，加連接液4.0μL混勻，16℃反應(yīng)過夜，得到重組質(zhì)粒(pAsbeIIa)。該pCAMBIA1301質(zhì)粒由本實驗室保存。
(2)重組質(zhì)粒pAsbe IIa與正向目的片段的連接將上述重組質(zhì)粒經(jīng)Sal I、Sac I酶切，分離載體大片段；克隆質(zhì)粒(pW2)經(jīng)Sal I和Sac I酶切，分離目的基因片段，用T4DNA連接酶連接到重組質(zhì)粒(pAsbe IIa)上，得反義+正義片段的表達(dá)質(zhì)粒pA-Ssbe IIa。
(3)種子特異啟動子與表達(dá)載體pA-Ssbe IIa的連接將pCAMBIA1301質(zhì)粒用Sph I、Sal I酶切，插入種子特異啟動子，得到pTSPsbe IIa。
(4)綠色熒光蛋白GFP與GUS基因的替換將克隆的綠色熒光蛋白基因的重組質(zhì)粒(pW3)用Bgl II和BstE II進(jìn)行雙酶切，與同樣雙酶切的pTSPsbe IIa載體進(jìn)行連接，得到最終的表達(dá)質(zhì)粒pTSPsbe IIa-GFP。該表達(dá)載體就是構(gòu)建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表達(dá)載體。
(5)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出3個重組克隆。通過限制性內(nèi)切酶Sac I和Sal I酶切鑒定，得到一條約560bp的特異帶，電泳圖譜表明目的片段確實插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301的種子特異啟動子下游，成功地構(gòu)建了siRNA的表達(dá)載體pTSPsbe IIa-GFP。
應(yīng)用實施例應(yīng)用玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表達(dá)載體培育高直鏈淀粉玉米自交系。利用花粉管通道技術(shù)玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表達(dá)載體。轉(zhuǎn)入玉米自交系7922，培育高直鏈淀粉玉米自交系。
1、表達(dá)質(zhì)粒(pTSPsbe IIa-GFP)的提取和純化采用改良的“堿裂解法”(大量)提取表達(dá)質(zhì)粒(pTSPsbe IIa-GFP)。提取后的質(zhì)粒DNA采用PEG分級沉淀法純化。用紫外吸收法檢測質(zhì)粒DNA的濃度和純度。濃度為1mg/ml；純度為OD260/280＝1.82；OD260/230＝2.1。置于冰箱中待用。
2、受體自交系Mo17的種植將受體自交系7922的種子播種于試驗田內(nèi)，按照一般方法管理，培育成株。
3、受體植株的選擇和套袋自交當(dāng)受體植物自花授粉8h后，切去花柱，將DNA導(dǎo)入液滴于切口，迅速套袋，1h后復(fù)滴1次。同時以不含DNA的等量SSC溶液按同樣處理作對照。記載授粉的日期和時間。
4、導(dǎo)入后的管理和收獲定期檢查導(dǎo)入果穗紙袋的完好情況，如發(fā)現(xiàn)早期破損，立即淘汰。待玉米果穗成熟時，按導(dǎo)入果穗分別收獲、曬干、脫粒。
5、轉(zhuǎn)化后代的篩選和鑒定(1)轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測對PCR-Southern雜交陽性植株進(jìn)行Southern雜交檢測。取基因組DNA經(jīng)Sph I和Sal I酶消化，以質(zhì)粒TSPsbe啟動子的PCR擴(kuò)增片段(934bp)經(jīng)DIG標(biāo)記后作為探針進(jìn)行Southern雜交。
(2)轉(zhuǎn)基因植株的Northern雜交檢測對Southern雜交陽性植株進(jìn)行Northern雜交檢測。利用異硫氰酸胍法提取轉(zhuǎn)基因植株和對照的總RNA，RNA經(jīng)1％甲醛-MOPS瓊脂糖凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，以DIG標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，Northern雜交及檢測按Roche公司的試劑盒說明進(jìn)行。
(3)轉(zhuǎn)基因植株的淀粉分支酶活性的檢測對Northern雜交陽性植株進(jìn)行淀粉分支酶活性的檢測。步驟如下首先，提取粗酶液。取授粉后20天的玉米籽粒5粒，稱重，加入0.05mol/L檸檬酸緩沖溶液(pH7.0)，在冰浴中研磨勻漿，然后在18000rpm/min下離心20min，上清液即為粗酶液。
然后，測定淀粉分支酶活性。取1mL粗酶液+1mL 0.2mol/L檸檬酸緩沖液(pH7.0)+0.5mL 0.1mol/L EDTA(振蕩，使α-淀粉酶失活)+0.5mL 0.75％可溶性淀粉，搖勻，在37℃水浴中保溫40min(加入10％TCA 4mL終止反應(yīng)，3000rpm離心8min)，加0.3mL碘液顯色，10min后在660nm處測光密度值(O.D)，以零時為對照，淀粉分支酶活性以O(shè).D660％下降的百分率表示ΔO.D660＝(O.D660零時-O.D660t時)/O.D660零時×100％結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因玉米的分支酶活性與對照相比有明顯的下降，分別降低了88％、79％、86％、72％和69％。說明構(gòu)建的siRNA表達(dá)體系有效地表達(dá)了siRNA，從而抑制了內(nèi)源性淀粉分支酶mRNA的翻譯，使淀粉分支酶活性明顯降低。
(4)轉(zhuǎn)基因植株淀粉含量的檢測直鏈淀粉和支鏈淀粉含量測定采用何照范(1985)的雙波長法。以直鏈、支鏈淀粉含量之和為總淀粉含量。方法如下取轉(zhuǎn)基因玉米成熟籽粒粉碎過60目篩，用乙醚脫脂，稱取脫脂樣品0.1g左右(精確至1mg)加0.5mol/L KOH 10mL，在35℃水浴中振蕩15min或在沸水浴中10min，取出，以蒸餾水定容至50mL(如有泡沫采用乙醇消除)，靜置。吸取樣品液2.5mL兩份，即樣品測定液和樣品空白液，均加入20-30mL蒸餾水，以0.1mol/L HCl調(diào)pH至3.5左右，在樣品測定液中加碘試劑0.5mL，將樣品測定液和樣品空白液定容至50mL，混勻(如有泡沫采用乙醇消除)，靜置20min，以樣品空白液為對照，用1cm或2cm比色杯，分別測定λ2、λ1、λ4、λ3的光密度Eλ2、Eλ1、Eλ4、Eλ3，得到ΔE直＝Eλ2-Eλ1，ΔE支＝Eλ4-Eλ3。分別查兩種淀粉的雙波長標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出脫脂樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量。
轉(zhuǎn)基因植株的淀粉含量測定結(jié)果顯示，總淀粉含量與對照基本沒有變化，但直鏈淀粉的含量均有提高，最高達(dá)55％。
6、轉(zhuǎn)化后代的培育對表現(xiàn)高直鏈淀粉含量的轉(zhuǎn)化單株進(jìn)行自交純化和農(nóng)藝性狀鑒定，培育成高直鏈淀粉含量的玉米自交系。
<110>吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>綠色熒光蛋白基因<130>gsy200703<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>562<212>DNA<213>淀粉分支酶基因<400>1cgtgtaaaga tacggatgga cacaccatct ggtgttaagg attccattcc tgcctggatc60aagttttctg tgcaggctcc aggtgaaata ccatacaacg gtatatatta tgacccacct120gaagaggaga aatatgtatt caaacaccct caacctaagc ggcccaagtc actgcggata180tatgaatcac atgttggaat gagtagcccg gaaccaaaga taaatacata tgctaacttc240agagatgagg tgcttccaag aattaaaaag cttggataca atgcagtaca gataatggca300atccaggaac actcttatta tgcaagcttt gggtaccatg ttacgaattt ttttgcccca360agtagccgtt ttgggactcc agaggaccta aaatctctta ttgataaagc gcatgagctt420ggcttgctag tgcttatgga tattgttcat agtcattcat caaataatac cttggatggt480ttgaatggtt tcgatggcac cgatacacat tacttccatg gtggtccacg aggccatcat540tggatgtggg attctcgcct at 562
<210>2<211>959<212>DNA<213>種子特異啟動子<400>2tctctccaac cccttcaatc tcgaagggga tttgagtttc caaactagat cctaaaagca60agtataataa ggtgatgtag gcgagctgta ggatataaca catcagattt gtgatgatat120gaaagaaaaa aatgaagaga gaatgaaagc ggactgttgc tcacggactc taagatataa180tacaagagga agagatgagc taagtattaa acgtataaat atatttttag ttagttatat240gtgataggac aatatcataa aactcacttt gtgccatatc gttaaacttg ctgtagcttc300accgttaatc gataaaaaat attaaaaaag catctcccgt ttgctcgact gctcgagtgt360gcaaaaaaaa aaaaaaggca cgacggaccc gcgcgctgac gcggtgagcc gcaagtccgc420aacggcgcgg ccgcgcgcta ggaaaaaagc ctcgcccgtg aagcgaactc cctctccttc480gaccttcgtt cttccactgc ggcctgcgcg acccgtgcag ctgcgcgctc cacctggccg540cgcctggggc ccacaccgcc tggcatctgg agcattgccc ccggacttcg cgcggccgcc600cgcagccccg ctccccaccg aaaagcgaag cgcgattgcc atccccacgc caccgcgaag660cacaaggtcc ccgccctgca cgatcagcag gacctcgcca cgccgccgct ggagctgcgc720gtgcgcgtgt gcgcttggac cgacgcgcaa cggcctgcct cgaccgcccg tgcacgccac780tgctcatgca gccgtccgcc tcgcccccgc cccgaactgc cgaggtcgcg tgaacgccca840ctcccctcac cgctcgtctc cgtgctatat aggcagcccg cgcccctcct aattgtagcc900ctgcagtcac ccagagcaga cccggatttc gctcttgcgg tcaatctcta gaggatccc 959
<210>3<211>701<212>DNA<213>綠色熒光蛋白基因<400>3atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac60ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac120ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc180ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag240cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc300ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg360gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac420aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac480ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc540gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc taccagtccg600ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg660ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta a70權(quán)利要求
1.一種玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體，其特征在于利用表達(dá)載體pCAMBIA1301上的多克隆位點，將玉米淀粉分支酶種子特異啟動子基因插入Sph I、Sal I兩個酶切位點之間，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa反義片段插入上述啟動子下游Sal I、Sac I之間，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，玉米淀粉分支酶基因SBE IIa的正義片段被插入到Sac I、Xho I之間，在Bgl II和BstE II兩個酶切位點之間插入綠色熒光蛋白基因GFP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體，其特征在于玉米淀粉分支酶基因的片段序列如SEQ ID NO.1所述。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體，其特征在于玉米淀粉分支酶種子特異啟動子基因序列如SEQ ID NO.2所述。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體，其特征在于綠色熒光蛋白基因GFP序列如SEQ ID NO.3所述。
5.如權(quán)利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下列步驟一、克隆玉米淀粉分支酶基因sbe IIa片段(1)淀粉分支酶基因片段的PCR擴(kuò)增RNA的提取使用TRIzoL試劑盒從玉米葉片及子粒提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在20μL的反應(yīng)體系中，總RNA9.5μL，5×緩沖液4.0μL，d NTP(10mM)2.0μL，RNA酶抑制劑0.5μL，引物(100pmol/μL)2.0μL，反轉(zhuǎn)錄酶2.0μL，引物設(shè)計根據(jù)GenBank發(fā)表的序列(U65948)，采用DNAMAN軟件設(shè)計兩對引物，利用PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)片段(562bp)；引物序列如下5′CGTGT AAAGA TACGG ATGGA C3′5′ATAGG CGAGA ATCCC ACAT 3′PCR反應(yīng)體系在50μL的反應(yīng)體系中，10×緩沖液5.0μL，dNTP 4.0μL，引物各50pmol/L，模板0.1μg，Taq酶0.3μL，以ddH2O補(bǔ)足50μL；PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，73℃延伸90s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min；(2)淀粉分支酶基因片段的克隆、篩選及鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳；得到約560bp大小，特異性強(qiáng)，單一的擴(kuò)增帶；目的DNA片段的回收按DNA片段凝膠回收試劑盒經(jīng)改良的方法進(jìn)行；回收的DNA片段，置-20℃冰箱保存；目的DNA片段與克隆載體的連接回收的PCR產(chǎn)物，其中含有反義或正義的目的片段，與pMD18-T-vector以3∶1的濃度比例，加緩沖液4.0μL混勻，16℃反應(yīng)過夜，得到重組載體含有反義目的基因片段的pW1、和含有正義目的基因片段的pW2；重組載體的轉(zhuǎn)化按Maniatis的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，冰浴30min，同時做對照管；以42℃熱激90s，冰上放置2min；每管加入800μL LB液體培養(yǎng)基，37℃溫育45min，140rpm/min。涂在含氨芐青霉素(100μg/mL)、×-gal、IPTG的LB培養(yǎng)基平板上選擇培養(yǎng)過夜(37℃)；挑取白斑用堿裂解法提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，得到重組克?。?3)淀粉分支酶基因片段的序列分析核酸序列分析用DNASIS軟件，562bp的序列如SEQ ID NO.1所述二、克隆淀粉分支酶基因的種子特異啟動子種子特異啟動子TSPsbe(959bp)序列如SEQ ID NO.2所述引物序列如下Primer15′TCT CTC CAA CCC CTT CAA TC 3′；Primer25′GAC CGC AAG AGC GAA ATC 3′；三、克隆綠色熒光蛋白基因從改造的p1300質(zhì)粒(p1300-GFP)上直接擴(kuò)增，并得到克隆載體(pW3)，綠色熒光蛋白序列如SEQ ID NO.3所述引物序列如下Primer15′ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC3′Primer25′TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA3′；四、構(gòu)建siRNA表達(dá)載體(1)目的片段與表達(dá)載體的反向連接將含有反義目的基因片段的克隆質(zhì)粒(pW1)和表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301分別用Sal I、Sac I進(jìn)行雙酶切，電泳分離酶切片段，分別回收目的基因片段和載體大片段，然后以3∶1的濃度比例，加連接液4.0μL混勻，16℃反應(yīng)過夜，得到重組質(zhì)粒(pAsbe IIa)；(2)重組質(zhì)粒pAsbe IIa與正向目的片段的連接將上述重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I、Xho I酶切，分離載體大片段；克隆質(zhì)粒(pW2)經(jīng)Sac I和Xho I酶切，分離目的基因片段，用T4DNA連接酶連接到重組質(zhì)粒(pAsbeIIa)上，得反義+正義片段的表達(dá)質(zhì)粒pA-Ssbe IIa；(3)種子特異啟動子與表達(dá)載體pA-Ssbe IIa的連接將pCAMBIA1301質(zhì)粒用Sph I、Sal I酶切，插入種子特異啟動子，得到pTSPsbe IIa；(4)綠色熒光蛋白GFP與GUS基因的替換將克隆的綠色熒光蛋白基因的重組質(zhì)粒(pW3)用Bgl II和BstE II進(jìn)行雙酶切，與同樣雙酶切的pTSPsbe IIa載體進(jìn)行連接，得到最終的表達(dá)質(zhì)粒pTSPsbeIIa-GFP。該表達(dá)載體就是構(gòu)建的玉米淀粉分支酶基因(sbe IIa)siRNA表達(dá)載體；(5)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出3個重組克?。煌ㄟ^限制性內(nèi)切酶Sac I和Sal I酶切鑒定，得到一條約560bp的特異帶，成功地構(gòu)建了siRNA的表達(dá)載體pTSPsbe IIa-GFP。
6.如權(quán)利要求1所述的玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體在培育高直鏈淀粉玉米自交系中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米淀粉分支酶基因siRNA表達(dá)載體，屬于植物基因工程和遺傳育種領(lǐng)域。用表達(dá)載體pCAMBIA1301上的多克隆位點，將玉米淀粉分支酶種子特異啟動子基因插入SphI、SalI兩個酶切位點之間，玉米淀粉分支酶基因SBEIIa反義片段插入上述啟動子下游SalI、SacI之間，在切除潮霉素抗生素抗性基因后，玉米淀粉分支酶基因SBEIIa的正義片段被插入到SacI、XhoI之間，在BglII和BstEII兩個酶切位點之間插入綠色熒光蛋白基因GFP。本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)點是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效封閉玉米淀粉分支酶基因sbeIIa的表達(dá)，降低玉米淀粉分支酶的活性，提高玉米直鏈淀粉含量，培育高直鏈淀粉玉米或創(chuàng)造新的高直鏈玉米淀粉種質(zhì)資源。
文檔編號C12N15/65GK101029314SQ20071005529
公開日2007年9月5日 申請日期2007年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月2日
發(fā)明者王丕武, 關(guān)淑艷, 劉慧靜, 劉廣娜, 姚丹, 曲同寶, 曲靜 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)