一種人工改造合成的dORF2^art基因及其編碼的蛋白質(zhì)的制作方法

專利名稱：一種人工改造合成的dORF2^art基因及其編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種豬圓環(huán)病毒2型(PorcineCircovirus Type 2，PCV2)的除去核定位信號的經(jīng)密碼子修飾的d0RF2art基因，該基因編碼的核衣殼 蛋白dCap，及核衣殼蛋白dCap在重組乳酸乳菌球中的表達(dá)。
背景技術(shù)：
據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計，我國養(yǎng)豬業(yè)每年因各種疾病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失總計達(dá)上百億 元，直接導(dǎo)致生產(chǎn)成本上升。另外，因疾病所造成的病原污染及治療藥物殘留的食物安全問 題對人類健康也構(gòu)成一定的威脅。由此可見，目前影響我國養(yǎng)豬業(yè)的瓶頸已經(jīng)不是豬種、飼 料和市場，而是各種疾病所帶來的威脅。疾病的流行是制約我國養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要 因素。因此，采取有效措施控制豬病，對促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展和提高動物源性食品安全性 具有重要的意義。豬免疫抑制性疫病已成為全球規(guī)?；B(yǎng)豬所面臨的一大問題。原因之一是豬群被 豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus type 2，PCV2)感染，導(dǎo)致群體免疫力和健康水平下 降，使豬群對疾病的易感性增高。同時研究表明，PCV2感染可引起繼發(fā)性免疫缺陷，發(fā)病或 感染豬至少存在短暫的不能激發(fā)有效的免疫應(yīng)答現(xiàn)象。豬圓環(huán)病毒(PorcineCircovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓 環(huán)病毒屬(Circovirus)，其基因組是一種環(huán)狀、單鏈DNA，長約1760bp左右，分子量為 0. 58X 106Da。PCV對外環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，在酸性環(huán)境及氯仿中可以存活較長時間。根據(jù)PCV 的致病性、抗原性及核苷酸序列差異可將其分為PCV1和PCV2兩型。PCV1無致病性，而PCV2 是引發(fā)豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合癥(Post WeaningMultisystemic Wasting Syndrome, PMWS)的主要病原。該病主要以患畜生長遲緩、進(jìn)行性消瘦和多系統(tǒng)病理損傷為特征。此外， PCV2還與豬皮炎與腎病綜合癥(Porcine Dermatitis And Nephropathy Syndrome，PDNS)、 新生仔豬先天性腦陣顫、增生性壞死肺炎以及懷孕母豬的繁殖障礙等疾病有關(guān)。PCV2已給 全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，近幾年來有效預(yù)防和治療PCV2感染受到了業(yè)界的 普遍關(guān)注。迄今為止，對PCV2感染尚無有效防治措施。在國內(nèi)，疫苗研究仍處于實驗室研究 階段，尚無商品化疫苗問世。在國外，盡管有報道已成功研制出PCV2注射疫苗，正在我國進(jìn) 行申報，但我們估計其價格不菲，我國養(yǎng)豬業(yè)能否承受如此代價仍是未知數(shù)。另一方面，傳 統(tǒng)的注射疫苗在使用過程中存在嚴(yán)重的免疫應(yīng)激，常導(dǎo)致豬只發(fā)熱、采食量明顯下降、以及 生長放緩等副作用，因此，如何減少免疫應(yīng)激也是業(yè)界一直關(guān)注的問題。再者，傳統(tǒng)的DNA 疫苗雖然制備簡單、成本低廉、可誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，但是，質(zhì)粒DNA導(dǎo)入細(xì)胞/機(jī)體 的效率低下，外源基因表達(dá)水平低，DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)可能誘發(fā)免疫耐受、自身免 疫、過敏反應(yīng)和超免疫性，并可能誘導(dǎo)抗DNA抗體，而且存在整合到宿主染色體上的風(fēng)險。 這些局限促使研究者尋找一種更為安全、表達(dá)水平更高、免疫效果更好的免疫調(diào)節(jié)劑，如由 病毒囊膜蛋白或核衣殼蛋白制備的口服(滴眼或鼻拭、噴)疫苗，通過粘膜免疫以獲得免疫保護(hù)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一種無入侵性，無病原性的食品安全級 (GRAS)微生物，被認(rèn)為是粘膜水平上投遞抗原和藥物分子的良好載體。相對于乳桿酸 (Lactobacillus)，乳酸乳球菌因其不定植于動物腸道中，不會引起動物的抗藥性等特點而 受到廣泛的認(rèn)可和運(yùn)用。通過免疫刺激動物的口腔、呼吸道、生殖道以及眼角膜等，乳酸乳 球菌可將抗原有效地遞逞到粘膜免疫系統(tǒng)。乳鏈球菌素誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)(Nisin Control Expression System，NICE系統(tǒng)) 是目前廣泛研究和使用的乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)，該菌屬于革蘭氏陽性菌，以乳鏈球菌素 (Nisin)為誘導(dǎo)劑。Nisin是FDA批準(zhǔn)可用于食品生產(chǎn)加工中的食品級防腐劑。以Nisin 為誘導(dǎo)劑的NICE系統(tǒng)，避免了如大腸桿菌、酵母菌等表達(dá)系統(tǒng)以IPTG、甲醇等有毒物質(zhì)為 誘導(dǎo)劑，在誘導(dǎo)劑層面保證了安全；同時該系統(tǒng)為緊密型表達(dá)系統(tǒng)，具有不含包涵體、含有 較少的蛋白酶、下游操作簡單，以及便于大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點。因此NICE系統(tǒng)是制備粘膜免 疫疫苗的理想表達(dá)系統(tǒng)。密碼子偏好性是制約外源基因在NICE表達(dá)系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)的主要因素之 一。隨著生物信息學(xué)和基因化學(xué)合成的發(fā)展，在不改變氨基酸序列的前提下，根據(jù)宿主的 密碼子偏好性對外源基因進(jìn)行密碼子修飾并進(jìn)行化學(xué)合成經(jīng)修飾的基因已成為可能。該技 術(shù)使得更多的外源基因可在乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，同時許多研究表明經(jīng)密碼子 修飾的基因其編碼的蛋白質(zhì)具有同樣的生物功能，即基因密碼子修飾對蛋白質(zhì)功能并無影 響。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上問題，本發(fā)明旨在構(gòu)建含PCV2的d0RF2art基因的重組乳酸乳球菌表達(dá)系 統(tǒng)，在重組乳酸乳球菌中表達(dá)由其編碼的dCap衣殼蛋白。本發(fā)明的第一個目的在于提供一種人工改造合成的d0RF2art基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO 1 所示。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種含有權(quán)利要求1所述(101^2"1基因的原核表達(dá) 載體。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種用d0RF2art基因原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組乳酸 乳球菌(Lactococcus lactis NZ9000)，并表達(dá) dCap 蛋白。本發(fā)明的第四個目的在于提供一種構(gòu)建d0RF2art基因原核表達(dá)載體的方法，包括 以下步驟1)根據(jù)乳酸乳球菌密碼子偏好性設(shè)計并人工合成d0RF2art基因；2)首先利用限制性內(nèi)切酶將步驟1)人工合成的d0RF2art基因進(jìn)行酶切，再通 過連接酶將該基因插入至原核表達(dá)載體(PNZ8048)，得到d0RF2art基因原核表達(dá)載體 (pNZ8048-d0RF2art)。本發(fā)明的技術(shù)路線為1)根據(jù)乳酸乳球菌密碼子偏好性設(shè)計d0RF2art基因；2)按照步驟1)所設(shè)計的核苷酸序列人工合成d0RF2art基因；3)構(gòu)建 d0RF2art 基因原核表達(dá)載體 pNZ8048-d0RF2art ；
4) pNZ8048-d0RF2art 轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌；5)乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化子(Lactococcus lactis NZ9000)誘導(dǎo)表達(dá)dCap蛋白。本發(fā)明所述d0RF2art基因針對表達(dá)宿主菌_乳酸乳球菌的密碼子偏好性，通過生 物信息學(xué)方法對野生型的d0RF2基因(d0RF2rt)進(jìn)行密碼子偏好性修飾，以提高其在宿主中 表達(dá)量。經(jīng)密碼子修飾的d0RF2art基因，相對于野生型基因，579個堿基中共有142個堿基 進(jìn)行了修飾，其中72個堿基進(jìn)行了轉(zhuǎn)換(同類嘌呤或嘧啶間相互轉(zhuǎn)化)，70個堿基進(jìn)行了 顛換(嘌呤嘧啶間相互轉(zhuǎn)化)。密碼子修飾后d0RF2art基因經(jīng)DNAstar軟件驗證后證實其 所編碼的氨基酸序列與野生型的相同。本發(fā)明采用乳酸乳球菌作為表達(dá)宿主，由于該菌為益生菌，所以其表達(dá)過程中產(chǎn) 生的外源蛋白無需分離、純化，就可以作為口服疫苗直接飼喂動物；同時該菌可調(diào)節(jié)動物胃 腸道的非特異性免疫功能，從而賦予了普通微生態(tài)制劑特異性免疫調(diào)節(jié)的功能。


圖 1 是重組表達(dá)載體 pNZ8048-d0RF2art 的酶切圖，M :DNA markerDL5000,1 5 pNZ8048-d0RF2art Nco I.Sac I 酶切產(chǎn)物；圖 2 是本發(fā)明 dCap 蛋白 SDS-PAGE 電泳分析圖，M :proteinmarker，1 3 :Nisin 誘導(dǎo)濃度依次為 30ng/ml，20ng/ml，10ng/ml ；圖3是本發(fā)明d0RF2art原核達(dá)載體pNZ8048_d0RF2art的構(gòu)建流程圖。圖4是人工改造dORFart與野生型d0RF2wt編碼的氨基酸序列的同源性比較圖， Query代表d0RF2wt基因序列即野生型d0RF2基因；Optimised代表d0RF2art基因序列即修飾型d0RF2基因；*代表顛換(嘧啶一嘌呤 /嘌呤一嘧啶)代表轉(zhuǎn)換(嘧啶一嘧啶/嘌呤一嘌呤)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說明。材料與來源限制性內(nèi)切酶Ncol、SacI、T4DNA連接酶均購自寶生物(大連)公司，E. coli MC1061、乳酸乳球菌載體pNZ8048及乳酸乳球菌Lactococcus lactis NZ9000購買自荷蘭 NIZ0 Food Research, NL。pNZ8048是一種具有廣泛宿主范圍的載體，可在L. lactis和E. coli中復(fù)制，帶有 氯霉素(Cm)抗性篩選標(biāo)記；L. lactis NZ9000由泛素缺陷型菌株MG1363衍生而來，其染色 體上整合有nisK和nisR基因；E. coliMC1061用于重組載體的克隆和大量DNA制備。實施例1設(shè)計d0RF2art基因核苷酸序列以GenBank發(fā)布的d0RF2[gi 147883260]為基礎(chǔ)，截去前123個堿基，針對表達(dá)宿 主乳酸乳球菌的密碼子偏好性，用OPTIMIZER(http://genomes.urv. es/0PTIMIZER/)對其 進(jìn)行密碼子修飾，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。實施例2化學(xué)合成經(jīng)密碼子修飾的基因在經(jīng)設(shè)計的d0RF2art基因兩端加上Ncol，SacI酶切位點序列，并委托寶生生物工 程(大連)公司進(jìn)行化學(xué)合成并克隆至pMD19-T-sample，得到pMD 19_d0RF2art。
實施例3 pNZ8048-d0RF2art原核表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建過程參閱圖3，Ncol和SacI分別雙酶切pMD19_d0RF2art和pNZ8048原核表達(dá) 質(zhì)粒，凝膠回收。16°C連接過夜，再轉(zhuǎn)化E. coliMC1061，氯霉素抗性篩選，挑6個陽性菌落， 分別進(jìn)行PCR和Nco I, Sac I雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果參閱圖1。符合預(yù)期結(jié)果的菌株編號 為MC1061-dCap，送往上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，所得結(jié)果與GenBank的Blastn 比對，分析d0RF2art與野生型d0RF2wt之間編碼的氨基酸序列的同源性，參閱圖4，比對結(jié)果 證明d0RF2art與d0RF2wt編碼的氨基酸序列完全相同實施例4 dCap蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定正確的攜有(101^2心基因的原核表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌 Lactococcus lactis NZ9000中。挑取單菌落接種到含氯霉素(5 ii g/ml)的GM17液體培養(yǎng) 基中，30°C，靜置培養(yǎng)過夜。次日，按2%的接種量接種到含氯霉素(5i!g/ml)的GM17液體 培養(yǎng)基中；當(dāng)0D600 ^0.4時，加入10mg/ml的Nisin至其終濃度為10ng/ml，30°C下誘導(dǎo) 5h后收菌，12% SDS-PAGE進(jìn)行分析，證實有dCap蛋白的表達(dá)，分子量約為22kD，與預(yù)期結(jié) 果相符合。結(jié)果參閱圖2。GM17培養(yǎng)基配方及配置方法胰蛋白胨5. 0g ；大豆胨5. 0g ；牛肉膏5. 0g ；酵母膏 2. 5g ；抗壞血酸 0. 5g ;MgS04. 7H20 0. 25g ；磷酸甘油二鈉 19. 0g ；蒸餾水 1000ml。pH 6.9。 121°C滅菌冷卻之后再加入預(yù)先已滅菌的20% (w/v)葡萄糖溶液至終濃度為0.5% (w/v)
權(quán)利要求
一種人工改造合成的dORF2art基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述d0RF2art基因的原核表達(dá)載體。
3.用權(quán)利要求2所述原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的乳酸乳球菌。
4.一種構(gòu)建d0RF2art基因原核表達(dá)載體的方法，包括以下步驟1)根據(jù)乳酸乳球菌密碼子偏好性設(shè)計并人工合成d0RF2art基因；2)將步驟1)人工合成的d0RF2art基因，首先通過限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，再通過連接 酶將該基因插入至原核表達(dá)載體，得到d0RF2art基因原核表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，公開了一種豬圓環(huán)病毒2型(PorcineCircovirus Type 2，PCV2)的除去核定位信號的經(jīng)密碼子修飾的dORF2art基因，該基因編碼的核衣殼蛋白dCap，及核衣殼蛋白dCap在重組乳酸乳菌球NZ9000(Lactococcus lactis NZ9000)中的表達(dá)。所述dORF2art基因可在重組乳酸乳球菌NZ9000中表達(dá)PCV2囊膜蛋白，為制成抗PCV2粘膜免疫苗打下了良好的基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/21GK101875941SQ20101012116
公開日2010年11月3日 申請日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月9日
發(fā)明者李適云, 李雪玲, 梁關(guān)海, 羅奇, 羅文華, 胡文鋒, 胡斌, 陳曉鵬 申請人:胡文鋒