專利名稱：檢測含有篩選基因nos的轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測含有篩選基因NOS的轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品的基因芯片及其應(yīng) 用，屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等轉(zhuǎn)基因作物已在很多國家獲得批準種植 和生產(chǎn)，有的被加工成食品、飼料或用做食物添加劑。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生態(tài)安全和食用安 全一直備受爭議，40多個國家和地區(qū)相繼實施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識制度。各國轉(zhuǎn)基因標識制度的相繼建立，對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的靈敏度和準確性提出了嚴 格的要求，各種轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)也成為研究熱點。常用的轉(zhuǎn)基因檢測方法有聚合酶鏈式反 應(yīng)(PCR)法，外源蛋白檢測法，基因芯片檢測技術(shù)。雖然國外對轉(zhuǎn)基因作物檢測方法研究已 有十幾年，但由于轉(zhuǎn)基因作物的種類多、數(shù)量大，一些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品經(jīng)過深加工、各種條件處 理與保存后，轉(zhuǎn)基因成分部分或完全降解，所以檢測難度大。因此，需要根據(jù)科學技術(shù)的發(fā) 展不斷更新檢測方法。但不容樂觀的是，設(shè)計PCR反應(yīng)引物是一個棘手的問題，必須確保反應(yīng)中兩條引 物有相近的熔接溫度，引物之間不會發(fā)生相互作用，另外還要注意非特異性擴增，特別是當 非特異性擴增帶與目的帶相近時，就會出現(xiàn)假陽性問題，從而干擾結(jié)果的判斷。隨著GMO檢 測技術(shù)的發(fā)展情況及研究趨勢，基因芯片技術(shù)在此展示了更大的優(yōu)勢。基因芯片檢測原理 是利用帶有熒光標記的樣品同探針特異雜交，從而產(chǎn)生陽性信號。因而非目的帶的擴增只 要不產(chǎn)生陽性信號，就不會干擾，而且芯片檢測不依據(jù)電泳條帶。并且基因芯片可根據(jù)任 何已知基因組序列設(shè)計特異性探針，以人工合成的方法快速制備芯片，且高度并行性、高通 量、微型化、自動化、高準確度和靈敏度等優(yōu)點具有廣泛的應(yīng)用前景。經(jīng)對現(xiàn)有專利和其他文獻的檢索，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于NOS基因的基因芯片檢測技術(shù)的 專利報道。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足和實際檢測的需要，本發(fā)明提供了一種檢測含篩選基因 NOS的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的檢測含篩選基因NOS轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因NOS探針以及核酸固定的陽性對照(HEX)、雜交陽性對 照(PC)、陽性質(zhì)控探針(18S rRNA)、陰性質(zhì)控探針、空白對照；其中，所述陽性對照和雜交陽性對照為北京博奧生物技術(shù)有限公司提供的晶芯 核酸固定陽性對照(HEX)(產(chǎn)品號為502000)和晶芯 雜交陽性對照(PC)(產(chǎn)品號為 503000)；
所述陽性質(zhì)控探針為18S rRNA，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(ClT) 15-ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG所述陰性質(zhì)控探針為SHDC-人類表達特異蛋白基因，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(ClT) 15-ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC所述陽性質(zhì)控探針和陰性質(zhì)控探針序列均來源于許小丹，文思遠等(檢測及鑒定 轉(zhuǎn)基因大豆寡核苷酸芯片的制備.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2005，13 (4) 429-434)的報道；所述空白對照為點樣液_雙蒸水；所述的篩選基因NOS探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-AAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTA。上述檢測轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS的基因芯片，還包括探針對照，探針 對照選自轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米Btll轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基 因玉米TC1507轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米GA21 轉(zhuǎn)化體特異性探針。轉(zhuǎn)基因玉米GA21、Btl 1、Mon810、TC1507和Btl76的轉(zhuǎn)化體特異性探針均來源于 路興波，武海斌等(轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體特異性寡核苷酸芯片檢測方法的研制.作物學報， 2009，35 (8) 1432-1438)的報道。所述芯片的陣列布局為人為規(guī)定，可以任意布局，本發(fā)明所用的布局如圖1所示。所述的陽性對照、雜交陽性對照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、空白對照、篩選基 因NOS探針的點樣濃度為25 μ mol/L。所述的探針對照的點樣濃度為25 μ mol/L。本發(fā)明的芯片的制備原理是以含有NOS基因的轉(zhuǎn)基因玉米GA21為材料，以轉(zhuǎn)基 因玉米Btl76和TC1507、非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958、非轉(zhuǎn)基因大豆1138-2、非轉(zhuǎn)基因棉花中49 等作為對照，根據(jù)NOS序列，利用Primer premier 5. 0引物設(shè)計軟件設(shè)計特異性引物，并對 引物進行篩選和優(yōu)化。熒光標記引物在5’端用Cy3-Amidite進行熒光標記。利用Primer premier 5.0和Oligo 6. 0軟件設(shè)計40mer Oligo NOS備選探針，探針在5，端以氨基己烷 修飾，氨基和探針序列之間以間隔臂poly(dT15)相連，使最終探針長度為55bp?？梢岳帽景l(fā)明設(shè)計的探針進行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS特異性芯片 檢測。本發(fā)明的基因芯片的的應(yīng)用方法為提取待測植物的基因組DNA，然后在二重熒光PCR反應(yīng)體系中擴增，其中，熒光染料為Cy3-Amidite然后取PCR產(chǎn)物，與雜交液混勻后， 于PCR儀中95°C熱變性lOmin，冰浴驟冷后加樣于芯片上的點樣區(qū)，蓋玻片封片；42°C水浴 雜交2h ；雜交后，芯片分別在42°C的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min離心甩干， 用晶芯 LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進行掃描，波長532nm ；PMT為850 V，Power為 90 V，產(chǎn)生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像；用LuxScan3. 0軟件進行數(shù)據(jù)采集和圖像 分析，分析掃描圖像的熒光強度值以確定是否含有NOS基因；所述雜交液包括3XSSC，0.2% SDS，25% 甲酰胺，5XDenhart，s，33nmol/L PC 雜 交陽性對照樣品；
所述洗液I 包括2XSSC，0. IXSDS ；所述洗液II 為 0. 2XSSC。本發(fā)明的檢測轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS基因芯片，具有很好的特異性， 靈敏度高，為轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS基因芯片檢測分析提供了基于簡單、可靠 的測定方法，可以用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的檢測。本 發(fā)明為轉(zhuǎn)基因標識提供了一種有用 的參考，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了必要的手段，可以滿足我國在進出口檢驗、種子市場抽 檢、轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)控監(jiān)測等方面的檢測需求，提高我國轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)管水平。
圖1為本發(fā)明的基因芯片陣列分布圖；其中al a5-核酸固定的陽性對照(HEX)，a6 al0、b6 bl0、cl c5、c6 clO、d6 dlO、el e5、e6 e 10-空白對照(點樣液)；bl b5_雜交陽性對照(PC)； dl d5-N0S探針；Π f5，g6 glO-陽性質(zhì)控探針(18S rRNA) ；f6 fl0，gl g5_陰 性質(zhì)控探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)；圖2為本發(fā)明的實施例1中的基因芯片陣列分布圖；其中，Al A5-核酸固定的陽性對照(HEX) ；A6 A10，B6 BlO-空白對照(點 樣液)；Bl B5-雜交陽性對照(PC) ；Cl C5-TC1507 ；C6 C10-GA21 ；Dl D5-N0S 探 針；D6 D10-Mon810 ；El E5_Btll ；E6 E10_Btl76 ；Fl F5，G6 GlO-陽性質(zhì)控探針 (18SrRNA) ；F6 F10，Gl G5-陰性質(zhì)控探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)。圖3為篩選基因NOS特異性PCR檢測示意圖；其中M-分子量Marker ； 1_非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958基因組DNA模板；2_非轉(zhuǎn)基因 大豆1138-2基因組DNA模板；3-非轉(zhuǎn)基因棉花中49基因組DNA模板；4-轉(zhuǎn)基因玉米Bt 176 基因組DNA模板；5-轉(zhuǎn)基因玉米TC1507基因組DNA模板；6-轉(zhuǎn)基因玉米GA21基因組DNA 模板；7-陰性對照；8-空白對照。圖4(a)為篩選基因NOS特異性芯片雜交信號圖；圖4(b)為非轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的芯片雜交信號圖(為圖4(a)的對照)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明實施例1 1、引物和探針的設(shè)計引物在5’端用Cy3-Amidite進行熒光標記。引物由上海博亞生物公司合成，引物 稀釋成ΙΟμπιοΙ/L備用。利用Primer premier 5.0 和 Oligo 6. 0 軟件根據(jù) NOS 的序列設(shè)計 40mer Oligo 備選探針，設(shè)計一般原則為(1)具有較相近的TM值，上下波動范圍為5°C ； (2)GC含量為 45% 55%之間，否則將增加非特異性雜交背景；(3)重復的單一堿基連續(xù)不超過4個； (4)探針分子最穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)配對堿基長度不大于4bp。探針在5’端以氨基己烷修飾，氨 基和探針序列之間以間隔臂poly(dT15)相連，使最終探針長度為55bp。所有探針在上海博 亞生物公司合成。
2、芯片制備將篩選基因NOS的特異性探針溶解在芯片點樣液中，稀釋成25ymol/L，取20μ L 轉(zhuǎn)移到384孔板，用博奧生物芯片有限公司晶芯 SmartArrayerTM-16芯片點樣儀點樣。先 預點40點后再點至醛基化玻片上，點間距為350 μ m，點樣后的芯片進行處理備用。每種樣 品點樣重復5次，并同時點有核酸固定的陽性對照(HEX)，雜交陽性對照(PC)，陽性質(zhì)控探 針(ISSrRNA)，陰性質(zhì)控探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)，空白對照(點樣液)，探針 對照。以保證信號的重復性及穩(wěn)定性。圖2為本實施例所制備芯片陣列示意圖，除包括篩 選基因NOS的特異性探針外，還包括GA21、Btl76、Btll、Mon810、及TC1507的特異性探針對照。3、應(yīng)用方法1)應(yīng)用特異性引物序列進行篩選基因NOS特異性定性PCR檢測方法所引用的引物序列如下(NY/T 675-2003)NOS-F :5，GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3，NOS-R :5，TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3，。用博日Biospin植物基因組DNA提取試劑盒，分別取轉(zhuǎn)基因玉米Btl76、TC1507 和GA21等轉(zhuǎn)基因玉米，非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958、非轉(zhuǎn)基因大豆1138-2、非轉(zhuǎn)基因棉花中49 的基因組DNA為模板，應(yīng)用引物進行PCR擴增。在20 μ L反應(yīng)體系中以IOOng不同來源的 基因組DNA為模板，其他各組分終濃度為PCR Buffer 2X (含有IU Taq DNA聚合酶，IOmM Tris-HCl,pH 8. 3,50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 250 μ M dNTPs)，引物各為 0. 5 μ Μ。反應(yīng)條件為， 95 0C 5min預變性，95 °C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 30秒，循環(huán)35次，72°C保溫2分鐘。PCR產(chǎn) 物以瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后鑒定是否存在擴增產(chǎn)物。2)利用本發(fā)明中所設(shè)計的特異性探針序列進行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因 NOS特異性基因芯片檢測方法所述的篩選基因NOS探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-AAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTA所述的探針對照轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性探針序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGCCCGTCACCGAGATCTGATGTTCTCTCCTCCATTGATG。所述的探針對照轉(zhuǎn)基因玉米Btll轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-TGTATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGATTTTTGGTGGAG。所述的探針對照的轉(zhuǎn)基因玉米TC1507轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly (dT) 15-GCGGAACACAAGAACGAAAGCACCTTTTCATTCTTTCATA。所述的探針對照轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2- (CH2) 6-0-Poly(dT)15-ACCTGAACGAGGACTTTCGGTAGCCTTCTTTCATTTCCGA。所述的探針對照轉(zhuǎn)基因玉米GA21轉(zhuǎn)化體特異性探針的序列為NH2-(CH2) 6-0-Poly (dT)15-ATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGTCCG。在30 μ L 二重熒光PCR反應(yīng)體系中以IOOng待測植物的基因組DNA為模板，其他各組分終濃度為PCR Buffer 2X(含有 IU Taq DNA 聚合酶，IOmM Tris-HCl, pH 8.3， 50mM KCl, 1. 5mM MgCl2, 250 μ M dNTPs)，0. 4 μ M 上下游玉米引物，0. 04 μ M 的 18S rRNA 的 上下游引物。反應(yīng)條件為，95°C 5min預變性，95°C 30秒，58°C 30秒，72°C 30秒，循環(huán)35 次，72°C保溫5分鐘。取7yL PCR產(chǎn)物與8μ L雜交液(3XSSC，0. 2% SDS，25%甲酰胺， 5XDenhart' s，33nmol/L PC雜交陽性對照樣品)混勻后，于PCR儀中95°C熱變性IOmin, 冰浴驟冷后加樣于芯片上的點樣區(qū)，蓋玻片封片。42°C水浴雜交2h。雜交后，芯片分別在 421的洗液1(2\55(，0. 1 X SDS)和洗液 11(0. 2 X SSC)中各清洗 4min，500r/min 離心甩 干，用晶芯 LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進行掃描(波長532nm)。PMT為850v，Power 為90v，產(chǎn)生分析精度為ΙΟμπι的16位TIFF圖像。用LuxScan3. 0軟件進行數(shù)據(jù)采集和圖像分析。所有的反應(yīng)都重復3次。以非轉(zhuǎn)基因玉米的基因組DNA作為對照。3、實驗結(jié)果1)應(yīng)用特異性引物序列進行篩選基因NOS特異性定性PCR檢測方法應(yīng)用引物以提取的基因組為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖3所示。由圖可見，只有 含有NOS基因的轉(zhuǎn)基因玉米GA21成功擴增出特異性180bp PCR產(chǎn)物，而其他轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn) 基因樣品做模板時都沒有擴增產(chǎn)物可觀察到。2)利用本發(fā)明中所設(shè)計的特異性探針序列進行篩選基因NOS特異性基因芯片檢 測方法針對外源基因與玉米基因組連接區(qū)域設(shè)計相應(yīng)的探針，利用二重熒光PCR產(chǎn)物與 芯片雜交，經(jīng)反復對雜交溫度、雜交時間等條件的優(yōu)化，驗證是否產(chǎn)生預期的有效信號。并 且無其他探針產(chǎn)生非特異性信號來說明探針的特異性。結(jié)果如圖4(a)、(b)所示。探針特 異性檢驗結(jié)果表明，針對轉(zhuǎn)化體特異性基因所設(shè)計的探針符合預期設(shè)計的目的，核酸固定 的陽性對照(HEX)，雜交陽性對照(PC)，陽性質(zhì)控探針(18S rRNA)和篩選基因NOS特異性 相應(yīng)探針點樣位置均有陽性信號，而陰性質(zhì)控探針(SHDC-人類表達特異蛋白基因)，空白 對照(點樣液)及其他轉(zhuǎn)基因玉米探針對照均無陽性信號出現(xiàn)，說明所設(shè)計的探針具有很 好的特異性，所建立的芯片檢測平臺是可靠的。以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS特異性基因芯片 檢測分析提供了基于簡單、可靠的測定方法，可以用于轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS 的檢測。本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因標識提供了一種有用的參考，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了必要的 手段。
權(quán)利要求
一種檢測含篩選基因NOS的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，其特征在于包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因NOS探針以及核酸固定的陽性對照、雜交陽性對照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、空白對照；所述陽性質(zhì)控探針為18S rRNA，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG；所述陰性質(zhì)控探針為SHDC-人類表達特異蛋白基因，其探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATTGCCAGA AGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC；所述空白對照為點樣液-雙蒸水；其特征在于所述的篩選基因NOS探針序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-AAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測含篩選基因NOS的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，其特 征在于還包括探針對照，探針對照選自轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米 Btll轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米TC1507轉(zhuǎn)化體特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米MonSlO轉(zhuǎn)化體 特異性探針、轉(zhuǎn)基因玉米GA21轉(zhuǎn)化體特異性探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測含篩選基因NOS的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，其特 征在于所述的探針對照的點樣濃度為25ymol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述檢測含篩選基因NOS的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片， 其特征在于所述的陽性對照、雜交陽性對照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、空白對照、篩 選基因NOS探針的點樣濃度均為25 μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測含篩選基因NOS的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片 在檢測轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS特異性中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述芯片應(yīng)用的方法是提取待測植物 的基因組DNA，然后在二重熒光PCR反應(yīng)體系中擴增；然后取PCR產(chǎn)物，與雜交液混勻后，于 PCR儀中95°C熱變性lOmin，冰浴驟冷后加樣于芯片上的點樣區(qū)，蓋玻片封片；42°C水浴雜 交2h ；雜交后，芯片分別在42°C的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min離心甩干，用 晶芯LuxScanTM IOK激光共聚焦掃描儀進行掃描，波長532nm ；PMT為850V，Power為90V， 產(chǎn)生分析精度為10 μ m的16位TIFF圖像；用LuxScan3. O軟件進行數(shù)據(jù)采集和圖像分析， 分析掃描圖像的熒光強度值以確定待測植物是否含有NOS基因；所述雜交液包括3XSSC，0. 2% SDS，25% 甲酰胺，5XDenhart，s，33nmol/L PC 雜交陽 性對照樣品；所述洗液I包括:2XSSC,0. IXSDS ；所述洗液II為0. 2XSSC。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測含篩選基因NOS的轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的基因芯片，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。該種芯片包括表面醛基化修飾的載玻片和陣列涂布于其上的篩選基因NOS探針以及核酸固定的陽性對照、雜交陽性對照、陽性質(zhì)控探針、陰性質(zhì)控探針、空白對照；其中所述的篩選基因NOS探針的序列為NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-AAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTA。本發(fā)明設(shè)計的檢測轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS的基因芯片，能進行轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品篩選基因NOS特異性檢測，具有較高的特異性。
文檔編號C12Q1/68GK101824473SQ20101012369
公開日2010年9月8日 申請日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者孫廷林, 孫紅煒, 李凡, 李萌, 武海斌 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所