用兩性離子化合物提高核酸雜交特異性的方法

專利名稱：用兩性離子化合物提高核酸雜交特異性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用特定的兩性離子化合物提高核酸雜交特異性的方法。
背景技術(shù)：
雜交特異性(也稱為雜交嚴(yán)格性)指當(dāng)兩條互補(bǔ)核酸和非互補(bǔ)核酸進(jìn)行雜交時(shí)， 互補(bǔ)核酸相互形成特異性雜合體的程度?？偟膩?lái)說(shuō)，已試圖通過(guò)調(diào)整緩沖液中的鹽濃度和 反應(yīng)溫度，或者通過(guò)加入添加劑如Denhart溶液，或添加非特異性DNA或RNA以誘導(dǎo)雜交競(jìng) 爭(zhēng)來(lái)獲得更高的雜交特異性。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是擴(kuò)增核酸的方法，包括核酸的變性、退火和延伸，在退火 進(jìn)程期間，發(fā)生探針與目標(biāo)核酸的雜交。可以根據(jù)探針與目標(biāo)核酸之間的同源程度更改PCR 的條件。當(dāng)在給定PCR條件下提高退火溫度時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降，然而，當(dāng)降 低退火溫度時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率增加。雜交特異性對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(尤其是對(duì)多重PCR)有不利影響。多重PCR使待擴(kuò) 增的不同基因能夠在同一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增。也就是說(shuō)，將能夠擴(kuò)增各自的目標(biāo)序列的不同 引物組放在一個(gè)反應(yīng)器中，目標(biāo)序列的擴(kuò)增在單個(gè)PCR中同時(shí)進(jìn)行。用于多重PCR的引物 應(yīng)當(dāng)只對(duì)目標(biāo)DNA序列是特異性的，并且不應(yīng)干擾其它引物的反應(yīng)，這樣目標(biāo)DNAs可以充 分地?cái)U(kuò)增。多重PCR產(chǎn)生許多目標(biāo)雜交產(chǎn)物，它們由許多的電泳條帶所顯示。因此，如果退 火過(guò)程中雜交特異性低，那么除了許多目標(biāo)條帶之外，在電泳凝膠上還會(huì)出現(xiàn)許多的條帶， 在多重PCR結(jié)果分析中帶來(lái)問(wèn)題。因此，強(qiáng)烈需要提高雜交特異性。美國(guó)專利4，936，963公開了是使用兩性離子物質(zhì)組氨酸減少電泳所用時(shí)間以降 低電泳中總傳導(dǎo)率的方法。該發(fā)明利用兩性離子物質(zhì)，本發(fā)明也利用兩性離子物質(zhì)。然而， 其使用兩性離子物質(zhì)的目的是減少電泳所用時(shí)間，不同于本發(fā)明的目的，本發(fā)明的目的是 提高核酸雜交特異性。出于這種考慮，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了研究，目的是解決相關(guān)領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)所暴 露出來(lái)的問(wèn)題，發(fā)現(xiàn)核酸雜交特異性的提高可以通過(guò)向核酸雜交反應(yīng)體系尤其是多重PCR 中添加特定的兩性離子化合物來(lái)誘導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供通過(guò)在含特定兩性離子化合物的溶液中雜交核酸來(lái)提高核酸雜交特 異性的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了提高核酸雜交特異性的方法，該方法包括在含兩 性離子化合物的溶液中雜交核酸，所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1_丙磺 酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl-ammonio]-1-propane sulfonate) (CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)_2_羥基-1-丙磺酸 鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法，該方法包括在含兩性離 子化合物的溶液中雜交引物和目標(biāo)核酸，所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1-丙 磺酸化4 幻、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨 基)-2_羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于核酸雜交的包含兩性離子化合物的溶液， 所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3- [ (3-膽酰胺基丙基)二甲 基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2_(環(huán) 己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含用于核酸雜交的溶液的核酸雜交試劑盒， 所述溶液包含兩性離子化合物，所述兩性離子化合物選自3-(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸 (CAPS)、3- [ (3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)_2_羥 基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。更具體地，本發(fā)明涉及1.提高核酸雜交特異性的方法，所述方法包括在含有選自以下的兩性離子化合物的溶液中雜交核酸3_(環(huán)己基氨基)-1_丙 磺酸化4 幻、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨 基)-2_羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。2.項(xiàng)1的方法，其中所述兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)為0. 2至3%。3.項(xiàng)1的方法，其中所述雜交選自DNA與DNA之間的雜交、DNA與RNA之間的雜 交，以及RNA與RNA之間的雜交。4.擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法，所述方法包括在溶液中雜交引物和目標(biāo)核酸，所述溶液 含有選自以下的兩性離子化合物3_(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙 基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO) 和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。5.項(xiàng)4的方法，其中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實(shí)施目標(biāo)核酸的擴(kuò)增。6.項(xiàng)5的方法，其中所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為多重PCR。7.項(xiàng)4的方法，其中所述引物對(duì)于大量病原體的檢測(cè)是特異性的。8.項(xiàng)4的方法，其中所述兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)為0. 2至3%。9.用于核酸雜交的溶液，其含有選自以下的兩性離子化合物3_(環(huán)己基氨 基)-1_丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán) 己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。10.核酸雜交試劑盒，其包含項(xiàng)9的用于核酸雜交的溶液。


通過(guò)參考附圖詳細(xì)描寫其示例性實(shí)施方案，本發(fā)明上述以及其他特征和優(yōu)勢(shì)將更 為明顯，其中圖1為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加3_(環(huán)
4己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降；圖2為目標(biāo)雜交產(chǎn)物和非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率的定量評(píng)估中，用Agilent 2100 Bioanalyzer獲得的譜圖；圖3為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加3_ (環(huán) 己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下 降；圖4為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加2_ (環(huán) 己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降；和圖5為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加甜菜 堿時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)在將參考附圖更為充分地描述本發(fā)明，附圖中顯示本發(fā)明的示例性實(shí)施方案。 然而，本發(fā)明可以許多不同形式來(lái)具體體現(xiàn)，而不應(yīng)理解為限于本文所列出的實(shí)施方案；相 反，提供這些實(shí)施方案將使本公開全面和完整，將充分地為本領(lǐng)域技術(shù)人員傳達(dá)本發(fā)明的 構(gòu)思。核酸雜交指不同來(lái)源的核酸之間的結(jié)合，雜交的條件可以根據(jù)所要結(jié)合的核酸的 序列同源性而有所不同。換句話說(shuō)，如果受試核酸之間的序列同源性高，則使用嚴(yán)格條件， 如果序列同源性低，則使用溫和條件。當(dāng)雜交條件嚴(yán)格時(shí)，雜交特異性提高，此雜交特異性 的提高導(dǎo)致非特異性雜交產(chǎn)物產(chǎn)率的下降。然而，在溫和雜交條件下，雜交特異性下降，此 雜交特異性的下降導(dǎo)致非特異性雜交產(chǎn)物產(chǎn)率的提高。尤其在后一種情況下，需要降低非 特異性雜交產(chǎn)物的水平，因此，在本發(fā)明中，嘗試通過(guò)在含特定兩性離子化合物的溶液中雜 交核酸而提高核酸雜交特異性。核酸之間的雜交可以分為DNA與DNA之間的雜交、DNA與RNA之間的雜交、和RNA 與RNA之間的雜交。核酸雜交反應(yīng)通常分為Southern雜交反應(yīng)或Northern雜交反應(yīng)。核 酸雜交反應(yīng)對(duì)于DNA芯片尤其重要，因?yàn)閷?shí)施雜交反應(yīng)時(shí)，可能影響特異于探針的目標(biāo)核 酸的快速檢測(cè)，其中所述探針固定在芯片上，且含目標(biāo)核酸的樣品添加到固定的探針上。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，提供通過(guò)在含特定兩性離子化合物的溶液中雜交核酸 來(lái)提高核酸雜交特異性的方法。兩性離子化合物指在中性溶液中能夠同時(shí)作為酸和堿起 作用的化合物。兩性離子化合物的例子包括甜菜堿、氨基酸、3_(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸 (CAPS)、3- [ (3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)_2_羥 基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)等。兩性離子化合物甜菜堿 和CAPS具有如下所示的結(jié)構(gòu)。
5 甜菜堿大多數(shù)情況下，兩性離子化合物在核酸雜交反應(yīng)中都傾向于提高核酸雜交特異 性，因此降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，但不幸的是，相同化合物也降低目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn) 率。然而，一些兩性離子化合物顯示出所期望的特征，即降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率而提 高核酸雜交特異性，同時(shí)維持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了具有此期望特 征的兩性離子化合物，包括3_(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二 甲銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、2-(環(huán)己 基氨基)乙磺酸鹽(CHES)等。當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的這種兩性離子化合物添加到核酸雜交反應(yīng)體系時(shí)，核 酸雜交反應(yīng)的特異性提高，結(jié)果可以減少假陽(yáng)性條帶的產(chǎn)生，假陽(yáng)性條帶的產(chǎn)生在雜交反 應(yīng)期間帶來(lái)顯著的問(wèn)題。假陽(yáng)性條帶是分離目標(biāo)基因方法的結(jié)果，其在核酸雜交反應(yīng)的特 異性下降時(shí)大量產(chǎn)生。這些假陽(yáng)性條帶使得目標(biāo)雜交產(chǎn)物的分離很困難，在處理時(shí)間和操 作成本方面給分離目標(biāo)基因的方法帶來(lái)不利影響。因此，目標(biāo)基因的分離強(qiáng)烈需要消除這 樣的非特異性雜交產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)可以為0.2至3%。當(dāng)兩 性離子化合物的濃度以重量計(jì)低于0. 2%時(shí)，核酸雜交特異性降低，降低非特異性雜交產(chǎn)物 產(chǎn)率的效果將因此下降。當(dāng)兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)高于3%時(shí)，目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn) 率下降。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法，包括在溶液中雜交引 物和目標(biāo)核酸，所述溶液含有選自以下的兩性離子化合物3_(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸 (CAPS)、3- [ (3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1 _丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)_2_羥 基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前的實(shí)施方案，擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法包括變性、退火和延伸，探針與 目標(biāo)核酸之間的雜交發(fā)生在退火過(guò)程期間。當(dāng)把根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物添 加到雜交反應(yīng)體系時(shí)，探針與目標(biāo)核酸之間的雜交特異性增強(qiáng)。此核酸雜交特異性的增強(qiáng) 導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)率的降低，只有所需的目標(biāo)雜交產(chǎn)物特異地?cái)U(kuò)增。擴(kuò)增目標(biāo)核酸的方法的例子包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈 置換擴(kuò)增、核酸依賴的擴(kuò)增、修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(impair chain reaction)、解旋酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (helicase chain reaction)、QB復(fù)制酶擴(kuò)增、以及連接(反應(yīng))激活的轉(zhuǎn)錄(ligation activated transcription)，優(yōu)選使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)施目標(biāo)核酸的擴(kuò)增。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，PCR為多重PCR。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的擴(kuò)增目標(biāo)核 酸的方法預(yù)計(jì)用于增強(qiáng)核酸雜交反應(yīng)的特異性，更具體地，預(yù)計(jì)用于消除目標(biāo)基因擴(kuò)增期 間多重PCR的非特異性雜交產(chǎn)物，其可用于鑒定大量病原體。大多數(shù)情況下，兩性離子化合物都傾向于提高核酸雜交反應(yīng)中的核酸雜交特異性，因此降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率， 但不幸的是，同樣的化合物也降低目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。然而，一些兩性離子化合物顯示出 所期望的特征，即降低非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率而提高核酸雜交特異性，同時(shí)維持目標(biāo)雜 交產(chǎn)物的產(chǎn)率。這些所期望的特征構(gòu)成能夠通過(guò)降低多重PCR中的假陽(yáng)性條帶正確鑒定特 異性病原體的基本要素。非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)生成為多重PCR中的特殊問(wèn)題。多重PCR允許通過(guò)單一 PCR檢測(cè)大量基因，電泳凝膠上出現(xiàn)許多條帶。在多重PCR中，如果除了所需大小的基因雜 交產(chǎn)物的條帶之外，還產(chǎn)生太多非特異性雜交產(chǎn)物的條帶，則不可能進(jìn)行特異性病原體的 正確鑒定。因此，在多重PCR中，有必要減少非特異性雜交產(chǎn)物條帶的數(shù)目。當(dāng)把適量的根 據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物添加到多重PCR中時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的數(shù)目 明顯減少。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，多重PCR消除非特異性雜交產(chǎn)物，而保留目標(biāo)雜交 產(chǎn)物。如以上所討論的，當(dāng)把適量的兩性離子化合物添加到多重PCR和時(shí)，非特異性雜交產(chǎn) 物條帶的數(shù)目明顯減少。然而，如果目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率也隨著非特異性雜交產(chǎn)物的減少 而降低，則不能獲得所需的效果。大多數(shù)情況下，兩性離子化合物同時(shí)降低非特異性雜交產(chǎn) 物的產(chǎn)率和目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。然而，當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物時(shí)， 有利地，同時(shí)減小非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率和維持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，可以以按重量計(jì)0. 2至3%的濃度使用所述兩性離 子化合物。當(dāng)兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)低于0. 2%時(shí)，核酸雜交特異性降低，降低非 特異性雜交產(chǎn)物產(chǎn)率的效果將因此降低。當(dāng)兩性離子化合物的濃度以重量計(jì)高于3%時(shí)，目 標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率將降低。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，引物對(duì)大量病原體的檢測(cè)來(lái)說(shuō)是特異的。當(dāng)使用根 據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物實(shí)施多重PCR時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的條帶數(shù)目減 少，同時(shí)維持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。因此，現(xiàn)在可以輕易地解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，所 述問(wèn)題即由于非特異性雜交產(chǎn)物的高產(chǎn)率而難以正確檢測(cè)大量的基因。大量基因的檢測(cè) 包括與病原體、遺傳性疾病等等相關(guān)的基因序列的分析。例如，導(dǎo)致人類呼吸性疾病的最 常見的病毒包括麻疹病毒、腸道病毒、鼻病毒、SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-coV)、水痘帶狀皰 疹病毒(VSV)、腺病毒、人副流感病毒1(HPIV 1)、人副流感病毒2(HPIV2)、人副流感病毒 3 (HPIV 3)、流感病毒A(IVA)、流感病毒B (IVB)、呼吸道合胞病毒A (RSVA)、和呼吸道合胞病 毒B(RSVB)?？焖偬禺惖貦z測(cè)這些病毒對(duì)于診斷、預(yù)放和治療呼吸性疾病是必需的，通過(guò)使 用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物實(shí)施多重PCR，可以快速正確地檢測(cè)所述病毒。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了用于核酸雜交的溶液，所述溶液含有選自以 下的兩性離子化合物3_(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基 銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)、和2_(環(huán)己 基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。根據(jù)本發(fā)明當(dāng)前實(shí)施方案的用于核酸雜交的溶液含有核酸雜 交反應(yīng)所需的多種化合物。當(dāng)使用根據(jù)當(dāng)前實(shí)施方案的用于核酸雜交的溶液實(shí)施核酸雜交 反應(yīng)時(shí)，核酸雜交的特異性增強(qiáng)，可以獲得更好的雜交結(jié)果，其中除了所述的多種化合物之 外，所述溶液還含有根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物。核酸雜交反應(yīng)對(duì)于DNA芯片 是尤其重要的。當(dāng)探針固定在芯片上時(shí)，向其添加含有目標(biāo)核酸的樣品，用本實(shí)施方案的核酸雜交溶液實(shí)施核酸雜交反應(yīng)，由此可以快速地檢測(cè)特異于探針的目標(biāo)核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供包含用于核酸雜交的溶液的核酸雜交試劑盒， 所述溶液含有選自以下的兩性離子化合物3_(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽 酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽 (CAPSO)、和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。所述核酸雜交試劑盒可以包含核酸雜交必 需的多種組成成分，所述組成成分可能是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。以下將參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明性目的，不應(yīng)解 釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例1 多重PCR中CAPS對(duì)核酸雜交特異性的影響從呼吸道感染的主要病原體流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)(來(lái)自 Samsung Medical Center)分離基因組 DNA (gDNA)，作為多重 PCR 的模板，以 0. 2ng 或 Ing 的量使用所分離的gDNA。以0. 5%或的濃度使用作為根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離 子化合物的3-(環(huán)己基氨基)-1_丙磺酸(CAPS)，以實(shí)施多重PCR。用GeneAmp PCR系統(tǒng) 9700 (ABI)、PCR 混合物(模板 gDNAO. 2ng 或 lng、CAPS 0· 5%或 1 %、1 X Taq Pol 緩沖液、 dNTP 混合物每種 200yM、PCR 引物每種 400nM(SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO :10) JPTaq Pol 5個(gè)單位)，于95°C 1分鐘，使DNA完全變性，然后對(duì)所述PCR混合物進(jìn)行25個(gè)PCR循環(huán) (950C 5秒、62°C 13秒、72°C 15秒)，72°C最后延伸1分鐘，如此實(shí)施多重PCR。圖1為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加CAPS 時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。由圖1可以看到，與沒有添加CAPS的 樣品(稱為-CAPS)相比，添加有CAPS的樣品(稱為+CAPS)中非特異性雜交產(chǎn)物條帶的 強(qiáng)度明顯降低，當(dāng)CAPS的濃度提高時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低。在添加有 CAPS (+CAPS)的情況下，非特異性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低，但保持了目標(biāo)雜交產(chǎn)物條 帶的強(qiáng)度。此外，當(dāng)如預(yù)期的增加模板DNA的量時(shí)，目標(biāo)雜交產(chǎn)物的量和非特異性雜交產(chǎn)物 的量也增加。在用CAPS處理期間，為了定量評(píng)估產(chǎn)生目標(biāo)雜交產(chǎn)物和非特異性雜交產(chǎn)物的程 度，使每種PCR產(chǎn)物都進(jìn)行電泳，然后用Agilent 2100Bioanalyzer檢測(cè)熒光。圖2為目標(biāo)雜交產(chǎn)物和非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率定量評(píng)估中用 Agilent2100Bioanalyzer獲得的譜圖。參見圖2，在圖2主圖下面的放大圖中所示的兩條 曲線當(dāng)中，上曲線對(duì)應(yīng)于用0.2ng gDNA而未經(jīng)CAPS處理所獲得的圖線，下曲線對(duì)應(yīng)于用經(jīng) 0.5% CAPS處理的0.2ng gDNA獲得的圖線。箭頭指示非特異性雜交產(chǎn)物的條帶位置。如 圖2所示，無(wú)論gDNA是否經(jīng)由CAPS處理過(guò)，目標(biāo)雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度都幾乎是一致的。然 而，當(dāng)用CAPS處理時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的條帶大部分被消除。因此，可以看到，當(dāng)把根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的兩性離子化合物CAPS添加到多重 PCR中時(shí)，非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率明顯降低，同時(shí)保持了目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率。由此發(fā)現(xiàn) 添加CAPS可用于檢測(cè)特定病原體。實(shí)施例2 多重PCR中CAPSO和CHES對(duì)核酸雜交特異性的影響為研究多重PCR中不同類型兩性離子化合物的核酸雜交特異性，還使用了 CAPSO 和CHES。以與實(shí)施例1中相同的方式進(jìn)行相同的試驗(yàn)，不同之處是分別向多重PCR添加濃 度為0. 2%,0. 4%,0. 8%禾口 1.6%^ CAPSO和CHES,并使用Ing的流感嗜血桿菌gDNA模板。
圖3為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加CAPSO 時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。參見圖3，對(duì)對(duì)照物進(jìn)行不添加CAPSO的 多重PCR。由圖3可以看到，與不添加CAPSO的情況相比，在添加CAPSO的情況下，非特異性 雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低，并且更高的CAPSO濃度導(dǎo)致條帶強(qiáng)度更顯著的降低。圖4 為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加CHES時(shí)獲得，結(jié)果 顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。如圖4所示，CHES產(chǎn)生與CAPSO類似的結(jié)果。實(shí)施例3 多重PCR中兩性離子化合物的類型對(duì)核酸雜交特異性的影響使用甜菜堿研究多重PCR中不同類型兩性離子化合物的核酸雜交特異性。以與實(shí) 施例1中相同的方式實(shí)施相同的試驗(yàn)，不同之處是用Solgent，Inc.的5X頻帶輔助器具 (band doctor)以 2· 5 μ 1 (0· 25X)、5 μ 1 (0· 5X)、10 μ 1 (1 X)、和 15 μ 1 (1· 5X)的量將甜 菜堿添加到多重PCR中，并且分別以lng、0. Ing和0. Olng的量使用流感嗜血桿菌gDNA模 板。圖5為顯示PCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果的照片，所述PCR產(chǎn)物在向多重PCR添加甜菜 堿時(shí)獲得，結(jié)果顯示非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率下降。參見圖5，對(duì)照實(shí)施不添加甜菜堿的多 重PCR，數(shù)字〃 1〃、“ 2〃和"3"指用于PCR的模板gDNA的量，例如分別為lng、0. Ing 和0. Olngo由圖5可以看到，與不添加甜菜堿的情況相比，在添加甜菜堿的情況下，非特異 性雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度顯著降低，并且更高的甜菜堿濃度導(dǎo)致條帶強(qiáng)度更顯著的降低。然 而，可以看到，與CAPS的情況不同，雖然隨著甜菜堿濃度的不斷增加，非特異性雜交產(chǎn)物條 帶的強(qiáng)度顯著降低，但目標(biāo)雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度也顯著降低。因此，顯示甜菜堿不適合于提 高核酸雜交特異性以檢測(cè)特定病原體的目的。因此，并非所有的兩性離子化合物都顯示本發(fā)明的效果，只有特定的兩性離子化 合物如CAPS能夠?qū)е路翘禺愋噪s交產(chǎn)物條帶強(qiáng)度的降低，同時(shí)保持目標(biāo)雜交產(chǎn)物條帶的強(qiáng)度。如以上所討論的，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的方法允許在多重PCR中減小非特異性雜 交產(chǎn)物的產(chǎn)率，同時(shí)保持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，因此提高核酸雜交的特異性，可以有效地用 于特定病原體的鑒定、遺傳性疾病的診斷、基因序列的分析等等。雖然已經(jīng)詳細(xì)地展示了本發(fā)明并參考其示例性實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員會(huì)了解可以在其中作出多種形式上和細(xì)節(jié)上的改變，而不背離下述權(quán)利要求 確定的本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
提高核酸雜交特異性的方法，所述方法包括在含有選自以下的兩性離子化合物的溶液中雜交核酸3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)，其中CAPS在溶液中的濃度以重量計(jì)為0.2至3％，CAPSO和CHES在溶液中的濃度以重量計(jì)為0.8至3％。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述雜交選自DNA與DNA之間的雜交、DNA與RNA之間的 雜交，以及RNA與RNA之間的雜交。
全文摘要
提供提高核酸雜交特異性的方法，包括在含有選自以下的兩性離子化合物的溶液中雜交核酸3-(環(huán)己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)、3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、3-(環(huán)己基氨基)-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CAPSO)和2-(環(huán)己基氨基)乙磺酸鹽(CHES)。所述方法允許在多重PCRs中減小非特異性雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率而同時(shí)保持目標(biāo)雜交產(chǎn)物的產(chǎn)率，由此提高核酸雜交的特異性。因此，所述方法能夠有效地用于特定病原體的鑒定、遺傳性疾病的診斷、基因序列的分析等等。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101886131SQ20101022236
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2006年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者李貞男, 白象鉉 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社