專利名稱：一種來源于芽孢桿菌的胞外普魯蘭酶編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用基因工程手段獲得的一種普魯蘭酶編碼基因及其應(yīng)用，屬于微生 物、酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淀粉質(zhì)原料是迄今最為廣泛應(yīng)用的工業(yè)原料之一，淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀 粉構(gòu)成的混合物，其中直鏈淀粉由葡萄糖通過α-1，4-糖苷鍵連接形成，而支鏈淀粉還含 有分支鏈，連接分支處的是α-1，6_糖苷鍵。淀粉水解酶是能對(duì)淀粉質(zhì)原料進(jìn)行水解利用 的一類酶，以α-淀粉酶和糖化酶最為常用，這兩種酶均作用于淀粉分子的α-1，4_糖苷 鍵。由于工業(yè)上使用的淀粉一般都含有一定量的支鏈，因此要將淀粉分子徹底水解就需要 使用一類能專一性切開支鏈淀粉分支點(diǎn)α-1，6-糖苷鍵的酶，這種酶一般稱為解支酶，以 普魯蘭酶和異淀粉酶最為常用，兩者都能水解支鏈淀粉中的α-1，6-糖苷鍵，而只有前者 能水解普魯蘭分子中的α-1，6_糖苷鍵。普魯蘭酶與α-淀粉酶和糖化酶配合使用能使淀 粉分子徹底水解為葡萄糖，提高淀粉質(zhì)原料利用率，因此在淀粉制糖、燃料酒精生產(chǎn)等行業(yè) 有重要的用途和良好的市場(chǎng)前景。另外普魯蘭酶在直鏈淀粉制備，高果糖漿、高麥芽糖漿 等的生產(chǎn)中也有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明從自然界中篩選到一株具有普魯蘭降解能力的芽孢 桿菌，其編號(hào)為Bacillus sp.042。該細(xì)菌已被江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息 中心(http:// www. cicim-cu. Jiangnan. edu. cn)收藏，其收藏編號(hào)為 Bacillus sp. CICIM B4312。利用基因工程技術(shù)從Bacillus sp. 042基因組DNA中克隆了一條普魯蘭酶編碼基 因pulA042，功能鑒定證實(shí)pulA042編碼I型普魯蘭酶。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是主要利用基因重組技術(shù)從普魯蘭酶產(chǎn)生菌基因組 DNA中克隆胞外普魯蘭酶編碼基因并確認(rèn)其功能，為利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)普魯蘭酶提供 基因資源。本發(fā)明的技術(shù)方案一種來源于芽孢桿菌Bacillus sp. 042的胞外普魯蘭酶編碼 基因，命名為PU1A042，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其編碼的普魯蘭酶原酶的氨基酸序 列為SEQ ID NO :2，基因pulA042與克隆載體pMD18_T Simple組成的重組質(zhì)粒pMD_PA的 大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，分類命名為JM109/pMD-PA，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào) CCTCC NO :M 2010200。所述普魯蘭酶編碼基因pulA042的獲得方法如下(1)從自然界篩選產(chǎn)普魯蘭酶的芽孢桿菌從自然界采集土樣，采用高溫處理殺 死營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞，富集芽孢桿菌。在以普魯蘭為唯一碳源的培養(yǎng)基上富集產(chǎn)普魯蘭酶細(xì)菌。進(jìn) 一步通過搖瓶培養(yǎng)和普魯蘭酶酶活檢測(cè)篩選產(chǎn)胞外普魯蘭酶的細(xì)菌。用16s rDNA基因序 列分析確認(rèn)所篩選微生物屬于芽孢桿菌屬。此輪工作選定芽孢桿菌Bacillus sp.042為普 魯蘭酶基因克隆研究的出發(fā)菌。
(2)Bacillus sp. 042普魯蘭酶基因的克隆第一步根據(jù)細(xì)菌普魯蘭酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，以Bacillus sp. 042染色體DNA 為模板PCR獲得普魯蘭酶基因部分片段。序列分析獲得該片段核苷酸序列，并根據(jù)所獲DNA 序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向PCR引物。第二步利用反向PCR技術(shù)獲得普魯蘭酶編碼基因的完整序列。利用上一步設(shè)計(jì)的一對(duì)反向PCR引物，通過PCR獲得普魯蘭酶編碼基因編碼區(qū)完 整DNA片段，該片段與克隆載體pMDIS-T Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含氨芐青霉 素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從獲得的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒測(cè)序，獲得普魯蘭酶編碼基因編碼 區(qū)完整序列，所獲普魯蘭酶編碼基因命名為PU1A042，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1。第三步獲得Bacillus sp. 042普魯蘭酶編碼基因根據(jù)SEQ ID NO :1再設(shè)計(jì)一對(duì)引物以擴(kuò)增Bacillus sp. 042普魯蘭酶編碼區(qū)完 整基因，以Bacillus sp. 042染色體DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得一 2. 5kb左右的DNA片段， 擴(kuò)增片段純化后與克隆載體PMD18-T Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含氨芐青霉素 的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。其編碼的普魯蘭酶原酶的氨基酸序列為SEQ ID NO :2?；?pulA042與克隆載體pMD18-T Simple組成的重組質(zhì)粒pMD_PA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，其分類命 名為JM109/pMD-PA，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏編號(hào)CCTCC NO =M 2010200。普魯蘭酶編碼基因pulA042的應(yīng)用普魯蘭酶編碼基因pulA042能用于在不同宿主細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用 于分解淀粉和糊精分子中α-1，6糖苷鍵。材料和方法普通分子生物學(xué)方法除非提及，DNA操作和轉(zhuǎn)化按照標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行(Sambrook等1989分 子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))。除非另外提及，PCR操作使用標(biāo)準(zhǔn)方法和PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行，可參見(Sambrook等 1989分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))。DNA操作所使用的酶根據(jù)供應(yīng)商的說明書使用。引物均為本專利發(fā)明人設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成?？寺≥d體pMD18-T Simple為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為D506A。反向PCR 技術(shù)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[Ochman H, Gerber AS and Hartl DL (1988) Genetic applications of an inverse polymerase chain reaction. Genetics 120:621-623]。大腸桿菌JM109，大腸桿菌BL21(DE3)，大腸桿菌表達(dá)載體pET28a均由中國(guó)高校工 業(yè)微生物資源與信息中心(http://www. cicim-cu. jiangnan. edu. cn)提供。DNA操作使用的酶和試劑盒除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性內(nèi)切酶，連接酶等均為大連寶 生物工程有限公司產(chǎn)品。PCR反應(yīng)使用的DNA聚合酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品Ex Taq，產(chǎn)品編號(hào)為DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反應(yīng)時(shí)所使用的緩沖液均為購買酶時(shí) 附贈(zèng)，緩沖液濃度均為反應(yīng)所需濃度的10倍。柱式DNA片段回收試劑盒以及從電泳凝膠 中回收DNA片段的試劑盒均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)分別為DV807A和DV805A。其他試劑普魯蘭為Sigma公司產(chǎn)品，紅色普魯蘭為Megazyme公司產(chǎn)品，糯米淀粉和玉米淀 粉均為浙江菱湖淀粉廠產(chǎn)品，酵母氮基為Difco公司0/0型酵母氮基，該產(chǎn)品不含碳源和氨 基酸。紅色普魯蘭、糯米淀粉和玉米淀粉溶液均采用10mM、pH 6. O的磷酸緩沖液配制，磷酸 緩沖液使用雙蒸水配制。誘導(dǎo)大腸桿菌基因表達(dá)使用的IPTG為寶生物工程有限公司產(chǎn)品， 產(chǎn)品編號(hào)為D9030A。培養(yǎng)基LB在“Sambrook等1989分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”中描述。以普魯蘭為唯一碳源的固 體培養(yǎng)基酵母氮基lg/L，普魯蘭2g/L，瓊脂粉15g/L，用雙蒸水配制；發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮 基lg/L，普魯蘭2g/L，(NH3)2SO4O. lg/L，用雙蒸水配制。搖瓶培養(yǎng)均采用500mL三角瓶，在 37°C條件下按220r/min條件在恒溫?fù)u瓶柜中進(jìn)行。碘溶液按文獻(xiàn)[姜錫瑞等.新編酶制劑實(shí)用技術(shù)手冊(cè).2002，北京輕工業(yè)出版社]中第 398頁“稀碘液”配制。細(xì)菌的16s rDNA基因序列分析按文獻(xiàn)進(jìn)行[陳源源，牛丹丹，王正祥.一種快速鑒定細(xì)菌的方法.食品與發(fā)酵工 業(yè)，2007，33 (5) :29-31]。普魯蘭酶活力測(cè)定普魯蘭酶酶活測(cè)定按文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行[Bibel M, Brett C, Gosslar U， et al. Isolation and analysis of amylolytic enzymes of the hyperthermophi1ic bacteriumThermotoga maritime. FEMS Microbiol Lett, 1998,158 :9 15]本發(fā)明的有益效果本發(fā)明實(shí)施后獲得的普魯蘭酶編碼基因編碼的普魯蘭酶在淀 粉加工中具有分解淀粉和糊精中α-1，6糖苷鍵的功能，利用本發(fā)明獲得的普魯蘭酶編碼 基因構(gòu)建重組微生物可實(shí)現(xiàn)普魯蘭酶的高效率生產(chǎn)。生物材料樣品保藏基因pulA042與克隆載體pMD18_T Simple組成的重組質(zhì)粒 PMD-PA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，分類命名為JM109/pMD-PA，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏日期2010年8月11日，保藏編號(hào)CCTCC NO :M2010200。
圖lpulA042基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)紅色普魯蘭的降解。圖1中A:BL21(DE3)/pET28a破碎液與紅色普魯蘭的反應(yīng)液經(jīng)酒精沉淀后上清液 為無色，顯示紅色普魯蘭沒有被分解。圖1中B :BL21(DE3)/pET-PA破碎液與紅色普魯蘭的 反應(yīng)液經(jīng)酒精沉淀后的上清液為紅色，顯示有部分紅色普魯蘭被降解。圖2pulA042基因表達(dá)產(chǎn)物與糯米淀粉的反應(yīng)。圖2中A :BL21 (DE3) /pET-PA破碎液與糯米淀粉的混合液在反應(yīng)后與碘反應(yīng)的顏 色由紫紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色，顯示糯米淀粉的支鏈被切斷，淀粉的支鏈含量下降。圖2中B BL21 (DE3)/pET28a破碎液與糯米淀粉的混合液在反應(yīng)后與碘反應(yīng)的顏色仍為紫紅色，顯示 糯米淀粉的支鏈沒有被切斷。
圖3pulA042基因表達(dá)產(chǎn)物與玉米淀粉的反應(yīng)。圖3中A 重組菌BL21 (DE3) /pET28a的破碎液與玉米淀粉的混合液在反應(yīng)后與碘 反應(yīng)的顏色仍為深藍(lán)色；B 重組菌BL21 (DE3)/pET-PA破碎液與玉米淀粉的混合液在反應(yīng) 后與碘反應(yīng)的顏色同樣仍為深藍(lán)色，顯示玉米淀粉沒有發(fā)生明顯變化。
具體實(shí)施例方式通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，實(shí)施例將不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 產(chǎn)普魯蘭酶芽孢桿菌Bacillus sp. 042的獲得從自然界篩選產(chǎn)普魯蘭酶的芽孢桿菌從云南省騰沖縣臘幸溫泉附近采集PH 4 左右的酸性土樣，在保鮮袋中常溫保存。在實(shí)驗(yàn)室中，將上述土樣放入燒杯中，加5倍雙蒸 水，混勻后在100°C保溫1小時(shí)。取少量上述混合液涂布以普魯蘭為唯一碳源的固體培養(yǎng) 基平板，37°C培養(yǎng)三天，共獲得308個(gè)菌落，顯微鏡觀察確定其中187株為桿狀細(xì)菌。將上 述桿狀細(xì)菌的菌落分別劃線分離后以單菌落接種發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)2天后取上清液檢 測(cè)普魯蘭酶酶活，其中3株菌培養(yǎng)液中檢測(cè)到明顯的普魯蘭酶活性。分別進(jìn)行細(xì)菌的16s rDNA基因序列分析，其中編號(hào)為042的細(xì)菌的16s rDNA基因部分序列為SEQ ID NO :3，利 用BLAST軟件將SEQ ID NO :3與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(www. ncbi. nlm. nih. gov，簡(jiǎn)稱 NCBI)收錄的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示SEQID NO 3與臘狀芽孢桿菌PCSBB的16s rDNA 基因序列(NCBI登錄號(hào)HM449698. 1)最為接近，相似性為96%。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，042細(xì) 菌應(yīng)屬于芽孢桿菌屬，命名為Bacillus sp. 042。Bacillus sp. 042被用于下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2 =Bacillus sp. 042普魯蘭酶基因的克隆第一步獲得Bacillus sp. 042普魯蘭酶基因的部分核苷酸序列根據(jù)細(xì)菌普魯蘭酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物5，-TGGGG (A, T, C, G) TA (T, C)AA(T, C)CC_3，(SEQ ID NO 4)5，-GG(A, G) TT (A, G) TA(A, T, G, C) CCCCA-3' (SEQ ID NO 5)以Bacillus sp. 042染色體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得一 0. 8kb左右的擴(kuò)增片 段。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后與克隆載體PMD18-T Simple連接，獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析， 結(jié)果顯示所獲PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)860bp，其核苷酸序列與Bacillus acidopullulyticus來源的 普魯蘭酶基因的部分序列相似性高達(dá)50%，這一結(jié)果顯示，上述PCR獲得的片段是普魯蘭 酶編碼基因的一部分。第二步獲得Bacillus sp. 042普魯蘭酶編碼基因的完整序列根據(jù)第一步所獲Bacillus sp. 042普魯蘭酶編碼基因部分片段核苷酸序列設(shè)計(jì)一 對(duì)反向PCR引物5，-CTGAAAGTGGCATTAAACAG-3，(SEQ ID NO 6)5，-TAATTTATCAAACTCTTCGC-3‘ (SEQ ID NO 7)利用反向PCR技術(shù)克隆Bacillus sp. 042普魯蘭酶基因完整編碼區(qū)。取Bacillus sp. 042染色體DNA約10 μ g，溶于100 μ L雙蒸水中。在上述DNA溶 液中加入IlyL酶切緩沖液和IyL限制性內(nèi)切酶Hind III，37°C酶切2小時(shí)后用柱式DNA 片段回收試劑盒回收經(jīng)酶切的DNA片段。取上述回收的含DNA片段的溶液44 μ L，加入連接 反應(yīng)緩沖液5 μ L，連接酶1 μ L，16°C連接過夜。以上述連接產(chǎn)物為模板，利用反向PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，反向PCR獲得一 3kb左右的擴(kuò)增片段，將上述擴(kuò)增片段分離 后與克隆載體PMD-18T Simple連接，重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析，并將所獲序列與已經(jīng)獲得序 列的片段比對(duì)，獲得普魯蘭酶編碼基因的完整序列，即SEQ ID N0:1。第三步獲得Bacillus sp. 042普魯蘭酶編碼基因根據(jù)SEQ ID NO :1序列再設(shè)計(jì)一對(duì)引物以擴(kuò)增Bacillus sp. 042普魯蘭酶編碼區(qū) 完整基因，引物序列如下5，-GTGCAAATTACAAAAAAATTAAT-3，(SEQ ID NO 8)5' -TTATTTAATCGGTTTCTCTGTT-3，(SEQ ID NO 9)以Bacillus sp. 042染色體DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得一 2. 5kb左右的DNA片段， 擴(kuò)增片段純化后與克隆載體PMD18-T Simple連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含氨芐青霉素 的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。從獲得的轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒測(cè)序，獲得普魯蘭酶編碼基因編碼區(qū) 完整序列，該基因命名為PU1A042，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其編碼的普魯蘭酶原酶的 氨基酸序列為SEQ ID NO :2?；騪ulA042與克隆載體pMD18-T Simple組成的重組質(zhì)粒 PMD-PA的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，其分類命名為JM109/pMD-PA，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心，保藏編號(hào) CCTCC NO :M 2010200。實(shí)施例3 普魯蘭酶基因的表達(dá)及重組酶功能分析以含有pulA042基因的重組質(zhì)粒pMD_PA為模板，用引物5 ‘ -AATGAATCGTTTCAAATTCAAAAACAAC-3 ‘ (SEQ ID NO 10)5’-AATAAGCTTTTATTTAATCGGTTTCTCTG-3，(SEQ ID NO 11)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得pulA042基因的成熟肽編碼區(qū)，用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和 Hind III酶切后與經(jīng)相同酶切的大腸桿菌表達(dá)載體pET28a連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-PA， 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌BL21 (DE3) /pET-PA。重組大腸桿菌 BL21 (DE3) /pET-PA在LB液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至培養(yǎng)液渾濁度為OD6tltl = 0. 8時(shí)加入IPTG 至終濃度為0. 5mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后培養(yǎng)液用超聲波處理破碎細(xì)胞。作為對(duì)照，用空質(zhì) 粒pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)獲得的重組菌BL21 (DE3) /pET28a也同樣培養(yǎng)并進(jìn)行細(xì) 胞破碎。對(duì)細(xì)胞破碎液檢測(cè)普魯蘭酶活力，結(jié)果顯示重組菌BL21 (DE3) /pET-PA的細(xì)胞破碎 液有明顯的普魯蘭酶活力，酶活約為6U/mL。而重組菌BL21 (DE3)/pET28a的細(xì)胞破碎液普 魯蘭酶活力為0?？梢?，基因pulA042成熟肽編碼基因的表達(dá)產(chǎn)物具有普魯蘭降解活性。為進(jìn)一步驗(yàn)證pulA042成熟肽編碼基因表達(dá)產(chǎn)物的功能，將上一節(jié)中制備的重組 菌BL21 (DE3)/pET-PA及BL21 (DE3)/pET28a的細(xì)胞破碎液分別與紅色普魯蘭、糯米淀粉、玉 米淀粉進(jìn)行反應(yīng)。細(xì)胞破碎液與紅色普魯蘭的反應(yīng)結(jié)果如圖1所示。取0. ImL 重組菌 BL21 (DE3)/pET-PA 及 BL21 (DE3)/pET28a 的細(xì)胞破碎液分別與 0. 3mL 0. 5%的紅色普魯蘭溶液混合，37°C反應(yīng)約1小時(shí)后加入ImL酒精，混勻后8，OOOr/ min離心lOmin。由于紅色普魯蘭為高分子化合物，與酒精混合生成沉淀。如果紅色普魯蘭 被降解，則形成小分子，與酒精混合不會(huì)形成沉淀。由圖1中A可見，BL21(DE3)/pET28a破 碎液與紅色普魯蘭的反應(yīng)液經(jīng)酒精沉淀后上清液為無色，紅色普魯蘭沉淀集中在離心管底 部，顯示紅色普魯蘭沒有被分解。圖1中B可見，BL21(DE3)/pET-PA的破碎液與紅色普魯 蘭的反應(yīng)液經(jīng)酒精沉淀和離心后上清液仍為紅色，而離心管底部的沉淀很少，顯示大部分紅色普魯蘭被降解為小分子。由圖1可見，PU1A042成熟肽編碼基因表達(dá)產(chǎn)物具有普魯蘭 降解能力。糯米淀粉是一類支鏈含量較高的淀粉，由于支鏈含量高，糯米淀粉與碘反應(yīng)顯紫 紅色而不是以直鏈為主的淀粉的深藍(lán)色。糯米淀粉與專一分解淀粉中α-1，6糖苷鍵的酶 接觸，其支鏈將被切斷，再與碘混合，反應(yīng)液表現(xiàn)為深藍(lán)色。細(xì)胞破碎液與糯米淀粉的反應(yīng) 結(jié)果如圖2所示。將0. 2mL 重組菌 BL21 (DE3)/pET-PA 及 BL21 (DE3)/pET28a 的細(xì)胞破碎液分別與 ImL 0.3%的糯米淀粉溶液混合，37°C反應(yīng)1小時(shí)后加入等體積碘溶液，混合。由圖2中 A可見BL21 (DE3)/pET-PA破碎液與糯米淀粉的混合液在反應(yīng)后與碘反應(yīng)的顏色由紫紅 色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色，顯示糯米淀粉的支鏈被切斷，淀粉的支鏈含量下降。由圖2中B可見 BL21 (DE3) /pET28a破碎液與糯米淀粉在反應(yīng)后與碘反應(yīng)的顏色仍為紫紅色，顯示糯米淀 粉的支鏈沒有被切斷。由圖2可見，pulA042成熟肽編碼基因表達(dá)產(chǎn)物具有分解支鏈淀粉 α-1，6糖苷鍵的功能。玉米淀粉是一類以直鏈為主的淀粉，與碘反應(yīng)顯深藍(lán)色。玉米淀粉的α -1，4糖苷 鍵被分解，形成糊精，再與碘反應(yīng)則表現(xiàn)為紅色或紫紅色。細(xì)胞破碎液與玉米淀粉的反應(yīng)結(jié) 果如圖3所示。將0. 2mL 重組菌 BL21 (DE3)/pET-PA 及 BL21 (DE3)/pET28a 的細(xì)胞破碎液分別與 ImL 0.3%的玉米淀粉溶液混合，37°C反應(yīng)約6小時(shí)后加入等體積碘溶液，混合。由圖3 可見重組菌BL21 (DE3)/pET28a及BL21 (DE3)/pET-PA的破碎液與玉米淀粉的混合液在 反應(yīng)后與碘反應(yīng)的顏色同樣都為深藍(lán)色，顯示玉米淀粉沒有發(fā)生明顯變化。由圖3可見， PU1A042成熟肽編碼基因表達(dá)產(chǎn)物不具有分解α _1，4糖苷鍵的功能。綜合上述實(shí)驗(yàn)可見，pulA042成熟肽編碼基因表達(dá)產(chǎn)物具有分解普魯蘭和支鏈淀 粉中α-1，6糖苷鍵的能力，不分解α-1，4糖苷鍵，符合I型普魯蘭酶的特點(diǎn)。這一類普魯 蘭酶在淀粉加工中可用于淀粉或糊精分子中α-1，6糖苷鍵的分解。本實(shí)施例采用大腸桿 菌表達(dá)pulA042成熟肽編碼基因，但pa042基因的表達(dá)方式顯然不局限于這一種。
權(quán)利要求
一種來源于芽孢桿菌屬細(xì)菌Bacillus sp.042的胞外普魯蘭酶編碼基因，命名為pulA042，其核苷酸序列為SEQ ID NO1。
2.權(quán)利要求1所述基因pulA042編碼的普魯蘭酶原酶的氨基酸序列為SEQIDNO :2。
3.權(quán)利要求1所述基因pulA042與克隆載體pMD18-TSimple組成的重組質(zhì)粒pMD_PA 的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，分類命名為JM109/pMD-PA，已保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編 號(hào) CCTCC NO :M 2010200。
4.權(quán)利要求1所述基因pulA042的應(yīng)用，其特征在于利用普魯蘭酶編碼基因pulA042構(gòu)建的重組微生物表達(dá)產(chǎn)生的重組普魯蘭酶具有分 解普魯蘭的能力，能降解淀粉中α-1，6糖苷鍵，不降解α_1，4糖苷鍵，是一種I型普魯蘭 酶，利用基因PU1A042生產(chǎn)的重組普魯蘭酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中的 α-1，6糖苷鍵。
全文摘要
一種來源于芽孢桿菌的胞外普魯蘭酶編碼基因及其應(yīng)用，屬于微生物、酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選到一株具有普魯蘭分解能力的芽孢桿菌Bacillus sp.042，利用反向PCR技術(shù)克隆了普魯蘭酶編碼基因pulA042編碼區(qū)完整序列，序列分析顯示該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)2571堿基，編碼一856個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈，多肽鏈N端32個(gè)氨基酸殘基組成一典型的信號(hào)肽，因此基因pulA042編碼一種胞外普魯蘭酶。Bacillus sp.042普魯蘭酶基因pulA042的表達(dá)產(chǎn)物具有分解普魯蘭和紅色普魯蘭的活性，能降解淀粉中α-1，6糖苷鍵，不降解α-1，4糖苷鍵，是一種I型普魯蘭酶。利用基因pulA042生產(chǎn)的重組酶在淀粉加工中用于分解淀粉或糊精分子中α-1，6糖苷鍵。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101974543SQ20101025628
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者沈微, 王正祥 申請(qǐng)人:江南大學(xué)