專利名稱：一種快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，具體講，涉及利用非特異擴(kuò)增循環(huán)和特異檢測(cè)循環(huán)兩個(gè)循環(huán)程序完成的PCR擴(kuò)增技術(shù)和核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)的一種快速檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的技術(shù)。
背景技術(shù)：
SNPs是指在基因組水平上，特定核苷酸位置上存在兩種或兩種以上不同的堿基，其中任何一種等位基因在群體中的頻率不小于1%。SNPs已成為繼限制性酶切片斷長度多態(tài)(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP),短串聯(lián)重復(fù)序列(Short TandemRepeat, STR)多態(tài)標(biāo)記后的第三代分子遺傳標(biāo)記。因此，SNP的檢測(cè)正成為廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，用于SNPs檢測(cè)的方法大多以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，并與熒光、質(zhì)譜法、基因芯片或測(cè)序等方法結(jié)合。這些方法操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、檢測(cè)時(shí)間長，因此不適合于基層醫(yī)院使用。本發(fā)明利用PCR核酸擴(kuò)增技術(shù)和核酸試紙條檢測(cè)技術(shù)發(fā)明的一種操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的檢測(cè)技術(shù)。因此，可廣泛地應(yīng)用于與單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)相關(guān)的領(lǐng)域。下面就幾種現(xiàn)有SNP檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行概述。I限制性酶切片斷長度多態(tài)(RFLP)利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用不同的限制性內(nèi)切酶作用于同一片斷，并根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果來判斷SNPs位點(diǎn)的堿基類型。2 寡核苷酸連接分析(Oligos Ligation Assay, OLA)預(yù)先設(shè)計(jì)的兩條寡核苷酸在與靶序列雜交后，連接酶可使其以共價(jià)連接，然后通過凝膠電泳等方法對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，即可判斷SNPs位點(diǎn)的堿基類型。3 基因芯片(Gene chip)通過在芯片上密集排列的已知序列的探針，與若干靶序列進(jìn)行雜交后檢測(cè)，從而達(dá)到檢測(cè)SNPs位點(diǎn)堿基類型的目的。4 實(shí)時(shí)突光定量 PCR(Real-time Quantitive PCR)根據(jù)熒光共振的原理，利用熒光檢測(cè)裝置檢測(cè)熒光變化，從而進(jìn)行SNPs位點(diǎn)堿基類型的檢測(cè)。5. DNA 測(cè)序法DNA測(cè)序能夠準(zhǔn)確、直接的反映序列的差異，但是該方法從樣品的處理到給出結(jié)果至少需要3-4天，而且價(jià)格也比較昂貴。6.突光偏振檢測(cè)技術(shù)(Fluorescence polarization)利用特異探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，使探針的3’端在聚合酶的作用下連接上一個(gè)標(biāo)有特定熒光素的ddNTP，然后根據(jù)檢測(cè)到的熒光素種類和偏振光強(qiáng)度判定SNPs位點(diǎn)堿基類型。
7.雜交雙探針熒光PCR技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入橫跨突變位點(diǎn)的熒光標(biāo)記探針，并通過熔解曲線(meltingcurve)分析而判定SNPs位點(diǎn)堿基類型。隨著SNPs的發(fā)現(xiàn)以及一些SNPs數(shù)據(jù)庫的建成，特定SNPs在特定群體的驗(yàn)證和頻率分析以及SNPs與某些生理或病理狀態(tài)關(guān)系的研究成為重點(diǎn)。但目前市場(chǎng)上的各種方法大多需要專門的分析儀器，不僅價(jià)格昂貴，而且操作復(fù)雜，專業(yè)性強(qiáng)，因此在應(yīng)用上受到了一定的限制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是在專利申請(qǐng)200610003429. 1“核酸薄膜層析快速檢測(cè)方法及其試紙條及其用途”專利的基礎(chǔ)上，結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)而發(fā)明出一種新的快速SNPs檢測(cè)方法-PCR-核酸試紙條快速檢測(cè)SNPs技術(shù)。目的在于為人們提供一種操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉和結(jié)果準(zhǔn)確的檢測(cè)已知SNPs位點(diǎn)或單堿基突變方法。本發(fā)明的首要目的在于提供一種快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提供一種快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及一種快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法采用在同一反應(yīng)體系中一步PCR反應(yīng)和核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法；首先通過第一種PCR溫度循環(huán)非特異性擴(kuò)增含有SNPs位點(diǎn)的片段，然后通過AS-PCR特異性擴(kuò)增含有單核酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基，最后通過核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為在同一個(gè)反應(yīng)中，包含不同作用的引物和探針。不同的引物和探針的作用分別為(I) 一對(duì)擴(kuò)增包含SNPs位點(diǎn)的模板序列的不帶任何標(biāo)記的引物A，非特異性擴(kuò)增靶模板以增加靶模板數(shù)量；引物A能對(duì)包含SNPs位點(diǎn)的模板序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并且不帶任何標(biāo)記；(2)針對(duì)SNPs位點(diǎn)上的不同堿基類型進(jìn)行特異性擴(kuò)增的特異性引物B，當(dāng)引物B與模板序列完全互補(bǔ)時(shí)，引物B才能延伸；(3)與引物B延伸產(chǎn)物進(jìn)行特異性雜交的探針C，從而完成對(duì)SNPs位點(diǎn)堿基類型的檢測(cè)。本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為所述特異性引物B上標(biāo)記有抗原或半抗原，所述抗原或半抗原選自生物素、地高辛或熒光染料，所述熒光染料選自Cy3、Cy5,Tetramethylrhodamine> AlexaFluor> Rhodamine> Fam 或 FitC,優(yōu)選生物素或地高辛。本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為所述探針C上標(biāo)記有抗原或半抗原，所述抗原或半抗原選自生物素、地高辛或熒光染料，所述熒光染料選自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine> AlexaFluor> Rhodamine> Fam 或 FitC,優(yōu)選突光染料。本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為所述同一體系中PCR的條件為先在90 98°C條件下保溫I 4分鐘；然后在90 96°C條件下5 15秒，66 75°C條件下10 20秒，共30 50個(gè)循環(huán)；接著在90 96°C條件下10 20秒，40 50°C條件下15 25秒，共5 20個(gè)循環(huán)；最后在92 98 °C條件下保溫I 4分鐘。 本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為所述同一體系中PCR的條件為先在92 95°C條件下保溫I. 5 2. 5分鐘；然后在92 95°C條件下8 12秒，66 72°C條件下12 18秒，共35 45個(gè)循環(huán)；接著在92 95°C條件下12 18秒，45 50°C條件下18 22秒，共8 15個(gè)循環(huán)；最后在92 95°C條件下保溫I. 5 3分鐘；進(jìn)一步優(yōu)選先在95°C條件下保溫2分鐘；然后在94°C條件下10秒，72°C條件下15秒，共40個(gè)循環(huán)；接著在94°C條件下15秒，45°C條件下20秒，共10個(gè)循環(huán)；最后在95°C條件下保溫2分鐘。
本發(fā)明的第六優(yōu)選技術(shù)方案為由于引物B、探針C和引物A設(shè)計(jì)的退火溫度不同，在第一個(gè)非特異擴(kuò)增循環(huán)過程中，引物B和探針C并不參與反應(yīng)；而完成非特異性擴(kuò)增靶模板達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，第二個(gè)循環(huán)開始時(shí)，低退火溫度的引物B和探針C參與反應(yīng)，達(dá)到特異性檢測(cè)的結(jié)果。本發(fā)明的第七優(yōu)選技術(shù)方案為引物A的退火溫度為55°C 72°C，引物B和探針C的退火溫度為35°C 50°C，引物A的退火溫度優(yōu)選65°C 72°C，引物B和探針C的退火溫度優(yōu)選40°C 45°C。本發(fā)明的第八優(yōu)選技術(shù)方案為所述核酸檢測(cè)試紙條上設(shè)置有與引物B/探針C雜交產(chǎn)物所標(biāo)記的抗原或半抗原特異性結(jié)合的抗體形成的檢測(cè)線。本發(fā)明的第九優(yōu)選技術(shù)方案為所述同一體系中PCR的PCR擴(kuò)增體系為模板2 4μ1;正向非特異性引物A :0. 025 O. 05 μ mo I ；反向非特異性引物A :0· I O. 2μπιο1 ;特異性引物B :O. I O. 2 μ mol ;特異性探針C :O. 025 O. 05 μ mol ;dNTP O. I O. 2mmol ；(NH4) 2SO4 5 IOmmol ；KCl 5 IOmmol ；pH 9. O 的 Tris-HCl 5 IOmmolTriton-100 O. 5% 1.0%;MgCl I. 25 2. SmmoI ；Taq DNA聚合酶 I 2單位；總體積為10 20微升。所述擴(kuò)增體系優(yōu)選為模板4μ1;正向非特異性引物A :0· 05 μ mol ;反向非特異性引物A :0· 2 μ mol ;特異性引物B :0. 2 μ mol ；特異性探針C :0. 05 μ mol ；dNTP 0. 2mmol ；(NH4) 2 SO4 10mmol ；KCl 10mmol ；pH 9. O 的 Tris-HCl 10mmolTriton-100 1.0%；MgCl 2. 5mmol ；
Taq DNA聚合酶2單位；總體積為20微升。本發(fā)明的第十優(yōu)選技術(shù)方案為根據(jù)SNPs位點(diǎn)上的不同堿基類型設(shè)計(jì)不同核苷酸序列的特異性引物B，每一個(gè)PCR擴(kuò)增體系中僅含有一種核苷酸序列的特異性引物B。本發(fā)明還涉及該檢測(cè)方法在檢測(cè)單核苷酸突變中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括(I)室溫保存的核酸檢測(cè)試紙條裝置；(2) _20°C保存的本發(fā)明所述的PCR擴(kuò)增體系(3) -20 V保存的陽性對(duì)照液；(4)_20°C保存的陰性對(duì)照液；(5)-20 0C 保存的 ddH20。其中，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)液為20人份時(shí)，陽性對(duì)照液為40ul，陰性對(duì)照液為40ul，ddH20為 140ul。其中，本發(fā)明中所述的陽性對(duì)照液含有可以使檢測(cè)試紙條產(chǎn)生陽性反應(yīng)的包含SNPs位點(diǎn)的模板序列，所述的陰性對(duì)照液為不含有使檢測(cè)試紙條產(chǎn)生陽性反應(yīng)的包含SNPs位點(diǎn)的模板序列的液體。只有當(dāng)引物B延伸產(chǎn)物與探針C特異性的結(jié)合在一起時(shí)，才能在核酸檢測(cè)試紙條的檢測(cè)線上形成有色的條帶；同時(shí)，如果當(dāng)引物B沒有延伸，那么就無法與探針C進(jìn)行特異性的結(jié)合，也就無法在檢測(cè)線上形成有色的條帶。本發(fā)明還涉及本試劑盒在病原體已知耐藥基因的檢測(cè)、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇、法醫(yī)研究中罪犯身份的鑒別或親子鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及該快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法在病原體已知耐藥基因的檢測(cè)、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇、法醫(yī)研究中罪犯身份的鑒別或親子鑒定中的應(yīng)用。下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明主要原理為先通過PCR擴(kuò)增含SNPs位點(diǎn)的片段，然后針對(duì)SNPs的堿基類型進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增(Allele specific Polymerase Chain Reaction, AS-PCR)；AS-PCR產(chǎn)物可與特異性探針進(jìn)行雜交，雜交產(chǎn)物可最終被核酸試紙條檢測(cè)到。PCR-核酸試紙條法檢測(cè)SNPs的反應(yīng)原理和步驟如圖I所示。本發(fā)明檢測(cè)SNPs的方法主要包括以下四個(gè)步驟I)通過PCR對(duì)包含SNPs位點(diǎn)的靶模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)的退火溫度在66°C 72°C之間，循環(huán)數(shù)為35 40。在這步驟中，PCR擴(kuò)增并不對(duì)SNPs位點(diǎn)的堿基類型進(jìn)行區(qū)分，只為了富集靶序列以便參與步驟2中的AS-PCR。同時(shí)，應(yīng)用于這一步驟中的擴(kuò)增引物并不進(jìn)行任何的標(biāo)記，其Tm應(yīng)該在66°C 72°C左右。2)針對(duì)SNPs位點(diǎn)的堿基類型進(jìn)行AS-PCR。AS-PCR反應(yīng)的退火溫度在45°C -50°C之間，循環(huán)數(shù)為5-10個(gè)。通過控制AS-PCR的反應(yīng)退火溫度，使得只有當(dāng)參與AS-PCR的引物與靶模板完全互補(bǔ)時(shí)，才能使得引物得以延伸。因此，可針對(duì)SNPs位點(diǎn)的不同堿基類型進(jìn)行特異性擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物時(shí)，可根據(jù)SNPs位點(diǎn)的堿基類型設(shè)計(jì)5’末端帶生物 素(Biotin)標(biāo)記的等位基因特異性引物，并將SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)在該引物的3’末端。弓丨物的Tm在45°C 50°C左右，以避免其參與到步驟I中，從而提高反應(yīng)的特異性。
3) AS-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性探針進(jìn)行雜交。特異性探針的3’末端帶異硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate, FITC), Tm 在 50°C 60°C左右。探針與 AS-PCR 的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后能形成同時(shí)帶有Biotin和FITC標(biāo)記的雜交復(fù)合物。
4)利用核酸試紙條對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，同時(shí)帶有Biotin和FITC標(biāo)記的雜交復(fù)合物先與表面帶親和素標(biāo)記的紅色顆粒結(jié)合，形成帶FITC標(biāo)記的紅色顆粒復(fù)合物。該紅色顆粒復(fù)合物在緩沖液的作用下，通過毛細(xì)現(xiàn)象沿纖維膜向核酸試紙條的吸收端流動(dòng)。當(dāng)其遇到核酸試紙條檢測(cè)線上的Anti-FITC時(shí)，由于FITC與Anti-FITC的相互作用可將有色顆粒復(fù)合物固定在檢測(cè)線上，并形成肉眼可見的紅色線條，此為陽性。但如果在AS-PCR中，等位基因特異性引物未得到延伸，那么該引物就無法與特異性探針進(jìn)行雜交并形成同時(shí)帶有Biotin和FITC標(biāo)記的雜交復(fù)合物，也就無法在核酸試紙條的檢測(cè)線上形成紅色的線條，此為陰性。本發(fā)明的一種快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，采用在同一反應(yīng)體系中一步PCR反應(yīng)和核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；首先通過第一種PCR溫度循環(huán)非特異性擴(kuò)增含有SNPs位點(diǎn)的片段，然后通過AS-PCR特異性擴(kuò)增含有單核酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基，最后通過核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。在同一個(gè)反應(yīng)體系中，包含不同作用的引物和探針。針對(duì)同一 SNPs上存在的兩種或兩種以上不同的堿基分別設(shè)計(jì)與該位點(diǎn)核苷酸相對(duì)應(yīng)的引物B的核苷酸序列，設(shè)置平行的PCR擴(kuò)增體系，每一個(gè)PCR擴(kuò)增體系中有一種引物B的核苷酸，在檢測(cè)過程中將待測(cè)樣品加入兩個(gè)或以上的平行PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)完成后采用核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)，從而得到檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明采用的核酸試紙條可采用專利申請(qǐng)?zhí)枮?00610109620. 4的全封閉核酸防污染檢測(cè)裝置，該檢測(cè)裝置具有全封閉檢測(cè)、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單快速、擴(kuò)增后檢測(cè)不需要任何儀器設(shè)備。該裝置使核酸擴(kuò)增檢測(cè)和分析均在封閉狀態(tài)完成，最大限度降低常規(guī)擴(kuò)增法中交叉污染的危險(xiǎn)。該試劑盒操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短，同時(shí)也減低了檢測(cè)成本，使檢測(cè)結(jié)果更加快速、可靠。其裝置中的試紙條的原理在申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專利申請(qǐng)200610003429. I中的進(jìn)行了敘述。專利申請(qǐng)200610003429. I公開了一種核酸薄膜層析快速檢測(cè)方法及其試紙條及其用途。該專利申請(qǐng)公開了一種特異性核酸序列的檢測(cè)方法，該方法將一種特異性抗體A吸附于有色顆粒，在顆粒表面形成抗體包被；將另一種特異性抗體-無色抗B抗體固定于膜上形成檢測(cè)線；待測(cè)核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，將所使用的探針或是引物用A抗原或B抗原標(biāo)記，形成擴(kuò)增物、探針、引物、抗原A、抗原B的復(fù)合物，將該復(fù)合物與吸附有色顆粒的抗體A結(jié)合，得到的該有色顆粒復(fù)合物在溶液中通過毛細(xì)血管現(xiàn)象眼纖維膜向上流動(dòng)只抗體B檢測(cè)條時(shí)，與線條上的抗體B結(jié)合，從而滯留在檢測(cè)線上，形成肉眼可見的有色線條。該試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序有樣品墊、有色顆粒結(jié)合物墊和吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上還設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中有色顆粒結(jié)合物墊上的有色顆粒有抗A抗體包被,檢測(cè)線上有抗B抗體包被,質(zhì)控線上有抗A抗體,有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。其中，在本發(fā)明的核酸檢測(cè)試紙條上設(shè)置有與引物B/探針C雜交產(chǎn)物所標(biāo)記的抗原或半抗原特異性結(jié)合的抗體形成的檢測(cè)線。本發(fā)明是以核酸檢測(cè)試紙條為檢測(cè)平臺(tái)，從樣品提取到給出結(jié)果，只需要2 3個(gè)小時(shí)。同時(shí)判讀簡(jiǎn)單，又不需要任何特殊儀器，使得操作復(fù)雜性和檢測(cè)成本大大降低，因此在一般的分子實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院檢驗(yàn)科完成檢測(cè)。表I為本方法與基因芯片，基因測(cè)序等SNPs檢測(cè)技術(shù)的比較表I
權(quán)利要求
1.一種快速單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法采用在同一反應(yīng)體系中一步PCR反應(yīng)和核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法；首先通過第一種PCR溫度循環(huán)非特異性擴(kuò)增含有SNPs位點(diǎn)的片段，然后通過AS-PCR特異性擴(kuò)增含有單核酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基，最后通過核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速SNPs檢測(cè)方法，其特征在于，包含以下引物和探針 擴(kuò)增包含SNPs位點(diǎn)的模板序列的不帶任何標(biāo)記的引物A，非特異性擴(kuò)增靶模板以增加靶模板數(shù)量； 針對(duì)SNPs位點(diǎn)上的不同堿基類型進(jìn)行特異性擴(kuò)增的特異性引物B，當(dāng)引物B與模板序列完全互補(bǔ)時(shí)，引物B才能延伸； 與引物B延伸產(chǎn)物進(jìn)行特異性雜交的探針C，從而完成對(duì)SNPs位點(diǎn)堿基類型的檢測(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述特異性引物B上標(biāo)記有抗原或半抗原，所述抗原或半抗原選自生物素、地高辛或熒光染料，所述熒光染料選自 Cy3、Cy5> Tetramethylrhodamine> AlexaFluor> Rhodamine> Fam 或 FitC,優(yōu)選生物素或地高辛。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述探針C上標(biāo)記有抗原或半抗原，所述抗原或半抗原選自生物素、地高辛或熒光染料，所述熒光染料選自 Cy3、Cy5> Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine> Fam 或 FitC,優(yōu)選突光染料。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述同一反應(yīng)體系中PCR的條件為先在90 98°C條件下保溫I 4分鐘；然后在90 96°C條件下5 15秒，66 75°C條件下10 20秒，共30 50個(gè)循環(huán)；接著在90 96°C條件下10 20秒，40 50°C條件下15 25秒，共5 20個(gè)循環(huán)；最后在92 98°C條件下保溫I 4分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述同一體系中PCR的條件為先在92 95°C條件下保溫I. 5 2. 5分鐘；然后在92 95°C條件下8 12秒，66 72°C條件下12 18秒，共35 45個(gè)循環(huán)；接著在92 95°C條件下12 18秒，45 50°C條件下18 22秒，共8 15個(gè)循環(huán)；最后在92 95°C條件下保溫I. 5 3分鐘；進(jìn)一步優(yōu)選先在95°C條件下保溫2分鐘；然后在94°C條件下10秒，72°C條件下15秒，共40個(gè)循環(huán)；接著在94°C條件下15秒，45°C條件下20秒，共10個(gè)循環(huán)；最后在95°C條件下保溫2分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6任一權(quán)利要求所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，在第一個(gè)非特異擴(kuò)增循環(huán)過程中，引物B和探針C不參與反應(yīng)；而完成非特異性擴(kuò)增靶模板達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，第二個(gè)循環(huán)開始時(shí)，低退火溫度的引物B和探針C參與反應(yīng)，達(dá)到特異性檢測(cè)的結(jié)果。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，引物A的退火溫度為55°C 72°C，引物B和探針C的退火溫度為35°C 50°C，引物A的退火溫度優(yōu)選65 °C 72 °C，引物B和探針C的退火溫度優(yōu)選40 V 45 °C。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述核酸檢測(cè)試紙條上設(shè)置有與引物B或探針C雜交產(chǎn)物所標(biāo)記的抗原或半抗原特異性結(jié)合的抗體形成的檢測(cè)線。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述同一體系中PCR的PCR擴(kuò)增體系為 模板2 I ; 正向非特異性引物A: 0. 025 0. 05iimol ; 反向非特異性引物A: 0. I 0.2iimol ; 特異性引物B :0. I 0. 2iimol ; 特異性探針C 0. 025 0. 05 ii mo I ； dNTP 0. I 0. 2mmo1 ； (NH4)2SO4:5 IOmmol ; KCl 5 10mmol ； pH 9. 0 的 Tris-HCl 5 IOmmol Triton-100 0.5% 1.0%; MgCl I. 25 2. 5mmol ； Taq DNA聚合酶I 2單位； 總體積為10 20微升。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，根據(jù)SNPs位點(diǎn)上的不同堿基類型設(shè)計(jì)不同核苷酸序列的特異性引物B，每一個(gè)PCR擴(kuò)增體系中僅含有一種核苷酸序列的特異性引物B。
12.權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法在檢測(cè)單核苷酸突變中的應(yīng)用。
13.權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法在病原體已知耐藥基因的檢測(cè)、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇、法醫(yī)研究中罪犯身份的鑒別或親子鑒定中的應(yīng)用。
14.一種快速單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 (1)室溫保存的核酸檢測(cè)試紙條裝置； (2)-20°C保存的權(quán)利要求10所述的PCR擴(kuò)增體系 (3)-20°C保存的陽性對(duì)照液； (4)-20V保存的陰性對(duì)照液；(5)-20°C保存的ddH20。
15.權(quán)利要求14所述的試劑盒在病原體已知耐藥基因的檢測(cè)、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇、法醫(yī)研究中罪犯身份的鑒別或親子鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)檢測(cè)方法，具體講，涉及一種采用在同一反應(yīng)體系中一步PCR反應(yīng)和核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的方法；首先通過第一種PCR溫度循環(huán)非特異性擴(kuò)增含有SNPs位點(diǎn)的片段，然后通過AS-PCR特異性擴(kuò)增含有單核酸多態(tài)性位點(diǎn)的堿基，最后通過核酸檢測(cè)試紙條對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。本方法也可用于檢測(cè)單核苷酸突變。本方法敏感度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短，成本低，使得檢測(cè)結(jié)果更加快速、可靠，具有蛋白質(zhì)與核酸診斷試劑各自的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還涉及本試劑盒在病原體已知耐藥基因的檢測(cè)、器官移植中供體和受體間的配對(duì)選擇、法醫(yī)研究中罪犯身份的鑒別或親子鑒定中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102618626SQ20111003238
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2011年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月30日
發(fā)明者尤其敏, 張文宏, 徐高連, 梅建, 王宏瑩, 胡林, 高謙 申請(qǐng)人:杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司