專利名稱：一種人類dna str檢測用標準物質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人類DNA STR檢測用標準物質(zhì)的制備方法，用于解決法醫(yī)學、人類學、遺傳學和疾病等領(lǐng)域的個體識別、親子鑒定以及基因診斷方面的DNA檢測的準確性和標準化問題。
背景技術(shù)：
標準物質(zhì)是具有準確量值的測量標準，按照“國際通用計量學基本術(shù)語”和“國際標準化組織指南30”，標準物質(zhì)(reference material,RM)有如下定義具有一種或多種足夠均勻和很好地確定了的特性值，用以校準測量裝置，評價測量方法或給材料賦值的一種材料或物質(zhì)。通過標準物質(zhì)實現(xiàn)了量值的傳遞和溯源，使得測量的標準可溯源至國際基本單位。DNA 標準物質(zhì)(DNA standard reference materials，簡稱 SRM)，是具有特性量值的DNA測量標準，能夠保證DNA測量結(jié)果的有效性和可比性，保證測量結(jié)果可溯源至國際單位制或者其他國際一致認可的單位，確保實驗室DNA檢測結(jié)果的可比性及一致性。DNA檢測屬于生物技術(shù)的范疇，快速發(fā)展的生物技術(shù)對有效性檢測提出了更高的要求，生物計量作為一門嶄新的科學也得到了人們的關(guān)注。1999年10月，第21屆國際計量大會決定把生物計量學提上日程。隨后，物質(zhì)的量咨詢委員會(Consultative Committee for Quantity ofSubstance-Metrology, CCQM)成立了生物分析工作組 (Bioanalysisfforking Group，BAWG)，至2007年已召開了 11次會議。該工作組的主要目的是建立生物技術(shù)可溯源測量系統(tǒng)，優(yōu)先考慮的是核酸測量、蛋白質(zhì)測量及其方法、分析過程的標準化，以及標準物質(zhì)的研制，以便鞏同核酸和蛋白質(zhì)測量的應用領(lǐng)域。DNA檢測主要采用PCR方法檢測，人類DNA檢測用標準物質(zhì)通常是具有特性量值的人類DNA基因組，以人類DNA檢測用標準物質(zhì)作為模板進行PCR，可以為DNA檢測工作提供科學的溯源保證，以提高檢測結(jié)果的科學性和可靠性，也可以對儀器進行檢驗及校準、評價和研究新的DNA檢驗方法、實驗室認可、DNA分析的內(nèi)部質(zhì)量控制，還可以用于對DNA檢驗人員水平及能力的考核。在法醫(yī)DNA檢測領(lǐng)域，其檢測技術(shù)迅速發(fā)展，檢測過程的標準化及規(guī)范化顯得尤其重要，這就需要標準物質(zhì)對檢測過程進行質(zhì)量控制。1998年，美國聯(lián)邦調(diào)查局(FBI)的 DNA建議委員會標準9. 5指出“實驗室每年或者實驗條件變化時都應該使用美國國家標準技術(shù)研究所(NIST)提供的標準物質(zhì)(SRM)對DNA檢驗步驟進行核查。”目前我圍還沒有適合法醫(yī)DNA檢測的標準物質(zhì)。法醫(yī)DNA檢測經(jīng)歷了限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、短串聯(lián)重復序列(STR)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)。同樣，法醫(yī)DNA標準物質(zhì)也隨著檢測技術(shù)的發(fā)展而不斷推出新的標準物質(zhì)。NIST作為美國的商業(yè)部門，負責開發(fā)國家及國際標準物質(zhì)。在OTST提供的標準物質(zhì)中，有多種標準物質(zhì)用于法醫(yī)DNA的分型檢測——基于RFLP分型技術(shù)的SRM2390、基于STR 分型技術(shù)的SRM2391b、用于線粒體DNA檢測的SRM2392、用于Y染色體DNA分型的SRM2395和用于人類DNA定量的SRM2372。 目前最常用于法醫(yī)DNA檢驗的遺傳標記為STR遺傳標記，短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat, STR)是廣泛存在于人類基因組中的一類具有長度多態(tài)性的DNA序列。它由 2-6個堿基作為核心序列，呈串聯(lián)重復排列，其長度多態(tài)性主要由核心序列的數(shù)目變化和重復次數(shù)不同而產(chǎn)生。STR分布廣、數(shù)目多，約占人類基因組的10%，一般認為，人類基因組平均每6-10kb就有1個STR基因座，不同STR基因座的組合產(chǎn)生了極為豐富的基因座圖譜信息，為法醫(yī)物證學中的個體識別和親子鑒定提供了基礎(chǔ)。法醫(yī)DNA STR檢測用標準物質(zhì)用于對DNA檢測過程中的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證，通過使用標準物質(zhì)，使檢測過程的標準化和規(guī)范化，建立標準化的DNA分析技術(shù)，確保法醫(yī)DNA檢測分析結(jié)果的準確性、公正性和可靠性，為DNA的檢測結(jié)果提供了質(zhì)量保障，DNA標準物質(zhì)也有利于各國各實驗室之間的數(shù)據(jù)的交流。美國國家標準技術(shù)研究所(NIST) 1995年發(fā)布了 STR檢測用標準物質(zhì)-SRM2391， SRM2391只含有4個STR基因座(TH01、F13A01、vffA和FES/FPS)的消息，這遠遠不能滿足 STR分型技術(shù)迅速發(fā)展對STR檢測用標準物質(zhì)的需求，SRM2391應包括所提供的所有的DNA 樣品的STR消息，至少應包括FBI的CODIS中13個核心基因座。1998年6月NIST對SRM2391 重新進行了分析檢測，檢測了各組分的25個基因座分型信息，包括CODIS中13個核心基因座以及其他 8 個 STR 基因座(CSP1P0、D2S 1338、D3S 1358、D5S818、D7S820、D8S1179、 D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、F13A01、F13B、FES/FPS、FGA、LPL、Penta D、 Penta E、TH01、TP0X 和 vWA)，以及 HLA_DQAI、PolyMarker、DlS80 和 Amelogenin 基因座。分析檢測后，NIST發(fā)布了 SRM2391的STR基因分型定值，新推出針對STR檢測的DNA標準物質(zhì) SRM2391a，其包括SRM2391的細胞組分和基因組DNA組分，而去除了擴增產(chǎn)物、D1S80等位基因分型混合物和分子量標志物，含有從9947A和9948細胞系所提取并定量為Ing/ μ L的基因組DNA。2003年1月NIST又推出針對STR檢測的DNA標準物質(zhì)SRM2391b來替代以前的SRM2391a，SRM2391b含有SRM2391a中的所有STR基因座，此外還增加了 SE33基因座。在商業(yè)化的擴增試劑盒中提供的人類基因組9947A、9948、K562等標準物質(zhì)作為 PCR擴增的陽性對照，對DNA檢測起到了內(nèi)部質(zhì)量控制的作用。但是，大多數(shù)DNA檢測實驗室使用的標準物質(zhì)都是由美國國家標準技術(shù)研究所(NIST)提供的，其標準物質(zhì)含有的DNA 是從人類細胞提出而來，采用人類細胞制備DNA標準物質(zhì)具有如下缺點1、細胞的遺傳不穩(wěn)定。細胞培養(yǎng)傳代到一定代數(shù)，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變， 出現(xiàn)亞二倍體、超二倍體或多倍體，DNA位點發(fā)生堿基缺失或插入突變。2、細胞保存量大。由于細胞遺傳的不穩(wěn)定性，需要細胞的培養(yǎng)傳代過程中需保留足夠的備份，導致細胞保存量大。3、細胞培養(yǎng)條件要求高。培養(yǎng)細胞時要控制好細胞生成的環(huán)境中各因素如溫度、 氣相、PH值、滲透壓等，此外，還需要與細胞直接接觸者如培養(yǎng)瓶、底物、培養(yǎng)劑等或間接接觸者如瓶蓋瓶塞等無細胞毒性，如果具細胞毒性會導致細胞的死亡，同樣避免細菌等微生物的污染、不同細胞類型的交叉污染及有害物質(zhì)的污染。因此，本發(fā)明采用分子克隆技術(shù)制備了人類DNA STR檢測用標準物質(zhì)
發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)在使用的DNA STR檢測用標準參考物質(zhì)制備過程存在的細胞遺傳不穩(wěn)定、 培養(yǎng)條件要求高的問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種易于保存、遺傳性能穩(wěn)定的DNA STR 檢測用標準物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明提供的制備 人類DNA STR檢測用標準物質(zhì)的方法，包括以下步驟步驟1、以人類基因組作為模板，人工合成或PCR擴增獲得含有人類DNA短串聯(lián)重復序列基因座的目的基因片段；步驟2、將步驟1的目的基因片段與質(zhì)粒載體重組，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細胞中，篩選出含有目的基因片段的陽性克隆并進行測序鑒定；步驟3、提取步驟2鑒定的陽性克隆中的重組質(zhì)粒，將含有不同基因型的重組質(zhì)粒等比例混合，配置成人類基因組的DNA STR檢測用標準物質(zhì)。作為優(yōu)選，所述目的基因片段為5 200種，每種目的基因片段含有至少一個基因型。更優(yōu)選，所述目的基因片段為10 50種，每種目的基因片段含有至少一個基因型。作為優(yōu)選，步驟2所述細胞是大腸桿菌細胞，所述質(zhì)粒載體為大腸桿菌相應的質(zhì)粒。作為優(yōu)選，步驟3所述重組質(zhì)粒為線性質(zhì)粒。作為優(yōu)選，步驟1所述目的基因片段為分別含有STR基因座CSF1P0、D2S1338、 D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、 D21S11、FGA、Penta D、Penta Ε、ThOl、Tpox、vffA 和性別標記位點 Amelogenin 的片段。用 SEQ ID No. I-SEQ ID No. 42所示引物序列進行PCR擴增。本發(fā)明還提供所述的方法制備的人類DNA STR檢測用標準物質(zhì)。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述描述的人類DNA STR標準物質(zhì)的試劑盒。本發(fā)明人選擇19 個 STR 基因座(CSF1P0、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、 D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、FGA、Penta D、 Penta E、Th01、Tpox、vWA)和性別標記位點Amelogenin制備STR檢測用標準物質(zhì)。對上述 19個STR基因座和性別標記位點Amelogenin的檢測可以基本滿足法庭科學中對于個人識別和親子鑒定中DNA檢測的要求。本發(fā)明人從GenBank和相關(guān)文獻查找到的上述19個STR基因座和性別標記位點Amelogenin全序列，以查找到的序列為模板通過Primer Premier軟件設(shè)計幾對引物， 然后用Oligo軟件篩選出一對引物擴增一個基因座。在設(shè)計STR檢測用標準物質(zhì)的引物時，必須要保證基因座中重復序列位于擴增片段的中間位置，且距離正向和反向引物均在 400-600bp之間。由于性別標記位點Amelogenin中的X、Y兩個位點同源性不是很高，因此需要針對Χ、Υ兩個位點各設(shè)計一對引物。設(shè)計的引物在5’端加入限制性酶切位點，有利于將PCR產(chǎn)物插入質(zhì)粒pUC18中。設(shè)計的引物序列見表1。表1.設(shè)計的引物序列
權(quán)利要求
1.一種制備人類DNA STR檢測用標準物質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1、以人類基因組作為模板，人工合成或PCR擴增獲得含有人類DNA短串聯(lián)重復序列基因座的目的基因片段；步驟2、將步驟1的目的基因片段與質(zhì)粒載體重組，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細胞中，篩選出含有目的基因片段的陽性克隆并進行測序鑒定；步驟3、提取步驟2鑒定的陽性克隆中的重組質(zhì)粒，將含有不同基因型的重組質(zhì)粒等比例混合，配置成人類基因組的DNA STR檢測用標準物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述目的基因片段為5 200種，每種目的基因片段含有至少一個基因型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述目的基因片段為10 50種，每種目的基因片段含有至少一個基因型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，所述目的基因片段分別含有STR基因座CSF1PO、 D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、 D19S433、D21S11、FGA、Penta D、Penta Ε、ThOU Tpox, vffA 和性別標記位點 Amelogenin 的片段，用SEQ ID No. I-SEQ ID No. 42所示引物序列分別進行PCR擴增。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，步驟2所述細胞是大腸桿菌細胞，所述質(zhì)粒載體為大腸桿菌相應的質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，步驟3所述重組質(zhì)粒為線性質(zhì)粒。
7.含有權(quán)利要求1制備的DNASTR標準物質(zhì)的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人類DNA STR檢測用標準物質(zhì)的制備方法，采用分子克隆技術(shù)制備人類DNA STR檢測用標準物質(zhì)。它的最大特點是將人工合成或PCR擴增獲得的含有STR基因座的片段與質(zhì)粒重組，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，通過測序篩選出含有正確插入片段的克隆，并大量繁殖，提取重組質(zhì)粒，通過酶切、純化、混合制備出大量優(yōu)質(zhì)DNA STR檢測用標準物質(zhì)。本發(fā)明所述制備方法過程簡單、成本低，本發(fā)明制備的DNA STR檢測用標準物質(zhì)具有良好的遺傳穩(wěn)定性，易于保存。
文檔編號C12Q1/68GK102251032SQ20111018583
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者何召明, 葉健, 畢萬里, 趙興春 申請人:公安部物證鑒定中心, 蘇州新海生物科技有限公司