專利名稱：一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸的方法，具體地說是指通過PH值控制和流加發(fā)酵的方法，利用葡萄糖和甘油共同作碳源高效發(fā)酵生產(chǎn) ε -聚賴氨酸，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ε -聚賴氨酸(ε -PL) 一般是由25 ；35個L_賴氨酸的α -COOH和ε -ΝΗ2相互縮合而形成的L-賴氨酸聚合物，分子量在3500 4500Da。ε -PL只能由微生物合成， 且ε-PL產(chǎn)生菌僅分布于鏈霉菌屬和北里孢菌屬。目前，ε-PL主要作為食品防腐劑，廣泛用于淀粉質(zhì)類食品防腐。ε -PL作為一種新型食品防腐劑，相比于傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑和生物防腐劑，具有更廣的抑菌譜(有效抑制G+、G-、酵母菌和霉菌等)、更好的水溶性、更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性(100°C，30min或120°C，20min)和更廣的pH適用范圍(等電點為pH9.0左右)等；同時，ε-PL的添加不會影響食品風(fēng)味。更為重要的是，ε-PL具有較高的安全性 ADME (Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion)實驗證實 ε-PL 很難被生物體的腸胃吸收且急性口服劑量達(dá)5g/kg。因此，ε-PL是一種安全、高效的新型生物防腐齊U。事實上，ε -PL早在1980s即被日本允許作為食品防腐劑使用；隨后，韓國也批準(zhǔn)ε -PL 在食品中添加；2003年，ε -PL獲得美國FDA認(rèn)證(GRN000135)，并開始進(jìn)入美國和歐洲市場。另外，ε-PL作為高分子聚合物前體，具有較高的生物相容性和特異陽離子性，被廣泛用作生物可降解材料、乳化劑、高吸收性水凝膠、藥物載體、抗癌增進(jìn)劑和生物芯片外被等領(lǐng)域研究和應(yīng)用。因此，ε-PL具有廣闊的市場應(yīng)用前景。然而，國際上只有日本窒素公司 (Chisso Corporation)實現(xiàn)了 ε-PL工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)且已形成年產(chǎn)千噸級的規(guī)模。ε-PL 在國內(nèi)的研究，大多處在實驗室和中試開發(fā)階段且發(fā)酵水平較日本差距較大。所以，建立 ε-PL高效發(fā)酵工藝提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，對于建立我國ε-PL產(chǎn)業(yè)具有重要意義。葡萄糖是發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL普遍采用的碳源。巖田敏治等人(CN 1260004Α)利用改造后的小白鏈霉菌Iysinopolymerus亞種11011Α-1 (FERM BP-1109)轉(zhuǎn)化葡萄糖合成大量 ε-PL0徐虹等人(CN 101509021Α)利用細(xì)胞固定化方法培養(yǎng)北里孢菌PL6-3，以葡萄糖作碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL。賈士儒等人(CN 101671703A)利用葡萄糖作碳源并流加L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL。雖然ε-PL產(chǎn)生菌能夠快速利用葡萄糖合成菌體和ε-PL，但ε-PL產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率不高，并且在補(bǔ)料階段由于葡萄糖溶解度以及流加方式的限制，會引起發(fā)酵液稀釋并導(dǎo)致ε-PL濃度降低，從而增加了后提取成本和廢水處理負(fù)荷，最終引起ε-PL生產(chǎn)成本的增加。最近，我們提出了利用工業(yè)甘油作碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL的方法 001110250123.7)。該方法與以葡萄糖作碳源相比，盡管顯著提高了 ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，但發(fā)酵時間較長，從而導(dǎo)致生產(chǎn)強(qiáng)度較低。
葡萄糖和甘油都是ε -PL產(chǎn)生菌最適碳源(Shima S, Sakai H. Agric Biol Chem 1981,45 :^97-250 。以葡萄糖為唯一碳源時，ε-PL產(chǎn)生菌的發(fā)酵速度快，但ε-PL產(chǎn)量低，葡萄糖轉(zhuǎn)化率低。以甘油為唯一碳源時，轉(zhuǎn)化率高，ε-PL產(chǎn)量高，但發(fā)酵速度慢。然而，我們研究發(fā)現(xiàn)簡單的將葡萄糖和甘油混合共同作為碳源用于ε -PL發(fā)酵卻并不能有效提高ε-PL發(fā)酵水平。其關(guān)鍵在于，如何確定最合適的葡萄糖和甘油混合比例？如何保證發(fā)酵中后期的葡萄糖和甘油比例維持在最佳水平以及如何控制發(fā)酵過程合適PH值？基于此，本發(fā)明在考察了葡萄糖和甘油混合比例的基礎(chǔ)上，結(jié)合葡萄糖和甘油流加策略保持發(fā)酵中后期總碳源濃度維持在較低水平的方法以及PH值控制策略，建立了一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸的方法，提高ε -PL發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，從而降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下利用ε -PL產(chǎn)生菌培養(yǎng)20 30h的種子液，接種葡萄糖和甘油混合碳源的培養(yǎng)基，在初始PH 6. 5 7. 0、溫度為28 32°C、溶氧保持在15 40%的培養(yǎng)條件下，采用pH 值調(diào)控策略和流加發(fā)酵方法生產(chǎn)ε -PL。本發(fā)明所指的起始發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖、甘油、酵母膏、(NH4) 2S04、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、和 FeSO4 · 7H20 組成。最優(yōu)配方為葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4Jg/ L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L。本發(fā)明所指的pH值調(diào)控策略是當(dāng)發(fā)酵起始pH值下降至3. 0 4. 5時，用氨水等堿性液體或液氨控制PH穩(wěn)定在3. 0 4. 5，并保持到發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明所指的流加發(fā)酵法是在ε -PL發(fā)酵過程中，當(dāng)甘油濃度低于2 3g/L時， 流加甘油，直到甘油濃度達(dá)到5 7g/L ；流加或不流加葡萄糖，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度為 0 7g/L。如采用葡萄糖流加策略，則在葡萄糖濃度低于2 3g/L時開始流加500g/L 800g/L葡萄糖；當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于1 2g/L，流加(NH4)2SO4,直到(NH4) 2SO4濃度達(dá)到 5 10g/L。與葡萄糖、甘油為單一碳源發(fā)酵牛產(chǎn)ε-PL方法相比，本發(fā)明所示的葡萄糖和甘
ε -PL m^m^^nt^ 1、提高了 ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量。利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL能夠明顯提高ε "PL發(fā)酵產(chǎn)量，比葡萄糖作單一碳源提高46%，比甘油作單一碳源提高17%。2、提高了 ε -PL發(fā)酵生產(chǎn)強(qiáng)度。利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε "PL能夠顯著縮短發(fā)酵時間，分別比葡萄糖和甘油作單一碳源縮短25%和33% ； ε -PL生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了 63%和17%。
具體實施例方式根據(jù)下列實施例，可以更好地理解本發(fā)明。實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件以及結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)力要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
^MM 1 現(xiàn)有工藝-葡萄糖單一碳源補(bǔ)料-分枇發(fā)酵牛產(chǎn)ε -PL在裝有3. 25L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基葡萄糖，50g/L ； (NH4) 2S04，IOg/ L ；酵母粉，5g/L ；MgSO4,0. 5g/L ；ZnSO4,0. 04g/L ；FeSO4,0. 03g/L ;Κ2ΗΡ04，0· 8g/L ；KH2PO4, 1. 36g/L)，接種0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 6. 8、溫度為30°C、 溶氧保持在30%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)pH值自然下降到4. 0左右，流加25%氨水維持該 PH值至發(fā)酵結(jié)束。在發(fā)酵后期，流加800g/L葡萄糖和80g/L (NH4) 2S04，使葡萄糖維持在IOg/ L左右。培養(yǎng)168h, ε -PL產(chǎn)量達(dá)到24g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度為3. 86g/L/d。^MM 2 現(xiàn)有工藝-甘油單一碳源補(bǔ)料-分枇發(fā)酵牛產(chǎn)ε -PL在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(甘油培養(yǎng)基甘油，60g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ； 酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 ·7Η20，0· 8g/L ；FeSO4 ·7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25L ε -PL 產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 6. 8、溫度為30°C、溶氧保持在30%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)PH值自然下降到3.5，流加10 25%氨水維持pH至發(fā)酵36h，隨后，用10 25%氨水使pH緩慢升至3. 8，保持到發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)發(fā)酵后期甘油濃度低于5g/L時，流加甘油，直到甘油濃度達(dá)到15g/L ；當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于5g/L，流加(NH4)2SO4,直到(NH4)2SO4濃度達(dá)到10g/L。培養(yǎng)168h，g-PL產(chǎn)量達(dá)到30. llg/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為4. 18g/L/d。^MM 3 葡萄糖和甘油、混合碳源分枇發(fā)酵牛產(chǎn)ε -PL在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基組成葡萄糖，50g/L ；甘油，10g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH 6. 0、溫度為38°C、溶氧保持在40%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)pH值自然下降到3. 0，流加10 25%氨水維持pH恒定至發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)40h, ε -PL產(chǎn)量達(dá)到6. 29g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度為3. 86g/L/d。實施例4:葡萄糖和甘油混合碳源分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基組成葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH7. 5、溫度為30°C、溶氧保持在 15%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)pH值自然下降到4. 5，流加10 25%氨水維持pH恒定至發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)34h，ε -PL產(chǎn)量達(dá)到6. 34g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為4. 54g/L/d。實施例5 葡萄糖和甘油混合碳源分批發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基組成葡萄糖，15g/L ；甘油，45g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH6. 8、溫度為35°C、溶氧保持在 30%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)pH值自然下降到3. 8，流加10 25%氨水維持pH恒定至發(fā)酵結(jié)束。培養(yǎng)38h，ε -PL產(chǎn)量達(dá)到6. 44g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為4. 13g/L/d。實施例6 葡萄糖和甘油混合碳源補(bǔ)料-分批發(fā)酵生產(chǎn)ε -PL在裝有3. 25L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中(培養(yǎng)基組成葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產(chǎn)生菌的20 30h種子培養(yǎng)液，在初始pH6. 8、溫度為30°C、溶氧保持在 30%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵。當(dāng)pH值自然下降到3. 8，流加10 25%氨水維持pH恒定至發(fā)酵結(jié)束。在發(fā)酵過程中，當(dāng)葡萄糖濃度低于2 3g/L時，流加500g/L 800g/L葡萄糖，直到葡萄糖濃度達(dá)到 8g/L ；當(dāng)甘油濃度低于2 3g/L時，流加甘油，直到甘油濃度達(dá)到 7 8g/L;當(dāng)(NH4)2SO4濃度低于2g/L，流力口 (NH4)2SO4,直到(NH4) 2S04濃度達(dá)到5g/L。培養(yǎng) 174h，ε -PL 產(chǎn)量達(dá)到 35. 14g/L，產(chǎn)率為 4. 85g/L/d。
權(quán)利要求
1.一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε -聚賴氨酸的方法，其特征在于ε-聚賴氨酸產(chǎn)生菌以葡萄糖和甘油混合物為碳源，在初始PH 6. 0 7. 5、溫度為25 38°C、溶氧保持在15 40%的培養(yǎng)條件下發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸；當(dāng)ε-聚賴氨酸開始合成時，采用PH值調(diào)控策略和流加補(bǔ)料發(fā)酵法，達(dá)到提高ε -聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，降低生產(chǎn)成本和減少廢水量的目的。
2.如權(quán)利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于所述混合碳源是指葡萄糖利甘油共同存在形成的混合物；或在發(fā)酵部分階段單獨使用葡萄糖或甘油作為碳源而后又流加另一種碳源(甘油或葡萄糖)形成的混合物。
3.如權(quán)利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于發(fā)酵起始階段控制發(fā)酵罐中葡萄糖濃度為80 40g/L，在發(fā)酵中后期流加或不流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度在0 7g/L。
4.如權(quán)利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于發(fā)酵起始階段控制發(fā)酵罐中甘油濃度為0 80g/L，在發(fā)酵后期甘油濃度低于 2 3g/L時，開始流加甘油，直到其濃度達(dá)到5 7g/L。
5.如權(quán)利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于采用PH值控制策略當(dāng)發(fā)酵起始ρΗ值下降至3. 0 4. 5時，用氨水等堿性液體或液氨控制PH穩(wěn)定在3. 0 4. 5，并保持到發(fā)酵結(jié)束。
6.如權(quán)利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε_聚賴氨酸的方法，其特征在于采用(NH4)2SCV流加發(fā)酵方法發(fā)酵起始(NH4)2SO4濃度為5 20g/L，當(dāng)(NH4)2SO4 濃度低于1 2g/L，流加(NH4)2SO4溶液，直到(NH4)2SO4濃度達(dá)到5 10g/L。
7.如權(quán)利要求4所述的混合碳源，在發(fā)酵初始階段發(fā)酵罐中甘油濃度的極值為Og/L， 此時葡萄糖為發(fā)酵初始階段的唯一碳源。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法采用葡萄糖和甘油共同作為碳源，結(jié)合流加發(fā)酵方法和pH控制策略生產(chǎn)ε-聚賴氨酸。利用本發(fā)明建立的發(fā)酵工藝，比葡萄糖單獨作碳源的ε-聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量提高40％以上；比甘油單獨作碳源的ε-聚賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)量提高20％以上。本發(fā)明改變了現(xiàn)有ε-聚賴氨酸生產(chǎn)方法，顯著提高了ε-聚賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。
文檔編號C12P13/02GK102352386SQ20111027432
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者唐蕾, 張宏建, 張建華, 李樹, 毛忠貴, 陳旭升 申請人:江南大學(xué)