一種以水稻秸稈為主要原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種以水稻秸稈為主要原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法，是以2012年6月5日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為：CCTCC?NO:M2012204的木酶屬里氏木酶Trichodema?reesei?QZ-5菌株為發(fā)酵菌株，以農(nóng)產(chǎn)品廢棄物-水稻秸稈為主要原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)制備纖維素酶，采用國際理論應(yīng)用化學協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標準方法測定酶活，即濾紙酶活力FPA測定，并換算成每克水稻秸稈可產(chǎn)纖維素酶的活力達4IU/g以上，所產(chǎn)纖維素酶可廣泛應(yīng)用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】一種以水稻秸稈為主要原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了一種以水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶的方法，采用的發(fā)酵菌株是2012年6月5日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為:CCTCC M2012204的木酶屬里氏木酶Trichodema reesei QZ-5菌株，該發(fā)明的特點是以農(nóng)產(chǎn)品廢棄物-水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶，采用國際理論應(yīng)用化學協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標準方法測定酶活，即濾紙酶活力FPA測定，并換算成每克水稻秸桿可產(chǎn)纖維素酶的活力達4IU/g以上，所產(chǎn)纖維素酶可廣泛應(yīng)用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶是一類能夠降解纖維素成葡萄糖的多組分復合酶系，可廣泛應(yīng)用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，近年來，隨著全球資源能源短缺問題日顯突出，纖維素酶是將自然界中分布最廣、含量最多、最為廉價的纖維素作為再生資源的主要酶之一，從而使生產(chǎn)制備纖維素酶的研究成了全球科研工作者更關(guān)注的課題。
[0003]然，現(xiàn)有纖維素酶制備的研究表明，纖維素酶的制備成本偏高，由于纖維素酶屬于誘導酶類，純纖維素通常被認為是纖維素酶合成的最佳誘導物，但純纖維素價格昂貴，而農(nóng)村水稻秸桿來源廣泛，是農(nóng)產(chǎn)品廢棄物，本身既是纖維素又能作為微生物生長的碳源，這促使我們?nèi)ヌ剿餮芯孔儚U為寶、低成本制備纖維素酶的方法，本發(fā)明就是在這樣的指導思想下，經(jīng)過無數(shù)次的試驗獲得成功的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種以`水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶的方法，采用的發(fā)酵菌株是2012年6月5日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為:CCTCC M2012204的木酶屬里氏木酶Trichodema reesei QZ-5菌株，該發(fā)明的特點是以農(nóng)產(chǎn)品廢棄物-水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)制備纖維素酶，采用國際理論應(yīng)用化學協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標準方法測定酶活，即濾紙酶活力FPA測定，并換算成每克水稻秸桿可產(chǎn)纖維素酶的活力達4IU/g以上，所產(chǎn)纖維素酶可廣泛應(yīng)用于能源、紡織、造紙、飼料、食品等領(lǐng)域，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:2012年6月5日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為:CCTCC M 2012204的木酶屬里氏木酶Trichodema reeseiQZ_5菌株為生產(chǎn)出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和是以農(nóng)產(chǎn)品廢棄物-水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)制備纖維素酶，工藝為:
[0006](I)種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，馬鈴薯200g/L。
[0007]200g/L馬鈴薯的制備:馬鈴薯去皮、切片后，取200g加1.5升水，煮沸20分鐘，沙布過濾取濾液，定容到I升。
[0008]接種工藝:取斜面菌種一支加入0.9%的生理鹽水10ml，用竹簽刮下培養(yǎng)基上的孢子，即為菌種孢子液，取Iml菌種孢子液放入含50ml種子培養(yǎng)基的250ml的三角中，置于搖床。培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速200rpm，溫度28°C，恒溫培養(yǎng)50小時，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子液。
[0009](2)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基
[0010]將水稻秸桿切成I厘米左右的小段，稱20克放入500ml的三角瓶中，加入用醋酸和氫氧化鈉調(diào)PH = 4.8的水50ml，121°C滅菌20分鐘，冷卻后待用。
[0011](3)發(fā)酵產(chǎn)酶及酶液提取
[0012]在滅菌冷卻后的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入5ml種子培養(yǎng)液并充分混合，28°環(huán)境中靜止培養(yǎng)9天，再加入200ml水，用棒充分攪散后，將250ml三角瓶置于溫度為28。轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上搖3小時，過濾得到酶液，用FPA測定法測酶活。
[0013](4)酶活的測定方法:
[0014]采用國際理論應(yīng)用化學協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標準方法測定酶活，即濾紙酶活力FPA測定。其定義為:在50°C，pH4.8的條件下，一個FPA國際單位等于酶水解反應(yīng)中每分鐘由濾紙生成1.0Uumol葡萄糖的酶量，以國際單位IU表示，濾紙酶活單位可以用體積表示IU/ml，其方法與步驟為:
[0015](I)將I X 6cm的濾紙條WhatmanN0.1濾紙條卷成圓筒,橫放在IOmL比色皿試管底部，(不要垂直放下，不要使濾紙貼在試管壁上)。
[0016](2)向試管中加入Iml pH = 4.8的濃度為0.05mol/L的檸檬酸鈉緩沖液。
[0017](3)將V體積的酶液加入到5mL的緩沖液中，適當?shù)南♂?。然后?.5mL的酶稀釋液加入到比色皿試管中。緩沖液作為空白。
[0018](4)將0.5mL酶液加入到裝有ImL檸檬酸緩沖液的試管中
[0019](5)恒溫水浴(500C )，反應(yīng)I小時.[0020](6)加入ImLDNS試劑，沸水浴5min，冷水浴至室溫，并定容到10mL。
[0021](7)540hm 下，測試 0D。
[0022](8)參照DNS的標準曲線，確定還原糖的含量。由(3)得到M毫克，由(4)得到m毫克。
[0023](9)公式如下:
【權(quán)利要求】
1.一種以水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法，采用的發(fā)酵菌株是2012年6月5日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號為:CCTCC M2012204的木酶屬里氏木酶 Trichodema reesei QZ-5 菌株。
2.一種以水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的方法，其特點是以農(nóng)產(chǎn)品廢棄 物-水稻秸桿為主要原料固態(tài)發(fā)酵制備纖維素酶，工藝為: (1)種子培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L;馬鈴薯200g/L。 200g/L馬鈴薯的制備:馬鈴薯去皮、切片后，取200g加1.5升水，煮沸20分鐘，沙布過濾取濾液，定容到I升。 (2)接種工藝:取斜面菌種一支加入0.9%的生理鹽水10ml，用竹簽刮下培養(yǎng)基上的孢子，即為菌種孢子液，取Iml菌種孢子液放入含50ml種子培養(yǎng)基的250ml的三角中，置于搖床。培養(yǎng)條件:轉(zhuǎn)速200rpm，溫度28°C，恒溫培養(yǎng)50小時，即為發(fā)酵產(chǎn)酶的種子液。 (3)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 將水稻秸桿切成I厘米左右的小段，稱20克放入500ml的三角瓶中，加入用醋酸和氫氧化鈉調(diào)PH = 4.8的水50ml，121°C滅菌20分鐘，冷卻后待用。 (4)發(fā)酵產(chǎn)酶及酶液提取 在滅菌冷卻后的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中加入5ml種子培養(yǎng)液并充分混合，28°環(huán)境中靜止培養(yǎng)9天后，再加入200ml水，用棒充分攪散后，將250ml三角瓶置于溫度為28。轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上搖3小時，過濾得到酶液。 (5)酶活測定采用國際理論應(yīng)用化學協(xié)會(IUPAC)推薦的國際標準方法即濾紙酶活力FPA測定。
【文檔編號】C12R1/885GK103509771SQ201210211315
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月26日
【發(fā)明者】李洪兵, 張峰, 張明 申請人:湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司