一種受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明屬生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及溶瘤腺病毒，具體涉及一種受組織或細胞特異性啟動子(轉(zhuǎn)錄水平)和microRNA(轉(zhuǎn)錄后水平)雙調(diào)控的新型溶瘤腺病毒及其構(gòu)建方法，構(gòu)建的雙調(diào)控溶瘤腺病毒比僅受組織或細胞特異性啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒更加安全、有效；本發(fā)明構(gòu)建的雙調(diào)控溶瘤腺病毒能單獨使用或與現(xiàn)有的腫瘤治療方法結(jié)合使用，能顯著提高腫瘤治療效果并減少副作用。
【專利說明】一種受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及溶瘤腺病毒，具體涉及一種受組織或細胞特異性啟動子(轉(zhuǎn)錄水平)和microRNA (轉(zhuǎn)錄后水平)雙調(diào)控的新型溶瘤腺病毒及其構(gòu)建方法，按此方法構(gòu)建的雙調(diào)控溶瘤腺病毒比僅受組織或細胞特異性啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒更加安全、有效。

【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)報道，生物治療是繼手術(shù)、放療、化療三大傳統(tǒng)療法之后治療癌癥的第四種療法，其主要包括免疫治療、細胞治療與基因治療等。有關(guān)腫瘤生物治療的研究與應(yīng)用已經(jīng)取得較多成果，其中，條件復制型腺病毒可以在腫瘤細胞內(nèi)選擇性的復制，而且具有顯著的“溶瘤效應(yīng)”和“旁觀者效應(yīng)”，因而作為一種新興方式被期望在晚期癌癥的治療中發(fā)揮作用。目前最常用的構(gòu)建條件復制型腺病毒的手段是利用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子調(diào)控腺病毒早期復制必需基因(ElA)，實現(xiàn)其僅在腫瘤細胞內(nèi)特異性復制和溶瘤的作用，以保證其治療效應(yīng)的安全性及有效性。然而，必須清楚地認識到，所述的安全性是相對的，尤其在高濃度病毒劑量的使用下，仍會產(chǎn)生比較嚴重的毒副作用，Kumiko Sug1等用人端粒酶啟動子調(diào)控ElA早期復制的腺病毒TRAD以1moi和2moi劑量分別感染人肺成纖維細胞WI38,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2moi小劑量情況下，病毒復制量很少，而在1moi劑量下，病毒復制量有500倍的增加John Nemunaitis得出同樣的結(jié)果；究其原因，均為腺病毒ElA基因的表達不夠嚴謹所導致。研究者認為，如果能夠在ElA mRNA的翻譯水平可根據(jù)細胞不同活性進行更精細地調(diào)控，使其ElA基因表達經(jīng)轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平雙重調(diào)控，則構(gòu)建的這種新型條件復制型腺病毒，其嚴謹性必應(yīng)得以增強，更為安全。近年來，MicroRNA是一類研究透徹的轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控分子，在腫瘤細胞和正常細胞中存在差異表達，它們是內(nèi)源表達的小編碼RNAs，通常只有18-25個核苷酸長度，是轉(zhuǎn)錄后基因表達的重要調(diào)控子，通過形成RNA誘導沉默復合體(RISC, RNA-1nduced silencing complex),和目的mRNA部分喊基完全互補配對結(jié)合，沉默靶基因；miR-145是其中研究眾多、也最為清楚的microRNA，在很多腫瘤中包括結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、卵巢癌組織和細胞系中表達量是低的，而在它們的正常細胞中表達量較高。本申請的前期研究曾成功構(gòu)建了一個人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動子調(diào)控腺病毒復制早期必需基因ElA的腺病毒Adzqll，其能很好地在腫瘤細胞內(nèi)選擇性復制。
[0003]在此基礎(chǔ)上，本申請的發(fā)明人擬構(gòu)建一種新的病毒Adzqll-145T。
[0004]與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有如下參考文獻:
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平雙調(diào)控的新型溶瘤腺病毒及其構(gòu)建方法。
[0018]本申請以Adzqll為基礎(chǔ)，利用miR_145存在腫瘤組織和正常組織差異表達的特點，設(shè)計四個拷貝的靶序列，加入腺病毒Adzqll早期復制必需基因ElA的3’非翻譯區(qū)，構(gòu)建一種新的病毒Adzqll-145T。
[0019]具體的，本發(fā)明以重組腺病毒(Ad)為載體，根據(jù)不同類型腫瘤的遺傳特點，轉(zhuǎn)錄水平選擇腫瘤細胞或狀態(tài)或組織特異性的啟動子調(diào)控腺病毒復制必需元件El基因，轉(zhuǎn)錄后水平選擇在腫瘤組織和正常組織差異表達的MicroRNA，設(shè)計多個拷貝的靶序列加入早期復制必需基因El的3’非翻譯區(qū)，構(gòu)建受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平雙調(diào)控的新型溶瘤腺病毒。
[0020]本方法構(gòu)建的雙調(diào)控溶瘤腺病毒能有效克服僅受組織或細胞特異性啟動子調(diào)控的溶瘤腺病毒由于啟動子嚴謹性的相對性帶來的安全性問題，能使腺病毒的復制更特異地局限在腫瘤細胞內(nèi)，而在正常細胞內(nèi)不復制。
[0021]本發(fā)明中，所述的腺病毒復制必需早期基因包括ElA，ElAElB，ElAElB19k。
[0022]所述腺病毒復制必需早期基因的啟動子，被人腫瘤細胞或腫瘤組織的啟動子所取代；所述的啟動子包括腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子或腫瘤組織特異性啟動子，其中，腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子可以是低氧誘導性基因的啟動子，E2F1基因啟動子，Midikin基因啟動子，端粒酶(TERT)基因啟動子或熱休克蛋白基因啟動子；所述的腫瘤組織特異性啟動子可以是前列腺組織特異性抗原基因啟動子，MUCl基因啟動子，肺細胞表面蛋白基因啟動子，α-甲胎蛋白(AFP)基因啟動子，erbB2基因啟動子，甲狀腺球蛋白基因啟動子，Tyrosinase基因的啟動子，神經(jīng)鞘基礎(chǔ)蛋白基因啟動子，乳球白蛋白基因啟動子或癌胚抗原蛋白(CEA)基因啟動子；
[0023]所述的mi croRNA為在腫瘤組織和正常組織差異表達的mi croRNA，即在正常組織中高表達，在腫瘤組織中低表達或不表達；所述microRNA包括:miR_143，miR-145,miR-122, miR-199, let_7等；其靶序列為與其完全或大部分互補的序列；序列拷貝數(shù)為1-10個；序列插入位置為病毒復制早期基因El表達框終止密碼與polyA之間；上述miRNA靶序列可2個或多個組合使用。
[0024]本發(fā)明中，所述腺病毒DNA的E3區(qū)域亦可嵌入報告基因或抗癌基因。
[0025]所述抗癌基因包括:細胞凋亡誘導基因，抗新生血管形成基因，自殺基因，細菌毒素基因，腫瘤抑制基因，免疫調(diào)節(jié)因子和放射線增敏基因及其反義基因或干擾RNA片段。其中，免疫基因包括:白介素(IL)，各種集落刺激因子(CSF)，腫瘤壞死因子(TNFa)，各種細胞粘附分子等；自殺基因包括:細菌或及酵母的cytosine deaminase (CD)基因；皰疫病毒的thymidine kinase (TK)基因以及p450基因等。所述的抗癌基因的啟動子包括:強效啟動子(如CMV)、腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子和腫瘤組織特異性啟動子。
[0026]本發(fā)明的另一目的是提供所述受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平雙調(diào)控的新型溶瘤腺病毒構(gòu)建方法的醫(yī)用用途；尤其涉及所述方法在用于制備腫瘤基因治療藥物中的新用途。
[0027]本發(fā)明所述受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平雙調(diào)控的新型溶瘤腺病毒構(gòu)建方法能用于腫瘤治療藥物的制備；尤其是用于制備治療人類原位或轉(zhuǎn)移腫瘤的藥物。
[0028]以本發(fā)明所述方法制備的新型雙調(diào)控溶瘤腺病毒可單獨用于腫瘤的治療。
[0029]以本發(fā)明所述方法制備的新型雙調(diào)控溶瘤腺病毒可與腫瘤的放射線治療、化學治療、光動力學治療及溫熱治療相結(jié)合，對腫瘤進行綜合治療?？梢栽诜派渲委?、化學治療、光動力學治療及溫熱治療前，治療期間，或治療后直接注射入腫瘤中。
[0030]本發(fā)明的技術(shù)方案通過下述方法和步驟實現(xiàn):
[0031]1、通過PCR反應(yīng)和克隆技術(shù)，分離腫瘤或組織特異性啟動子；
[0032]2、構(gòu)建攜帶腫瘤或組織特異性啟動子調(diào)控腺病毒復制必需元件El基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒；
[0033]3、通過PCR反應(yīng)或基因合成獲得miRNA靶序列；
[0034]4、利用分子克隆技術(shù)將獲得的miRNA靶序列插入到腺病毒復制早期基因El表達框終止密碼與polyA之間；
[0035]5.構(gòu)建和鑒定攜帶報告基因及治療基因的腺病毒骨架質(zhì)粒；
[0036]6.包裝、擴增、純化腺病毒，并進行病毒滴度及功能鑒定；
[0037]7.病毒感染正常細胞及腫瘤細胞測定并復制及殺傷能力，評價安全性及有效性。
[0038]本發(fā)明中，采用的質(zhì)粒pEGFP-Nl為 CLONTECH L aboratories, Inc.產(chǎn)品，GenBankAccess1n#U55762ο
[0039]本發(fā)明的有益效果在于，
[0040]本發(fā)明只要根據(jù)不同類型腫瘤的遺傳特點，選擇合適的腫瘤細胞或狀態(tài)或組織特異性的啟動子及在正常組織和腫瘤中差異表達的miRNA從轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平雙重調(diào)控腺病毒復制必需元件ElA基因，從而調(diào)控腺病毒復制，使得溶瘤腺病毒具有更好的安全性，適用于不同組織來源的腫瘤及疾病的個體化治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0041]為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發(fā)明的進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1.質(zhì)粒構(gòu)建，測序和腺病毒包裝，其中，
[0043]圖1a是質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；圖1b是腺病毒包裝出毒顯示“彗星狀”帶，成功構(gòu)建出病毒Adzqll和病毒Adzql 1-145T ;圖1c是pDC311-telo-ElA_145T質(zhì)粒測序顯示四個拷貝的miR-145祀序列已經(jīng)成功插入到pDC311_telo_ElA的E1A3’非翻譯區(qū)。
[0044]圖2.miR-145和ElA在A549和HLF細胞中的表達，其中，
[0045]圖2a顯示miR-145在HLF中的表達明顯高于A549中；圖2b顯示了質(zhì)粒pDC311-telo-ElA和pDC311-telo-ElA_145T轉(zhuǎn)染細胞后ElA的表達分析比較:在A549細胞中，轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后ElA水平差異較小，而在HLF中，pDC311-telo-ElA-145T質(zhì)粒ElA表達水平顯著下降；圖2c為病毒AdzqlI和Adzql 1-145T感染細胞后ElA的表達分析:病毒感染細胞后，A549細胞中兩種病毒的ElA表達量都較高；HLF細胞中，Adzqll-145T病毒ElA表達顯著下降(*ρ〈0.05, **ρ〈0.01) ο
[0046]圖3.腺病毒復制和細胞毒性檢測，其中，
[0047]圖3a顯示了空斑單位法檢測腺病毒在Α549和HLF中的復制情況:在A549中，Adzqll-145T復制量高于Adzqll ;在咖中，Adzqll_145T復制量明顯低于Adzqll ;圖3b顯示了病毒對兩種細胞的殺傷情況比較:CCK8結(jié)果顯示:不同劑量組，Adzqll對A549殺傷效應(yīng)均明顯強于HLF ;而同樣劑量經(jīng)改造后的Adzql 1-145T對HLF的殺傷力減小，較Adzqll更為安全(*P〈0.05，**p〈0.01)。
[0048]圖4.病毒感染A549和HLF細胞后病理改變，其中，
[0049]熒光顯微鏡下可見，隨著病毒濃度增大，病毒對細胞的殺傷效果都逐步增大，病毒Adzqll和Adzql 1-145T對A549細胞均有殺傷且后者殺傷效果明顯，胞體變圓，粘附力差；而在HLF細胞中，Adzqll-145T感染后，所有細胞胞體呈長梭狀，觸角長，粘附牢；病毒Adzqll感染后，還可見存在部分變圓的、折光度稍差的病變細胞，細胞存活狀態(tài)較Adzqll-145T 差。

【具體實施方式】
[0050]實施例1:通過PCR反應(yīng)和克隆技術(shù)，分離腫瘤特異性啟動子
[0051]A.端粒酶5’端調(diào)控順序
[0052]為了分離端粒酶啟動子，本發(fā)明采用PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增啟動子(序列一)，將其插入質(zhì)粒pEGFP-Ι(購自Clontech公司)中，驅(qū)動GFP基因表達，構(gòu)建pTERT-EGFP表達質(zhì)粒，然后，用脂質(zhì)體將pTERT_EGFP轉(zhuǎn)入各種細胞中，實驗顯示，EGFP僅在腫瘤細胞中表達，而在正常細胞中則沒有EGFP表達；
[0053]B.E2F1基因啟動子
[0054]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增出啟動子(序列二 )，將該段順序插入質(zhì)粒pEGFP-Ι中，以E2F1基因啟動子驅(qū)動EGFP表達，獲得表達質(zhì)粒pE2Fl_EGFP。之后的脂質(zhì)體輔助的轉(zhuǎn)導實驗結(jié)果顯示，GFP在腫瘤細胞中高水平表達，而在正常成纖維細胞中表達量很低。表明該啟動子的活性在正常與腫瘤細胞之間的區(qū)別很大，可用于調(diào)控腺病毒選擇性地在腫瘤內(nèi)復制；
[0055]C.缺氧誘導性啟動子
[0056]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增分離缺氧誘導性的啟動子(序列三)，所述啟動子是血管生長因子/血管通透性因子(VEGF)的5’端的啟動子，其已被多種實驗證明，是能被缺氧微環(huán)境所誘導的最強烈的基因。而它的啟動子也被證實在腫瘤中選擇性的活化。本發(fā)明將所述啟動子插入到質(zhì)粒pEGFP-Ι中，得到pHRP-EGFP-1。實驗證明，上述啟動子在缺氧的腫瘤細胞中被選擇性激活，而在正常氧氣分壓下它的活性很低；
[0057]D.α-胚胎蛋白(AFP)基因啟動子
[0058]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增出α-胚胎蛋白基因啟動子(序列四)，將其克隆到質(zhì)粒pEGFP-Ι中，得到pAFP-EGFP。將所得質(zhì)粒導入細胞中，結(jié)果顯示，只有在肝癌細胞中才觀察到有高水平的GFP報告基因表達，而在正常細胞和沒有α -胚胎蛋白表達的腫瘤細胞中均沒有GFP表達；
[0059]Ε.癌胚抗原(CEA)基因啟動子
[0060]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增出CEA啟動子(序列五)，將其克隆到質(zhì)粒pEGFP-Ι中，得到pCEA-EGFP。將所得質(zhì)粒導入細胞中，結(jié)果顯示，在CEA陽性的直腸癌細胞Lovo和SW620中觀察到有高水平的GFP報告基因表達，而在正常細胞和無CEA表達的腫瘤細胞(如ChangLiver和Hela細胞)中均沒有GFP表達；
[0061]F.熱休克蛋白(HSP)基因啟動子
[0062]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增出HSP啟動子(序列六)，將其克隆到質(zhì)粒pEGFP-Ι中，得到pHSP-EGFP，將所得質(zhì)粒導入細胞中，結(jié)果顯示，上述啟動子在加熱的腫瘤細胞中被選擇性激活，而在正常情況下它的活性很低；
[0063]G.MUC-1基因啟動子
[0064]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增分離MUC-1基因啟動子(序列七)，將其順序插入質(zhì)粒pEGFP-Ι中，得到pMUCl-EGFP。細胞轉(zhuǎn)染實驗證明，GFP僅在MUCl基因高水平表達的腫瘤細胞中特異性表達，而在沒有MUCl基因表達的細胞中則基本不表達；
[0065]F.c~erbB2 啟動子
[0066]本發(fā)明通過PCR技術(shù)，以人類細胞DNA為模板，擴增分離erbB2基因啟動子(序列八)，將其順序插入質(zhì)粒pEGFP-Ι中，得到perbB2-EGFP。細胞轉(zhuǎn)染實驗證明，GFP僅在erbB2基因高水平表達的腫瘤細胞(如乳腺癌細胞株SKBR-3)中特異性表達，而在沒有erbB2基因表達的細胞中則基本不表達。
[0067]實施例2:構(gòu)建攜帶腫瘤特異性啟動子調(diào)控腺病毒復制必需元件ElA基因的真核表達載體
[0068]將實施例1中所分離出的腫瘤特異性啟動子(TSP)通過遺傳工程的方法嵌入真核表達載體，用其控制腺病毒復制必需的早期基因ElA的表達。所述質(zhì)粒的特點是其攜帶的腺病毒復制必需元件ElA基因被腫瘤組織特異性的啟動子所調(diào)控。本發(fā)明采用的真核表達載體結(jié)構(gòu)示意為:Plasmid-TSP-ElA，其中，Plasmid為腺病毒穿梭質(zhì)粒(比如:pDC311，pDC312，pDC315，pDC316) ;TSP為實施例1中所分離出的腫瘤特異性啟動子及其它未提及的腫瘤特異性啟動子。
[0069]實施例3:通過PCR反應(yīng)或基因合成獲得miRNA靶序列
[0070]通過PCR反應(yīng)或基因合成獲得1-10個拷貝的miRNA靶序列，各拷貝間含linker序列，兩端含酶切位點。如通過基因合成獲得含4個拷貝的miRNA145靶序列(序列九)。
[0071]實施例4:利用分子克隆技術(shù)將獲得的miRNA靶序列插入到腺病毒復制早期基因El表達框終止密碼與polyA之間
[0072]將實施例3獲得的miRNA靶序列與實施例2構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒Plasmid-TSP-ElA經(jīng)同一限制性內(nèi)切酶處理，連接，將獲得的miRNA靶序列插入到腺病毒復制早期基因El表達框終止密碼與polyA之間，構(gòu)建雙調(diào)控腺病毒穿梭質(zhì)粒PIasmid-TSP-EIA-miRNA。
[0073]實施例5:構(gòu)建和鑒定攜帶報告基因及治療基因的腺病毒骨架質(zhì)粒:
[0074]按本領(lǐng)域常規(guī)方法構(gòu)建下述攜帶報告基因及治療基因的腺病毒骨架載體
[0075]①.攜帶報告基因EGFP編碼基因:pBHG-CMV-EGFP
[0076]②.攜帶具有刺激機體免疫能力的IL2編碼基因:pBHG-CMV_IL2
[0077]③.攜帶具有刺激機體免疫能力的GM-CSF編碼基因:pBHG-CMV-GM_CSF
[0078]④.攜帶腫瘤壞死因子TNFa編碼基因:pBHG-CMV-TNF a
[0079]實施例6:包裝、擴增、純化腺病毒，并進行病毒滴度及功能鑒定；
[0080]采用人胚腎293細胞對上述構(gòu)建病毒進行包裝，經(jīng)過噬菌斑(plaquepurificat1n)篩選后再進行擴增,采用氯化銫密度梯度離心及透析純化病毒。純化的病毒滴度均可達3-5 X 110Pfu/ml。
[0081]將上述病毒感染腫瘤細胞測定報告基因EGFP及治療基因的表達。結(jié)果證明，熒光顯微鏡下觀察上述Ad-CMV-EGFP感染的腫瘤細胞，表達綠色熒光蛋白；ELISA檢測治療基因的表達水平，IL2，GM-CSF和TNF α的表達量都較高。
[0082]實施例7:病毒感染正常細胞及腫瘤細胞測定比較復制及殺傷能力，評價安全性及有效性
[0083]將實施例6純化后的雙調(diào)控溶瘤病毒Adzqll-145T(Ad-TERTp-ElA_mil45T)和單調(diào)控對照病毒Adzqll (Ad-TERTp-ElA)(圖1)分別感染非小細胞肺癌A549和正常人胚肺細胞HLF，空斑單位法檢測腺病毒在A549和HLF中的復制情況:在A549中，Adzqll-145T復制量高于Adzqll ;在咖中，Adzql 1-145T復制量明顯低于Adzqll。CCK8結(jié)果顯示:不同劑量組，Adzqll-145T對A549殺傷效均不低于甚至高于Adzqll ;而同樣劑量經(jīng)改造后的Adzqll-145T對HLF的殺傷力減小，較Adzqll更為安全(圖3-4)；
[0084]將5 X 18Adzql 1-145T以及對照5 X 18Adzqll分別注射到人非小細胞肺癌A549裸鼠皮下移植瘤內(nèi)，每2-3天測量腫瘤大小一次，跟蹤觀察腫瘤生長情況；結(jié)果表明，Adzql 1-145T和Adzql I組都具有一定抑制腫瘤生長的能力，但Adzql 1-145T組較Adzql I組抗癌效果明顯增強，動物生存時間延長，顯示Adzqll-145T能夠顯著地提高腫瘤治療效果并減少副作用。
[0085]本發(fā)明所涉及的啟動子序列做如下說明:
[0086]序列一:
[0087]GenBank:AF097365
[0088]Homo sapiens telomerase reverse transcriptase (TERT) gene, promoter andpartial cds.
[0089]序列二:
[0090]GenBank: U47675
[0091]Human transcript1n factor E2F1 (E2F1)gene, promoter and exonl.
[0092]序列三:
[0093]GenBank: AH006957
[0094]Homo sapiens hypoxia-1nducible factor I alpha subunit (HIFlA)gene,complete cds
[0095]序列四:
[0096]GenBank: L34019
[0097]Homo sapiens(clone Ch-HAF3)alpha-fetoprotein(AFP)gene, promoter reg1n
[0098]序列五:
[0099]GenBank: Z21818
[0100]H.sapiens carcinoembryonic antigen gene
[0101]序列六:
[0102]GenBank:X13229
[0103]Human hsp70Bgene5’-reg1n
[0104]序列七:
[0105]GenBank: M35093
[0106]Homo sapiens tumor mucin antigen (MUCl) gene, complete cds.
[0107]序列八:
[0108]GenBank: M16892
[0109]Human c-erbB-2proto-oncogene, promoter reg1n
[0110]序列九:
[0111]四個miR-145 的靶序列(S-145T)
[0112]gttaacagggattcctgggaaaactggactcagagggattcctgggaaaactggacctgaagggattccL L
【權(quán)利要求】
1.一種受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，通過下述方法構(gòu)建，以重組腺病毒(Ad)為載體，根據(jù)不同類型腫瘤的遺傳特點，以及轉(zhuǎn)錄水平，選擇腫瘤細胞或狀態(tài)或組織特異性的啟動子調(diào)控腺病毒復制必需元件El基因，轉(zhuǎn)錄后水平選擇在腫瘤組織和正常組織差異表達的MiCT0RNA，設(shè)計多個拷貝的靶序列加入早期復制必需基因El的3’非翻譯區(qū)，構(gòu)建受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平雙調(diào)控的新型溶瘤腺病毒。
2.按權(quán)利要求1所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，構(gòu)建的雙調(diào)控溶瘤腺病毒使腺病毒的復制特異地局限在腫瘤細胞內(nèi)，而在正常細胞內(nèi)不復制。
3.按權(quán)利要求1所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒復制必需早期基因選自E1A，ElAElB或ElAElB19k。
4.按權(quán)利要求1所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述腺病毒復制必需早期基因的啟動子，被人腫瘤細胞或腫瘤組織的啟動子所取代；所述的啟動子包括腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子或腫瘤組織特異性啟動子。
5.按權(quán)利要求4所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子選自低氧誘導性基因的啟動子，E2F1基因啟動子，Midikin基因啟動子，端粒酶(TERT)基因啟動子或熱休克蛋白基因啟動子； 所述的腫瘤組織特異性啟動子選自前列腺組織特異性抗原基因啟動子，MUCl基因啟動子，肺細胞表面蛋白基因啟動子，α-甲胎蛋白(AFP)基因啟動子，erbB2基因啟動子，甲狀腺球蛋白基因啟動子，Tyrosinase基因的啟動子，神經(jīng)鞘基礎(chǔ)蛋白基因啟動子，乳球白蛋白基因啟動子或癌胚抗原蛋白(CEA)基因啟動子。
6.按權(quán)利要求1所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的microRNA為在腫瘤組織和正常組織差異表達的microRNA，即在正常組織中高表達，在腫瘤組織中低表達或不表達。
7.按權(quán)利要求6所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述microRNA選自miR-143，miR-145，miR-122，miR-199或let_7 ;其靶序列為與其完全或大部分互補的序列；序列拷貝數(shù)為1-10個；序列插入位置為病毒復制早期基因El表達框終止密碼與PolyA之間；所述miRNA靶序列可2個或多個組合使用。
8.按權(quán)利要求1所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述腺病毒DNA的E3區(qū)域嵌入報告基因或抗癌基因。
9.按權(quán)利要求8所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述抗癌基因選自:細胞凋亡誘導基因，抗新生血管形成基因，自殺基因，細菌毒素基因，腫瘤抑制基因，免疫調(diào)節(jié)因子和放射線增敏基因及其反義基因或干擾RNA片段；其中，免疫基因選自:白介素(IL)，各種集落刺激因子(CSF)，腫瘤壞死因子(TNF α )或細胞粘附分子；自殺基因選自:細菌或及酵母的cytosine deaminase (⑶)基因；抱疫病毒的thymidine kinase (TK)基因以及P450基因； 所述的抗癌基因的啟動子包括:強效啟動子(如CMV)、腫瘤細胞或微環(huán)境特異性的啟動子和腫瘤組織特異性啟動子。
10. 一種受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后雙調(diào)控的溶瘤腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于，其包括步驟: 1)通過PCR反應(yīng)和克隆技術(shù)，分離腫瘤或組織特異性啟動子； 2)構(gòu)建攜帶腫瘤或組織特異性啟動子調(diào)控腺病毒復制必需元件El基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒; 3)通過PCR反應(yīng)或基因合成獲得miRNA靶序列； 4)利用分子克隆技術(shù)將獲得的miRNA靶序列插入到腺病毒復制早期基因El表達框終止密碼與polyA之間； 5)構(gòu)建和鑒定攜帶報告基因及治療基因的腺病毒骨架質(zhì)粒； 6)包裝、擴增、純化腺病毒，并進行病毒滴度及功能鑒定； 7)病毒感染正常細胞及腫瘤細胞測定并復制及殺傷能力，評價安全性及有效性。
11.權(quán)利要求1所述的受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平雙調(diào)控的溶瘤腺病毒在用于制備腫瘤基因治療藥物中的用途。
12.按權(quán)利要求11的用途，其特征在于，所述的藥物為治療人類原位或轉(zhuǎn)移腫瘤的藥物。
【文檔編號】C12N15/861GK104178460SQ201410345521
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】王慧萍, 韋芳, 王榮花 申請人:上海市第一人民醫(yī)院