一種愛(ài)德華氏菌的滅活方法及其滅活疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種愛(ài)德華氏菌的滅活方法及其滅活疫苗，屬于魚(yú)用疫苗領(lǐng)域，具體說(shuō)是巰基試劑作為滅活劑，對(duì)愛(ài)德華氏菌的滅活方法及其制備的滅活疫苗，所用的滅活劑為體積分?jǐn)?shù)小于或等于10％的巰基試劑，其滅活溫度范圍為0℃—100℃下，滅活時(shí)間范圍為10min—48h。本方法制備的滅活?lèi)?ài)德華氏菌疫苗可有效維持愛(ài)德華氏菌抗原的免疫保護(hù)力。
【專利說(shuō)明】一種愛(ài)德華氏菌的滅活方法及其滅活疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚(yú)用疫苗領(lǐng)域，具體說(shuō)是巰基試劑作為滅活劑，對(duì)愛(ài)德華氏菌的滅活 方法及其制備的滅活疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella sp.)包括遲緩愛(ài)德華氏菌（E. tarda)、鲇魚(yú)愛(ài)德華氏 菌（E. ictaluri)和?？茞?ài)德華氏菌（E.hoshinae)，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要病原菌之一，其宿 主范圍十分廣泛，魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)以及包括人類(lèi)的哺乳類(lèi)都有感染報(bào)道，且呈世 界性分布，普遍存在于淡水和海水環(huán)境中，主要分布在中國(guó)、澳大利亞、日本、印度、以色列、 馬來(lái)群島、美國(guó)、巴拿馬等熱帶和亞熱帶國(guó)家和地區(qū)。從首次報(bào)道至今，該菌在多種養(yǎng)殖魚(yú) 類(lèi)中引發(fā)了病害并造成了巨大損失。目前在魚(yú)類(lèi)疾病防治中常采用化學(xué)治療劑以及抗生 素，但隨著它們的使用，病原耐藥性也隨之增強(qiáng)，而且藥物殘留和在環(huán)境中的擴(kuò)散已經(jīng)引起 了食品安全、環(huán)境及公共衛(wèi)生方面的問(wèn)題。魚(yú)用疫苗使用后不會(huì)產(chǎn)生污染，不會(huì)在免疫魚(yú)體 內(nèi)形成殘留，可以避免環(huán)境污染并維持魚(yú)體本身的品質(zhì)，反復(fù)使用也不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)用 前景廣闊。
[0003] 目前，目前，魚(yú)用疫苗在應(yīng)用中，包括有滅活疫苗、減毒活疫苗、DNA疫苗、亞單位疫 苗和菌蛻疫苗等形式，其中滅活疫苗研發(fā)周期短、制作成本低、安全性好，在免疫效率得到 保證的情況下最容易獲得批準(zhǔn)，因此成為目前商業(yè)化疫苗的最主要種類(lèi)。但研究表明，愛(ài)德 華氏菌與弧菌等許多病原菌不同，采用常規(guī)技術(shù)制備的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗對(duì)受試魚(yú)不能 產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)性。Gutierrez 和 Miyazaki (1994, Dis Aquat Org. 6:110-117.)研 究中福爾馬林滅活的遲緩愛(ài)德華氏菌注射免疫日本鰻的相對(duì)保護(hù)率僅為12. 5-25%，我們 前期實(shí)驗(yàn)采用未經(jīng)優(yōu)化的常規(guī)技術(shù)制作的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗的相對(duì)保護(hù)率（RPS)也不 到 40% ;Mekuchi 等（1995, Fish Pathol. 30(4) :251-256)分別采用肌肉注射、浸泡或口服 的接種方式用福爾馬林滅活的遲緩愛(ài)德華氏菌免疫牙鲆，但均沒(méi)有取得有效的免疫保護(hù)效 果；Sun 等（2011，F(xiàn)ish Shellfish Immunol. 31 ⑷：595-599.)雖然也報(bào)道了愛(ài)德華氏菌的 滅活疫苗，愛(ài)德華氏菌的單價(jià)滅活疫苗的免疫保護(hù)率只有33. 3%，只有當(dāng)滅活的愛(ài)德華氏 菌與鰻弧菌等另三種菌聯(lián)合使用時(shí)，才能獲得較好的免疫保護(hù)率，鰻弧菌等其他三種菌滅 活疫苗其實(shí)為愛(ài)德華氏菌滅活疫苗起到了免疫佐劑的作用?？傮w來(lái)說(shuō)，結(jié)合我們自己的多 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及大多數(shù)的報(bào)道，愛(ài)德華氏菌滅活疫苗的免疫效果不盡理想的現(xiàn)狀，這也可 能是人們不得不花更大的代價(jià)進(jìn)行其他種類(lèi)的疫苗的研究的原因。
[0004] 愛(ài)德華氏菌的弱毒活疫苗的應(yīng)用報(bào)道中，Klesius等（2000)的發(fā)明（US Patent 6153202)公開(kāi)了一種鯰魚(yú)愛(ài)德華氏菌減毒活疫苗，Evans等（2006)的發(fā)明（US Patent 7067122)公開(kāi)了一種基因修飾的遲緩愛(ài)德華氏菌的活疫苗，王啟要等（2010)的發(fā)明 (201010541646. 2)公開(kāi)了一株遲緩愛(ài)德華氏菌基因缺失弱毒活疫苗。這些專利說(shuō)明減毒疫 苗在愛(ài)德華氏菌疫苗研究中得到了更多的重視。減毒疫苗雖然能保證愛(ài)德華氏菌疫苗的免 疫保護(hù)率，但由于減毒疫苗仍然存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，在安全性評(píng)價(jià)上需要更為謹(jǐn)慎， 使得這種疫苗研制和實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的周期長(zhǎng)，代價(jià)高。另外由于不同疫苗都存在一定的特異 性，一旦有不同種或不同血清型的愛(ài)德華氏菌的威脅，這種減毒疫苗可能就不再發(fā)揮免疫 保護(hù)作用。愛(ài)德華氏菌的其他類(lèi)新型疫苗，如DNA疫苗、亞單位疫苗和菌蛻疫苗等，雖然也 具有一定的免疫效果，但考慮到生產(chǎn)工藝，成本，安全性等問(wèn)題，上述疫苗目前也難以投入 到實(shí)際應(yīng)用中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種有效維持愛(ài)德華氏菌抗原免疫保護(hù)力的滅活方法及其 滅活疫苗以及該滅活疫苗的應(yīng)用，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的愛(ài)德華氏菌的滅活方法，即采用巰基滅活劑對(duì)愛(ài) 德華氏菌進(jìn)行滅活處理，能夠維持愛(ài)德華氏菌抗原的免疫原性。
[0007] 優(yōu)選的，對(duì)愛(ài)德華氏菌采用最低滅活強(qiáng)度進(jìn)行滅活處理，所述最低滅活強(qiáng)度即為 最低劑量的巰基滅活劑、最低滅活溫度和最短滅活時(shí)間之間組合，且三者之間互為負(fù)相關(guān)。
[0008] 使用最低滅活強(qiáng)度的目的是滅活?lèi)?ài)德華氏菌的同時(shí)盡可能的維持抗原的免疫原 性。經(jīng)上述最低滅活劑劑量、滅活溫度和滅活時(shí)間這三種條件的組合滅活處理的愛(ài)德華氏 菌，經(jīng)將滅活劑去除，并能使100%的處理后的愛(ài)德華氏菌在TSB液體培養(yǎng)基中完全失去生 長(zhǎng)繁殖的能力，而且也無(wú)法在體內(nèi)恢復(fù)生長(zhǎng)繁殖的能力，則視為完全滅活。這三種條件的組 合關(guān)系是三者互為負(fù)相關(guān)性，形成在由這三種條件組成的三維坐標(biāo)系中的連續(xù)的近倒數(shù)關(guān) 系的曲面，曲面上的具體點(diǎn)的確定是在特定溫度和特定時(shí)間下測(cè)定使愛(ài)德華氏菌完全滅活 的最低滅活劑劑量，或特定劑量的滅活劑在特定溫度下測(cè)定使愛(ài)德華氏菌完全滅活的最短 時(shí)間。本發(fā)明證實(shí)采用不同劑量的同種滅活劑制備完全滅活疫苗的時(shí)間是不同的，兩者的 關(guān)系呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
[0009] 優(yōu)選的，所述巰基滅活劑的劑量為小于或等于10%的體積分?jǐn)?shù)；滅活溫度范圍在 0°C - 100°C ;滅活時(shí)間范圍是lOmin - 48h。
[0010] 優(yōu)選的，所述的巰基滅活劑為β -巰基乙醇。
[0011] 優(yōu)選地，所述滅活條件為，體積分?jǐn)?shù)為6%的β -巰基乙醇、滅活溫度為4°C、滅活 時(shí)間為24h，或體積分?jǐn)?shù)為2%的β-巰基乙醇、滅活溫度為16°C、滅活時(shí)間為36h，或體積 分?jǐn)?shù)為8%的β -巰基乙醇、滅活溫度為50°C、滅活時(shí)間為40min，上述滅活方法所制備的疫 苗對(duì)受試魚(yú)可提供相對(duì)保護(hù)率（RPS)分別為50. 7%、56. 2% -61. 3%和50. 1% -54. 6%的 免疫保護(hù)效果。
[0012] 本發(fā)明還包括愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，愛(ài)德華氏菌經(jīng)檢測(cè)滅活后，去除滅活劑，即得 到愛(ài)德華氏菌的滅活疫苗。
[0013] 優(yōu)選地，對(duì)上述滅活處理后愛(ài)德華氏菌，進(jìn)行細(xì)菌是否已完全滅活檢測(cè)。由于細(xì) 菌的滅活中，一些物理因素的影響，如可能存在著一些可影響滅活劑與作用效果等的可能 因子，例如滅活時(shí)不同的細(xì)菌濃度、培養(yǎng)基成分等可能消耗一些滅活劑的滅活效應(yīng)等，因 此在實(shí)際應(yīng)用中，特別是商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的條件下，可能會(huì)導(dǎo)致滅活不完全的問(wèn)題從而 影響疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性及安全性，也因此，實(shí)際應(yīng)用中有必要通過(guò)實(shí)際滅活效果的檢 測(cè)（如疫苗的安全性、穩(wěn)定性及應(yīng)用免疫效果等），制定針對(duì)上述因素在滅活工藝的相應(yīng)標(biāo) 準(zhǔn)。
[0014] 本發(fā)明證實(shí)滅活條件對(duì)愛(ài)德華氏菌滅活疫苗的免疫原性有重要影響，對(duì)愛(ài)德華氏 菌的核酸和蛋白分析表明，不同滅活條件處理對(duì)滅活疫苗的核酸完整性及蛋白結(jié)構(gòu)存在有 明顯的影響。以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物進(jìn)行愛(ài)德華氏菌滅活疫苗的應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)采用最 低滅活劑量的不同滅活劑制備的滅活疫苗能在魚(yú)體內(nèi)誘導(dǎo)不同抗體水平，產(chǎn)生不同的免疫 效果。因此，對(duì)于改變具體滅活條件制備的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，只要遵循最低滅活強(qiáng)度的 原則進(jìn)行滅活疫苗的制備，并取得有效免疫保護(hù)的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，就仍然受到本專 利的保護(hù)。
[0015] 上述滅活方法制備滅活疫苗的免疫保護(hù)力評(píng)估可以采用以下方式，即1次免疫注 射受試魚(yú)4周后，再用10倍半致死劑量LD 5(I的愛(ài)德華氏菌對(duì)受試魚(yú)注射感染，較未經(jīng)滅活 疫苗免疫接種的對(duì)照魚(yú)，計(jì)算免疫組的相對(duì)保護(hù)率（RPS)。
[0016] 優(yōu)選地，上述滅活方法所獲得的滅活疫苗在使用中也可以與佐劑聯(lián)合應(yīng)用以達(dá)到 更好的免疫保護(hù)效果。其中，佐劑的作用是主要通過(guò)免疫調(diào)節(jié)、參與抗原遞呈、誘導(dǎo)免疫應(yīng) 答、抗原貯存等方式提高抗原的免疫原性和免疫反應(yīng)的可持續(xù)性?？蛇x用的常用佐劑主要 有不溶性鋁鹽類(lèi)膠體、油水乳劑、微生物成分、核酸及其類(lèi)似物、多糖類(lèi)物質(zhì)、細(xì)胞因子、月旨 質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物、蜂膠、中草藥成分等。
[0017] 本發(fā)明還包括將愛(ài)德華氏菌滅活疫苗用做制備治療愛(ài)德華氏菌感染藥物的應(yīng)用。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明制作的愛(ài)德華菌滅活疫苗是采用 最低滅活強(qiáng)度對(duì)愛(ài)德華氏菌進(jìn)行完全滅活，能有效維持愛(ài)德華氏菌抗原的免疫保護(hù)力。初 步的應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果表明該方法制備的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗的免疫效果較好，其RPS可以達(dá) 到60%的效果，這一結(jié)果要明顯高于使用常規(guī)滅活劑處理所得的愛(ài)德華氏菌疫苗的免疫保 護(hù)率。本發(fā)明所述的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗符合商業(yè)化疫苗的安全、有效、實(shí)用和成本低的要 求，具有進(jìn)行商業(yè)銷(xiāo)售或直接對(duì)商業(yè)化養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)實(shí)施免疫接種開(kāi)發(fā)價(jià)值。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為不同滅活劑處理對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌基因組DNA的影響；
[0020] 其中：泳道1，來(lái)蘇水；泳道2,硫酸銅；泳道3,丙酮；泳道4,戊二醛；泳道5, β-巰 基乙醇；泳道6，PBS (對(duì)照）；
[0021] 圖2為不同滅活劑處理對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌細(xì)菌蛋白的影響。
[0022] 其中：Marker為分子量標(biāo)記；泳道1，丙酮；泳道2, β -巰基乙醇；泳道3,來(lái)蘇水； 泳道4,硫酸銅；泳道5, PBS (對(duì)照）；泳道6,戊二醛。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024] 實(shí)施例1 :不同滅活劑最低滅活劑量的確定
[0025] 遲緩愛(ài)德華氏菌可培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg， 去離子水定容至lL，pH7.0)或胰蛋白胨大豆肉湯（TSB，胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，葡萄 糖2. 5g，NaC15. 0g，Κ2ΗΡ042· 5g，去離子水定容至1L，ρΗ7· 3)或2216E培養(yǎng)基中（根據(jù)培養(yǎng) 基成分中海水的有無(wú)，可分為兩種，其一：酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，F(xiàn)eP040. lg，海水定 容至1L，pH7. 6 - 7. 8 ;其二：酵母提取物lg，胰化蛋白胨5g，F(xiàn)eP040. lg，NaC134g，去離子水 定容至1L，pH7. 6 -7. 8)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的遲緩愛(ài)德華菌以1 :100的比例接種至上述一種 培養(yǎng)基中，28°C恒溫培養(yǎng)箱，180rpm振蕩培養(yǎng)5h，6000rpm，4°C離心lOmin收集菌體，以無(wú)菌 磷酸鹽緩沖液（PBS)洗滌菌體三次，并用PBS重懸菌體，制成1 X 109CFU/mL菌懸液。
[0026] 實(shí)驗(yàn)室對(duì)滅活劑的滅活劑量篩選中，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加入200 μ L制備 好的遲緩愛(ài)德華氏菌懸液。選用的滅活劑分別為來(lái)蘇水（10%)、丙酮（AR)、β-巰基乙醇 (AR)、戊二醛（25% )和硫酸銅（AR)，采用的劑量梯度如表1所示，其中，上述滅活劑的前3 種的劑量均按體積分?jǐn)?shù)計(jì)，后2種按終濃度計(jì)，4°C靜置（期間多次重懸），24h后，各孔取菌 液20 μ L轉(zhuǎn)接至另一 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（各孔加有新鮮200 μ L TSB培養(yǎng)基）的相應(yīng)孔中， 28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，以檢查滅活情況。觀察各孔中菌體實(shí)際生長(zhǎng)情況（PBS組作為對(duì)照），如 原最低滅活劑劑量末能達(dá)到完全滅活的效果，則對(duì)原不同梯度中的滅活劑劑量進(jìn)行相應(yīng)添 力口，重新進(jìn)行最低滅活劑劑量的確定試驗(yàn)，方法同上；反之，則可依據(jù)本次試驗(yàn)的結(jié)果，確定 滅活劑對(duì)遲緩愛(ài)德華氏菌的最低滅活劑量。
[0027] 表1不同滅活劑的滅活劑量篩選
[0028]
【權(quán)利要求】
1. 一種愛(ài)德華氏菌滅活方法，其特征在于，采用巰基滅活劑對(duì)愛(ài)德華氏菌進(jìn)行滅活處 理，能夠維持愛(ài)德華氏菌抗原的免疫原性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的愛(ài)德華氏菌滅活方法，其特征在于，對(duì)愛(ài)德華氏菌采用最低 滅活強(qiáng)度進(jìn)行滅活處理，所述最低滅活強(qiáng)度即為最低劑量的巰基滅活劑、最低滅活溫度和 最短滅活時(shí)間之間組合，且三者之間互為負(fù)相關(guān)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的愛(ài)德華氏菌滅活方法，其特征在于，所述巰基滅活劑的劑量 為小于或等于10%的體積分?jǐn)?shù)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愛(ài)德華氏菌滅活方法，其特征在于，所述滅活溫度為0? 100。。。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愛(ài)德華氏菌滅活方法，其特征在于，所述滅活時(shí)間為lOmin? 48h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愛(ài)德華氏菌滅活方法，其特征在于，所述巰基滅活劑為β-巰 基乙醇。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6任一權(quán)利要求所述方法制得的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，其特征在 于，愛(ài)德華氏菌經(jīng)最低滅活強(qiáng)度全部滅活后，將滅活劑去除后，得到所述疫苗。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，其特征在于，所述的愛(ài)德華氏菌滅活 疫苗中還可含有佐劑。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，其特征在于，所述的佐劑為不溶性鋁 鹽類(lèi)膠體、油水乳劑、微生物成分、核酸及其類(lèi)似物、多糖類(lèi)物質(zhì)、細(xì)胞因子、脂質(zhì)體、免疫刺 激復(fù)合物、蜂膠或中草藥成分中的一種或多種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的愛(ài)德華氏菌滅活疫苗，可作為制備治療愛(ài)德華氏菌感染藥 物的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/36GK104099286SQ201410350881
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】黃倢, 隋虎辰, 謝國(guó)駟, 王秀華, 杜迎彬, 史成銀 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所