從動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽的方法與所制備的高活性膠原蛋白肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從牛胎盤制備高活性膠原蛋白肽(Collagen?Peptide，CP)的新型方法。所述方法包括如下步驟：哺乳動物胎盤的低溫保持，切碎，浸泡漂洗，磨漿，抽提，離心，酶解，過濾，脫鹽，濃縮，冷凍干燥步驟。本發(fā)明的方法具有抽提效果好，所獲得高活性膠原蛋白肽具有純度高，高活性等特點，通過而且制備含有膠原蛋白產(chǎn)品容易吸收的特點。本發(fā)明方法操作簡單，生產(chǎn)成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，實現(xiàn)了從牛胎盤中高效制備高活性膠原蛋白肽的目的。
【專利說明】從動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽的方法與所制備的高活 性膠原蛋白肽及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從牛胎盤中制備高活性膠原蛋白肽的方法，屬于蛋白質(zhì)生物化學(xué)工程 和醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 以下描述利于讀者理解。所提供的信息或引用的參考文獻都不能被認為是本發(fā)明 的現(xiàn)有技術(shù)。
[0003] 胎盤（placenta)又名"紫河車"為常用中藥材料，民間常將其煮爛食之。我國傳 統(tǒng)中醫(yī)理論認為：胎盤性甘、咸，歸肺、肝、腎經(jīng)，功能為補氣、養(yǎng)血、益精，可用作滋補、養(yǎng)顏、 強壯之藥。現(xiàn)代生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究證明：胎盤除含有多種免疫球蛋白、生物活性肽等之外， 還含有豐富的膠原蛋白。
[0004] 膠原蛋白（Collagen)又稱膠原，是由三條肽鏈擰成的螺旋形纖維狀蛋白質(zhì)，是細 胞外結(jié)締組織最重要的水不溶性纖維蛋白，是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的骨架，占人體蛋白質(zhì)總量 的25% -30%，是人體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)。結(jié)締組織除了含60?70%的水分外，膠原蛋 白占了約20?30%，因為有高含量的膠原蛋白，結(jié)締組織具有了一定的結(jié)構(gòu)與機械力學(xué)性 質(zhì)，如張力強度、拉力、彈力等以達到支撐、保護的功能。膠原蛋白在細胞外基質(zhì)中形成半 晶體的纖維，給細胞提供抗張力和彈性，并在細胞的遷移和發(fā)育中起重要作用。膠原蛋白 在各種動物中都有存在。脊椎動物中腱、軟骨和骨中的膠原非常豐富，幾乎占了蛋白總重 的一半。膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)單位是原膠原（tropocollagen)，原膠蛋白肽鏈的一級結(jié)構(gòu) 具有（Gly-x-y)n重復(fù)序列，其中X常為脯氨酸（Pro)，y常為羥脯氨酸（Hypro)或羥賴氨 酸（Hylys)。Hylys殘基可發(fā)生糖基化修飾，其糖單位有的是一個半乳糖殘基（Gal),但通 常是二糖（Glu-Gal-)，膠原蛋白上的糖所占的量約為膠原蛋白的10%。原膠原是由三條 α-肽鏈組成的纖維狀蛋白，相互擰成三股螺旋狀構(gòu)型，長300nm，直徑1.5nm。膠原蛋白， 主要存在于人和動物的皮膚、骨骼、眼睛、牙齒、肌腱、內(nèi)臟（包括心、胃、腸、膀胱、血管、肺、 氣管、腦等）部位，所有組織臟器都含有不同數(shù)量和種類的膠原蛋白，其功能是維持組織器 官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，也是修復(fù)各損傷組織的重要原料物質(zhì)。人體膠原蛋白有28種，不同部位 所含的膠原蛋白的類型也各不相同。在人體皮膚成份中，以I型、III型居多，有70%是由膠 原蛋白所組成目前已發(fā)現(xiàn)20個左右的基因分別在不同組織中編碼不同類型的膠原蛋白； 不同類型的膠原蛋白定位于體內(nèi)的特定組織，也有2-3種不同的膠原存在于同一組織中。
[0005] 當(dāng)膠原蛋白不足時，不僅皮膚及骨骼會出現(xiàn)問題，對內(nèi)臟器官也會產(chǎn)生不利影響。 膠原蛋白是維持身體正?；顒铀豢扇鄙俚闹匾煞?。同時也是使身體保持年輕、防止老 化的物質(zhì)。另外，服用膠原蛋白還可以預(yù)防疾病，改善體質(zhì)，對美容和健康都很有幫助。
[0006] 不同生產(chǎn)方法制備的膠原蛋白，其品質(zhì)和功效差異很大。確切地說，用低溫、低酸 堿度方法生產(chǎn)的膠原蛋白最為理想，完全保持了膠原蛋白的原有構(gòu)象，生物活性最佳。目 前，市面上或進口的膠原蛋白產(chǎn)品品質(zhì)參差不齊，一些是用明膠（英文學(xué)名Gelatin)制備 的所謂"膠原蛋白"，其實是明膠蛋白，是一些失去活性的混合蛋白，未經(jīng)任何提取過程，質(zhì) 量極差。還有一些"酶解膠原蛋白"，事實上也是變性膠原蛋白的一種，因為它們在生產(chǎn)過程 中，為了去除脂肪，使用火堿處理，火堿是蛋白質(zhì)的強變性劑，完全破壞了膠原蛋白的三維 結(jié)構(gòu)，喪失了大部分膠原蛋白的生物活性。使用該膠原蛋白的產(chǎn)品在美容和保健品產(chǎn)品中， 實際應(yīng)用過程中效果低。不能滿足于世界對膠原蛋白的客觀需求。
[0007] 基于解決現(xiàn)有技術(shù)方法中長期存在的制備的膠原蛋白變性程度高，急需提供一種 能夠制備活性高膠原蛋白的方法。本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的科學(xué)實驗，意外地發(fā)現(xiàn)在制 備膠原蛋白，即使不使用傳統(tǒng)技術(shù)的火堿脫脂方法，采用本發(fā)明的酸抽提法，經(jīng)歷動物胎盤 的低溫處理，切碎，浸泡漂洗，磨漿，抽提，離心，酶解，過濾，脫鹽，濃縮，冷凍干燥等步驟制 備高活性和高純度的膠原蛋白多肽。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種從動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽的方法，其特征在 于，所述的方法包括以下步驟：動物胎盤的低溫保持，切碎，浸泡漂洗，磨漿，抽提，離心，酶 解，過濾，脫鹽，濃縮，冷凍干燥步驟。
[0009] 在本發(fā)明的又一個方面，利用酸抽提的方法從所述動物胎盤提取膠原蛋白，所述 的酸為有機酸或無機酸，優(yōu)選為醋酸。
[0010] 在本發(fā)明的一個具體方面，提供了一種從動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽的方 法，所述的方法包括以下具體步驟：
[0011] 1)取冷凍牛胎盤，切碎后加入5-10倍體積的水，過夜浸泡除去血液成分，骨泥磨 磨漿后，加入20-40倍體積的2-10%醋酸浸提6-12小時，14000轉(zhuǎn)/離心30-60分鐘，收集 沉淀得膠原蛋白粗品；
[0012] 2)膠原蛋白粗品加3-5重量體積去離子水，攪拌，調(diào)pH7. 0-9. 0,加入膠原蛋白粗 品重量的0. 1%胰蛋白酶，水解6-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品。
[0013] 3)酶解膠原蛋白肽粗品用0. 2微米的濾膜過濾，過濾液用400-500道爾頓的納濾 膜脫鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的牛胎盤膠原蛋 白肽凍干粉。
[0014] 在本發(fā)明的一個具體方面，提供了一種從動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽的方 法，所述的方法的具體步驟為：
[0015] 1)冷凍牛胎盤，切碎后加入5-10倍體積的水，過夜浸泡除去血液成分，骨泥磨磨 漿后，加入20-40倍體積的2-10%醋酸浸提6-12小時，14000轉(zhuǎn)/離心30-60分鐘，收集沉 淀得膠原蛋白粗品；
[0016] 2)膠原蛋白粗品加3-5重量體積去離子水，攪拌，調(diào)PH7-9. 0,加入膠原蛋白粗品 重量的0. 1%胰蛋白酶，水解4-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品。
[0017] 3)酶解膠原蛋白肽粗品用0. 2微米的濾膜過濾，過濾液用400-500道爾頓的納濾 濾脫鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的牛胎盤膠原蛋 白肽凍干粉。
[0018] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種膠原蛋白肽，其以對ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換 酶）抑制的百分率和IC 5(I來表征。如果以對ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)換酶）抑制的百分率作為 活力參數(shù)，當(dāng)使用濃度o. lmmol/L本發(fā)明所制備的膠原蛋白肽制品時，超過25%的ACE被抑 制，例如大于27 %，大于30 %，甚至大于35 %的ACE被抑制；當(dāng)使用濃度為0. 5mmol/L時，超 過45%以上的ACE被抑制，例如大于48%以上或者大于55%以上的ACE被抑制；當(dāng)使用濃 度為lmmol/L時，超過65以上的ACE被抑制，例如大于70%以上或者大于75%以上的ACE 被抑制。IC5(I是衡量ACE抑制劑效果的指標，也是對膠原蛋白的活性衡量指標。利用本發(fā) 明方法所制備的各種心管膠原蛋白的IC 5(I均低于0· 60mg/mL，例如低于0· 58mg/mL、0. 55mg/ mL、0. 50mg/mL、0. 45mg/mL、0. 40mg/mL〇
[0019] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種膠原蛋白肽產(chǎn)品，其具有大于20%的ACE抑 制率；優(yōu)選為大于25 %，例如大于30 %、40 %、45,再例如大于48%，甚至大于50 %都有可 能。并且，IC5。低于 0· 65mg/mL，例如低于 0· 60mg/mL、0. 55mg/mL、0. 45mg/mL、0. 35mg/mL、 0· 20mg/mL。
[0020] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了通過本發(fā)明方法制備的膠原蛋白制品的用途，所 述的用途包括將所述的膠原蛋白用于預(yù)防和/或防治受試者老化的藥物、食品、保健品或 化妝品中的應(yīng)用，合適地，所述的受試者為哺乳動物，優(yōu)選地，所述的受試者為人類。
[0021] 在本發(fā)明的另一個方面，將所述藥物、食品、保健品或化妝品制備成口服制劑、夕卜 用制劑、吸入制劑、經(jīng)鼻制劑、經(jīng)直腸制劑、經(jīng)皮制劑或注射制劑，優(yōu)選為外用劑型或注射制 劑。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點在于所制備的膠原蛋白活性高，純度高。本發(fā)明的方法操作簡單，生 產(chǎn)成本低廉，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，實現(xiàn)了從牛胎盤中高效制備膠原蛋白資源。離心和 過濾所得到的濾液由于不含有任何有害物質(zhì)，不會污染環(huán)境。本工藝幾乎不產(chǎn)生固形廢棄 物，沒有垃圾，無需專門進行垃圾處理。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1、牛胎盤膠原蛋白肽生產(chǎn)工藝流程圖。
[0024] 圖2、馬尿酸含量測定標準曲線。
[0025] 圖3、不同膠原蛋白的ACE活性抑制效果。
[0026] 圖4、不同膠原蛋白的IC5Q比較。

【具體實施方式】
[0027] 為了提供對本發(fā)明的實質(zhì)性理解，在下文中以不同的詳細程度描述了本發(fā)明的某 些方面、模式、實施方式、變型和特征。
[0028] 在實施本發(fā)明的過程中，使用了生物化學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)、蛋白質(zhì)生物化學(xué)工 程、制藥工藝學(xué)、醫(yī)學(xué)、病理學(xué)、動物實驗學(xué)等很多傳統(tǒng)技術(shù)。這些技術(shù)是熟知的。
[0029] 在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種從哺乳動物胎盤制備高活性膠 原蛋白肽的新型方法。所述方法包括如下步驟：包括新鮮哺乳動物低溫保持，切碎，浸泡漂 洗，磨漿，抽提，離心，酶解，脫鹽，濃縮，冷凍干燥步驟。
[0030] 所述哺乳動物可源自于任何種類的動物，包括陸生的或者水生的哺乳動物，本文 的陸生哺乳動物包括但不限于人類、猩猩，猴、牛、水牛、野牛、豬、野豬、羊（例如羊羔、綿 羊、山羊）、驢、鹿、駱駝、鼠類、馬等，本文的水生哺乳動物包括但不限于鯨魚、河馬、海豹等。 因此本文中的哺乳動物是指能夠提供胎盤的一切哺乳動物，并且用該胎盤制備膠原蛋白。
[0031] 術(shù)語"一"，"一種"和"該"：除非內(nèi)容清楚指明，否則本說明和所附的權(quán)利要求中 使用的單數(shù)形式"一"，"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)的引用對象。例如，所提及的"一種胎盤"包 括單獨一種哺乳動物胎盤，兩種不同哺乳動物胎盤或更多種哺乳動物胎盤的組合等。
[0032] 在本發(fā)明的又一實施方式中，提供了哺乳動物胎盤的低溫保持方法。所述胎盤可 以整塊冷凍保存，也可以成數(shù)個大塊甚至切碎保存。本發(fā)明可以直接使用新鮮的胎盤組織 也可以使用低溫保持過的胎盤組織。
[0033] 術(shù)語"低溫保持"包括"冷藏保持"和"冷凍保藏"兩種方式。
[0034] 在另一個實施方式中，冷藏保持可在低于約10°C的溫度下將哺乳動物胎盤溫育， 例如在0 °C以上至約9 °C之間，適合地在約1 °C至約8 °C，適合地在約2 °C至約6 °C之間，優(yōu)選 在約2°C至約4°C之間溫育。
[0035] 在一個實施方式中，可將哺乳動物胎盤冷藏保持幾十分鐘至7天甚至更長時間。 有時候出于生產(chǎn)目的需要，如果環(huán)境溫度比較低，甚至不用專門冷藏保持設(shè)備。例如東北的 秋季，溫度較低時候。如果需要冷藏，有時只需要冷藏保持數(shù)十分鐘，幾個小時，或1天、2 天、3天、4天、5天、6天、7天。但出于微生物腐敗和異味等因素考慮，往往不會超過7天。
[0036] 在另一個實施方式中，可在低于約0°C的溫度下將哺乳動物胎盤冷凍保藏，例如 在0°C以下至約-180°C (比如液態(tài)氮）之間，適合地在約-20°C至約-180°C?？紤]到電力 消耗和原材料運營成本等諸多因素，適合地在約_25°C至約_80°C之間，優(yōu)選在約_25°C至 約-40°C之間冷凍保藏。
[0037] 在一個實施方式中，適合地，可將哺乳動物胎盤冷凍保藏約1天至35天甚至更長 時間，適合地冷凍保藏約2天至20天之間，優(yōu)選冷凍保藏約5天至10天之間。
[0038] 在另一個實施方式中，可在低于約_0°C的溫度下將所述肉與所述組合物一起冷凍 保藏，例如在〇°C以下至約-180°C (比如液態(tài)氮）之間，適合地在約-20°C至約-80°C，適合 地在約_25°C至約_80°C之間，優(yōu)選在約-25°C至約_40°C之間冷凍保藏。
[0039] 當(dāng)將所述胎盤組織在低于約0°C (比如液態(tài)氮）的溫度下將所述肉與所述組合物 一起冷凍保藏時，例如在〇°C以下至約-180°C之間，適合地在約-20°C至約-80°C，更適合地 在約-25°C至約_80°C之間，優(yōu)選在約_25°C至約_40°C之間冷凍保藏約5天至8天。
[0040] 在本發(fā)明的又一個【具體實施方式】中，將動物胎盤切成切片、塊、絲、條、剁碎成末狀 和/或機械粉碎成糜狀，優(yōu)選為末狀或糜狀。使其形狀更有利于充分如下抽提步驟。
[0041] 低溫保持可以采取多階段方式進行，例如先將動物組織在液氮中速凍數(shù)十分鐘， 然后放入-80°c冰箱冷凍保藏過夜，在放置于-25°c冰箱中冷凍保藏備用。
[0042] 在本發(fā)明的又一個【具體實施方式】中，對切碎的胎盤進行了浸泡和漂洗。浸泡可以 用1-10倍或者10倍以上的清水來進行，環(huán)境溫度可以在0_25°c直接任意溫度進行，通常為 浸泡過夜，對于浸泡效果本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際觀察的胎盤組織的狀態(tài)做出選擇。 漂洗可以進一步去除胎盤中的漂浮的脂肪和血水，通常漂洗2次以上，例如3次，4次，5次 等。
[0043] 在本發(fā)明的又一個【具體實施方式】中，對浸泡漂洗后的胎盤進行了酸抽提。所述的 酸包括有機酸或無機酸。
[0044] 本文中的術(shù)語"有機酸"是指單獨一種有機酸，或?qū)煞N以上的有機酸。本文僅為 舉例性質(zhì)，用于本發(fā)明的所述有機酸選自由甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸、辛酸、 葵酸、月桂酸、肉桂酸、硬脂酸、亞麻酸、油酸、亞油酸、芥酸、肉豆蘧酸、葡萄糖酸、棕櫚酸，適 合地為乳酸、月桂酸、肉桂酸、花生酸、硬脂酸、亞麻酸、油酸、葡萄糖酸、亞油酸、棕櫚酸、蘋 果酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸、甲基馬來酸、富馬酸、甲基富馬酸、草酸、丙二酸、戊二酸、己 二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸、檸檬酸等。
[0045] 術(shù)語"無機酸"包括含有鹵素、碳、氮、硼、硅、磷、硫等原子的含有氧或者非含有氧 原子的所有無機酸；僅為舉例性質(zhì)例如：碳酸、硫酸、亞硫酸、醋酸、硼酸、硝酸、亞硝酸、焦 磷酸、亞磷酸、磷酸、氯酸、次氯酸、重鉻酸、溴酸、次溴酸、碘酸、次碘酸等；用于本發(fā)明的無 機酸可以是一種或兩種以上的無機酸，優(yōu)選地，所述無機酸為醋酸、碳酸、硫酸、亞硫酸、硝 酸、亞硝酸、焦磷酸、亞磷酸、磷酸所組成的組的一種或兩種以上的；更優(yōu)選地，所述無機酸 為醋酸。
[0046] 上述酸可以為固體或者是液體，如果是固體一般用水溶解后稀釋使用。也可以將 一種或一種以上的有機酸和無機酸混合使用。
[0047] 按照體積比，用于抽提的胎盤組織沉淀與液體酸的體積比（νο? :ν〇1)為1 :1_40， 優(yōu)選為1 :1-20 ;更優(yōu)選為1 最優(yōu)選為1 :1_5。酸的濃度根據(jù)具體酸的性質(zhì)而定，使用 醋酸的情況下，可以是1% -20%，例如1% -15%，1-10%，2-10 %。
[0048] 上述抽提的 pH 為 1-6. 8,例如 pH 為 6· 7、6· 6、6· 5、6· 4、6· 2、6· 1、6· 0、5· 9、5· 8、 5· 7、5· 6、5· 5、5· 4、5· 3、5· 2、5· 1 有時候低于 5 都有可能，例如 pH 低于 4· 5、4· 0、3· 5、3· 0,甚 至低于2.0。
[0049] 抽提的溫度可以選擇在室溫中進行，也可以在低于室溫下進行，低于20°C，優(yōu)選低 于10°c，更優(yōu)選低于6°C，最優(yōu)選低于4°C。
[0050] 抽提時間依據(jù)抽提溫度、抽提效果和膠原蛋白性質(zhì)來決定，例如2-24小時，例如， 4-20小時，6-16個小時；即使抽提超過24小時也是可能的。在一些實例中進行了過夜抽 提，即抽提在通常在8-12小時。本領(lǐng)域技術(shù)人員會根據(jù)抽提液的濃度和效果選擇合理的抽 提時間。
[0051] 整個實施例的溫度條件可以控制在1_18°C，例如1-16°C，1-14°C，1-10°C，優(yōu)選低 于8°C，更優(yōu)選低于6°C，最優(yōu)選低于4°C。
[0052] 本發(fā)明的另一【具體實施方式】是對抽提后樣品采用了離心操作，離心可以采用實驗 室常用的各種離心設(shè)備，例如真空離心機，或非真空離心機。按照轉(zhuǎn)速可以分為低速、高速 和超速離心機。按照是否制冷，分為冷凍離心機或者常溫離心機。工業(yè)化生產(chǎn)常用的離心 機，例如高速連續(xù)離心機。
[0053] 通常離心力大小以g為單位進行計算轉(zhuǎn)速的設(shè)定，離心力可以在lOOOOOg以上，也 可以在1000g至20000g之間，例如1000g至10000g之間，優(yōu)選為8000g，更優(yōu)選為100000g。
[0054] 離心也可以以每分轉(zhuǎn)速來表示，例如，在1000、1500、2000、3000、5000、10000轉(zhuǎn)以 上，15000轉(zhuǎn)以上，20000轉(zhuǎn)甚至100000轉(zhuǎn)以上。
[0055] 離心溫度可以可以選擇在室溫中進行，也可以在低于室溫下進行，例如低于20°C， 或低于15°C，優(yōu)選為低于10°C，更優(yōu)選為6°C，或低于4°C。
[0056] 離心時間可以為任何時間，基于不能使離心時間過長導(dǎo)致過多的雜質(zhì)沉淀而導(dǎo)致 收量降低，同時過長時間也容易導(dǎo)致膠原蛋白變性。通常選擇1個小時以內(nèi)，例如40分鐘， 30分鐘，或20分鐘
[0057] 離心后可以有效去除含有雜質(zhì)的上清液，保留含有膠原蛋白的沉淀粗品。
[0058] 本發(fā)明的另一【具體實施方式】是對上述離心后膠原蛋白的沉淀粗品進行酶水解 (利用水解蛋白酶分解膠原蛋白）。本發(fā)明使用的水解蛋白酶分解膠原蛋白可以為任何酶， 包括但不限于胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶中性蛋白蛋、酸性蛋白酶等， 優(yōu)選為胰蛋白酶。
[0059] 上述酶水解時間可以在24小時以上，也可以在24小時以內(nèi)，但為了水解效水果和 避免水解帶來的降解，比較合適的水解時間為12小時以內(nèi)，例如2-12小時，2-10個小時， 4-8個小時。優(yōu)選為8小時，更優(yōu)選為6小時，最優(yōu)選為4小時。
[0060] 在本發(fā)明的又一個實施方式中，提供了對酶解膠原蛋白肽粗品過濾和納濾脫鹽的 方法，過濾采用了利用板筐壓濾機和納濾機過濾。常用的板筐壓濾機有手動板框壓濾機、機 械板框壓濾機和液壓板框壓濾機，過濾機通常裝有過濾膜，膜的大小可以任意調(diào)節(jié)，例如5 微米、2微米、1微米、0. 5微米、0. 2微米、0. 1微米、0. 05微米等等。同時采用納濾機進行濃 縮脫鹽，常用的納濾機有空心纖維柱式納濾機和反滲透納濾機。納濾機通常裝置有納濾膜， 其大小根據(jù)所截留蛋白分子大小的目的而設(shè)置，本發(fā)明采用了分子量為400-500道爾頓的 納濾膜進行了納濾脫鹽和濃縮。
[0061] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，提供了一種從動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽 的方法，所述的方法包括以下具體步驟：
[0062] 1)冷凍牛胎盤，切碎后加入5-10倍體積的水，過夜浸泡除去血液成分，骨泥磨磨 漿后，加入20-40倍體積的2-10%醋酸浸提6-12小時，14000轉(zhuǎn)/離心30-60分鐘，收集沉 淀得膠原蛋白粗品；
[0063] 2)膠原蛋白粗品加3-5重量體積去離子水，攪拌，調(diào)pH7_9. 0,加入膠原蛋白粗品 重量的0. 1%胰蛋白酶，水解4-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品。
[0064] 3)酶解膠原蛋白肽粗品用0. 2微米的濾膜過濾，過濾液用400-500道爾頓的納濾 濾脫鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的牛胎盤膠原蛋 白肽凍干粉。
[0065] 在本發(fā)明的又一個【具體實施方式】，提供了一種從動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽 的方法，所述的方法的具體步驟為：
[0066] 1)取冷凍牛胎盤，切碎后加入5倍體積的清水，浸泡過夜，次日用清水反復(fù)沖洗3 次，充分去除血水，用膠體磨磨漿，加入20倍體積3%醋酸，攪拌浸提過夜，用14000轉(zhuǎn)/分 離心40分鐘，收集沉淀沉淀得膠原蛋白粗品；
[0067] 2)膠原蛋白粗品加3倍重量體積去離子水，攪拌混勻，調(diào)pH8. 6,加入膠原蛋白粗 品重量的0. 1 %膜蛋白酶，42°C水解8小時，得酶解月父原蛋白膚粗品；
[0068] 3)酶解膠原蛋白肽粗品用0. 2微米的膜板筐過濾機過濾，過濾液用400-500道爾 頓的納濾膜脫鹽4次，攪拌后納濾濃縮，最后濃縮到含蛋白肽8%，冷凍干燥得膠原蛋白肽。 [0069] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了通過本發(fā)明方法制備的膠原蛋白制品的用途，所 述的用途包括將所述的膠原蛋白用于預(yù)防和/或防治受試者老化的藥物、食品、保健品或 化妝品中的應(yīng)用，合適地，所述的受試者為哺乳動物，優(yōu)選地，所述的受試者為人類。
[0070] 在本發(fā)明的另一個方面，將所述藥物、食品、保健品或化妝品制備成口服制劑、夕卜 用制劑、吸入制劑、經(jīng)鼻制劑、經(jīng)直腸制劑、經(jīng)皮制劑或注射制劑，優(yōu)選為外用劑型或注射制 劑。
[0071] 在本發(fā)明的又一個實施方式中，提供了通過本發(fā)明制備的膠原蛋白制品，如果以 對ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-Converting Enzyme，ACE))抑制的百分率作為活 力參數(shù)，ACE的測定方法可以參照可選地所制備的活力大于20%，例如大于25%，30%，大 于30 %或45 %。在一些實施例中，60 %以上的ACE都被抑制。
[0072] 在本發(fā)明的一些實施方式中對粗品中的膠原蛋白肽的蛋白含量進行測定，可以采 用凱氏定氮法或其它蛋白濃度測定法進行測定，含量例如在〇. 1% -10%，合適為2-10%， 例如4-10%等。
[0073] 同時，還對所制備的膠原蛋白肽的純度進行了測定，可以通過現(xiàn)有技術(shù)中的常用 蛋白質(zhì)條帶染色強度來衡量純度，在一些實施例中所制備的純度在60%以上，例如均在 80%以上。在本發(fā)明的又一些實施例中通過本發(fā)明的方法制備高純度的膠原蛋白肽，例如 純度在 85%，86%，87%，88%，89%，90%，92%，95%，96% 以上。
[0074] 同時，對于小分子的膠原蛋白肽的純度采用了質(zhì)譜進行分析，在一些實施例中所 制備的純度在90%以上，例如均在92%以上。在本發(fā)明的又一些實施例中通過本發(fā)明的 方法制備高純度的膠原蛋白肽，例如純度在93 %，94%，95 %，95. 5 %，96 %，96. 5 %，97 %， 97. 5%，98%，98. 5% ,99% 以上。
[0075] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】，提供了一種膠原蛋白肽產(chǎn)品，其具有大于20%的 ACE抑制率；優(yōu)選為大于25 %，例如大于30 %、40 %、45,再例如大于48%，甚至大于50 %都 有可能。并且，IC5。低于 0· 95mg/mL，例如低于 0· 80mg/mL、0. 75mg/mL，0· 70mg/mL、0. 65mg/ mL、0. 60mg/mL、0. 55mg/mL、0. 45mg/mL、0. 35mg/mL、0. 20mg/mL〇
[0076] 在本發(fā)明的又一個實施方式中，提供了一種膠原蛋白肽，其以對ACE(血管緊張素 轉(zhuǎn)換酶）抑制的百分率和IC 5(I來表征。如果以對ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)換酶）抑制的百分率 作為活力參數(shù)，當(dāng)使用濃度〇. 1_〇 1/L本發(fā)明所制備的膠原蛋白肽制品時，超過25 %的ACE 被抑制，例如大于27 %，大于30 %，甚至大于35 %的ACE被抑制；當(dāng)使用濃度為0. 5mmol/L 時，超過45%以上的ACE被抑制，例如大于48%以上或者大于55%以上的ACE被抑制；當(dāng) 使用濃度為lmm〇l/L時，超過65以上的ACE被抑制，例如大于70%以上或者大于75%以上 的ACE被抑制。IC 5(I是衡量ACE抑制劑效果的指標，也是對膠原蛋白的活性衡量指標。利 用本發(fā)明方法所制備的各種心管膠原蛋白的IC 5(I均低于0. 60mg/mL，例如低于0. 58mg/mL、 0· 55mg/mL、0. 50mg/mL、0. 45mg/mL、0. 40mg/mL〇
[0077] 在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供了通過本發(fā)明方法制備的膠原蛋白肽制品的 用途，所述的用途包括將所述的膠原蛋白肽用于預(yù)防和/或防治受試者老化的藥物、食品、 保健品或化妝品中的應(yīng)用。
[0078] 在本發(fā)明的又一個實施方式中，將所述藥物、食品、保健品或化妝品制備成口服制 劑、外用制劑、吸入制劑、經(jīng)鼻制劑、經(jīng)直腸制劑、經(jīng)皮制劑或注射制劑，優(yōu)選為外用劑型或 注射制劑。
[0079] 在本發(fā)明的再一個實施方式中，每天對人施用預(yù)防和/或治療有效量的含有本發(fā) 明所制備的膠原蛋白肽，上述有效量可以為任何有效量，例如〇· 5ug/kg、lug/kg或10ug/kg 人體重，合適地的有效量包括對人每天施用約lug/kg至約10000mg/kg體重的膠原蛋白肽。
[0080] 通過如下實施例記載，更好地理解本發(fā)明，但不局限于該實施例。
[0081] 實施例
[0082] 實施例1
[0083] 奶牛分娩后取冷凍胎盤10kg，切碎，加50升自來水，浸泡過夜，次日用清水反復(fù)沖 洗3次，充分去除血水，用膠體磨磨漿，加入200升3%醋酸，攪拌浸提過夜。用14000轉(zhuǎn)/ 分離心40分鐘，收集沉淀。沉淀加30升去離子水，攪拌混勻，調(diào)pH8. 6,加入30克胰蛋白 酶，42°C保溫8小時。用0. 2微米的膜板筐過濾機過濾，穿過液用納濾機濃縮到10升，再加 入去離子水到30升，攪拌后納濾濃縮，反復(fù)4次，最后濃縮到10升，冷凍干燥，得膠原蛋白 肽0. 3公斤。
[0084] 實施例2
[0085] 奶牛分娩后取新鮮冷凍胎盤100kg，切碎，加500升自來水，浸泡過夜，次日用清 水反復(fù)沖洗3次，充分去除血水，用膠體磨磨漿，加入2000升3 %醋酸，攪拌浸提過夜。用 14000轉(zhuǎn)/分離心50分鐘，收集沉淀。沉淀加300升去離子水，攪拌混勻，調(diào)pH8. 6,加入 300克胰蛋白酶，42°C保溫8小時。用0. 2微米的膜板筐過濾機過濾，穿過液用納濾機濃縮 至IJ 100升，再加入去離子水到30升，攪拌后納濾濃縮，反復(fù)4次，最后濃縮到100升，冷凍干 燥，得膠原蛋白肽3. 5公斤。
[0086] 實施例3
[0087] 奶牛分娩后取新鮮冷凍胎盤500kg，切碎，加 2500升自來水，浸泡過夜，次日用清 水反復(fù)沖洗3次，充分去除血水，用膠體磨磨漿，加入10000升3%醋酸，攪拌浸提過夜。用 14000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘，收集沉淀。沉淀加 1500升去離子水，攪拌混勻，調(diào)pH8. 6,加入 3000克胰蛋白酶，42°C保溫8小時。用0. 2微米的膜板筐過濾機過濾，穿過液用納濾機濃縮 到2500升，再加入去離子水到15000升，攪拌后納濾濃縮，反復(fù)4次，最后濃縮到400升，冷 凍干燥，得膠原蛋白肽20公斤。
[0088] 實施例4
[0089] 實驗為使用本工藝制備的牛胎盤膠原蛋白肽（下文稱之為自制膠原蛋白，為實施 例1獲得的膠原蛋白肽）與市售的的德國（vikki膠原蛋白，http://www.vikkiup.com/) 和法國產(chǎn)膠原蛋白肽（法國羅賽洛（R0USSEL0T)集團，http://cctv.manager8844.com/ flxdtjdbf/)進行血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-Converting Enzyme, ACE)抑制試驗， 以此檢驗我們制備的膠原蛋白肽質(zhì)量（由于商業(yè)上的工藝技術(shù)保密問題，我們無法得知德 國和法國膠原蛋白肽生產(chǎn)工藝）。分為以下幾個步驟：
[0090] (1)從豬肺中提取血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（劉宏，陳蘭英.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶純化與 性質(zhì)研究.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2000, 06:788-792;劉淑集，王茵，蘇永昌，吳 成業(yè).血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE)的提取與活性驗證，福建水產(chǎn)，2009, 02:1-5)將200g新鮮 豬肺放置冷藏室中12h后用預(yù)冷的0. 9 %的生理鹽水清洗，剪成小塊，除去脂肪和大血管， 加入600mL的蒸餾水，斷續(xù)勻漿10 X 20s，加入15mL的10% Triton X-100,慢速攪拌30min， 4層紗布過濾，濾液4°C離心（6000gX20min)，保留上清液，1. 6?2. 6mol/L硫酸銨分級沉 淀，收集沉淀溶液。用預(yù)冷的pH8. 3、100mmol/L的磷酸緩沖液（含0. 3mol/L NaCl)溶解。 溶解液離心后取上清進行透析以及濃縮，得到ACE濃縮液。
[0091] (2)馬尿酸標準曲線的制作：將馬尿酸標準樣品用磷酸緩沖液溶解配成lmmol/ L的標準母液。然后將標準母液稀釋成5 μ mol/L、10 μ mol/L、50 μ mol/L、100 μ mol/L、 150 μ mol/L、200 μ mol/L系列濃度。經(jīng)0· 45 μ M濾膜過濾后，在228nm下分別測定吸光值。 以馬尿酸濃度為橫坐標，其吸光值為縱坐標，繪制標準曲線（見圖2)。
[0092] (3) ACE活力測定參考Cushman等的（CUSHMAN D W, CHEUNG H. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology, 1971，20: 1637-1648，和，PRADIPTA B C，SHANTHI. Isolation of novel bioactive regions from bovine Achilles tendon collagen having angiotensin I-converting enzyme-inhibitory properties[J]. Process Biochemistry, 2012, 4712)的經(jīng)典方法并稍作修改：在37°C，pH8. 3的條件下，ACE催化血 管緊張素 I的模擬物HHL產(chǎn)生馬尿酸。產(chǎn)物馬尿酸在波長228nm處具有特殊吸收峰。根據(jù) 馬尿酸標準曲線上相對應(yīng)的值即可進行活性計算。
[0093] (4)膠原蛋白對ACE抑制效果的比較：將以上三種膠原蛋白用磷酸緩沖液溶解配 成 lmg/mL 的標準母液。經(jīng)過稀釋之后配成 0· 01mg/mL、0. 05mg/mL、0. lmg/mL、0. 5mg/mL、 1. Omg/mL系列濃度后。分別與提取的適量ACE預(yù)先混合，將混合物在37°C水浴鍋中先溫浴 10min。實驗具體操作步驟根據(jù) PRADIPTA 等方法（PRADIPTA B C，SHANTHI. Isolation of novel bioactive regions from bovine Achilles tendon collagen having angiotensin I-converting enzyme-inhibitory properties[J]. Process Biochemistry, 2012,4712), 并稍作修改：測量的總體積為350μ L，含lOOmmol/L pH8. 3磷酸緩沖液、0. 3mol/L NaCl、 5mmol/L HHL。在37°C恒溫水浴3min，然后加入溫浴lOmin后的混合物啟動反應(yīng)，恒溫保持 40!1^11后，加入25(^1^1111〇1/1!1(：1中止反應(yīng)。再加入1.51^乙酸乙酯，用力混合158,3500 轉(zhuǎn)/min離心15min后取出1. OmL酯層轉(zhuǎn)入另一試管中，在120°C的烘箱經(jīng)30min蒸干，再將 它重新溶于1. 〇mL的磷酸緩沖液中，在228nm處測定吸光值。抑制率的計算方法根據(jù)TSAI 等的方法（TSAI J S, CHEN J L, BONNIE S Ρ· ACE-inhibitory peptides identified from the muscle protein hydrolysate of hard clam(Meretrix lusoria). Process Biochem istry.，2008, 43(7) :743-747)。如下式計算：①抑制率（％ ) = (0DA-0DBV(0DA-0Dc)，（注： 〇D AS不存在抑制劑時的光密度；0DB為存在抑制劑與酶時的光密度；0D。為抑制劑與酶都不 存在時的光密度。對ACE抑制率達到50%時的抑制劑濃度即為半抑制濃度，記為IC 5(I。IC5Q 值越小，說明抑制劑活性越大。
[0094] (5)測定結(jié)果：不同產(chǎn)地的膠原蛋白對ACE的抑制率結(jié)果見表1，根據(jù)表1結(jié)果繪 制的不同來源不同濃度的膠原蛋白ACE活性的抑制曲線見圖3。從圖3中可以看出當(dāng)濃度 在0. 01mg/mL?0. 05mg/mL時，三種不同來源的膠原蛋白對ACE活性的抑制率幾乎處在同 一水平上，并沒有表現(xiàn)出明顯的活性抑制作用。在加入的濃度到達0. lmg/mL時，自制膠原 蛋白對ACE的抑制率就達到了將近30*%，而另外兩種商品化|父原蛋白的抑制率僅為20左 右。繼續(xù)升高濃度，自制膠原蛋白依然在ACE抑制作用上表現(xiàn)出很好的效果，在加入濃度為 0. 5mg/mL時，就已經(jīng)達到48%的ACE抑制率。而在同樣的濃度下，另外兩種商品化膠原蛋 白的ACE抑制率相比其有一定的差距。而當(dāng)濃度升至lmg/mL時，這種差距進一步被拉大。 根據(jù)表1中IC 5Q結(jié)果繪制的不同膠原蛋白對ACE抑制效果柱狀圖見圖4。IC5Q是一種公認 檢驗ACE抑制劑效果的指標，IC 5(I的值越低說明抑制ACE作用的效果越好。通過計算得出 自制膠原蛋白，德國膠原蛋白以及法國膠原蛋白的IC 5Q分別為0. 524lmg/mL、0. 6780mg/mL 和0. 9696mg/mL。根據(jù)結(jié)果繪制不同膠原蛋白IC5Q的比較柱狀圖見圖4,通過分析后發(fā)現(xiàn)， 自制的膠原蛋白對ACE的抑制效果極顯著地超越于另外兩種商品化的膠原蛋白（P〈0. 01)， 其抑制能力甚至接近法國產(chǎn)膠原蛋白的2倍之多。
[0095] 表1不同膠原蛋白對ACE的抑制效果比較
[0096]

【權(quán)利要求】
1. 一種從哺乳動物胎盤制備高活性膠原蛋白肽的方法，其特征在于，所述的方法包括 以下步驟：哺乳動物胎盤的低溫保持，切碎，浸泡漂洗，磨漿，抽提，離心，酶解，過濾，脫鹽， 濃縮，冷凍干燥步驟。
2. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述的抽提為酸抽提。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述的酸為醋酸。
4. 如權(quán)利要求1-3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下具體步驟： 1) 取冷凍牛胎盤，切碎后加入5-10倍體積的水，過夜浸泡，沖洗除去血液成分，骨泥磨 磨漿后，加入20-40倍體積的2-10%醋酸浸提6-12小時，14000轉(zhuǎn)/離心30-60分鐘，收集 沉淀得膠原蛋白粗品； 2) 向膠原蛋白粗品加 3-5重量體積去離子水，攪拌混勻，調(diào)pH7-9. 0,加入膠原蛋白粗 品重量的0. 1%胰蛋白酶，水解6-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品； 3) 酶解膠原蛋白肽粗品用0. 2微米的濾膜過濾，過濾液用400-500道爾頓的納濾膜脫 鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的牛胎盤膠原蛋白肽 凍干粉。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其具體步驟為： 1) 冷凍牛胎盤，切碎后加入5-10倍體積的水，過夜浸泡除去血液成分，骨泥磨磨楽后， 加入20-40倍體積的2-10%醋酸浸提6-12小時，14000轉(zhuǎn)/離心30-60分鐘，收集沉淀得 月父原蛋白粗品； 2) 膠原蛋白粗品加 3-5重量體積去離子水，攪拌，調(diào)pH7-9. 0,加入膠原蛋白粗品重量 的0. 1 %胰蛋白酶，水解4-8小時，得酶解膠原蛋白肽粗品； 3) 酶解膠原蛋白肽粗品用0. 2微米的濾膜過濾，過濾液用400-500道爾頓的納濾濾脫 鹽3-5次，再濃縮到含蛋白肽4-10%，除菌過濾，冷凍干燥制備高活性的牛胎盤膠原蛋白肽 凍干粉。
6. 如權(quán)利要求1-5所述方法制備的膠原蛋白肽，所述膠原蛋白肽具有大于20%的ACE 抑制率和低于〇.65mg/mL IC5。。
7. 如權(quán)利要求6所述的膠原蛋白肽，其特征在于，當(dāng)膠原蛋白肽濃度為0. 5mmol/mL時， 其具有超過40%以上的ACE抑制率；且當(dāng)膠原蛋白肽濃度為Immol/mL時，其具有超過60% 以上的ACE抑制率；和低于0· 55mg/mL IC5。。
8. 如權(quán)利要求7所述的膠原蛋白肽，其特征在于，當(dāng)膠原蛋白肽濃度為0. 5mmol/mL時， 其具有大于45 %的ACE抑制率；且當(dāng)膠原蛋白肽濃度為Immol/mL時，其具有大于65 %的 ACE抑制率；和低于0· 55mg/mL IC5。。
9. 如權(quán)利要求6-8所述的膠原蛋白肽的用途，所述的用途包括將所述的膠原蛋白肽用 于制備預(yù)防和/或防治人類老化的藥物、食品、保健品或化妝品中的應(yīng)用。
10. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于：在本發(fā)明的又一個實施方式中，將所述藥 物、食品、保健品或化妝品制備成口服制劑、外用制劑、吸入制齊?、經(jīng)鼻制齊?、經(jīng)直腸制劑、經(jīng) 皮制劑或注射制劑，優(yōu)選為外用劑型或注射制劑。
【文檔編號】C12P21/06GK104195205SQ201410398311
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】劉爽, 龐海, 龐玉, 鄧小霞 申請人:吉林省金梓源生物科技有限公司