專利名稱：基因型對于對魚油治療的敏感性的影響的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及評估個體對利用飲食補(bǔ)充物的炎性疾病療法的易感性的方法。
背景技術(shù)：
人體內(nèi)的炎性疾病由腫瘤壞死因子-α(TNF-α)介導(dǎo)。TNF-α是一組在感染和損傷之后迅速出現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子(Beutler et al.，Crit Care Med21423-35(1993)和Lin et al.，Surgery 127117-26(2000))。TNF-α具有廣泛的效應(yīng)其導(dǎo)致瘦肉和脂肪組織丟失，體溫升高，減小胃口并刺激多種免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子和氧化劑分子的生成(Grimble，Clin Sci 91121-30(1996))。這些效應(yīng)產(chǎn)生不利入侵病原體的環(huán)境，從內(nèi)源來源提供免疫系統(tǒng)廣的底物，并增加和改變免疫系統(tǒng)的活性。因此TNF-α在允許機(jī)體耐受病原入侵中具有關(guān)鍵作用。
然而，過量或過早生成的TNF-α在敗血癥(van der Poll et al.，Infect DisClin North Am.13413-26(1999))，腦膜炎(Westendorp et al.，Lancet 349170-3(1997))和瘧疾(Knight et al.，Proc Assoc Am Physicians 111290-8(1999))的死亡率和病死率中起主要作用。TNF-α也在炎性疾病諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Maini et al.，Ann Rev Med 51207-29(2000))和炎性腸病(Murch et al.，Gut32913-7(1991))，動脈硬化斑塊形成(Ross，Nature 362801-91993))以及移植的組織的排異(Kutukculer et al.，Transpl Int.845-50(1995))的病理中起主要作用。
富含n-3多不飽和脂肪酸(n-3PUFA)的魚油在多種炎癥動物模型中顯示抗炎效應(yīng)(Calder，Ann Nutr Metab 41203-341997)和Grimble，Proc Nutr Soc.57535-421998))，并在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Calder&Zurier Curr Opin Clin NutrMetab Care 4115-21(2001))，克隆氏病(Belluzi et al.，N Engl J Med3341557-616(1996))和銀屑病(Mayser et al.，J Am Acad Dermatol 38539-47(1998))中產(chǎn)生抗炎效應(yīng)。包囊化的魚油通常作為飲食補(bǔ)充物而被服用。
一種報道的魚油的抗炎作用是通過外周血單核細(xì)胞(PBMC)來減少TNF-α生成(Endres et al.，N EnglJ Med 320265-71(1989))。然而，在魚油被作為抗炎劑而研究的研究中，沒有發(fā)現(xiàn)魚油在所有個體中有效。例如，在研究魚油對健康個體PBMC的TNF-α生成的影響的11項研究中(Endres etal.，N Engl J Med 320265-71(1989)；Schmidt et al.，Scand J ClinLab Med5687-92(1996)；Cooper et al.，Clin Nutr 12321-8(1993)；Blok et al.，Eur J ClinInvest 271003-8(1997)；Meydani et al.，J Clin Invest 92105-13(1993)；Molviget al.，Scan J Immunol 34399-410(1991)；Meydani et al.，J Nutr 121547-55(1991)；Caughey et al.，Am J Clin Nutr 63116-22(1996)；Yaqoob et al.，Eur JClin Nutr 30399-410(2000)；Gallai et al.，J Neuroimmunol 56143-53(1995)and Kelley et al.，Lipids 34317-24(1999))，只有六項報道了抑制效應(yīng)(Endres et al.，N Engl J Med 320265-71(1989)；Meydani et al.，J Clin Invest92105-13(1993)；Meydani et al.，J Nutr 121547-55(1991)；Caughey et al.，AmJ Clin Nutr 63116-22(1996)；Gallai et al.，J Neuroimmunol 56143-53(1995)and Kelley et al.，Lipids 34317-24(1999))。
健康男性和停經(jīng)后女性中，PBMC的TNF-α生成顯示與顯示特征性細(xì)胞因子生成水平的每個個體明顯一致(Jacob et al.，PNAS 871233-7(1990))。然而，個體的TNF-α生成有很大差異。推定TNF-α和淋巴毒素-α(LT-α，也已知為TNF-β)基因的啟動子區(qū)中的多態(tài)性影響炎性刺激后生成的TNF-α的量(Wilson et al.，J Inflamm 451-12(1995))。這顯示具有臨床意義。例如，TNF-α-308(TNF2)等位基因純合個體的瘧疾相關(guān)病死率以及嚴(yán)重神經(jīng)癥狀發(fā)生率是更為常見的TNF1等位基因的雜合或純合個體的7倍(Mc Guire etal，Nature 371508-11(1994))。出現(xiàn)敗血癥的LT-α+252(TNFB2)等位基因純合子手術(shù)患者的死亡率比TNFB1等位基因純合個體的高3.5倍，比雜合個體高2.4倍(Stuber et al.，Crit Care Med 24381-4(1996))。
其它細(xì)胞因子，細(xì)胞因子-6(IL-6)的水平也被推定以測定個體對魚油治療的反應(yīng)。根據(jù)文獻(xiàn)(Fishman et al.，J.Clin Invest 1021369-1376(1998)和Villuendas et al.，J.Clin Endocrinol Metab 871134-1141(2002))，其IL-6基因具有位置-174的GG堿基對的個體產(chǎn)生升高水平的IL-6，而在該位置具有CC堿基對的個體產(chǎn)生低水平IL-6。體內(nèi)IL-6生成對個體的炎癥總水平有貢獻(xiàn)。然而，現(xiàn)有技術(shù)沒有將位置-174的具體基因型與TNF生成相聯(lián)系。對-174位置的基因型，炎癥水平以及TNF生成之間的關(guān)系的分析將使得魚油更準(zhǔn)確地靶向很可能對魚油有反應(yīng)的那些個體。
有關(guān)魚油對TNF-α生成的影響的所有研究都報道了TNF-α生成中存在較大標(biāo)準(zhǔn)偏差，其提示研究群體中基因型是混合的。對于TNF-α，LT-α和IL-6基因中的多態(tài)性是否影響魚油抑制TNF-α生成的能力是未知的。對這些相互作用的理解可解釋文獻(xiàn)中的不一致性，并允許將魚油治療更為特異地靶向炎性疾病。
魚油是炎性疾病的廉價治療。然而，如果作為每日的飲食補(bǔ)充物應(yīng)用可消耗大量金錢而不會保證成功，優(yōu)選將魚油靶向很可能獲益的那些患者，而不是向每名患者建議他們應(yīng)當(dāng)服用該補(bǔ)充物以“看看是否有幫助”。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人認(rèn)識到個體對于魚油對TNF-α生成的炎癥抑制效應(yīng)的敏感性與TNF-α-308，LT-α+252和IL-6-174單核苷酸多態(tài)性(SNP)編碼或相關(guān)的遺傳變異有關(guān)聯(lián)。魚油對TNF-α生成的炎癥抑制效應(yīng)與細(xì)胞固有TNF-α生成水平相關(guān)。
因此，本發(fā)明第一方面提供了評估個體對利用魚油進(jìn)行的炎性疾病療法的易感性的方法，包括測定所述個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因的多態(tài)性相關(guān)的基因型；和由此判斷所述個體是否對魚油治療有良好反應(yīng)。
第二方面，本發(fā)明提供了評估個體對利用魚油進(jìn)行的炎性疾病療法的易感性的方法，包括a)測定個體的固有TNF-α狀態(tài)；和b)測定所述個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因的多態(tài)性相關(guān)的基因型；和由此判斷所述個體是否對魚油治療有良好反應(yīng).
另一方面，本發(fā)明提供了治療患者中的炎性疾病的方法，包括評估個體對利用魚油進(jìn)行的炎性疾病療法的敏感性，所述評估包括a)測定所述個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因多態(tài)性相關(guān)的基因型；b)由此判斷所述個體是否對魚油治療有良好反應(yīng)；和用適量的魚油治療所述個體.
另一方面，本發(fā)明提供了治療患者中的炎性疾病的方法，包括評估個體對利用魚油進(jìn)行的炎性疾病療法的易感性，所述評估包括a)測定個體的固有TNF-α狀態(tài)；b)測定所述個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因多態(tài)性相關(guān)的基因型；c)由此判斷所述個體是否對魚油治療有良好反應(yīng)；和用適量的魚油治療所述個體。
發(fā)明內(nèi)容第一方面，本發(fā)明需要測定所述個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因多態(tài)性相關(guān)的基因型。
TNF-α(TNF1，TNF2)基因和LT-α(TNFB1，TNFB2)基因中的多態(tài)性將導(dǎo)致每種情況中的三種基因型，純合TNF1/1或TNFB1/1，或純合TNF2/2和TNFB2/2，或雜合TNF1/2和TNFB1/2。在類似的方式中，關(guān)于IL-6基因，個體可為純合CC或GG或雜合CG。因此，本發(fā)明中，個體可具有以下基因型之一純合TNF1/1純合TNFB1/1純合IL-6CC純合TNF1/1純合TNFB1/1純合IL-6GG純合TNF1/1純合TNFB1/1雜合IL-6CG純合TNF1/1純合TNFB2/2純合IL-6CC純合TNF1/1純合TNFB2/2純合IL-6GG純合TNF1/1純合TNFB2/2雜合IL-6CG純合TNF1/1雜合TNFB1/2純合IL-6CC純合TNF1/1雜合TNFB1/2純合IL-6GG純合TNF1/1雜合TNFB1/2雜合IL-6CG純合TNF2/2純合TNF1/1純合IL-6CC純合TNF2/2純合TNFB1/1純合IL-6GG純合TNF2/2純合TNFB1/1雜合IL-6CG純合TNF2/2純合TNFB2/2純合IL-6CC純合TNF2/2純合TNFB2/2純合IL-6GG
純合TNF2/2純合TNFB2/2雜合IL-6CG純合TNF2/2雜合TNFB1/2純合IL-6CC純合TNF2/2雜合TNFB1/2純合IL-6GG純合TNF2/2雜合TNFB1/2雜合IL-6CG雜合TNF1/2純合TNFB1/1純合IL-6CC雜合TNF1/2純合TNFB1/1純合IL-6GG雜合TNF1/2純合TNFB1/1雜合IL-6CG雜合TNF1/2純合TNFB2/2純合IL-6CC雜合TNF1/2純合TNFB2/2純合IL-6GG雜合TNF1/2純合TNFB2/2雜合IL-6CG雜合TNF1/2雜合TNFB1/2純合IL-6CC雜合TNF1/2雜合TNFB1/2純合IL-6GG；或雜合TNF1/2雜合TNFB1/2雜合IL-6CG.
盡管在文獻(xiàn)中，上述是所有可能的基因組合，實際上，并非所有組合都會出現(xiàn)。一些組合的形成可能被阻止，例如由于一些基因的連接，導(dǎo)致連鎖不平衡。此外，基因TNF2/2非常少見，出現(xiàn)在少于10％的群體中。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選LT-α基因的基因型是雜合TNFB1/2。
本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，優(yōu)選IL-6基因的基因型是純合GG。
本發(fā)明更為優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)選LT-α和IL-6基因的基因型分別是雜合TNFB1/2和IL-6GG。
在本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案中，測定了TNF-α，LT-α和IL-6等位基因之一的基因型。但更優(yōu)選，測定了TNF-α，LT-α和IL-6等位基因中的兩種或多種的基因型，最優(yōu)選測定了LT-α和IL-6等位基因的基因型。
第二方面，本發(fā)明需要測定個體的固有TNF-α狀態(tài)。
個體固有TNF-α狀態(tài)是該個體白細(xì)胞生成TNF的能力的測定。無病或基本無病狀態(tài)個體的固有TNF-α狀態(tài)顯示了明顯的一致性。TNF-α的生成通常不受個體年齡或性別影響。無病或基本無病指所述個體不患有任何類型或明顯水平的炎性疾病。個體的固有TNF-α狀態(tài)因此優(yōu)選在所述個體不患有任何類型或明顯水平的炎性疾病的情況下測定。
個體固有TNF-α狀態(tài)的測定可通過利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行。通常收集全血樣品，從其中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。分離PBMC的技術(shù)是已知的，并包括例如用肝素鋰處理全血，然后離心分離PBMV，隨后可利用諸如EASIAELISA試劑盒(Biosource International，Nivelles，Belgium)等標(biāo)準(zhǔn)方法測定TNF-α濃度。
TNF-α生產(chǎn)者可根據(jù)它們的PBMC產(chǎn)生的TNF-α濃度分成多組并由此限定它們的固有TNF-α狀態(tài)。通常為本發(fā)明的目的，優(yōu)選所述生產(chǎn)者可分成三組，例如，高，中或低生產(chǎn)者。盡管PBMC產(chǎn)生的TNF-α的確切量對于限定上述三組并非必須的，通常優(yōu)選高生產(chǎn)者具有的TNT-α濃度約850-2500ng/L來自1×109細(xì)胞的保溫物，中等生產(chǎn)者的TNF-α濃度為2500-5000ng/L來自1×109細(xì)胞保溫物，高生產(chǎn)者的TNF-α濃度為約5000-14000ng/L來自1×109細(xì)胞保溫物。
下表1舉例證實了魚油對TNF-α生成的影響。
表1

*與補(bǔ)充前的值有明顯差異(P＜0.05；Student’s成對t-檢驗)。
TNF-α生成在魚油補(bǔ)充前后的差異利用Student’s成對t-檢驗測定。從上述結(jié)果明顯可見，對給予魚油的敏感性受到補(bǔ)充前TNF-α生成或固有TNF-α生成的影響。在最高tertile中，平均TNF-α生成降低43％。TNF-α生成在中間tertile中降低，但降低的量較不明顯，在最低tertile中，TNF-α生成增加160％。
考慮到上述結(jié)果，本發(fā)明人確定其固有TNF-α生成導(dǎo)致他們成為“低產(chǎn)量生產(chǎn)者”類別的個體，即具有約850-2500ng TNF-α/L來自1×109細(xì)胞的保溫物的個體，很可能對魚油治療反應(yīng)良好。
適合用于所述方法的基因組樣品可分離自任何適宜的委托人或患者細(xì)胞樣品。為方便，優(yōu)選所述DNA分離自面頰(頰)細(xì)胞。這使得能夠容易并無痛地收集細(xì)胞。
細(xì)胞可利用具有塑料或紙質(zhì)基質(zhì)“刷”的一次性刮擦器械例如C.E.P.SwabTM(LifeTechnologies Ltd.，UK)從口腔內(nèi)側(cè)分離。細(xì)胞經(jīng)對頰內(nèi)側(cè)面的輕柔摩擦可沉積在所述基質(zhì)上，導(dǎo)致收集到大約2000個細(xì)胞(Aron，Y.et al(1994)Allergy 49(9)788-90)。隨后可將紙質(zhì)刷放置到完全干燥，從置于微離心管中的把手中拆出，儲存?zhèn)浞治鲇谩?br> 細(xì)胞樣品的基因組DNA可利用常規(guī)方法分離。例如，DNA可固定在濾紙，柱基質(zhì)或磁性珠上?？墒褂酶鞣N商業(yè)試劑盒，諸如Qiagen QIAamp試劑盒(Qiagen，Crawley，UK)。簡而言之，所述細(xì)胞樣品可置于微離心管中并與蛋白酶K在一起，混合，允許其保溫使細(xì)胞裂解。隨后加入乙醇并將裂解物轉(zhuǎn)移到QIAamp旋轉(zhuǎn)柱，數(shù)次洗滌后從所述柱洗脫出DNA。
通過所用具體方法分離的DNA的量可被定量以保證足夠的DNA可用于試驗以及測定達(dá)到PCR擴(kuò)增所需DNA濃度的稀釋度。例如，所需靶DNA濃度可為50ng-150ng。該范圍以外的DNA濃度可影響各個等位基因的PCR擴(kuò)增，并由此影響所述多態(tài)性測定步驟的敏感性和選擇性。
獲自樣品的DNA的質(zhì)量可利用任何適宜技術(shù)確定。所述技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括UV(Maniatis T.，F(xiàn)ritsch E.F.，和Sambrook J.，(1982)Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSprings Harbor，NY)或基于熒光的方法。由于UV法可由于污染物質(zhì)諸如核苷酸，RNA，EDTA和苯酚等而使吸光度受到影響，并且該技術(shù)的動態(tài)范圍和敏感度不像熒光法那樣大，熒光法是優(yōu)選的?？少彽没跓晒獾脑噭┖兄T如PicoGreen dsDNA Quantification(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)。
檢測樣品以前，樣品中的核酸可選擇性擴(kuò)增，例如利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，如美國專利4,683,202和4,683,195所述。
優(yōu)選用于本發(fā)明的引物長度為18-23核苷酸，無內(nèi)部同源性或引物-引物同源性。
此外，為保證目的區(qū)被擴(kuò)增以及特異性，采用ARMS-PCR或等位基因特異性PCR法。由此，在每個PCR反應(yīng)中，一種引物的3’末端恰好位于SNP位點，使得擴(kuò)增僅在對應(yīng)一種具體等位基因的核苷酸堿基存在的情況下出現(xiàn)。每個SNP進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)對一種等位基因特異。一種引物對于兩種PCR反應(yīng)是共同的，而對于每次反應(yīng)加入分離的等位基因特異性引物，例如所述共同引物可為“正向的”，等位基因1(反應(yīng)1)或等位基因2(反應(yīng)2)則加入作為“反向”引物，或反之。
該方法基于最初的發(fā)現(xiàn)，即PCR反應(yīng)中的特異性有賴于PCR引物的3’末端與其靶DNA序列的精確配對。利用該方法，利用單種屬(single generic)引物結(jié)合分別的PCR反應(yīng)中兩種反義引物之一，點突變可與野生型序列區(qū)分。一種反義引物與所述野生型序列在其3’末端精確配對，而第二種引物與突變序列在其3’末端精確配對。因此，一次PCR反應(yīng)僅擴(kuò)增野生型序列而另一次僅擴(kuò)增突變序列。該方法(最初稱為“擴(kuò)增抵抗型突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system)-PCR”(ARMS-PCR)(Newton et al1989)有賴于這樣的事實，Taq DNA聚合酶缺乏3′到5′的核酸外切校對活性，使得引物-模板雙鏈體3末端的Watson-Crick錯配不能被校正，這導(dǎo)致誤引發(fā)(mispriming)。成功應(yīng)用ARMS-PCR法需要嚴(yán)格的條件使PCR反應(yīng)中的引物退火。該方法的重要組分是包含第二引物對，其擴(kuò)增第二基因序列，作為試管內(nèi)陽性對照而在該試管內(nèi)進(jìn)行成功或失敗的PCR擴(kuò)增。
用于分析TNF-α，LT-α和IL-6基因的引物對的優(yōu)選實例連同用于擴(kuò)增來自人白細(xì)胞抗原DRB1的第三內(nèi)含子的序列的對照引物示于表2，后者作為成功PCR的內(nèi)部對照。
表2

獲得DNA樣品后(所述DNA優(yōu)選具有目的擴(kuò)增區(qū))，個體多態(tài)性可得以鑒定。多態(tài)性標(biāo)記的鑒定包括區(qū)分性檢測TNF-α，LT-α和IL-6基因的等位基因形式，所述等位基因形式由于具有分別在位置-308，+252和/或-174的核苷酸取代而不同。
檢測已知核苷酸差異的存在的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法包括，但不限于-與等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交，(Wallace，R.B.et al(1981)Nucleic Acids Research.9879-894；Ikuta，S.et al(1987)Nucleic AcidsResearch.15797-811；Nickerson，D.et al(1990)PNAS USA 878923-8927，Verlaan-de Vries，M et al(1986)Gene.50313-320，Saiki，R.K.et al(1989)PNAS.USA 866230-6234和Zhang，Y.et al(1991)Nucleic Acids Research.193929-3933)。
-等位基因特異性PCR，(Newton，C.R.et al(1989).Nucleic Acids Research.172503-2516，Gibbs，R.A.et al(1989)Nucleic Acids Research.172437-2448)。
以下對比文件詳細(xì)描述了所用TNF alpha/LT alpha基因分型系統(tǒng)-Howell WM，Bateman AC，Turner SJ，Theaker JM(2002).Influence of TNFα和LTαsingle nucleotide polymorphisms on susceptibility to and prognosis incutaneous malignant melanoma in the British population European Journal ofImmunogenetics，29，17-23。
一些詳述通過ARMS-PCR進(jìn)行的細(xì)胞因子基因分型的其它實例包括-McCarron SL，Edwards S，Evans PR，Gibbs R，Dearnaley DP，Dowe A，Southgate C，The CRC/BPG UK Familial Prostate Cancer Study Collaborators，Easton DF，Eeles RA，Howell WM (2002)Influence of cytokine genepolymorphisms on the development of prostate cancer.Cancer Research，62，3369-3372.
-Howell WM，Turner SJ，Bateman AC，Theaker JM(2001).IL-10promoterpolymorphisms influence tumour development in cutaneous malignant melanoma.Genes and Immunity，2，25-31.
-Poole KL，Gibbs PJ，Evans PR，Sadek SA，Howell WM(2001)Influence ofpatient and donor cytokine Genotypes on renal allograft rejectionevidence from asingle study.Transplant Immunology，8，259-265.
其它目的對比文件包括-固相顯微測序(Solid-phase minisequencing)(Syvanen，A.C.et al(1993)Am.J.Human Gene t.5246-59).
-寡核苷酸連接測定法(Oligonucleotide ligation assay)(OLA)(Wu，D.Y.，etal(1989)Genomics.4560-569，Barany，F(xiàn).(1991)PNAS USA 88189-193，Abravaya，K.et al 1995.Nucleic Acids Research.23675-682).
-5’熒光團(tuán)核酸酶測定法(The 5’fluorogenic nuclease assay)(Lee，E.et al J.Toxicol.Soc.23140-142，(1998)，US4,683,202，US4,683,195，US5,723,591和US5,801,155).
-限制片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism)(RFLP)，(Donis-Keller H.et.al.(1987)Cell，51，319-337)。
優(yōu)選實施方案中，三個基因的基因座可通過用于檢測多態(tài)性的特定類型的PCR評估，所述PCR通常稱為Taqman實驗和并利用AB7700或7900HT裝置(Applied Biosystems，Warrington，UK)進(jìn)行。在該方法中，合成與含有所述多態(tài)性的目的區(qū)域雜交的探針。所述探針含有三種修飾熒光報道分子，熒光猝滅分子，以及小溝結(jié)合化學(xué)物質(zhì)，以促進(jìn)與基因組DNA鏈的結(jié)合。所述探針可與DNA的任何一條鏈結(jié)合。例如，在與編碼鏈結(jié)合的情況下，當(dāng)Taq聚合酶開始從5’上游引物合成DNA時，所述聚合酶將遇到探針并利用5’-3’核酸外切酶活性從所述探針移除堿基，每次一個。當(dāng)與熒光報道物分子結(jié)合的堿基被移除，所述熒光分子不再被猝滅分子猝滅，而將開始發(fā)熒光。這種類型的反應(yīng)僅能在所述探針與配對的基因組序列完全雜交時發(fā)生。由于擴(kuò)增以連續(xù)循環(huán)的方式進(jìn)行，即更多的探針和引物與反應(yīng)混合物中的DNA結(jié)合，熒光的量將增加并檢測到陽性結(jié)果。如果基因組DNA不具有與探針完全匹配的序列，檢測不到熒光信號。
遺傳多態(tài)性分析的結(jié)果可與生產(chǎn)者的固有TNF-α生成水平的測定結(jié)果相結(jié)合使用，以允許測定個體對魚油治療的易感性。下表3表明了TNF-α。LT-α和IL-6基因型在研究群體中的分布與固有TNF-α生產(chǎn)者狀態(tài)的關(guān)系。
表3

*表示LT-α和IL-6基因型的分布明顯區(qū)別于TNF-α生成的低tertile(P＜0.001x2檢驗)。
從上表可見，屬于TNF1/1，TNF1/2和TNF2/2基因型的個體的百分比分別為大約68％，30％和2％?；蛐蜑門NFB1/1，TNFB1/2和TNFB2/2的個體的百分比分別為19％，53％和28％，基因型為IL-6GG，IL-6GC和IL-6CC的個體分別為53％，56％和29％。TNTNFF-α基因型似乎與TNF-α生成無關(guān)，這是由于TNF 1和TNF2等位基因的分布對于所有補(bǔ)充前TNF-α生成的tertile中的受試者而言幾乎相同。TNFB2/B2和IL-6GG基因型的頻率與TNF-α生成正相關(guān)，在TNFB2/2的情況下從最低tertile中的19％增加到最高tertile中的48％，在IL-6的情況下增幅較小，為從最低tertile中的33％增加到最高tertile中的39％。隨固有TNF-α生成增加，TNFB1/B2基因型和IL-6CC基因型的頻率降低。
基因型對魚油降低LPS刺激外周血單核細(xì)胞導(dǎo)致的TNF-α生成的能力的影響也顯示在表4中。從該表明顯可見，單獨的IL-6GG或TNFB 1/2多態(tài)性的存在導(dǎo)致具有這些基因型之一的個體對魚油給藥后降低TNF-α生成的有益效應(yīng)更為易感。此外，TNFB 1/2和IL-6GG基因型的結(jié)合很可能增強(qiáng)魚油降低TNF生成的效果，如56％具有該基因型的受試者顯示給予魚油后TNF-α生成減少這一事實所示(表4)。
表4基因型對魚油(6g/d，12周)降低LPS刺激人外周血單核細(xì)胞的TNF-α生成的能力的影響

如果給予魚油后的值比給予魚油前的值降低＞10％，認(rèn)為受試者的TNF-α生成降低。
TNF-β+252和IL-6-174單核苷酸多態(tài)性表征的。
10-10-2002為本發(fā)明的目的，將魚油從含有至少28％n-3PUFA的新鮮魚肉和器官中提取出來，其中約60％是二十碳五烯酸，約40％是二十二碳六烯酸。所述魚油可提取自任何魚油來源。在這方面具體適合的是鯖魚(mackerel)，西鯡(sprat)，鯡魚(herring)，金槍魚(tuna)和野生鮭魚(wild salmon)，這些魚富含n-3PUFA。魚油的其余組分通常是飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸的混合物，其不具有魚油的任何活性。
適宜的炎性疾病包括需要減輕炎癥的任何疾病，包括炎性皮膚疾病諸如異位性皮炎(atopic dermatitis)，接觸性皮炎(contact dermatitis)，濕疹(eczema)，銀屑病(psoriasis)以及其它炎性疾病，諸如肛周克隆氏病(PerianalCrohn’s disease)和關(guān)節(jié)炎，例如類風(fēng)濕性或銀屑病性關(guān)節(jié)炎。魚油治療被發(fā)現(xiàn)對于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特別有益。
一些實施方案中，方法可包含進(jìn)一步將魚油給藥個體的步驟。魚油可單獨給藥或與一或多種維生素B12/B6以及抗氧化劑諸如維生素C，維生素E，蕃茄紅素β-類胡蘿卜素和礦物質(zhì)諸如鎂，錳，硒和鋅等聯(lián)用。
諸如片劑或丸劑，其例如包含活性組分以及適宜的賦形劑，或者為富含魚油的食物。適宜的食物將包括含油魚(oily fish)諸如鯖魚(mackerel)，西鯡(sprat)，鯡魚(herring)，金槍魚(tuna)和野生鮭魚。
方法可包括進(jìn)一步為所述個體提供飲食方案，所述方案包括含有升高水平的一或多種葉酸，維生素B6/B12和維生素C的食品。
本發(fā)明另一方面提供包含魚油的組合物在制備用于治療個體中炎性疾病的藥物中的用途，所述個體對于一或多種TNF-α-308，LT-α+252和IL-6-174多態(tài)性而言是多態(tài)的。
本文術(shù)語“治療”指治療疾病，通常指治療和療法，無論是人或是動物(例如在獸醫(yī)應(yīng)用中)的，其中獲得一些所需的治療效果，例如炎性疾病進(jìn)展的抑制，并包括進(jìn)展速率的減慢，進(jìn)展速率的停滯，炎性疾病的緩解，以及炎性疾病的治愈。包括作為預(yù)防措施的治療(即防病)。
本文術(shù)語“治療有效量”指活性化合物或物質(zhì)，包含活性化合物的組合物或劑型的量，其對于產(chǎn)生一些所需的治療效果有效，同時伴有合理的受益/風(fēng)險比例。
魚油或含有魚油的藥用組合物可通過任何方便的給藥途徑給予受試者，包括但不限于口服給藥(即通過攝入)，或胃腸外給藥，例如經(jīng)皮下，肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注入。
所述受試者可為真核生物，動物，脊椎動物，哺乳動物，嚙齒動物，鼠，犬，貓，馬，牛，綿羊或人。
雖然魚油可單獨給藥，優(yōu)選將其作為藥物組合物(例如配制劑)，其包含至少魚油以及一或多種可藥用載體、佐劑、賦形劑、稀釋劑、過濾物、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、潤滑劑以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的物質(zhì)，并可選包括其它治療或預(yù)防藥劑。
因此，本發(fā)明還提供如上述的藥物組合物，以及制備藥物組合物的方法，包括將魚油與本文所述一或多種可藥用載體、賦形劑、緩沖劑、佐劑、穩(wěn)定劑或其它物質(zhì)進(jìn)行混合。
本文術(shù)語“可藥用”指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適合與受試者的組織接觸而不導(dǎo)致過度的毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，并具有合理的受益/風(fēng)險比例的化合物、物質(zhì)、組合物和/或劑型。每種載體、賦形劑等在與配制劑的其它組分相容的意義上也必須是“可接受的”。適宜的載體，賦形劑等可見于標(biāo)準(zhǔn)藥等教科書，例如Remington’s PharmaceuticalSciences，18th edition，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990。
所述配制劑可方便地存在單位劑量形式中，并通過藥物領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備。所述方法包括將活性化合物與構(gòu)成一或多種輔助成分的載體結(jié)合的步驟。通常，使活性化合物與液體載體和/或粉碎的固體載體均一并緊密地結(jié)合，并按需使所得產(chǎn)品成型來制備所述配制劑。
配制劑可以是液體，溶液，懸液，乳液，酏劑，糖漿，片劑，糖錠，顆粒，粉末，膠囊，扁囊，丸劑，安瓿，油，栓劑，彈丸或持續(xù)釋放的配制劑的形式。
適于口服(例如通過攝入)給藥的配制劑可作為離散單位存在諸如膠囊，扁囊或片劑中，每種都含有預(yù)定量的活性化合物；作為粉末或顆粒；作為含水或非含水液體中的溶液或懸液；或作為水包油液體乳劑或油包水液體乳劑；作為藥團(tuán)；作為藥糖劑(electuary)；或作為貼劑。
片劑可通過常規(guī)方法制備，例如壓縮或模制，可選具有一或多種輔助成分。壓縮片劑可通過在適宜機(jī)器中對自由流動形式諸如粉末或顆粒的活性化合物加壓來制備，所述活性化合物可選與以下物質(zhì)混合一或多種黏合劑(例如聚烯吡酮，凝膠，阿拉伯膠，山梨糖醇，黃蓍膠，羥基丙基甲基纖維素)；填充劑或稀釋劑(例如乳糖，微晶纖維素，磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂，滑石，二氧化硅)；崩解劑(例如淀粉甘醇酸鈉(sodium starchglycolate)，交聯(lián)的聚烯吡酮，交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)；表面活性劑或分散劑或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)；以及防腐劑(例如甲基p-羥基苯甲酸鹽(酯)，山梨酸)。成型的片劑可通過在適宜的機(jī)器中使得利用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物成型來制備。所述片劑可選被包被或刻痕，并配制成緩慢或受控制地釋放其中的活性物質(zhì)，所述配制利用例如不同比例的羥基丙基甲基纖維素以提供所需的釋放圖譜。片劑可選具有腸包衣，以便在除胃以外的內(nèi)臟部分中釋放。
胃腸外給藥的特征通常在于注射，其可為皮下，肌內(nèi)，或靜脈內(nèi)。可注射物可以以常規(guī)形式制備，其可作為液體溶液或懸液，適合在注射前溶解或懸于液體中的固體形式，或乳劑。適宜的賦形劑為，例如水，鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等。此外，如果需要，待給藥的藥物組合物可含有少量非毒性輔助物質(zhì)諸如濕潤或乳化劑，pH緩沖劑等，諸如乙酸鈉，山梨聚糖單月桂酸酯(鹽)，油酸三乙醇胺，三乙醇胺乙酸鈉等。
最近設(shè)計的胃腸外給藥方法利用緩慢釋放或持續(xù)釋放系統(tǒng)的植入，使得保持劑量水平恒定。見例如美國專利3,710,795。
所述胃腸外組合物中所含活性化合物的百分比高度依賴于其具體性質(zhì)，以及化合物的活性和患者需要。然而，溶液中0.1％-10％的活性組分百分比是可用的，并且如果所述組合物是固體，可稀釋到上述百分比，則所述百分比可以更高。優(yōu)選所述組合物含有的活性組分為溶液的0.2-2％。
將理解所述活性化合物，以及包含所述活性化合物的組合物的適當(dāng)劑量對于不同患者而言是不同的。最優(yōu)劑量的確定將通常包括治療益處相對于本發(fā)明治療的任何風(fēng)險或有害負(fù)作用的平衡。所選劑量水平將有賴于多種因素，包括但不限于，具體化合物的活性，給藥途徑，給藥時間，化合物排出速率，治療持續(xù)時間，其它藥物，化合物和/或聯(lián)用的物質(zhì)，以及所述患者的年齡，性別，體重，病情，一般健康以及病史?；衔锏牧恳约敖o藥途徑最終由醫(yī)師決定，但通常所述劑量將使得在作用位點的局部濃度可實現(xiàn)所需效應(yīng)但不導(dǎo)致本質(zhì)上有害或不良副效應(yīng)。
在治療過程中，可在一次劑量、連續(xù)或間斷給藥(例如在適當(dāng)?shù)拈g隔時間以分離的劑量)中實現(xiàn)體內(nèi)給藥。測定最有效給藥途徑和劑量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并隨以下因素而不同用于治療的配制劑，治療目的，被治療靶細(xì)胞，以及被治療的受試者。單次或多次給藥可利用治療師所選的劑量水平和模式進(jìn)行。
通常，適宜的魚油劑量為每天約4g-約8g，更優(yōu)選每天約6g。其可為單次藥團(tuán)劑量的形式或更優(yōu)選多次給藥或持續(xù)釋放制劑的形式。諸如年齡，體重性別，其它非炎性疾病的存在或缺失等因素通常對適宜的魚油日劑量沒有影響。
實施本發(fā)明方法的確切模式可利用常規(guī)技術(shù)和知識，由本領(lǐng)域技術(shù)人員以不同方式進(jìn)行。
當(dāng)然，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將設(shè)計任何適合的對照試驗，用來比較本發(fā)明方法所得結(jié)果。
本發(fā)明的方面將參照以下試驗和結(jié)果舉例說明，僅作為實例而并非限制。其它方面和實施方案對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是明顯的。
說明書中包括的所有文獻(xiàn)都包含在此作為參考。
試驗1.受試者以及試驗設(shè)計健康男性受試者(n＝111)募集自Southampton區(qū)，其年齡28±8(20-57)，體重77±11kg(50-103kg)，體重指數(shù)24±4kg/m2(18-34kg/m2)。吸煙者以及患有炎性疾病的個體或服用抗炎藥物的個體從本研究中排除。受試者繼續(xù)他們的正常生活方式和飲食，還服用6g/d魚油膠囊(提供1.8ng n-3PUFAs/天)(Maxepa，Seven Seas Ltd，Hull，UK)12周。提供血液前，受試者禁食過夜，至少12小時。分別在魚油補(bǔ)充期間開始以及完成時連續(xù)取三次分離的血樣。用含有肝素鋰的真空管保存第一次的20ml血液；該血液用于制備PBMC。然后用無抗凝劑的真空管取5ml血液；該血液用于制備血清以測定C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度。最后用含有EDTA的真空管取5ml血液；該血液用于制備用于基因分型的DNA。
測定血清CRP濃度以檢測取樣時受試者中的感染或炎癥的存在。任一血樣中CRP濃度＞100mg/L的個體從本研究中排除。
2.TNF-α誘導(dǎo)和測定PBMC通過在Histpaque-1077(Sigma Chemical Co.，Poole，UK)(Yaqoobet al，.Eur J Clin Nutr 30399-410(2000))上離心肝素化的血液而分離，并重懸于含有2mmol/L谷氨酰胺和50ml/l自體血漿的RPMI培養(yǎng)基中。PBMC(2×106)在24孔組織培養(yǎng)板上，在存在終培養(yǎng)體積2ml中的終濃度為15mg/l的大腸桿菌0111B4內(nèi)毒素(Sigma Chemical Co.，Poole，UK)的條件下培養(yǎng)。在37℃、5％CO2/95％空氣中、24小時后，離心所述培養(yǎng)板并將上清凍于-80℃用于分析。TNF-α濃度利用EASIAELISA試劑盒(Biosource International，Nivelles，Belgium)測定。試驗間和試驗內(nèi)變異系數(shù)＜10％，檢測限為3ng/l。
3.TNF-α和LT-α等位基因的基因分型已經(jīng)收集到EDTA中的血液等分試樣對于TNF-α-308(TNF1，TNF2)和LT-α+252(TNFB 1，TNFB2)單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行基因分型。這些SNP由于它們與TNF-α生成的公知但可變的關(guān)系而被選出(Kroeger et al.，Cytokine 12110-119(2000)和Warzocha et al.，Blood 913564-81(1998))?；蚪MDNA通過鹽析法提取(Miller et al.，Nucleic Acid Res 161215(1988))。利用兩種反應(yīng)擴(kuò)增抵抗型突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(ARMS-PCR)法基于以前公開的方法檢測每種SNP(Howell WM et al.，European Journal of Immunogenetics，2917-23(2002)；Perrey et al.，TransplImmunol 7127-8(1999))。在該方法中，對每種SNP進(jìn)行兩次分離的PCR反應(yīng)。每次PCR反應(yīng)還含有另外的PCR引物對，將序列從人白細(xì)胞抗原DRB1基因的內(nèi)含子進(jìn)行擴(kuò)增，作為成功PCR的內(nèi)部對照。所有PCR反應(yīng)以反應(yīng)體積10μl進(jìn)行，終試劑濃度如下1×AS反應(yīng)緩沖液(Abgene，Epsom，UK)，200μmol/l每種dNTP，120g/l蔗糖，200μmol/l甲酚紅，1μmol/l每種特異性或共同引物，0.2μmol/l每種內(nèi)部對照引物，0.25單位ThermoprimePLUS DNA聚合酶(Abgene，Epsom，UK)，1.75mmol/l MgCl2和25-100ng DNA。每種SNP擴(kuò)增子的PCR引物序列和產(chǎn)物大小如表2所示。PCR反應(yīng)條件利用Primus 96Plus熱循環(huán)儀(MWG Biotech，Germany)根據(jù)以下循環(huán)條件進(jìn)行96℃、60s，然后以96℃、15s，65℃、50s，72℃、40s循環(huán)10次；然后以96℃、190s，60℃、50s，72℃、40s循環(huán)20次。PCR產(chǎn)物直接加樣于含有0.5g/l溴化乙錠的2％瓊脂糖，進(jìn)行電泳并在UV透射下顯像。
4.血漿磷脂脂肪酸組合物對食用魚油治療的依從性通過測定血漿磷脂的脂肪酸組合物來評估。利用氯仿/甲醇(2∶1v/v)從血漿提取總脂質(zhì)，并利用己烷/乙醚/乙酸(90∶30∶1v/v/v)混合物作為洗脫相通過薄層色譜法分離磷脂。脂肪酸甲基酯通過與10g/l三氟化硼在甲醇中于80℃保溫60分鐘制備。脂肪酸甲基酯通過溶劑提取分離，干燥并在配置了30m×0.32mm BPX70毛細(xì)管柱，膜厚度0.25μm的Hewlett-Packard 6890氣相色譜儀(Hewlett Packard，Avondale，PA)中通過氣相色譜分離。利用1.0ml/min的氦作為載體氣體，并利用分流/非分流比例為20∶1的分流/非分流注射器。注射器和檢測儀溫度為275℃。樣品注入后，柱型烘箱溫度保持在170℃、12min，并程控為以5℃/min從170增至210℃，然后保持在210℃15min。所述分離用HP GC Chem Station軟件(HewlettPackard，Avondale，PA)記錄。脂肪酸甲基酯通過與以前的標(biāo)準(zhǔn)操作相比較而得以鑒定。
5.統(tǒng)計學(xué)分析除非另有說明，值均表示為均值±SD。魚油補(bǔ)充前，TNF-α和LT-α基因型在TNF-α生成tertile中的分布利用x2檢驗來檢測。魚油補(bǔ)充前后，TNF-α生成值以及血漿磷脂中各種脂肪酸比例的差異利用Students成對t檢驗測定。魚油補(bǔ)充前后，不同基因型TNT-α生成的差異通過單因子ANOVA測定?；蛐汀⒀a(bǔ)充前TNF-α生成的tertile以及它們對于魚油對TNF-α生成影響的相互作用的影響通過雙因子ANOVA測定。在所有的情況中，顯著性水平定為0.05，并利用Bonferonni校正進(jìn)行多重比較。所有統(tǒng)計學(xué)比較利用SPSS Version 10(SPSS Inc，Chicago，IL)進(jìn)行。
結(jié)果1.血漿磷脂脂肪酸組合物所有受試者顯示，補(bǔ)充期末，其血漿磷脂中的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸比例增加，分別平均增加370和94(表5)。魚油來源的n-3PUFA的增加伴隨血漿磷脂中花生四烯酸比例的明顯降低。
表5

*表示與補(bǔ)充前的值有明顯差異(P＜0.01；Student成對t-檢驗)
基因型在研究群體中的分布以及與TNF-α生成的關(guān)系和魚油對TNF-α生成的影響如上所述。
2.TNF-α，LT-α和IL-6基因型對于對魚油的反應(yīng)的影響高TNF-α生產(chǎn)者中魚油的抑制效應(yīng)的出現(xiàn)與TNF-α，LT-α或IL-6基因型無關(guān)(表6)。然而，在魚油補(bǔ)充后TNF-α生成降低程度的測定中，存在TNF-α基因型和固有TNF-α生成之間的明顯相互作用(相互作用的P＝0.035；雙因子ANOVA)。
表6

進(jìn)一步分析顯示，如果補(bǔ)充前TNF-α生成最高tertile中的個體具有TNF1/2基因型，其TNF-α生成的減少明顯高于所述個體具有TNF1/1基因型的情況(P＝0.02)(表6)。在魚油補(bǔ)充后TNF-α生成減少程度的測定中，LT-α基因型和固有TNF-α生成之間的相互作用不能達(dá)到統(tǒng)計學(xué)顯著性(相互作用的P＝0.062；雙因子ANOVA)。魚油能夠抑制固有TNF-α生成的最低和中等tertile中一些個體的細(xì)胞的TNF-α生成。TNFB 1/B2等位基因?qū)τ跍y定這些個體對魚油的敏感性是重要的。因此，對魚油治療表現(xiàn)TNF-α生成降低的固有TNF-α生成最低的tertile中的所有8名個體均具有TNFB 1/B2基因型。在固有TNF-α生成中等的tertile中，16名以此種方式反應(yīng)的受試者中有12名具有TNFB1/B2基因型。在固有TNF-α生成最高的tertile中，TNFB1/B2基因型僅僅為對魚油治療表現(xiàn)TNF-α生成降低的受試者中一半(32名中有16名)的特征。
討論我們的數(shù)據(jù)提示，個體對于n-3PUFA對TNF-α生成的抑制效應(yīng)的敏感性與補(bǔ)充前個體細(xì)胞的細(xì)胞因子固有生成水平以及TNF-α-308，LT-α+252和IL-6-174SNP編碼或相關(guān)的遺傳變異相關(guān)。矛盾的是，魚油促進(jìn)一些受試者中的TNF-α生成，具體是補(bǔ)充前生成的最低tertile中的個體。魚油促進(jìn)而不是降低TNF-α生成的能力是意料之外的。在炎性過程中，磷脂酶A2水解膜磷脂，由此使得花生四烯酸可用于制備促炎性類十二烷酸前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)。體外研究顯示，PGE2和LTB4對促炎細(xì)胞因子生成具有對抗效果，前者具有抑制效果而后者具有刺激效應(yīng)(Endres et al.，N Eng J Med 320265-71(1989)和Choi et al.，Cell Immunol 170178-84(1996))。魚油可改變細(xì)胞膜中的原花生四烯酸。所述效果將降低PGE2和LTB4生成并增加PGE3和LTB5生成。這些類十二烷酸的生物活性低于PGE2和LTB4。因此，對TNF-α生成的總體效應(yīng)(抑制或刺激)有賴于從花生四烯酸以及二十碳五烯酸產(chǎn)生的不同的刺激和抑制性類十二烷酸之間的平衡。
如前所述，遺傳影響在影響TNF-α生成中是重要的。本研究中TNF1，TNF2，TNFB1，TNFB2，IL-6GG和IL-6CC等位基因的頻率與對健康英國人和其它歐洲受試者的研究公開的值接近(Perrey et al.，Transpl Immunol6193-7(1998)，F(xiàn)anning et al.，Tissue Antigens 5023-31(1997)和Brinkman etal.，Br J Rheumatol 36516-21(1997))，并與來自我們實驗室的獨立研究的結(jié)果非常接近(Howell et al.，Eur J Immunogenet 2917-23(2002))。因此本發(fā)明研究的受試者的組代表獲取其的群體，至少對于所檢測的TNF-α，LT-α和IL-6基因型的頻率而言如此。觀察到TNFB2純合性和固有TNF-α生成之間的陽性關(guān)系證實了Stuber et al.，Crit Care Med 24381-4(1996)和Pociot etal.，Eur J Immunol 23224-31(1993)的發(fā)現(xiàn)。然而，我們沒有確定TNF-α-308基因型和TNF-α生成之間的關(guān)系。當(dāng)檢測固有TNF-α生成的三種tertile中個體的遺傳特征與魚油降低固有TNF-α生成的能力的相關(guān)性時，復(fù)雜的相互作用是明顯的。本研究的結(jié)果提示，首先大多數(shù)(在這種情況下86％)具有高TNF-α生成固有水平的個體對魚油的抗炎效果敏感，其次，中等與高固有TNF-α生成與對TFNB2等位基因的純合性相關(guān)，第三，具有中等或低固有TNF-α生成水平的個體很可能經(jīng)歷魚油抗炎效果，條件是所述個體是TNFB等位基因雜合的，第四，具有IL-6-174CC基因型與對魚油抗炎效果的低水平反應(yīng)性(就TNF生成而言)相關(guān)。此外，TNFB2/B2個體經(jīng)歷魚油的抗炎效應(yīng)的可能性較低，與他們的固有TNF-α生成水平無關(guān)。
本研究是科學(xué)文獻(xiàn)中目前報道的關(guān)于飲食魚油補(bǔ)充對人PBMC離體TNF-α生成的影響的最大研究(Calder et al.，Nutr Res 21309-41(2001))。來自本研究的數(shù)據(jù)在被集合而不考慮每個個體的固有離體TNF-α生成，或TNF-α、LT-α或IL-6基因型的情況下，與提示魚油對所述生成不顯示調(diào)節(jié)作用的其它研究一致(Schmidt et al.，Scand J Clin Lab Med 5687-92(1996)；Cooper at al.，Clin Nutr 12321-8(1993)；Blok et al.，Eur J Clin Invest 271003-8(1997)；Molvig et al.，Scand J Immunol 34399-410(1991)和Yaqoob et al.，Eur JClin Nutr 30399-410(2000))。魚油的大的劑量范圍已經(jīng)用于類似的研究中(0.55-6g n-3PUFA/d)。魚油對TNF-α生成的抑制效應(yīng)總體上已經(jīng)在采用高于本研究所用n-3PUFA劑量的研究中得以證實(Endres et al.，N Engl J Med320265-71(1989)；Gallai et al.，J Neuroimmunol 56143-53(1995)和Kelley etal.，Lipids 34317-24(1999))。然而，這并不是普遍的情況，一些研究利用更高劑量，但卻顯示對TNF-α生成沒有影響(Blok et al.，Eur J Clin Invest271003-8(1997)；Molvig et al.，Scand JImmunol 34399-410(1991)和Yaqoobet al.，Eur J Clin Nutr 30399-410(2000))。在5項研究中(Schmidt et al.，Scand JClin Lab Med 5687-92(1996)；Cooper at al.，Clin Nutr 12321-8(1993)；Bloket al.，Eur J Clin Invest 271003-8(1997)；Meydani et al.，J Clin Invest92105-13(1993)和Molvig et al.，Scand J Immunol34399-410(1991))，僅僅Meydani et al的研究證實了魚油對TNF-α生成的抑制效應(yīng)。然而，在后一研究中，魚油被給予食用低脂飲食的受試者。在這一飲食情況下，來自飲食中的n-6PUFA與來自用于摻入細(xì)胞結(jié)構(gòu)的補(bǔ)充物的n-3PUFA之間的競爭將低于本發(fā)明中的情況。
本研究的結(jié)果，以及關(guān)于魚油補(bǔ)充對TNF-α生成的影響的其它研究的結(jié)果，表明n-3PUFA攝入以及細(xì)胞因子生物學(xué)之間的相互作用是復(fù)雜的。當(dāng)所給予的魚油的劑量可決定魚油對TNF-α生成的抑制性作用是否可在全體群體水平顯示時，我們的數(shù)據(jù)提示個體對魚油效應(yīng)的不同敏感性(TNF-α-308，LT-α+252和IL-6-174SNP編碼或相關(guān)的遺傳變異)可限制魚油作為抗炎劑的適宜劑量的有效性。對本發(fā)明提供的魚油的敏感性的決定因素的確切性質(zhì)的理解越多，將使得魚油補(bǔ)充可比本發(fā)明的情況更為精確地用于影響炎癥。
權(quán)利要求
1.評估個體對利用魚油進(jìn)行的炎性疾病療法的敏感性的方法，包括測定該個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因多態(tài)性相關(guān)的基因型；由此判斷所述個體是否對魚油治療有良好反應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括測定所述個體的固有TNF-α狀態(tài)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中測定LT-α+252和IL-6-174等位基因的基因型。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中LT-α基因的基因型是雜合TNFB1/2。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中IL-6基因的基因型是純合GG。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中LT-α和IL-6基因的基因型分別是雜合TNFB1/2和IL-6GG。
7.評估個體對利用魚油進(jìn)行的炎性疾病療法的敏感性的方法，包括a)測定所述個體的固有TNF-α狀態(tài)；和b)測定所述個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因多態(tài)性相關(guān)的基因型；和由此判斷所述個體是否對魚油治療有良好的反應(yīng)。
8.治療患者中的炎性疾病的方法，其包括評估個體對利用魚油進(jìn)行的炎性疾病療法的易感性，所述評估包括a)測定所述個體與TNF-α-308，LT-α+252和/或IL-6-174等位基因多態(tài)性相關(guān)的基因型；和b)由此判斷所述個體是否對魚油治療有良好反應(yīng)；和用適量的魚油治療所述個體。
9.權(quán)利要求8的方法，還包括測定個體的固有TNF-α狀態(tài).
10.權(quán)利要求1-9之一的方法，其中所述炎性疾病選自以下疾病組成的組炎性皮膚病，肛周克隆氏病或關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及評估個體對用飲食補(bǔ)充物的炎性疾病療法的易感性的方法。本發(fā)明描述了以下認(rèn)識個體對于魚油對TNF－α生成的炎癥抑制效應(yīng)的敏感性與遺傳變異以及細(xì)胞的固有TNF－α生成水平相關(guān)，所述遺傳變異由TNF－α，LT－α和/或IL－6單核苷酸多態(tài)性編碼或與其相關(guān)。
文檔編號A61K35/60GK1806054SQ200480016679
公開日2006年7月19日 申請日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月22日
發(fā)明者羅伯特·F·格林布爾, 菲利普·C·考爾德, 威廉·M·豪厄爾 申請人:南安普敦大學(xué)