專利名稱：治療流感病毒感染的方法
相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求于2006年2月23日提交的60/775,869號美國臨時申請以及于2006年2月23日提交的60/776,043號美國臨時申請的權(quán)益，其所公開的內(nèi)容在此全部通過引用并入本申請中。
背景技術(shù)：
流感病毒是多種疾病的主要的感染源，其會導(dǎo)致嚴(yán)重的感冒癥狀并經(jīng)常引起呼吸失調(diào)和/或可致命的肺炎。根據(jù)核蛋白和膜蛋白的血清類型的不同，流感病毒被分成三種類型，即A型、B型以及C型。在這些類型的流感病毒中，每年流行的類型為流感病毒A和流感病毒B。流感病毒A在其包膜的表面上具有兩種糖蛋白，即血細(xì)胞凝集素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，因此基于此根據(jù)蛋白質(zhì)的抗原性(antigenecities)其被分為亞型，例如H1N1、H2N2以及H3N2。流感病毒B和流感病毒C各自只具有一種亞型。
流感病毒A在抗原性方面經(jīng)歷了重大的改變，每年都比其它類型的病毒流行。用于流感病毒A的抗病毒劑是已知的，但是由于其通常不能應(yīng)付病毒的突變，因此其不是令人完全滿意的?？共《緞o力應(yīng)付病毒的突變很可能是由于病毒嚴(yán)重的抗原變異。
所有A型流感病毒，包括那些有規(guī)律地引起人季節(jié)性流行病的病毒，在遺傳上是不穩(wěn)定的并且很好地適于規(guī)避宿主的防御。流感病毒缺乏“校正”和修復(fù)在復(fù)制期間發(fā)生的錯誤的機(jī)制。由于這些未得到糾正的錯誤，當(dāng)其在人體和動物體中復(fù)制時，病毒的基因組成改變，現(xiàn)有的菌株被一種新的抗原變體取代。這些流感病毒A的抗原組成的持續(xù)的、永久的并且通常為小的改變被稱為抗原“漂移”。
流感病毒經(jīng)歷頻繁和永久的抗原改變的趨勢需要持續(xù)地監(jiān)控全球的流感形勢以及每年調(diào)整流感疫苗的組成。
流感病毒具有另外的大眾鍵康考慮的特點。即，流感病毒A，包括源自不同種類的亞型可以置換或重排(reassort)基因物質(zhì)并且融合。該重排過程，被稱為抗原漂移，產(chǎn)生不同于兩種母體病毒的新的亞型。由于人類對新的亞型不具有免疫力，并且沒有現(xiàn)有的疫苗可以給予保護(hù)，抗原漂移已經(jīng)在歷史上導(dǎo)致高度致命的大流行性感冒。為了使其發(fā)生，新的亞型需要具有源自人體流感病毒的可易于在一持續(xù)的期間從一人傳遞至另一人的基因。
通常認(rèn)為出現(xiàn)抗原漂移的有利條件涉及與感染了流感病毒的各種菌株的其它馴化種極為貼近地居住的人類。例如，豬既易于感染禽的病毒也易于感染哺乳動物的病毒，包括人類菌株。因此，其可以作為一種“混合器”用于從人的病毒和禽的病毒奪取(scrambling)基因物質(zhì)，導(dǎo)致出現(xiàn)新的亞型。然而，近來已經(jīng)確認(rèn)了出現(xiàn)抗原漂移的另一種可能的機(jī)制。已經(jīng)表明人類自身可以作為出現(xiàn)新的亞型的一種混合器。
當(dāng)今已知存在十五(15)種禽流感病毒亞型。由于幾種原因，H5N1亞型需要特別地關(guān)注。H5N1突變迅速，并且有文獻(xiàn)表明其具有從感染其它動物種類的病毒獲取基因的傾向。通過香港1997年和2003年的兩次事件(occasions)已經(jīng)證明其引起人類嚴(yán)重疾病的能力。自那時起至2005年12月14日止，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)通過實驗室確診138例人類感染H5N1禽流感。在這138例中，71例已經(jīng)死亡。
此外，實驗研究已經(jīng)表明源自該病毒的分離物具有很高的致病性并且可以引起人類嚴(yán)重的疾病。此外，感染了禽流感H5N1亞型的幸存的鳥類排泄病毒至少十(10)天，從而促進(jìn)了活禽市場以及候鳥中病毒的進(jìn)一步傳播。鳥中感染的傳播增加了人類直接感染的機(jī)會。隨著時間的過去，如果更多的人受到感染，如同時感染人流感菌株和禽流感菌株，那么人類作為出現(xiàn)新的亞型的混合器的可能性增加，其具有足夠的易于從一人傳遞至另一人的人類基因。這將標(biāo)志著流感大流行的開始。在歷史上，當(dāng)新的病毒亞型出現(xiàn)且易于從一人傳遞至另一人時，可以預(yù)期流感大流行平均每個世紀(jì)發(fā)生三至四次。流感大流行的發(fā)生是不可預(yù)測的。大多數(shù)流感專家一致認(rèn)為另一次流感大流行是不可避免的，并且可能即將發(fā)生。
雖然生產(chǎn)流感疫苗的經(jīng)驗是值得考慮的，特別是正如疫苗成分每年改變以適應(yīng)由于抗原漂移而導(dǎo)致的散布的病毒的變化，為了生產(chǎn)任何有意義的量的、可以對抗新的病毒亞型而給予保護(hù)的任何新的疫苗可能至少需要四個月。
因此，用于治療流感病毒感染癥狀的組合物通常對那些受到感染的患者給藥。考慮到新出現(xiàn)的流感病毒菌株的增強(qiáng)的致病性，治療或減輕流感病毒感染癥狀越來越重要。
雖然存在各種治療流感病毒感染癥狀的方法，但是許多方法對于新出現(xiàn)的包括禽的菌株的亞型不總是有效，并且許多引起有害的副作用。因此，在本技術(shù)領(lǐng)域中存在用于治療流感病毒感染的新的以及更有效的方法的需要。本發(fā)明滿足了這種需要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及通過給予兒茶酚丁烷(catecholic butane)或其藥學(xué)上可接受的鹽治療流感病毒感染的方法。雖然希望不受任何特定理論的約束，但是可以認(rèn)為本發(fā)明的方法既可以用于降低宿主中的流感病毒的復(fù)制或生長也可以降低附隨于流感病毒感染的各種疾病或紊亂的出現(xiàn)和/或嚴(yán)重性。
本發(fā)明的一個實施方案包括一種治療受試對象中流感病毒感染的方法。所述方法包括給受試對象施用有效治療量的通式(I)的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；?、或亞烴基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)；條件是當(dāng)R7、R8和R9之一表示氫時，那么-OR1、-OR2與R7、R8和R9中的其它兩者不同時表示-OH。取代的或未取代的氨基酸殘基和其藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選為在其羧基末端與芳環(huán)相連。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種治療受試對象中流感病毒感染的方法。所述方法包括給受試對象給藥治療有效量的通式(II)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R14、R15、R16和R17分別獨立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3，或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R18和R19分別獨立地表示-H或低級烷基；條件是R14、R15、R16和R17不同時為-OH。取代的或未取代的氨基酸殘基和其藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選為在其羧基末端與芳環(huán)相連。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種治療受試對象中流感病毒感染的方法，所述方法包括給受試對象施用有效治療量的通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R20、R21、R22和R23分別獨立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，條件是R20、R21、R22和R23不同時為-OH。取代的或未取代的氨基酸殘基和其藥學(xué)上可接受的鹽優(yōu)選為在其羧基末端與芳環(huán)相連。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種治療受試對象中流感病毒感染的方法。所述方法包括給受試對象給藥治療有效量的下述組合物，所述組合物含有選自由三-O-甲基去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)、四-O-甲基NDGA、四-甘氨酰NDGA、四-二甲基甘氨酰NDGA，或其藥學(xué)上可接受的鹽組成的組的兒茶酚丁烷，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種治療人受試對象中H5N1亞型流感病毒感染的方法。所述方法包括對人受試對象口服給藥通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，使用的量為約10mg/kg至約375mg/kg每劑量
其中R20、R21、R22和R23分別表示-OCH3。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種抑制由于流感病毒感染而誘導(dǎo)細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子的方法。所述方法包括對細(xì)胞給藥有效量的通式I的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；?、亞烴基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種抑制由于流感病毒感染而誘導(dǎo)細(xì)胞中的促炎脂質(zhì)介質(zhì)的方法。所述方法包括對細(xì)胞給藥有效量的通式I的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級酰基、亞烴基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種抑制由于H5N1亞型流感病毒感染而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的瘤腫壞死因子α(TNF-α)的方法。所述方法包括對巨噬細(xì)胞給藥有效量的通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R20、R21、R22和R23分別表示-OCH3。
此外，本發(fā)明的另一實施方案包括一種抑制由于H5N1亞型流感病毒感染而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中的前列腺素E2(PGE2)的方法。所述方法包括給巨噬細(xì)胞給藥有效量的通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R20、R21、R22和R23分別表示-OCH3。
本發(fā)明的另一實施方案包括一種含有通式I的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及通過使用兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽治療受試對象流感病毒感染的說明書的試劑盒。
根據(jù)下面所公開的內(nèi)容，本發(fā)明的其他方面、特征和優(yōu)點將會是顯而易見的，所公開的內(nèi)容包括本發(fā)明的詳細(xì)描述以及其優(yōu)選實施方案和所附權(quán)利要求。
當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時，可以更好地理解上述發(fā)明內(nèi)容以及下述本發(fā)明的詳細(xì)的描述。為了舉例說明本發(fā)明，在附圖中示出了目前優(yōu)選的實施方案。然而，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所示出的精確安排和手段。
在附圖中 圖1為在各種條件下使用RAW 264.7鼠巨噬細(xì)胞由脂多糖(LPS)誘導(dǎo)在不同時間產(chǎn)生TNF-不的圖示。
圖2為在各種條件下在C3HA成纖維細(xì)胞中TNF-胞誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的圖示。
圖3為在各種條件下使用RAW 264.7巨噬細(xì)胞由脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE2的圖示。
圖4為在各種條件下使用RAW 264.7巨噬細(xì)胞由脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE2α的圖示。
圖5為在各種條件下使用RAW 264.7巨噬細(xì)胞由脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE1α的圖示。
圖6A和6B為根據(jù)抗體芯片研究在各種條件下使用RAW 264.7巨噬細(xì)胞由脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子的圖示。
圖7包括EM-1421對MDCK細(xì)胞中的流感病毒A/WS/33的復(fù)制的作用的圖示，其中組A和組B顯示了同樣的數(shù)據(jù)，但是分別具有線性和對數(shù)y軸(linear and log y-axes)。
圖8包括EM-1421對RAW 264.7巨噬細(xì)胞中的流感病毒A/WS/33的復(fù)制的作用的圖示，其中組A和組B顯示了同樣的數(shù)據(jù)，但是分別具有線性和對數(shù)y軸。
圖9包括EM-1421對在病毒感染之前使用EM-1421處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞中的流感病毒A/WS/33的復(fù)制的作用的圖示，其中組A和組B顯示了同樣的數(shù)據(jù)，但是分別具有線性和對數(shù)y軸。
圖10為根據(jù)低感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)由RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞感染病毒時和/或使用EM-1421處理產(chǎn)生的TNF-α的圖示。
圖11為根據(jù)低感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)使用RAW264.7鼠巨噬細(xì)胞對產(chǎn)生TNF-α的劑量反應(yīng)實驗的圖示。
圖12為根據(jù)低感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)使用RAW 264.7鼠巨噬細(xì)胞對產(chǎn)生TNF-α的時程實驗的圖示。
圖13為根據(jù)高感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)由RAW 264.7鼠巨噬細(xì)胞感染病毒時和/或使用EM-1421處理產(chǎn)生的TNF-α的圖示。
圖14為根據(jù)高感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)使用RAW 264.7鼠巨噬細(xì)胞對產(chǎn)生TNF-α的劑量反應(yīng)實驗的圖示。
圖15為根據(jù)高感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)使用RAW 264.7鼠巨噬細(xì)胞對產(chǎn)生TNF-α的時程實驗的圖示。
圖16為根據(jù)低感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)在各種條件下使用RAW264.7巨噬細(xì)胞由病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE2的圖示。
圖17為根據(jù)高感染復(fù)數(shù)(MOI)模型系統(tǒng)在各種條件下使用RAW264.7巨噬細(xì)胞由病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生PGE2的圖示。
圖18為根據(jù)抗體芯片研究在各種條件下使用RAW 264.7巨噬細(xì)胞由病毒感染誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子的圖示。
具體實施例方式 發(fā)明人在本發(fā)明中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)兒茶酚丁烷可用于治療流感病毒感染。所述兒茶酚丁烷具有通式(I)或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；騺啛N基，或-OR1和OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)；條件是當(dāng)R7、R8和R9之一表示氫時，那么-OR1、-OR2與R7、R8和R9中的其它兩者不同時表示-OH。優(yōu)選地，取代的或未取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽在其羧基末端與芳環(huán)相連。此類兒茶酚丁烷可以與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑結(jié)合以生產(chǎn)可以被制成多種釋放途徑的藥物組合物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，兒茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和R2獨立地表示-H、低級烷基、低級酰基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基；R5、R6、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R7、R8和R9獨立地為-H、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；條件是所述兒茶酚丁烷不是NDGA。
在本發(fā)明的又一實施方案中，兒茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和R2獨立地表示-H、低級烷基、低級酰基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基；R5、R6、R7、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R8和R9獨立地為-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；條件是所述兒茶酚丁烷不是NDGA。
在本發(fā)明的還一實施方案中，兒茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和R2獨立地為-CH3或-(C＝O)CH2N(CH3)2或其鹽。
在本發(fā)明的另一實施方案中，兒茶酚丁烷具有通式(I)，其中R8和R9獨立地為-OCH3或-O(C＝O)CH2N(CH3)2或其鹽。
在本發(fā)明的又一實施方案中，兒茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和R2獨立地為-CH3、-(C＝O)CH2N(CH3)2或-(C＝O)CH2N+H(CH3)2·Cl-以及R8和R9獨立地為-OCH3、-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-(C＝O)CH2N+H(CH3)2·Cl-。
在本發(fā)明的還一實施方案中，兒茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和R2獨立地表示-H或-CH3，R8和R9獨立地為-OH或-OCH3，條件是所述兒茶酚丁烷不是NDGA。
在本發(fā)明的一不同的實施方案中，兒茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和R2各自為-CH3，R8和R9各自為-OCH3。
在一可選實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的實施方案的方法中的兒茶酚丁烷為具有下述通式(II)的NDGA衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R14、R15、R16和R17分別獨立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，R18和R19分別獨立地表示-H或諸如低級烷基的烷基，例如-CH3或-CH2CH3；條件是R14、R15、R16和R17不同時為-OH。優(yōu)選地，取代的或未取代的氨基酸殘基和其藥學(xué)上可接受的鹽在其羧基末端與芳環(huán)相連。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)含有至少一種NDGA衍生物的基本上為純制劑的組合物可有效地用于治療流感病毒感染。由于NDGA衍生物最初是用于其它目的給藥，并且治療流感是一種意外的認(rèn)識，該發(fā)現(xiàn)是偶然發(fā)現(xiàn)的并且是出乎意料的。
優(yōu)選地，使用于本發(fā)明的實施方案的NDGA衍生物具有如上所述的通式(II)，其中R14、R15、R16和R17分別獨立地表示-OH、低級烷氧基，例如，-OCH3、低級酰氧基，例如，-O(C＝O)CH3、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，但是不能分別同時為-OH；R18和R19獨立地表示-H或諸如低級烷基的烷基，例如，-CH3或-CH2CH3。在一實施方案中，R18和R19可以都為-H、-CH3或-CH2CH3。優(yōu)選地，當(dāng)R14、R15、R16和R17中的一個或多個表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽時，所述殘基在羧基末端與芳環(huán)相連。
適當(dāng)制劑形式的本發(fā)明的兒茶酚丁烷，需要時與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑一起，可以通過選自包括下述組的一種或多種途徑安全地給藥至一個或多個需要這種治療的受試對象鼻內(nèi)給藥；口服給藥；吸入給藥；皮下給藥；透皮給藥；靜脈給藥；口腔給藥；腹膜內(nèi)給藥；眼內(nèi)給藥；眼周給藥；肌肉內(nèi)給藥；植入給藥；輸注以及中央靜脈給藥。
此外，所述兒茶酚丁烷可以以適當(dāng)?shù)娜芤?、懸浮液、半固體或固體形式，或通過上述一種或多種途徑以脂質(zhì)體制劑、納米顆粒制劑或膠束制劑安全地對一個或多個需要這種治療的患者給藥。
此外，脂質(zhì)體制劑、納米顆粒制劑或膠束制劑的兒茶酚丁烷可以埋入可生物降解的聚合物制劑中并可安全地給藥，例如通過皮下植入。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用于本發(fā)明的給藥途徑不是通過腸胃外給藥，本發(fā)明中的腸胃外給藥指的是靜脈給藥、肌肉內(nèi)給藥、皮下給藥、透皮給藥和腹膜內(nèi)給藥。
本發(fā)明還描述了含有用于治療流感的兒茶酚丁烷的特征的一種藥物組合物，所述組合物被制成如上所述地釋放或給藥，例如，以藥片、膠囊、親水或疏水的液體、諸如由凍干產(chǎn)生的粉末、氣溶膠形式或以含水水溶性組合物、疏水組合物、脂質(zhì)體組合物、諸如基于聚山梨醇酯80或二嵌段共聚物的膠束組合物、納米顆粒組合物、聚合物組合物、環(huán)糊精包合組合物、乳狀液或基于被稱為“脂質(zhì)核(lipocores)”的納米顆粒的脂質(zhì)形式。
此外，本發(fā)明還提供了一種含有用于治療流感的兒茶酚丁烷的藥物組合物，所述組合物被制成用于與藥學(xué)上可接受的載體一起口服或注射釋放，所述載體包括選自由下述物質(zhì)組成的組的增溶劑和賦形劑的至少一種(a)水溶性有機(jī)溶劑；(b)環(huán)糊精(包括改性環(huán)糊精)；(c)離子、非離子或兩性表面活性劑；(d)改性纖維素；(e)不溶于水的脂質(zhì)；以及載體(a)-(e)的任意組合。
根據(jù)本發(fā)明的實施方案，兒茶酚丁烷可以結(jié)合一種或多種其它的藥劑或藥物用藥。其可以與其它藥劑或藥物同時、在其它藥劑或藥物用藥之前或之后用藥。在特定的實施方案中，兒茶酚丁烷可以結(jié)合一種或多種另外的消炎劑用藥。所述另外的消炎劑選自下述組，包括(1)血清素受體拮抗劑；(2)血清素受體激動劑；(3)組胺受體拮抗劑；(4)緩激肽受體拮抗劑；(5)激肽釋放酶抑制劑；(6)速激肽受體拮抗劑，包括神經(jīng)激肽1和神經(jīng)激肽2受體亞型拮抗劑；(7)降血鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)受體拮抗劑；(8)白細(xì)胞介素受體拮抗劑；(9)作用于花生四烯酸代謝物合成通路的酶抑制劑，包括(a)磷脂酶抑制劑，包括PLA2異形體抑制劑和PLC和異形體抑制劑(b)環(huán)氧合酶抑制劑，以及(c)脂氧化酶抑制劑；(10)前列腺素受體拮抗劑，包括類二十烷酸EP-1和EP-4受體亞型拮抗劑和血栓素受體亞型拮抗劑；(11)白三烯受體拮抗劑，包括白三烯B4受體亞型拮抗劑和白三烯D4受體亞型拮抗劑；(12)阿片受體激動劑，包括μ阿片、片阿片和κ阿片受體亞型激動劑；(13)嘌呤受體激動劑和拮抗劑，包括P2X受體拮抗劑和P2Y受體激動劑；(14)三磷酸腺苷(ATP)-敏感性鉀通道開放劑。
在其它實施方案中，兒茶酚丁烷可以結(jié)合一種或多種其它的抗流感藥劑用藥，例如通式I的第二種兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽、金剛烷胺、奧斯米韋、帕拉米韋、金剛乙胺、扎那米韋或阿比多爾。
本發(fā)明還描述了一種制備本發(fā)明的藥物組合物的方法的特征，所述方法包括制備或提供基本上為純化形式的兒茶酚丁烷，將所述成分與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑結(jié)合，以可與希望的給藥方式相符的方式制備組合物。
另外，本發(fā)明還涉及包括用于治療流感的如上所述的組合物或制劑的試劑盒，所述組合物被制成如上所述釋放，包括但不限于鼻內(nèi)給藥、吸入、口服給藥、局部給藥、靜脈給藥、腹膜內(nèi)給藥以及其它腸胃外給藥，可選地，包括用于此類給藥的給藥裝置以及用于此類給藥的使用說明。
定義 除非本申請另有定義，本申請中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員一般地理解的含義相同的含義。根據(jù)下述特定的含義可以更好地理解本發(fā)明。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“活性劑”、“化合物”以及“藥物”指的是一種或多種兒茶酚丁烷，包括NDGA衍生物，以及其藥學(xué)上可接受的鹽的。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“烷撐二氧基”指的是亞甲基(或被取代的亞甲基)二氧基或乙烯基(或被取代的乙烯基)二氧基。
適合用于本發(fā)明的“緩沖劑”包括本技術(shù)領(lǐng)域的任何常規(guī)的緩沖劑，例如Tris、磷酸鹽、咪唑和重碳酸鹽。
本發(fā)明中使用的“載體”指的是一種無毒的固體、半固體或液體填料、稀釋劑、介質(zhì)、賦形劑、增溶劑、膠囊材料或任何常規(guī)類型的制劑助劑，并且包括組合物中活性藥物成分之外的所有組分。所述載體可以含有另外的藥劑，例如潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。需要時，可以加入其它物質(zhì)，例如抗氧化劑、保濕劑、粘度穩(wěn)定劑以及類似的藥劑。
本發(fā)明中使用的“環(huán)糊精”指的是一種未經(jīng)改性的環(huán)糊精或改性的環(huán)糊精，包括但不限于α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精以及含有其改性部分的任何改性環(huán)糊精，例如羥丙基-β-環(huán)糊精(“HP-β-CD”)或磺丁基醚β-環(huán)糊精(“SBE-β-CD”)。環(huán)糊精通常具有6(α-環(huán)糊精)、7(β-環(huán)糊精)和8(γ-環(huán)糊精)糖，每個糖具有最多三個取代基，因此可能具有0-24個一級取代基(一級取代基定義為與環(huán)糊精環(huán)直接相連的取代基)。本發(fā)明中使用的改性的或未經(jīng)改性的環(huán)糊精可以具有任何適當(dāng)數(shù)目和位置的一級取代基或其它改性部分。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“細(xì)胞因子”指的是由各種類型細(xì)胞分泌的許多類激素的、低分子量的任何蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)過程中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時間以及介導(dǎo)細(xì)胞至細(xì)胞的通信。細(xì)胞因子的示例包括趨化因子、白細(xì)胞介素、淋巴因子以及其它信號分子，例如腫瘤壞死因子和干擾素等。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“趨化因子”指的是一組小的、最基本的、結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分子，所述分子通過與一組7-跨膜、G蛋白偶聯(lián)受體相互作用調(diào)節(jié)各種類型白細(xì)胞的細(xì)胞運輸。趨化因子在免疫系統(tǒng)的發(fā)育、動態(tài)平衡以及功能方面也起根本性的作用，并且其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞以及涉及血管生成或血管生長抑制的內(nèi)皮細(xì)胞具有影響。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“白細(xì)胞介素”或“IL”指的是由淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和某些其它細(xì)胞合成的一組多功能的細(xì)胞因子。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“淋巴因子”指的是由活化淋巴細(xì)胞釋放的一組細(xì)胞因子，其介導(dǎo)免疫反應(yīng)。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“干擾素”指的是由通過諸如病毒、細(xì)菌、寄生物以及腫瘤細(xì)胞的外來的藥劑對多種攻擊做出反應(yīng)的脊椎動物細(xì)胞分泌的一組糖蛋白。干擾素促進(jìn)免疫反應(yīng)并賦予對抗外來藥劑的抗性，例如，通過抑制正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞的增殖、阻礙胞內(nèi)寄生物的繁殖、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的噬菌作用、提高自然殺傷細(xì)胞活性以及具有幾種其它免疫調(diào)節(jié)功能。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“腫瘤壞死因子”或“TNF”指的是一種主要地由巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。TNF可以與其受體TNFRSF1 A/TNFR1和TNFRSF 1B/TNFBR結(jié)合并通過該受體起作用。該細(xì)胞因子參與多種生物過程的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡、脂類代謝和凝聚。該細(xì)胞因子涉及多種疾病，包括自身免疫疾病、胰島素抗性以及癌癥。在流感病毒感染時產(chǎn)生的增多的TNF也涉及與病毒感染(參見下文定義)相關(guān)的疾病、失調(diào)或綜合癥的表現(xiàn)。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽”指的是-OR1、-OR2或合適的其它R基團(tuán)之一，用于本發(fā)明的兒茶酚丁烷的配方中的為氨基酸殘基或取代的氨基酸殘基或氨基酸殘基的鹽或取代的氨基酸殘基的鹽，包括但不限于丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、5-羥賴氨酸、4-羥脯氨酸、甲狀腺氨酸、3-甲基組氨酸、ε-N-甲基賴氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、氨基己二酸、γ-羧基谷氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、N-甲基精氨酸、N-乙酰賴氨酸，和N，N-二甲基-取代的氨基酸殘基，或其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“低級烷基”指的是C1-C6烷基，其可以是直鏈或帶支鏈的，并且可選地包括一個或多個不飽和碳-碳鍵。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“低級?；敝傅氖荂1-C6?；?，其可以是直鏈或帶支鏈的，并且可選地包括一個或多個不飽和碳-碳鍵。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“NDGA使指的是去甲二氫愈創(chuàng)木酸。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“NDGA衍生物”指的是分別具有通式(II)的一種或多種化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R14、R15、R16和R17獨立地表示-OH、低級烷氧基、低級酰氧基，或未取代的或取代的氨基酸殘基，或其藥學(xué)上可接受的鹽，但是不能各自同時為-OH；R18和R19獨立地為-H或諸如低級烷基的烷基。例如，所述術(shù)語包括其中R14、R15、R16和R17各自為-OCH3，或各自為-O(C＝O)CH3；以及R18和R19各自為-H或各自為低級烷基的化合物。在本發(fā)明的一實施方案中，R18和R19各自為-CH3或-CH2CH3。
本發(fā)明中使用的“藥學(xué)上可接受的載體”指的是一種無毒的固體、半固體或液體的填料、稀釋劑、膠囊材料或任何常規(guī)類型的制劑助劑?！八帉W(xué)上可接受的載體”在使用的劑量和濃度對受者是無毒的，并且與制劑中的其它成分是可以共存的。例如，優(yōu)選地，用于含有本發(fā)明的兒茶酚丁烷的制劑的載體不含有氧化劑和其它已知的會損害所含兒茶酚丁烷的化合物。合適的載體包括但不限于水、葡萄糖、甘油、鹽水、乙醇、緩沖劑、二甲亞砜、聚氧乙烯蓖麻油(Cremaphor EL)及其組合物。載體可以含有另外的藥劑，例如增溶劑、潤濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。需要時，可以加入其它物質(zhì)，例如抗氧化劑、保濕劑、粘度穩(wěn)定劑以及類似的藥劑。
本發(fā)明中使用的藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與多肽的游離氨基形成)，其與諸如鹽酸或磷酸的無機(jī)酸或諸如醋酸、扁桃酸、草酸和酒石酸的有機(jī)酸一起形成。與游離的羧基形成的鹽也可以由諸如鈉、鉀、銨、鈣或鐵的氫氧化物的無機(jī)堿和諸如異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇和組氨酸的有機(jī)堿獲得。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括載體、佐劑或稀釋劑或其它輔助物質(zhì)，例如那些公眾可容易地獲得的本技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)的物質(zhì)。例如，藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)包括pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、浸透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑等。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“受試對象”、“宿主”以及“患者”是可互換使用的，指的是使用本發(fā)明的組合物治療的動物，包括但不限于類人猿、人、禽、貓、犬、馬、嚙齒類動物、牛、豬、綿羊、山羊、哺乳類農(nóng)場動物、哺乳類運動動物以及哺乳類寵物。
本發(fā)明中使用的涉及兒茶酚丁烷“基本上為純的”化合物指的是基本上不含非本發(fā)明的兒茶酚丁烷的化合物(下文簡稱“非NDGA物質(zhì)”)?；旧喜缓傅氖侵辽?0％，優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％不含非NDGA物質(zhì)。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“治療”、“處理”等指的是獲得希望的藥理和/或生理效果。所述效果就完全地或部分地防止一種狀況或疾病或其癥狀而言可以是預(yù)防性的，和/或就部分地或完全地治療一種狀況或疾病和/或可歸于所述狀況或疾病的副作用而言可以是治療性的。因此，例如“治療”包括哺乳動物，尤其是人的狀況或疾病的任何治療，包括(a)防止受試對象的一種狀況或疾病或其癥狀出現(xiàn)，所述受試對象可能有所述狀況或疾病的傾向但是尚未診斷具有所述狀況或疾??；(b)抑制所述狀況或疾病或其癥狀，例如，阻止其發(fā)展；以及(c)解除、減輕或改善所述狀況或疾病或其癥狀，例如，使所述狀況或疾病或其癥狀消退。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“治療有效量”或“有效量”指的是由研究者、獸醫(yī)、醫(yī)師或其它臨床醫(yī)生探尋的、對受試對象的組織系統(tǒng)或受試對象引起希望的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的活性劑、化合物或藥物的量。希望的反應(yīng)包括阻斷、防止、減輕或緩解存在于被治療的受試對象的病毒感染。在某些實施方案中，希望的反應(yīng)包括治療中的受試對象的流感病毒感染的至少一種或多種癥狀、失調(diào)或疾病的減輕。在其它某些實施方案中，希望的反應(yīng)包括治療中的受試對象的流感病毒的計數(shù)的減少或復(fù)制或生長的抑制。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到用于本發(fā)明的活性劑的“治療有效量”可以隨著多種因素變化，例如特定的受試對象，例如年齡、體重、日常飲食、健康狀況等，所尋求治療或預(yù)防的病毒感染狀況的嚴(yán)重性和并發(fā)癥，活性劑的給藥方式，使用的特定的活性劑等?？梢詧?zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的程序以評估給受試對象以活性劑的給藥效果，從而使本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定給予受試對象的活性劑的有效的量。例如，可以從受試對象在給予活性劑之前或之后測試病毒感染的綜合癥，例如發(fā)燒或炎癥等，或病毒計數(shù)。此外，也可以使用諸如調(diào)查或動物模型的技術(shù)以評價用于治療或預(yù)防病毒感染的活性劑的療效。
當(dāng)提供一數(shù)值范圍時，除非上下文另外清楚地指出，可以理解在所述范圍的上限和下限之間的各個中間值，到下限單位的1/10(to the tenthof the unit of the lower limit)，以及其它任何陳述的或在所述范圍中的中間值都包括在本發(fā)明內(nèi)。除了在所述范圍中明確排除的界限外，這些更小范圍的上限和下限可以獨立地包括在所述更小的范圍中，并且也包括在本發(fā)明內(nèi)。當(dāng)所述范圍包括所述界限的一個或兩個時，排除了那些被包括的界限的任一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明中提及的所有出版物，包括專利、專利申請以及期刊文章，都整體地通過引用的方式并入本發(fā)明中，包括其引用的參考文件也通過引用的方式并入本發(fā)明中。本發(fā)明中所討論的出版物僅提供其在本發(fā)明的申請日之前公開的內(nèi)容。本發(fā)明中沒有內(nèi)容被解釋成根據(jù)在先的發(fā)明承認(rèn)本發(fā)明不具有先于此類出版物的權(quán)利。此外，所提供的出版物的日期可能不同于實際的出版日期，其可能需要被獨立地確認(rèn)。
必須注意，除非上下文另外清楚地指出，本發(fā)明中使用的單數(shù)形式“a”、“an”和the”的詞包含復(fù)數(shù)的指代對象。因此，例如，提及“一種化合物”包括多種此類化合物，提及“所述兒茶酚丁烷”包括指代一種或多種兒茶酚丁烷以及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的衍生物。
在本發(fā)明的下文中描述的實施方案僅以示例的方式給出，無論如何都不應(yīng)解釋成對本發(fā)明的限制。
兒茶酚丁烷的制備 可以通過任何常規(guī)的方法制備本發(fā)明的兒茶酚丁烷。例如，可以如下所述制備此類化合物美國專利5,008,294(Jordan等人，1991年4月16日頒發(fā))；美國專利6,291,524(Huang等人，2001年9月18日頒發(fā))；Hwu等人(Hwu等人，“甲基化甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acids)的抗病毒活性。1.泰特調(diào)節(jié)(Tat-regulated)的HIV反式激活的合成、結(jié)構(gòu)識別和抑制。藥物化學(xué)雜志(J.Med.Chem)4/(16)2994-3000＂(1998))；或McDonald等人，(McDonald，R.W.等人，甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)以及類似物的合成和抗癌活性?！笨拱┧幬镌O(shè)計(Anti-Cancer Drug Des.)，16261-270(2001))。
在本發(fā)明的一個實施方案中，一種兒茶酚丁烷，四-O-甲基NDGA，也稱為內(nèi)消旋-1，4-雙(3，4-二甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷、特萊梅普科爾(terameprocol)、EM-1421或M4N(如下式所示)通過如下方法制備在反應(yīng)燒瓶中制備一種含有NDGA和氫氧化鉀的甲醇溶液。然后添加硫酸二甲酯至反應(yīng)燒瓶，使反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。最后用水將反應(yīng)物急速冷卻，使產(chǎn)物沉淀。通過過濾并在真空爐中干燥分離所述沉淀。然后將化合物溶解在二氯甲烷和甲苯溶液中，隨后通過氧化鋁柱純化。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，在異丙醇中將沉淀物打散并通過過濾分離。在真空爐中干燥濾餅。通過在異丙醇中回流所述濾餅使四-O-甲基NDGA(M4N)結(jié)晶并通過過濾重新分離晶體。
在本發(fā)明的某些實施方案中，本發(fā)明的某些兒茶酚丁烷，例如G4N，也稱為內(nèi)消旋-1，4-雙[3，4-(二甲基氨基乙酰氧基)苯基]-(2R，3S)-二甲基丁烷或四-二甲基甘氨酰NDGA(如下式所示)，或其鹽酸鹽以及具有氨基酸取代基的類似化合物，也可以根據(jù)常規(guī)的方法制備，例如，如美國專利6,417,234所述。
組合物 本發(fā)明還提供了包括藥物組分的組合物，所述組合物包括兒茶酚丁烷和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這些組合物可以包含根據(jù)兒茶酚丁烷的希望的用途選擇的緩沖劑，也可以包含適合用于所希望的用途的其它物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇一種適合用于所希望的用途的合適的緩沖劑，其中多種緩沖劑是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的。在某些情況下，所述組合物可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中多種賦形劑是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的。適合用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的賦形劑在多種出版物中進(jìn)行了描述，包括，例如Gennaro(Gennaro，A.，“雷明頓制藥科學(xué)與實踐(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)”“第19版，利普平科特，威廉&威爾金斯出版社(Lippincott，Williams，& Wilkins)(1995))；Ansel等人(Ansel，H.C.等人，“藥物劑型以及藥物釋放系統(tǒng)(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems eds.)”，第7版，利普平科特，威廉&威爾金斯出版社(Lippincott，Williams，& Wilkins)(1995))；以及Kibbe(Kibbe，A.H.，藥物賦形劑手冊(Handbook ofPharmaceutical Excipients)，第3版。美國制藥協(xié)會(Amer.PharmaceuticalAssoc))。
根據(jù)可能的給藥方式制備本發(fā)明的組合物。因此，如果所述組合物意欲通過鼻內(nèi)或吸入給藥，例如，為此目的，所述組合物可以轉(zhuǎn)換為本技術(shù)領(lǐng)域中通常的粉末或氣溶膠形式。其它制劑，例如用于口服或胃腸道的釋放，也通常在本技術(shù)領(lǐng)域中使用。
用于本發(fā)明給藥的組合物可以形成溶液、懸浮液、藥片、藥丸、膠囊、可持續(xù)釋放的制劑或粉末。
適合用于口服或注射釋放的組合物或制劑另外地包括含有用于治療流感的兒茶酚丁烷的藥物組合物，其中所述組合物與藥學(xué)上可接受的載體一起制成，其中所述載體包括至少一種選自下述組的溶劑和賦形劑，所述組包括(a)水溶性有機(jī)溶劑；(b)環(huán)糊精(包括改性環(huán)糊精)；(c)離子、非離子或兩性表面活性劑；(d)改性纖維素；(e)不溶于水的脂質(zhì)；以及(a)-(e)中任何載體的結(jié)合物。
水溶性有機(jī)溶劑可以優(yōu)選地但并非必然地地為二甲基亞砜。非限制的示例性的水溶性有機(jī)溶劑包括聚乙二醇(“PEG”)，例如，PEG 300、PEG400或PEG 400單月桂酸酯、丙二醇(“PG”)、聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)、乙醇、苯甲醇或二甲基乙酰胺。優(yōu)選地，對于某些實施方案，當(dāng)水溶性有機(jī)溶劑為PG時，PG在不存在白凡士林、黃原膠(也稱為漢生膠和三仙膠)、甘油或甘氨酸的至少一種時存在。當(dāng)水溶性有機(jī)溶劑為PEG時，對于某些實施方案，PEG優(yōu)選為在不存在抗壞血酸或丁基羥基甲苯(“不存在”)時存在，對于某些實施方案，當(dāng)PEG為聚乙二醇400時，優(yōu)選地，聚乙二醇400在不存在聚乙二醇8000時存在。
環(huán)糊精或改性環(huán)糊精可以非限制性地為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、HP-β-CD或SBE-β-CD。
離子、非離子或兩性表面活性劑可以包括，例如非限制性地為諸如聚氧化乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(也稱為聚山梨醇酯)的表面活性劑，其為一種非離子表面活性劑，例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，商業(yè)上可獲得的為
20或
80、D-α生育酚聚二乙烯1000琥珀酸(“TPGS”)、甘油單油酸酯(也稱為甘油基單油酸酯(glyceryl monooleate))，其為一種酯化了的脂肪酸或一種乙撐氧與蓖麻油以摩爾比為35∶1的反應(yīng)產(chǎn)物，商業(yè)上可獲得的為
EL。優(yōu)選地，對于某些實施方案，當(dāng)表面活性劑為非離子表面活性劑時，非離子表面活性劑在不存在黃原膠時存在。
改性環(huán)糊精的非限制性示例包括乙基纖維素(“EC”)、羥丙基甲基纖維素(“HPMC”)、甲基纖維素(“MC”)、或羧甲基纖維素(“CMC”)。在本發(fā)明的一個實施方案中，兒茶酚丁烷可以在改性纖維素中溶解，改性纖維素在使用前可以在乙醇(“EtOH”)中稀釋。
不溶于水的脂質(zhì)包括，例如，油或油類，例如蓖麻油、芝麻油或薄荷油，蠟或蠟類，例如蜂蠟或棕櫚蠟(carnuba wax)，以及混合的脂肪乳化劑組合物，例如
(Pharmacia & Upjohn公司，現(xiàn)為Pfizer公司)，根據(jù)制造者的推薦使用。例如，推薦的成人劑量為不超過2g脂肪/kg體重/天(10％、20％以及30％的
分別為20mL/kg、10mL/kg以及6.7mL/kg)。認(rèn)為10％的
1,000mL含有純豆油100g、純卵磷脂12g、無水甘油22g、用于注射的水補(bǔ)足至1,000mL。使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至約8。
20％1,000mL含有純豆油200g、純卵磷脂12g、無水甘油22g、用于注射的水補(bǔ)足至1,000mL。使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至約8。
30％1,000mL含有純豆油300g、純卵磷脂12g、無水甘油16.7g、用于注射的水補(bǔ)足至1,000mL。使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至約7.5。這些
產(chǎn)品被貯存在低于25℃的控制的室溫，并不應(yīng)冷凍。對于某些注射制劑的實施方案，油為一種非蓖麻油的油，對于某些口服制劑的實施方案，蓖麻油在不存在蜂蠟或棕櫚蠟時存在。
在本發(fā)明的一個實施方案中，兒茶酚丁烷在不同的載體中溶解或在不同的載體中溶解并且稀釋以形成一種用于動物，包括人口服的液體組合物。例如，在該實施方案的一個方面，兒茶酚丁烷溶解在水溶性有機(jī)溶劑中，例如PEG 300、PEG 400或PEG 400月桂酸酯(“PEG化合物”)或溶解在PG中。在另一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解在改性環(huán)糊精中，例如HP-β-CD或SBE-β-CD。在另一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解和/或稀釋在一種含有PEG化合物和HP-β-CD的組合制劑中。在又一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解在諸如HPMC、CMC或EC的改性纖維素中。在還一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解在另一種既含有改性環(huán)糊精也含有改性纖維素的組合制劑中，例如，HP-β-CD和HPMC或HP-β-CD和CMC。
在本發(fā)明的還一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解在離子、非離子或兩性表面活性劑中，例如
20、
80、TPGS或酯化脂肪酸。例如，本發(fā)明的化合物可以僅溶解在TPGS或
20中，或溶解在諸如TPGS和PEG 400或
20和PEG 400的組合物中。
在另一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解在不溶于水的脂質(zhì)中，例如蠟、脂肪乳化劑，例如
或油。例如，本發(fā)明的化合物可以僅溶解在薄荷油中，或溶解在薄荷油與
和PEG 400的組合物中，或薄荷油與PEG 400的組合物中，或薄荷油與
的組合物中，或薄荷油與蓖麻油的組合物中。
當(dāng)然，EC可以取代或加入以替換上述示例中的HPMC或CMC；PEG300或PEG 400單月桂酸酯可以取代或加入以替換上述示例中的PEG400；
80可以取代或加入以替換上述示例中的
20，諸如玉米油、橄欖油、豆油、礦物油或甘油的其它油可以取代或加入以替換上述示例中的薄荷油或蓖麻油。
此外，可以進(jìn)行加熱，例如，在制備任何這些組合物的過程中加熱至約30℃到約90℃的溫度以使本發(fā)明的化合物溶解或獲得本發(fā)明化合物的均勻地分散的懸浮液。
在另一實施方案中，兒茶酚丁烷可以不伴隨任何載體或與載體一起使用以固體形式口服。在一實施方案中，本發(fā)明的化合物首先溶解在一種如上述示例的液體載體中，隨后制成一種作為口服組合物給藥的固體組合物。例如，本發(fā)明的化合物溶解在諸如HP-β-CD的改性環(huán)糊精中，凍干所述組合物以生產(chǎn)一種適合口服的粉末。
在又一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解或懸浮在TPGS溶液中，適當(dāng)?shù)丶訜嵋垣@得均勻分散的溶液或懸浮液。
當(dāng)冷卻時，所述組合物變得似奶油，適合口服。在另一實施方案中，本發(fā)明的化合物溶解在油中，加入蜂蠟以制備蠟狀固體組合物。
一般而言，在制備口服制劑的過程中，在加入其它賦形劑之前，首先溶解本發(fā)明的化合物以生產(chǎn)更高穩(wěn)定性的組合物。不穩(wěn)定的制劑是不希望的。不穩(wěn)定的液體制劑通常形成晶狀沉淀或兩相溶液。不穩(wěn)定的固體制劑通常顯現(xiàn)為粒狀或塊狀，有時含有流動的液體。最佳的固體制劑顯現(xiàn)為光滑的、均勻的，并且具有小的熔化溫度范圍。一般而言，制劑中的賦形劑的比例可以影響穩(wěn)定性。例如，太少的硬化劑，例如蜂蠟對于精致的口服制劑過于松軟(runny)。
因此，一般而言，對于本發(fā)明的液體制劑而言，使用的賦形劑應(yīng)該是本發(fā)明的兒茶酚丁烷化合物的好的溶劑，例如M4N。換而言之，賦形劑應(yīng)該未經(jīng)加熱就能溶解兒茶酚丁烷。賦形劑也應(yīng)與兒茶酚丁烷彼此互相獨立地共存以便其可以形成一種穩(wěn)定的溶液、懸浮液或乳化液。此外，一般而言，就本發(fā)明的固體制劑而言，使用的賦形劑應(yīng)該是兒茶酚丁烷的好的溶劑以避免結(jié)塊和不均勻的制劑。為了避免不希望的固體制劑質(zhì)地太松軟或不均勻，賦形劑應(yīng)該彼此可以共存以使其即使在不存在兒茶酚丁烷時也可以形成光滑的均勻固體。
治療方法 發(fā)現(xiàn)兒茶酚丁烷以及本主題發(fā)明的組合物在希望為受到流感病毒感染的患者提供治療時可以用作治療劑。
當(dāng)關(guān)注從鳥至廣義的哺乳動物尤其是人的跨物種感染時，根據(jù)本發(fā)明的主題方法，可治療多種動物宿主，包括人類和非人類動物，例如在禽流感時的鳥。當(dāng)這些術(shù)語被廣泛地使用以描述包括食肉目動物(例如狗和貓)、嚙齒目動物(例如豚鼠和兔)以及包括牛、山羊、馬、綿羊、兔、豬和靈長類動物(例如人、黑猩猩和猴)的其它動物的哺乳類有機(jī)體時，通常此類宿主為“哺乳動物”或“哺乳類動物(mammalian)”。在許多實施方案中，宿主為人。動物模型對于實驗研究具有影響，例如提供用于治療人類疾病的模型。此外，本發(fā)明也適用于動物治療。
給藥的制劑、劑量和途徑 如上所述，有效量的活性劑被給予宿主或受試對象。通常，本發(fā)明的組合物可以含有低于約1％至約99％的活性劑，即本發(fā)明的兒茶酚丁烷；可選地，本發(fā)明可以含有約5％至約90％的活性劑。此外，本發(fā)明還提供組合物，在所述組合物中，諸如含有NDGA衍生物，例如M4N的兒茶酚丁烷的活性劑以根據(jù)動物，例如人的體重以約低于0.1mg/kg至約400mg/kg或更高的口服劑量給予受試對象，例如人。更具體而言，僅作為非限制性的示例，可以使用從約0.01至約400mg/kg體重的范圍的劑量通過任何合適的給藥途徑治療受試對象，例如低于約0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg或400mg/kg或更高。
給藥的合適的劑量取決于待治療的受試對象，例如受試對象的總體鍵康狀況、受試對象的年齡、疾病或狀況的狀態(tài)、受試對象的體重。一般而言，約0.1mg至約500mg可以給予兒童，約0.1mg至約5g可以給予成人。所述活性劑可以單一劑量或更通常地以多種劑量給藥。對于給定的藥劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地通過多種方式確定優(yōu)選的劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)的試驗建立劑量反應(yīng)曲線可以容易地確定其它有效的劑量。當(dāng)然，藥劑的量將根據(jù)使用的具體藥劑而變化。
如同劑量一樣，護(hù)理者將根據(jù)年齡、體重、疾病狀況、鍵康狀況以及患者反應(yīng)確定活性劑的給藥頻率。因此，只要如常規(guī)地確定的需要，所述藥劑可以連續(xù)地、間歇地、每日一次或多次或在其它合適的期間給藥。
本發(fā)明的兒茶酚丁烷或活性劑可以被結(jié)合至多種制劑中以用于治療給藥。更具體而言，本發(fā)明的兒茶酚丁烷可以通過結(jié)合適當(dāng)?shù)?、藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑制成藥物組合物，并且可以制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊、粉末、氣溶膠、脂質(zhì)體、納米顆粒、微粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑以及氣溶膠。
同樣地，可以通過多種方式實現(xiàn)活性劑的給藥，例如口服、口腔給藥、直腸給藥、鼻內(nèi)給藥、靜脈給藥、皮下給藥、肌肉內(nèi)給藥、氣管內(nèi)給藥、局部給藥、間質(zhì)給藥、透皮給藥等，或通過吸入或植入。尤其是，納米顆粒、膠囊和脂質(zhì)制劑可以系統(tǒng)地給藥，包括非口服和經(jīng)鼻內(nèi)，以及經(jīng)間質(zhì)、口服、局部給藥、透皮給藥，通過吸入或植入，例如用于藥物靶向、增強(qiáng)藥物生物利用度以及保護(hù)藥物的生物活性和穩(wěn)定性。本發(fā)明的結(jié)合了納米顆粒的藥物可以預(yù)期會獲得延長的體內(nèi)藥物保留時間。
在藥物劑型方面，活性劑可以其藥學(xué)上可接受的鹽形式給藥，或其也可以單獨地或適當(dāng)?shù)芈?lián)合，以及與其它藥物活性化合物結(jié)合使用。下述方法和賦形劑只是示例性的，絕不具有限制性。
對于口服制劑，活性劑可以單獨或與適當(dāng)?shù)奶砑觿┙Y(jié)合以溶液或懸浮液形式作為液體使用，或以片劑、粉末、微?；蚰z囊的形式作為固體使用，例如，與常規(guī)的添加劑一起使用，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；與粘合劑一起使用，例如晶狀纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；與崩解劑一起，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑一起，例如滑石粉或硬脂酸鎂；并且如果需要，與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和調(diào)味劑一起使用。
藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如介質(zhì)、佐劑、載體或稀釋劑是本技術(shù)領(lǐng)域中通用的。合適的賦形劑介質(zhì)為，例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及其組合物。此外，如果需要，所述介質(zhì)可以包括微量的輔助物質(zhì)，例如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑或乳化劑。制備此類劑型的實際方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的或?qū)⑹秋@而易見的。例如，參見雷明頓藥物科學(xué)，麥克出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania)，第17版，1985。在任何情況下，給藥的組合物或制劑都將含有足夠量的藥劑以在接受治療的受試對象中獲得希望的狀態(tài)。
所述活性劑可以通過在水溶液中或非水溶劑例如在植物油或其它類似的油中，包括玉米油、蓖麻油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇中將其溶解、懸浮或乳化制成注射液；如果需要，與常規(guī)的添加劑一起使用，例如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。用于胃腸道遞送根據(jù)本發(fā)明的兒茶酚丁烷的合適的治療制劑還包括下述文獻(xiàn)中公開的各種可注射的載體/賦形劑制劑2005年1月27日提交的美國臨時專利申請，以及2006年1月27日提交的國際申請PCT/US2006/000287，其名稱為“用于將含有NDGA化合物的兒茶酚丁烷注射入動物中的制劑”，國際公布號為WO2006/081364A2，公布日期為2006年8月3日，其全部內(nèi)容通過引用并入本發(fā)明中。
活性劑可以以氣溶膠形式使用通過吸入給藥。本發(fā)明的化合物可以被制入加壓的可接受的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
此外，所述活性劑可以與諸如乳化堿或水溶性堿的多種堿混合制成栓劑。本發(fā)明的化合物可以通過栓劑經(jīng)由直腸給藥。所述栓劑可以包括介質(zhì)，例如可可脂、卡波蠟(carbowaxes)以及聚乙二醇，所述栓劑可以在體溫時熔化，而在室溫時固化。
可以提供用于口服或直腸給藥的單位劑型，例如糖漿劑、酏劑以及懸浮液，其中各劑量單位，例如一茶匙的量、一大湯匙的量、藥片或栓劑包括含有一種或多種活性劑的預(yù)定量的組合物。類似地，用于注射或靜脈給藥的單位劑型可以包括作為無菌水溶液的組合物中的活性劑、生理鹽水或其它藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明中使用的術(shù)語“單位劑型”指的是適合作為單一劑量用于人和動物的受試對象的物理性的離散單元(physically discrete units)，各單元含有預(yù)定量的本發(fā)明的化合物，所計算的量足以與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或介質(zhì)一起產(chǎn)生希望的效果。用于本發(fā)明的新的單位劑型的規(guī)格取決于使用的特定化合物和欲獲得的效果，以及與宿主中的各化合物相關(guān)的藥效學(xué)。
本發(fā)明包括具有多倍或單位劑量的活性劑的試劑盒。在此類試劑盒中，除了裝有多倍或單位劑量的含有NDGA衍生物的組合物的容器外，其可以是一種帶有用法說明的信息性的藥品說明書，所述說明書描述了藥物在治療有關(guān)病理狀況方面的使用以及伴隨的益處，在本發(fā)明中，病理狀況為流感，并且尤其為流感H5N1亞型。
納米顆粒(“NP”)的制備 本發(fā)明包括兒茶酚丁烷NP制劑的制備。適合用于本發(fā)明的許多不同的NP制劑可以根據(jù)釋放方法制備。通過控制分子量、共聚物比率、載藥量、微粒粒徑以及孔隙率和制作條件，NP制劑根據(jù)希望的藥物釋放曲線可以不同。NP制劑也可以根據(jù)使用在生產(chǎn)工藝中的聚合物、穩(wěn)定劑和表面活性劑而不同。不同的賦形劑對藥物攝取、藥物在體內(nèi)的分布以及藥物在血漿中的持久性也具有不同的效果。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定希望的特性或特征，因此確定使用的合適的NP制劑。
NP的聚合物基質(zhì)必須滿足生物相容性、生物利用度、機(jī)械強(qiáng)度和容易處理的標(biāo)準(zhǔn)。用于此目的的最有名的聚合物為可生物降解的聚(丙交酯-乙交酯)共聚物(“PLGAs”)。
本發(fā)明中的NP可以通過本技術(shù)領(lǐng)域的任何常規(guī)的方法制備。在一實施方案中，例如，可以如下述文獻(xiàn)所述制備Lockman等人(Lockman，P.R.等人，用于通過血腦屏障釋放藥物的納米技術(shù)”藥物開發(fā)制藥學(xué)工業(yè)(DrugDevelopment Indus.Pharmacy)，28(1):1-13，(2002))。此種類型的制造工藝包括，例如乳液聚合、界面聚合、脫溶劑化蒸發(fā)以及溶劑沉積。
在本發(fā)明的制備NP的乳液聚合過程中，所述聚合過程包括從單一的單體單元構(gòu)造一條聚合物鏈，例如，如下述文獻(xiàn)所述Kreuter(Kreuter，J.，納米顆?！保扑幖夹g(shù)百科全書(Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology)，Swarbick，J.；Boylan，J.C.Eds.；馬賽爾德克公司(MarcelDekker)(紐約，1994)，165-190頁，(1994))。在由自由基或離子形成物觸發(fā)后，例如通過使用高能射線、紫外線或氫氧根離子，聚合在室溫會自動地發(fā)生。一旦聚合完成，過濾并中和溶液。聚合物形成包括從約100至107個聚合物分子的膠束和液滴。在該過程中通常不需要表面活性劑和穩(wěn)定劑。此外，該過程可以在有機(jī)相而非水相中完成。
本發(fā)明的NP也可以通過界面聚合過程制備，例如，如下述文獻(xiàn)所述Khouri(Khouri，A.I.等人，用于制造聚異丁基氰丙烯酸酯納米顆粒的新工藝的開發(fā)”，國際藥物雜志(Int.J.Pharm.)，28125(1986))。在該過程中，當(dāng)水相和有機(jī)相通過在大力矩的機(jī)械攪拌下均質(zhì)、乳化或微流化而融合在一起時，單體被用于產(chǎn)生聚合物并發(fā)生聚合。例如，通過將親脂性的兒茶酚丁烷與單體在有機(jī)相中混合、在油中溶解混合物并將混合物通過一小管緩慢地在不斷攪拌時加入水相而制備含有兒茶酚丁烷的聚氰基丙烯酸納米顆粒。然后通過陰離子聚合可以自動地形成200-300nm的膠囊。該過程的變化包括將苯甲酸芐酯、丙酮以及磷脂加入含有單體和藥物的有機(jī)相中，例如，如下述文獻(xiàn)所述Fessi等人(Fessi，H.等人，“在溶劑置換后通過界面沉積制備納米膠囊”國際藥物雜志(Int.J.Pharm.)，55R1-R4，(1989))。這產(chǎn)生一種制劑，在該制劑中所述藥物通過裝入膠囊而保護(hù)其到達(dá)靶組織前不降解。
諸如白蛋白和明膠的大分子可以在制備NPs時油變性和去溶劑化的過程中使用。在油乳化變性過程中，可以通過均質(zhì)化使大分子截留在有機(jī)相中。一旦被截留，所述大分子通過持續(xù)地攪拌而緩慢地被誘導(dǎo)至水相中。然后，可以通過交聯(lián)，例如與乙醛或通過熱變性使通過引入兩種不混溶相形成的納米顆粒硬化。
可選地，大分子可以通過“解溶劑化”形成NPs。在解溶劑化過程中，大分子溶解在一種溶劑中，所述大分子以膨脹的、卷曲的構(gòu)造存在于溶劑中。然后，通過改變環(huán)境，例如pH、電荷或使用諸如乙醇的去溶劑使膨脹的大分子被誘導(dǎo)以緊密地卷曲。然后，所述大分子可以通過與乙醛交聯(lián)而固定與硬化。在交聯(lián)前，NDGA化合物可以被吸附或束縛至大分子，從而衍生物被陷入新形成的微粒中。
通過高壓均質(zhì)可以處理固體脂質(zhì)NP。固體脂質(zhì)NP具有可以被滅菌以及被蒸壓的優(yōu)點并且其具有提供控制釋放的固體基質(zhì)。
本發(fā)明還包括具有不同載藥方法的NP。NP可以為藥物在其中分散均勻的固體膠狀NP。NP可以為固體的NP，藥物與NP的外部相連，例如通過吸附。NP可以為使藥物陷入其中的納米膠囊。NP還可以為固體膠狀NP，在其中具有分散均勻的藥物以及用于靶向給藥至適當(dāng)組織的細(xì)胞表面配體。
NP的大小可以與用于給定釋放模式的療效相關(guān)。NP通常為約10nm至約1000nm；可選地，NP可以為約30nm至約800nm；更進(jìn)一步地通常為約60nm至約270nm；甚至更進(jìn)一步地為約80nm至約260nm；或約90nm至約230nm，或約100nm至約195nm。幾種因素影響NP的大小，所有因素都可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員調(diào)整，例如，在聚合過程中使用的溶液的pH，起始觸發(fā)的量(例如加熱或輻射等)以及單體單元的濃度。通過使用光散射由光子相關(guān)光譜可以進(jìn)行NP的大小測量。
可選地，本發(fā)明中的NP，例如多糖NP或清蛋白NP可以涂覆一層脂質(zhì)涂層。例如，多糖NP可以與磷酸鹽(陰離子的)和季銨鹽(陽離子的)配體交聯(lián)，有或沒有脂質(zhì)雙分子層，例如一種含有二棕櫚酰磷脂酰膽堿和膽固醇涂層的脂質(zhì)雙分子層。其它聚合物/穩(wěn)定劑包括但不限于豆油；麥芽糊精；聚丁基氰丙烯酸酯；丁基氰丙烯酸酯/右旋糖苷70kDa，聚山梨醇酯-85；聚丁基氰丙烯酸酯/右旋糖苷70kDa，聚山梨醇酯-85；硬脂酸；聚甲基丙烯酸甲酯。
例如通過吸附至NP使含有兒茶酚丁烷的NP制劑可以靜脈給藥用于治療流感。為了避免這些NP制劑不希望地被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的細(xì)胞攝入，NP可以涂覆有表面活性劑或使用磁反應(yīng)物質(zhì)制備。
因此，可選地，表面活性劑可以與NP結(jié)合使用。例如，聚丁基氰丙烯酸酯NP可以與右旋糖苷-70,000穩(wěn)定劑以及作為表面活性劑的聚山梨醇酯-80一起使用。其它表面活性劑包括但不限于聚山梨醇酯-20、40或60；泊洛沙姆(Poloxamer)188；脂質(zhì)涂層-二棕櫚酰磷脂酰膽堿；Epikuron 200；泊洛沙姆(Poloxamer)338；Polaxamine 908；Polaxamer 407。例如，Polyaxamine 908可以作為一種表面活性劑使用以減少肝臟、脾、肺以及骨髓中的RES對NP的攝入。
所述磁反應(yīng)物質(zhì)可以為磁鐵(Fe3O4)，其可以被結(jié)合至用于制備NP的組合物中。這些磁反應(yīng)NP可以由磁體在外部引導(dǎo)。
在另一實施方案中，可以如Mu和Feng所描述的使用聚丙交酯-乙交酯共聚物(“PLGAs”)和d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽(維生素ETPGS或TPGS)的混合物制備本發(fā)明的NP(Mu，L和Feng，S.S.，“一種用于抗癌藥物紫杉醇(
)藥物的新的控制釋放劑含有維生素E TPGS的PLGA納米顆粒?！笨刂漆尫烹s志(J.Control.Rel.)8633-48(2003))。后者除了作為基質(zhì)材料外，還可以用作乳化劑。
膠囊形成載體的制備 本發(fā)明包括在膠束載體中形成的兒茶酚丁烷，其中所述膠束由本技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方法制備。此類制備方法的示例如下述文獻(xiàn)中所描述的例如Liggins(Liggins，R.T.和Burt，H.M.，g“用于制備紫杉醇聚合物膠束給藥系統(tǒng)的聚醚-聚酯二嵌段共聚物?！彼幬镝尫叛芯窟M(jìn)展(Adv.Drug Del.Rev.54191-202，(2002))；Zhang等人(Zhang等人，“作為紫杉醇的膠束載體的兩親性二嵌段共聚物的進(jìn)展?！眹H藥物雜志(Int.J.Pharm.)132195-206，(1996))；以及Churchill(Churchill，J.R.以及Hutchinson，F(xiàn).G.，“生物可降解兩親性共聚物?！泵绹鴮＠?,745,160，(1988))。在一此類方法中，聚醚-聚酯嵌段共聚物為具有親水(聚醚)部分和疏水部分(聚酯)的兩親性共聚物，其用作形成膠束的載體。
另一種類型的膠束為，例如由既具有親水部分也具有疏水部分的AB-型嵌段共聚物形成，由于其兩親性特性，在水介質(zhì)中形成膠束結(jié)構(gòu)是已知的，例如如下述文獻(xiàn)描述的Tuzar(Tuzar，Z.和Kratochvil，P.，“溶液中的嵌段和接枝共聚物膠束?！?，膠體表面科學(xué)進(jìn)展(Adv.Colloid InterfaceSci.)5201-232.(1976))；以及Wilhelm等人(Wilhelm，M.等人，“水中的聚(苯乙烯-乙撐氧)嵌段共聚物膠束形成熒光探針研究。”，高分子241033-1040(1991))。不考慮高含量的疏水藥物被結(jié)合至膠束內(nèi)核內(nèi)，這些聚合物膠束可以保持令人滿意的水穩(wěn)定性。這些在大小上約<200nm的范圍的膠束可有效地降低非選擇性RES凈化并顯示出增強(qiáng)的滲透性和保持力。
此外，例如，可以使用MePEG 1900和5000制備聚(D，L-丙交酯)-6-甲氧基聚乙二醇(MePEG:PDLLA)二嵌段共聚物。使用辛酸亞錫(0.25％)作為催化劑，反應(yīng)在160℃可以允許進(jìn)行3小時。然而，如果反應(yīng)允許進(jìn)行約6小時，可以使用低如130℃的溫度，或如果反應(yīng)僅允許進(jìn)行約2小時，可以使用高如190℃的溫度。
在一實施方案中，使用Kohori，F(xiàn).等人(1998)的方法(Kohori，F(xiàn).等人，“含有聚(N-異丙基丙烯酰胺-b-D，L-丙交酯)的熱敏性嵌段共聚物膠束的制備和特性?！?，控制釋放雜志(J.Control.Rel.)5587-98，(1998))通過自由基聚合過程，可以使用N-異丙基丙烯酰胺(“IPAAm”)(興人(Kohjin)，東京，日本)和二甲基丙烯酰胺(“DMAAm”)(和光純化學(xué)品公司(Wako PureChemicals)，東京，日本)制備端羥基聚(IPAAm-DMAAm)共聚物。制得的共聚物可以溶解在冷水中，通過兩種超濾膜過濾，分離(cut-off)分子量為10,000和20,000的共聚物。聚合物溶液首先通過分子量為20,000的分離膜過濾。然后，再通過分子量為10,000的分離膜過濾濾液。結(jié)果可獲得三種分子量的餾分，低分子量餾分、中分子量餾分以及高分子量餾分。然后由中分子量餾分的聚IPAAm-co-DMAAm共聚物的端羥基通過D，L-丙交酯的開環(huán)聚合可以合成嵌段共聚物。制得的聚IPAAm-co-DMAAm-b-聚(D，L-丙交酯)共聚物可以如Kohori，F(xiàn).等人(1999)所描述的方法(Kohori，F(xiàn).等人，“使用由聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-N，N-二甲基丙烯酰胺)-b-聚(D，L-丙交酯)組成的熱敏性聚合物膠束控制阿霉素細(xì)胞毒活性?！保z體表面化學(xué)生物界面(Colloids Surfaces BBiointerfaces)16195-205，(1999))制備。
兒茶酚丁烷可以被裝載于膠束的內(nèi)核中，并且通過透析法同時制備膠束。例如，兒茶酚丁烷的鹽酸鹽可以溶解在N，N-二甲基乙酰胺(“DMAC”)中并添加三乙胺(“TEA”)。聚(IPAAm-co-DMAAm)-b-聚(D，L-丙交酯)嵌段共聚物可以溶解在DMAC中，并可添加蒸餾水。兒茶酚丁烷的溶液和嵌段共聚物溶液可以在室溫混合，然后使用分離分子量為12,000-14,000的透析膜(
2的光譜醫(yī)療工業(yè)公司(spectrumMedical Indus.)，加利福尼亞，美國)在25℃通過蒸餾水透析。見上文，如Kohori，F(xiàn).等人(1999)所描述的，可以通過使用20nm孔徑的微濾膜(ANODISCTM沃華國際(Whatman International))過濾純化結(jié)合了兒茶酚丁烷的聚(IPAAm-co-DMAAm)共聚物-b-聚(D，L-丙交酯)膠束。
含有兒茶酚丁烷的多囊脂質(zhì)體的制備 可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中的任何常規(guī)方法制備多囊脂質(zhì)體(“MVL”)，例如如Mantriprgada描述的復(fù)乳化法(Mantriprgada，S.，“制用于緩釋給藥的脂質(zhì)體(
技術(shù))?！敝|(zhì)體研究進(jìn)展(Prog Lipid Res.)41392-406，(2002))。簡而言之，在復(fù)乳化法中，首先通過溶解兩親性脂質(zhì)體制備“油包水”乳化液，例如含有至少一種中性脂質(zhì)體的磷脂，例如一種或多種揮發(fā)有機(jī)溶劑中的甘油三酸酯，將第一種不混溶的水溶液成分以及疏水兒茶酚丁烷，例如疏水兒茶酚丁烷加入該脂質(zhì)體成分。然后乳化混合物以形成油包水的乳化液，然后與第二種不混溶的水溶液成分混合，然后通過機(jī)械混合以形成懸浮在第二種水溶液成分中的溶劑球粒。所述溶劑球粒將包含在其中溶解了兒茶酚丁烷的多種液滴。然后從球粒除去有機(jī)溶劑，通常通過蒸發(fā)，通過減壓或在懸浮液上方或其中通入氣流。當(dāng)溶劑被完全除去后，球粒變成MVL，例如DepoFoam微粒。當(dāng)該方法中不包括中性脂質(zhì)體時，將形成通常的多層囊泡或單層囊泡而非MVL。
用于口服給藥的兒茶酚丁烷制劑 一些兒茶酚丁烷為水溶性、親水性化合物，例如G4N。本發(fā)明包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中的親水化合物的制劑以及諸如口服制劑的給藥方式，例如化合物的水溶液形式，或者化合物可以被凍干而作為粉末給藥，或者制成藥片，或者將化合物裝入膠囊。
本發(fā)明中的化合物可以為腸衣片。本發(fā)明中的制劑可以被緩釋和/或控制釋放，包括減速釋放或加速釋放。
可以根據(jù)給受試對象給藥的希望的劑量調(diào)整包括在口服制劑中的兒茶酚丁烷的量。此種調(diào)整在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)水平內(nèi)。
一些兒茶酚丁烷是疏水的或親水的化合物，例如M4N。通過使用可以促進(jìn)化合物在腸道水溶液流體中的溶解速度或范圍的藥學(xué)上可接受的載體可以促進(jìn)腸內(nèi)親脂性化合物的吸收。脂質(zhì)載體在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，例如，如Stuchlik所描述的(Stuchlik，M.和Zak，S.，k“用于口服給藥的脂質(zhì)介質(zhì)。”，生物醫(yī)學(xué)論文(Biomed.Papers)145(2)17-26，(2001))。本發(fā)明的制劑可以作為口服液體給藥或可以裝入各種類型的膠囊中。
在一實施方案中，本發(fā)明包括一種含有親脂性的兒茶酚丁烷的制劑，通過將此類化合物溶解在三?；视椭兴鰞翰璺佣⊥楸恢瞥煽诜o藥，然后所述制劑被裝入膠囊以供口服。三酰基甘油為帶有與甘油分子相連的長鏈和/或中鏈脂肪酸分子。長鏈脂肪酸的范圍為從約C14至C24，可以在普通的脂肪中發(fā)現(xiàn)。中鏈脂肪酸的范圍為從約C6至C12，可以在椰子油或棕櫚仁油中發(fā)現(xiàn)。適合用于本發(fā)明的三酰基甘油包括結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，所述結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含有短鏈脂肪酸或中鏈脂肪酸或兩者都含有的混合物，所述短鏈脂肪酸或中鏈脂肪酸在相同的甘油分子上酯化。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以將一種或多種表面活性劑加入到兒茶酚丁烷和脂質(zhì)載體的混合物中，以使藥物以油/表面活性劑混合物精細(xì)液滴存在。表面活性劑可以促進(jìn)油性制劑分散稀釋于胃腸道液體中。
本發(fā)明還包括含有親水表面活性劑和油的微乳液形式的兒茶酚丁烷的用于口服的制劑。所述微乳液微?？梢詾楹腥芙獾挠秃退幬锏谋砻婊钚詣┠z束。
固體脂質(zhì)納米顆粒制劑中的兒茶酚丁烷制劑也適合用于口服給藥?？梢允褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域中任何常規(guī)的方式制備固體脂質(zhì)納米顆粒，例如，見上文，如Stuchlik，M.和Zak，S.(2001)所描述的。
在一實施方案中，通過在高溫均質(zhì)熔化的脂質(zhì)可以在熱的均質(zhì)過程中制備固體脂質(zhì)納米顆粒。在該過程中，固體脂質(zhì)被熔化，兒茶酚丁烷溶解在熔化的脂質(zhì)中。然后預(yù)熱過的分散介質(zhì)與裝載藥物的脂質(zhì)熔體混合，混合物與均質(zhì)劑(homogenisator)混合以形成粗制的預(yù)乳化液。然后在高于脂質(zhì)熔點的溫度進(jìn)行高壓均質(zhì)以產(chǎn)生油/水-納米乳。冷卻納米乳至室溫以形成固體脂質(zhì)納米顆粒。
在本發(fā)明的另一實施方案中，可以在冷的均質(zhì)過程中制備固體脂質(zhì)納米顆粒。在該過程中，脂質(zhì)溶解，兒茶酚丁烷溶解在熔化的脂質(zhì)中。然后在液氮或干冰中固化裝載藥物的脂質(zhì)。在粉磨廠研磨固體藥物脂質(zhì)以形成50-100μm的微粒。然后在冷的水溶液分散介質(zhì)中分散脂質(zhì)微粒，在室溫或低于室溫的溫度均質(zhì)以形成固體脂質(zhì)納米顆粒。
本發(fā)明還包括用于口服給藥的脂質(zhì)體或膠束中的親脂性兒茶酚丁烷的制劑?？梢允褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域中任何常規(guī)的方式制備這些制劑。膠束通常為脂質(zhì)單層囊泡，在所述囊泡中疏水的藥物與單層上的疏水區(qū)域結(jié)合。脂質(zhì)體通常為磷脂雙層囊泡。親脂性的兒茶酚丁烷通常將位于這些囊泡的中央。
另外的根據(jù)本發(fā)明的合適的用于口服給藥的兒茶酚丁烷的制劑在下述文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述2005年1月27日提交的序列號為60/647,495的美國臨時專利申請，以及2006年1月27日提交的，名稱為“用于包括NDGA化合物的兒茶酚丁烷給藥的口服制劑”的國際申請，代理人案號為682714-9WO，其全部內(nèi)容通過引用并入本發(fā)明。
用于鼻內(nèi)給藥的兒茶酚丁烷制劑 本發(fā)明包括用于鼻內(nèi)給藥的兒茶酚丁烷制劑以及其鼻內(nèi)給藥方式。有利地，鼻內(nèi)給藥可以比通過靜脈給藥在腦中積聚更高濃度的活性劑。此外，該給藥方式避免了在接受藥物的受試對象的肝和腸內(nèi)首過代謝的問題。
可以被吸收的活性劑的量部分地取決于粘液中的藥物的溶解度，所述粘液為一種含有約95％的血清蛋白、糖蛋白、脂質(zhì)以及電解質(zhì)的水溶液的組合物。一般而言，隨著本發(fā)明的活性劑的親脂性增強(qiáng)，CSF中的藥物濃度也增加。例如，見(Minn，A.等人，“藥物轉(zhuǎn)移至哺乳動物腦中鼻內(nèi)途徑以及其特定代謝障礙?！?，藥物靶向雜志(J.Drug Target)，10285-296，(2002))。
親水的兒茶酚丁烷可以溶解在藥學(xué)上可接受的載體中，例如鹽水、磷酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖鹽。在一實施方案中，如所描述的，pH7.4的0.05M磷酸鹽緩沖液可以用作載體，例如，Kao等人(Kao，H.D.等人，“通過左旋多巴(L-Dopa)的水溶性前體藥物的鼻內(nèi)給藥促進(jìn)其全身性給藥以及CNS特定給藥。”，藥物研究(Pharmaceut.Res.)，17(8)978-984，(2000))。
當(dāng)施用藥劑時，通過調(diào)整受試對象的位置可以使本發(fā)明藥劑的鼻內(nèi)給藥最優(yōu)化。例如，患者的頭部可以不同地定位為垂直-90、仰臥-90°、仰臥-45°或仰臥-70°以獲得最佳效果。
兒茶酚丁烷組合物的載體可以為藥學(xué)上可接受的任何物質(zhì)并可以與組合物中的活性劑共存。當(dāng)載體為液體時，其可以相比于鼻分泌液為低滲的或等滲的，并且pH在約4.5至約7.5的范圍內(nèi)。當(dāng)載體為粉末形式時，其也在可接受的pH范圍內(nèi)。
用于鼻內(nèi)給藥的載體成分可以可選擇地包括可以促進(jìn)活性劑通過鼻粘膜并由嗅覺神經(jīng)途徑進(jìn)入腦中而吸收的親脂性物質(zhì)。此類親脂性物質(zhì)的示例包括但不限于神經(jīng)節(jié)苷脂和磷脂酰絲氨酸。在所述組合物中可以包括一種或幾種親脂佐劑，例如以膠束形式。
用于治療流感的鼻內(nèi)給受試對象給藥的活性劑藥物組合物可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)方式制備，例如，如美國專利6,180,603中所描述的。例如，本發(fā)明的組合物可以制成粉末、微粒、溶液、氣溶膠、滴劑、納米顆?；蛑|(zhì)體。除了活性劑外，所述組合物可以含有合適的佐劑、緩沖劑、防腐劑、鹽。諸如鼻內(nèi)滴劑的溶液可以含有抗氧化劑、緩沖劑等。
通過植入給藥 本發(fā)明的兒茶酚丁烷可以通過外科手術(shù)植入給藥給受試對象用于治療，例如含有兒茶酚丁烷的生物可降解聚合物的皮下植入。除了外科手術(shù)外，該治療可以與其它常規(guī)的治療結(jié)合。
因此，本發(fā)明的生物可降解聚合物可以為可溶解在組織液中、對宿主組織沒有任何毒性或不利效果的聚合物或共聚物。優(yōu)選地，聚合物或由其合成聚合物的單體是由食品與藥品管理局準(zhǔn)予人體服用的。具有不同溶解特性單體的共聚物是優(yōu)選的以控制降解的動力學(xué)，例如提高一種單體相對于其它單體的比例以控制溶解速度。
在一實施方案中，聚合物為1，3-雙-(對羧基苯氧基)丙烷與癸二酸[p(CPP:SA)]的共聚物，如下述文獻(xiàn)所描述的Fleming A.B.和Saltzman，卡莫司汀植入劑的藥物動力學(xué)(Pharmacokinetics of the CarmustineImplant)，臨床藥物動力學(xué)(Clin.Pharmacokinet)，41(6):403-419(2002)；以及Brem，H.和Gabikian，P.，“用于治療腦部腫瘤的生物可降解聚合物植入物。”控制釋放雜志(J.Control.Rel.)74:63-67，(2001))。在另一實施方案中，聚合物為聚乙二醇(“PEG”)與癸二酸的共聚物，如Fu等人所描述的(Fu，J.等人，“用于在吸入或注射后控制藥物釋放的新的聚合物載體。”生物材料(Biomaterials)，23:4425-4433，(2002))。
聚合物給藥系統(tǒng)既可適用于本發(fā)明的疏水的兒茶酚丁烷也可適用于本發(fā)明的親水的兒茶酚丁烷。兒茶酚丁烷可以與生物可降解聚合物結(jié)合以及通過外科手術(shù)植入。一些聚合物組合物也可用于本發(fā)明的靜脈或吸入療法。
通過吸入給藥 本發(fā)明的兒茶酚丁烷可以通過吸入全身性地和/或局部地給藥至肺。藥物的吸入給藥作為一種在肺的組織內(nèi)獲得高的藥物濃度而基本上不引起全身性毒性的方法，以及作為一種實現(xiàn)藥物的全身性循還的方法已經(jīng)被廣泛地接受。用于制備此類制劑的技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的。通過該方式給藥疏水兒茶酚丁烷或親水兒茶酚丁烷可以看到治療肺病的功效。
對于通過吸入肺部給藥，本發(fā)明的兒茶酚丁烷可以被制成干粉、水溶液、脂質(zhì)體、納米顆?；蚓酆衔铮约袄缱鳛闅馊苣z給藥。親水性制劑可以通過肺泡表面吸收并進(jìn)入血管供全身性利用。
在一實施方案中，見上文如Fu，J.等人(2002)所描述的制備和使用含有本發(fā)明的活性劑的聚合物。例如，本發(fā)明的聚合物可以為癸二酸和聚乙二醇(“PEG”)的聚合物，或聚(乳酸-co-乙二醇)酸(“PLGA”)或聚乙烯亞胺(“PEI”)和多聚-L-賴氨酸(“PLL”)的共聚物。
在另一實施方案中，如Choi等人所描述的(Choi，W.S.等人，“由乙醇懸浮液的蛋白質(zhì)的吸入給藥?！?，美國國家科學(xué)院學(xué)報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，98(20)11103-11107，(2001))，用于吸入給藥的兒茶酚丁烷在霧化吸入和服用前可以溶解在鹽或乙醇中。
在另一實施方案中，當(dāng)以本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的方式制備、作為干粉給藥時，本發(fā)明的藥劑也有效，例如，如Patton等人所描述的(Patton，J.S.等人，“吸入胰島素，”藥物釋放研究進(jìn)展(Adv.Drug Deliv.Rev.)，35235-247(1999)(2001))。
本發(fā)明包括在嵌入藥物釋放裝置中的微處理器的協(xié)助下釋放兒茶酚丁烷，例如，SmartMistTM物和AERxTM例如如Gonda，I.等人(1998)所描述的，“具有順應(yīng)性和疾病管理能力的吸入釋放系統(tǒng)?！笨刂漆尫烹s質(zhì)(J.Control.Rel.)53:269-274。
本發(fā)明的兒茶酚丁烷和組合物被給藥用于治療任何流感病毒。在某些優(yōu)選實施方案中，待治療的流感流行株為禽株。在一些優(yōu)選的實施方案中，待治療的流感感染為基于H5N1禽株。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，兒茶酚丁烷和組合物被給藥給感染了禽流感流行株的人受試對象。此外，在某些優(yōu)選的實施方案中，兒茶酚丁烷和組合物被給藥給遭受人流感和禽流感復(fù)合感染的人受試對象。在閱讀本發(fā)明所公開的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識到通過服用本發(fā)明的制劑可以治療和/或減輕其它疾病狀況和/或癥狀。
雖然不受限于任何特定的流感發(fā)病機(jī)制或癥狀反應(yīng)的理論，但是可以認(rèn)為人體中的流感病毒感染引起促炎細(xì)胞因子調(diào)節(jié)異常。嚴(yán)重的人H5N1疾病的臨床特征與病毒引起的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)異常一致。雖然認(rèn)為所有的流感病毒感染引起促炎細(xì)胞因子，但是H5N1/97病毒比人流感A病毒亞型H3N2或H1N1引起促炎細(xì)胞因子高得多的轉(zhuǎn)錄(Cheung CY，Poon LL，Lau AS等人，“由流感A(H5N1)病毒引起的人體巨噬細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子一種罕見嚴(yán)重的人疾病的機(jī)理？”柳葉刀(Lancet)，2002360(9348)1831-7)。產(chǎn)生的特定的細(xì)胞因子為TNF-α(在本發(fā)明中以及附圖中也稱為“TNF”)和人主要的單核細(xì)胞體外衍生的巨噬細(xì)胞中的干擾素β(Id.)。
流感病毒感染通常呈現(xiàn)嚴(yán)重的類似感冒的癥狀，并且通常引起呼吸失調(diào)和/或致命的肺炎。感染了H5N1流感亞型的患者已經(jīng)由于急性呼吸窘迫和多器官功能障礙綜合癥的癥狀使原發(fā)性病毒肺炎變復(fù)雜。淋巴細(xì)胞減少和噬紅細(xì)胞作用在一些這類患者中已經(jīng)成為顯著性的表現(xiàn)。噬紅細(xì)胞作用以及急性呼吸窘迫和多器官功能障礙綜合癥的癥狀通常與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)異常有關(guān)。1997年的與H5N1相關(guān)的死亡的死后報告描述了伴以促炎細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ以及TNF-α濃度的升高的反應(yīng)性噬紅細(xì)胞作用癥狀。存在許多與流感感染相關(guān)的疾病或紊亂，包括但不限于氣喘、肺炎、流感后腦炎、細(xì)菌性肌炎、心臟心電圖的變化、支氣管炎、肺結(jié)核、癌、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、囊性纖維化、惡病質(zhì)、整體肌無力失調(diào)、心力衰竭、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化或格林-巴利綜合癥。
2003年的人H5N1病毒，類似于人H5N1/97分離株，其在體外顯示通過人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞引起促炎細(xì)胞因子的過量生成。通過與人病毒類似基因型的源自禽的H5N1病毒在原發(fā)性人巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的TNF-α(Guan Y，Poon LL，Cheung CY等人，“H5N1流感變形蛋白大流行威脅?！泵绹鴩铱茖W(xué)院學(xué)報(Proc Natl Acad Sci U S A)，2004101(21):8156-61)。因此，認(rèn)為源自巨噬細(xì)胞的TNF-α和其它細(xì)胞因子的水平的增加與感染了流感A的患者的疾病的嚴(yán)重性相關(guān)，尤其是與攜帶H5N1疾禽流感”的患者的不尋常的臨床表現(xiàn)和疾病的嚴(yán)重度相關(guān)。系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙、急性呼吸窘迫綜合癥、反應(yīng)性噬紅細(xì)胞作用以及淋巴細(xì)胞減少為具有嚴(yán)重的H5N1疾病的患者的突出特征。
TNF-α引起細(xì)胞凋亡的能力是公知的。由于細(xì)胞凋亡對于有效的流感病毒復(fù)制而言是關(guān)鍵性的，因此引起細(xì)胞凋亡的活動也是流感的致病原因。人流感病毒和禽流感病毒的有效復(fù)制都與TNF超家族成員TRAIL和FasL的上調(diào)相關(guān)(Wurzer WJ，Ehrhardt C，Pleschka S等人“腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)和Fas/FasL的NF-/F-依賴誘導(dǎo)(NF-kappaB-dependent induction)對于有效的流感病毒繁殖是關(guān)鍵性的?！鄙锘瘜W(xué)雜志(J Biol Chem)，2004279(30):30931-7)。
此外，雖然不受限于任何特定的理論，但是已經(jīng)建議且認(rèn)為相應(yīng)于流感病毒基因組RNA的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生增多由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞膜上的Toll樣受體發(fā)出信號(Diebold SS，Kaisho T，Hemmi H等人，“依靠單鏈RNA的TLR7介導(dǎo)識別的先天抗病毒反應(yīng)?！笨茖W(xué)(Science)，2004303(5663)1529-31)。使用一種細(xì)菌內(nèi)毒素的脂多糖(“LPS”)刺激巨噬細(xì)胞也導(dǎo)致產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，例如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10和諸如前列腺素、白三烯的促炎脂質(zhì)介質(zhì)以及血小板活化因子。已經(jīng)表明響應(yīng)于LPS產(chǎn)生的細(xì)胞因子是通過Toll樣受體途徑起作用，類似于流感病毒反應(yīng)(Takeda K，Kaisho T和Akira S.“Toll樣受體?！薄懊庖邔W(xué)年度評論(Annu Rev Immunol)”，200321:335-76)。
諸如通式(I)、(II)和(III)的兒茶酚丁烷，例如，M4N或G4N，以及含有根據(jù)本發(fā)明的一種或多種兒茶酚丁烷的組合物在響應(yīng)鼠單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的LPS或病毒感染時會抑制TNF-α和其它促炎生物因子、前列腺素E2以及其它促炎脂質(zhì)介質(zhì)的產(chǎn)生。由于鼠單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(RAW 264.7)與原發(fā)性人巨噬細(xì)胞相比響應(yīng)于LPS會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量TNF-α，因此其代表了一種預(yù)測TNF系統(tǒng)中的人藥物效果的合適的模式。
現(xiàn)參照下述非限制性的實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
實施例1 研究使用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對由LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的效果以測定M4N抑制TNF-α誘導(dǎo)的能力。可以使用與該實施例的方法類似的方法測定通式(I)的任何兒茶酚丁烷對在任何LPS刺激的巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生任何促炎細(xì)胞因子的效果。
如圖1所示以及下文所描述的，M4N抑制RAW 264.7巨噬細(xì)胞中的LPS誘導(dǎo)的TNF-α過表達(dá)，在誘導(dǎo)后10小時最大抑制量為57％。
更具體而言，關(guān)于用于測定M4N通過LPS抑制TNF-α誘導(dǎo)的方法，或者留下1.5 x 105個巨噬細(xì)胞不處理(對照)或使用LPS(1μg/ml)，M4N(25μM)或兩種化合物一起在不同時間點培養(yǎng)。RAW 264.7細(xì)胞為鼠單核巨噬細(xì)胞。使用的LPS源自明尼蘇達(dá)沙門氏菌R595(Salmonella minnesotaR595)，其可從立斯特生物技術(shù)實驗室股份公司(List BiologicalLaboratories，Inc.)(坎貝爾，加利福尼亞(Campbell，CA))獲得。然后使用鼠TNF-α特異免疫檢測通過源自標(biāo)準(zhǔn)曲線的插值測定培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平。所有的測試都進(jìn)行兩次，并且在每種情形下，誤差圖(errorbars)小于符號大小(symbol size)。
從ATCC購買RAW264.7巨噬細(xì)胞，在添加了10％的胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco′s modified Eagles medium)中培養(yǎng)并在8％的二氧化碳中保持在37℃。FBS購自亞特蘭大生物制品公司(Atlanta Biologicals)(亞特蘭大，喬治亞州(Atlanta，GA))，而所有其它培養(yǎng)基成分購自希格瑪愛爾克公司(Sigma Aldrich)(圣路易絲，密蘇里州(St.Louis，MO))。對于TNF的制備，通過胰酶消化采集細(xì)胞，離心、計數(shù)，在24孔組織培養(yǎng)板中放置1.5 x 105個細(xì)胞并過夜培養(yǎng)。然后在不存在/存在25μMM4N，使用每毫升1克的脂多糖(LPS)如圖1中示出的時間點刺激細(xì)胞。在添加至孔之前，在組織培養(yǎng)基中溶解LPS并超聲粉碎。在DMSO中制備M4N儲存液，然后在添加至孔之前，在培養(yǎng)基中稀釋。收集產(chǎn)生的上清液，在8,000rpm離心兩分鐘以除去細(xì)胞和碎片，在-20℃貯存。使用從研發(fā)系統(tǒng)股份公司(R&D Systems Inc.)(明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州(Minneapolis，MN))購買的康尼提凱(Quantikine)鼠TNF-α/TNFSF1A，免疫檢測劑測定培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平。所述檢測劑為夾層類型的捕獲ELISA?？滋峁┯蓄A(yù)包被的用于鼠TNF-α的特定親和純化的多克隆抗體。添加上清液至孔，孵育，存在的任何TNF-α由固定抗體捕獲。清洗后，加入與抗-TNF-α捕獲抗體的酶，然后進(jìn)行第二孵育步驟。再次清洗孔，然后加入底物溶液。底物的分裂產(chǎn)生藍(lán)色溶液，然后在加入終止液時所述溶液變黃。使用BMG POLARstar星系微孔板讀數(shù)器(galaxymicroplate reader)在450nm測定光密度。由制造商提供標(biāo)準(zhǔn)的重組鼠TNF-α溶液以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，由源自標(biāo)準(zhǔn)曲線的插值測定培養(yǎng)上清液中TNF-α的水平。圖1中示出的所有點都進(jìn)行兩次，平均值用于定量。
在使用佛波醇十四烷基乙酸酯(phorbol myristyl acetate)(PMA)或A23187(鈣離子載體)，而非LPS誘導(dǎo)后，在RAW 264.7巨噬細(xì)胞中沒有觀察到通過M4N對產(chǎn)生TNF-α的抑制。認(rèn)為PMA和A23187是非特異性地發(fā)揮作用，獨立于細(xì)胞表面受體和大多數(shù)信號傳遞過程。因此，雖然不受限于任何特定理論，但是M4N抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-生的能力可以來源于對TNF反應(yīng)的上游信號和激活階段的影響，而不是對負(fù)責(zé)TNF-α的合成和釋放的下游過程的影響。因此，可以確信M4N對治療H5N1感染的有益效果而不引起對產(chǎn)生TNF-α的潛在的有害的非特異性下降。
該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制過多地產(chǎn)生響應(yīng)LPS誘導(dǎo)的TNF-α，說明在流感感染時通過提高TNF-α的水平，所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治療疾病或在流感感染時由增高的TNF-α介導(dǎo)的紊亂。
實施例2 研究使用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對鼠成纖維細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的凋亡的效果以測定M4N抑制TNF-α誘導(dǎo)凋亡的能力?？梢允褂门c該實施例的方法類似的方法測定通式(I)的任何兒茶酚丁烷對任何類型的細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)凋亡的的效果。
流感感染誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α，TNF-α促凋亡活性是公知的。流感病毒需要凋亡以有效的復(fù)制，阻斷TNF-α誘導(dǎo)的凋亡可以減少流感病毒復(fù)制和疾病。
如圖2所示以及下文所描述的，M4N通過放線菌酮強(qiáng)烈地抑制對TNF敏感的TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。C3HA鼠成纖維細(xì)胞在不存在/存在NDGA(25μM)或M4N(50μM)與人重組TNF-α(20ng/ml)、放線菌酮(CHI)(10ng/ml)或兩者一起孵育。同時加入所有化合物并處理6小時。在最后的半個小時期間加入若丹明(Rhodamine)123，使用BMGPOLARstar星系熒光分析儀(galaxy flourimeter)測量熒光。
更具體而言，C3HA細(xì)胞在添加了10％的胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco′s modified Eagles medium)中培養(yǎng)并在8％的二氧化碳中保持在37℃。C3HA細(xì)胞系為由C3H鼠衍生的3T3樣的鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞系。FBS購自亞特蘭大生物制品公司(亞特蘭大，喬治亞州)，而所有其它培養(yǎng)基成分購自希格瑪愛爾克公司。對于凋亡檢測，通過胰酶消化采集細(xì)胞，離心、計數(shù)，在培養(yǎng)基的平底96孔酶標(biāo)板的各孔添加1.5 x 104個細(xì)胞。在不存在/存在去甲二氫愈創(chuàng)木酸(25μM)或M4N(50μM)時，在添加TNF(20ng/ml)、CHI(10g/ml)或兩者之前允許細(xì)胞粘附至少六(6)小時。人重組TNF-α購自培普特克(Peprotech)(石丘，新澤西州(Rocky Hill，NJ))，而CHI購自EMD生物科學(xué)股份公司(EMD Biosciences Inc.)(圣地亞哥，加利福尼亞州(San Diego，CA))。兩者都溶解在培養(yǎng)基中。NDGA也溶解在培養(yǎng)基中，而M4N儲存液在DMSO中制備，然后在培養(yǎng)基中稀釋，然后在添加至孔之前，在培養(yǎng)基中稀釋。同時添加總量為200微升的所有化合物，允許孵育六(6)小時。在孵育的最后三十(30)分鐘期間添加50μL的若丹明123至最終濃度為2μg/ml的各孔。若丹明123購自分子探針股份公司(Molecular Probes Inc.)(尤金，俄勒岡州(Eugene，OR))并在培養(yǎng)基中稀釋。若丹明123被有活力的線粒體隱蔽，活的鍵康細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的線粒體熒光性。相反，由于凋亡的細(xì)胞通常會經(jīng)歷線粒體通透性轉(zhuǎn)換，從而線粒體失去其膜電位，因此熒光在經(jīng)歷了凋亡的細(xì)胞中會減弱。結(jié)果，若丹明123熒光在凋亡的細(xì)胞中急劇地減弱。然后使用BMG POLARstar星系微板讀數(shù)器在分別設(shè)定激發(fā)波長492納米以及發(fā)射波長538納米時測定熒光強(qiáng)度。所有的點都進(jìn)行三次，根據(jù)下述方程式計算細(xì)胞死亡百分比 [(對照值-實驗值)/對照值]*100 該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于減少流感病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，而有效復(fù)制需要凋亡。
實施例3 研究使用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對由LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2(“PGE2”)、前列腺素F1α(“PGF1G”)以及前列腺素F2α(“PGF2α”)的效果以測定M4N在響應(yīng)流感病毒感染時抑制過量產(chǎn)生前列腺素的能力。可以使用與該實施例的方法類似的方法測定通式(I)的任何兒茶酚丁烷對在任何LPS刺激的巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生任何促炎脂質(zhì)介質(zhì)的效果。
事實上，前列腺素是在所有組織和器官中發(fā)現(xiàn)的自分泌和旁分泌脂質(zhì)介質(zhì)。其在細(xì)胞中由必需脂肪酸合成，例如γ-亞麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸。其作用于多種細(xì)胞，例如除了內(nèi)皮細(xì)胞、子宮細(xì)胞和肥大細(xì)胞外，引起聚合或解聚的血小板細(xì)胞，引起收縮或擴(kuò)張的血管平滑肌細(xì)胞，引起疼通的脊髓神經(jīng)元。前列腺素具有多種作用，包括但不限于肌肉收縮和誘導(dǎo)炎癥。其它效果包括鈣流動和細(xì)胞生長調(diào)控。
前列腺素E2由前列腺素E合成酶作用于前列腺素H2(PGH2)產(chǎn)生，前列腺素H2通過環(huán)氧化酶(COX-1和COX-2)的作用由脂肪酸獲得。在流感感染發(fā)生期間，PGE2被誘導(dǎo)。感染人流感病毒亞型H3N2會增加支氣管上皮細(xì)胞中PGE2的釋放(MizumuraK，Hashimoto S，Maruoka S等人，“流感病毒中的絲裂原活化蛋白激酶從支氣管上皮細(xì)胞中的花生四烯酸誘導(dǎo)前列腺素E2的作用?！迸R床和實驗性過敏(Clin Exp Allergy)，200333(9):1244-51)。
可以由包括PGH2、PGE2或PGD2的三種不同的底物通過三種途徑產(chǎn)生PGF2G。PGF2G引起平滑肌收縮，其活性與氣喘和分娩相關(guān)。
環(huán)前列腺素，也稱為PGI2，其通過PGI合酶的作用由PGH2產(chǎn)生，其廣泛地由許多細(xì)胞類型表達(dá)。環(huán)前列腺素在諸如炎癥和分娩的多種生物反應(yīng)中是一種重要的有效的血管擴(kuò)張劑和平滑肌松馳劑。然而，環(huán)前列腺素不穩(wěn)定，通常通過測量被稱為PGF1α(6-keto-PGF1α)的環(huán)前列腺素的穩(wěn)定衍生物而獲得可靠的測量結(jié)果。
如圖3所示以及下文所描述的，M4N對LPS誘導(dǎo)的PGE2的產(chǎn)生具有強(qiáng)的抑制作用。在圖3中，M4N(25μM)呈現(xiàn)了在RAW 246.7巨噬細(xì)胞中對LPS誘導(dǎo)PGE2產(chǎn)生的強(qiáng)的抑制。在示出的時間段單獨使用LPS(1μg/ml)，或與25μM M4N組合使用處理巨噬細(xì)胞。然后使用前列腺素E2免疫檢測(R&D系統(tǒng)公司，明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州)由上清液檢測PGE2。示出的數(shù)據(jù)為在各個時間點2-4個測定值的平均+/-SEM。在6、10和16小時，抑制水平分別為72、64和80％。M4N的抑制作用在整個16小時期間內(nèi)都在培養(yǎng)液中持續(xù)。
如圖4所示以及下文所描述的，M4N對LPS誘導(dǎo)的PGF2α的產(chǎn)生也具有強(qiáng)的抑制作用。在圖4中，用LPS(1μg/ml)刺激16小時后，從RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測出15ng/ml的PGF2α。當(dāng)同時使用LPS(1μg/ml)和M4N(25μM)處理RAW 264.7巨噬細(xì)胞16小時時，PGF2α的產(chǎn)生被抑制。根據(jù)兩次實驗由M4N(25μM)抑制的平均值％為82％。使用PGF2αELISA試劑盒(檢測設(shè)計公司，安玨伯，密西根州(Assay Designs，Ann Arbor，MI))通過ELISA測定RAW 264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGF2α的值。示出的數(shù)據(jù)為兩次獨立實驗的平均+/-SEM。
如圖5所示以及下文所描述的，M4N對LPS誘導(dǎo)的PGF1α的產(chǎn)生也具有一些抑制作用，在圖5中，使用LPS(1μg/ml)刺激16小時后，從RAW 264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測出5-6ng/ml的PGF1α。當(dāng)使用LPS(1μg/ml)和M4N(25μM)同時處理RAW 264.7巨噬細(xì)胞16小時時，PGF1α的產(chǎn)生被抑制。根據(jù)兩次試驗的抑制平均值％為41％。使用PGF1α ELISA試劑盒(R&D系統(tǒng)公司，明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州)通過ELISA測定RAW 264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGF1α的水平。示出的數(shù)據(jù)為根據(jù)獨立的RAW 264.7試驗的平均值+/-SEM。
為了確認(rèn)圖5中示出的對產(chǎn)生PGF1α(一種PGI2/前列環(huán)素的指標(biāo))的相對適中的抑制率不是歸因于一些試驗誤差，也測量了這些RAW 264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中產(chǎn)生PGE2的抑制％。與圖3中的結(jié)果一致，檢測出這些上清液中PGE2的抑制超過90％，這表明所觀察的對產(chǎn)生PGF1α的適中的抑制率不可能歸因于與細(xì)胞、LPS和M4N相關(guān)的試驗誤差。
因為也稱為EM-1421的M4N對前列腺素和白三烯的產(chǎn)生具有強(qiáng)的抑制作用，其可以特別好地適于治療肺中的炎癥狀況，例如由流感感染引起的哮喘，其傾向依賴于脂質(zhì)介質(zhì)。與PGE合酶和PGF合酶不同，PGI合酶對EM-1421可以相對地具有抗性，在存在EM-1421時其說明了大量產(chǎn)生PGF1α的原因。
更具體而言，關(guān)于用于測定M4N對PGE2產(chǎn)生的效應(yīng)的方法，購買RAW264.7巨噬細(xì)胞，并根據(jù)實施例1中描述的程序培養(yǎng)和維持。通過胰酶消化采集細(xì)胞而完成細(xì)胞中前列腺素E2的產(chǎn)生并離心。對細(xì)胞計數(shù)，在24孔組織培養(yǎng)板中放置1.5 x 105個細(xì)胞并過夜培養(yǎng)。然后在不存在/存在25μM時使用1μg/mi LPS如圖5中示出的時間點刺激細(xì)胞。在添加至孔之前，在組織培養(yǎng)基中溶解LPS并超聲處理。在DMSO中制備M4N終止液，然后在添加至孔之前，在培養(yǎng)基中稀釋。收集產(chǎn)生的上清液，在8,000rpm離心兩分鐘以除去細(xì)胞和碎片，在-20℃貯存。使用從研發(fā)系統(tǒng)股份公司購買的前列腺素E2免疫檢測測定培養(yǎng)上清液中的前列腺素E2水平。所述檢測為競爭型的ELISA。上清液中存在的前列腺素E2與固定量的堿磷酶標(biāo)記的前列腺素E2競爭結(jié)合鼠單克隆抗前列腺素E2抗體。產(chǎn)生的復(fù)合物被與微量滴定孔結(jié)合的山羊抗鼠抗體結(jié)合。清洗后，加入產(chǎn)生顏色的底物以對結(jié)合酶的量進(jìn)行定量。使用BMG POLARstar星系微孔板讀數(shù)器在405nm測定光密度。由制造商提供標(biāo)準(zhǔn)的前列腺素E2溶液以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，由源自標(biāo)準(zhǔn)曲線的插值測定培養(yǎng)上清液中前列腺素E2的水平。所有點都進(jìn)行兩次，平均值用于定量。
使用類似的方法測定M4N對PGF1α和PGF2α產(chǎn)生的效應(yīng)。
該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制響應(yīng)LPS刺激的過多的前列腺素產(chǎn)生，說明在所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治療在流感感染時由高水平前列腺素介導(dǎo)的疾病或紊亂。
實施例4 研究應(yīng)用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對由RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一組細(xì)胞因子的效應(yīng)以測定通過LPS刺激的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)以及M4N抑制誘導(dǎo)的能力。
在該研究中使用了抗體(“Ab”)芯片技術(shù)。如圖6所示以及下文所描述的，M4N對LPS誘導(dǎo)的幾種細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有抑制作用。雖然細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平總體上低，但是未經(jīng)LPS刺激或EM-1421處理(圖6A中的“控制”組)在來源于RAW264.7巨噬細(xì)胞的上清液中檢測出許多細(xì)胞因子。雖然幾種細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少(KC、BLC、IL-4、IL-9、MIP-1α、M1P-1γ和IL-12p40p70)且兩種細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加(IL-1α和MIG)，但是在使用EM-1421以終濃度25μM(圖6A中的“EM-1421”組)處理后，此種細(xì)胞因子的產(chǎn)生模式總體上被維持。這加強(qiáng)了EM-1421是安全的臨床證據(jù)。
LPS引起許多細(xì)胞因子(圖6B中的“LPS”組)的大量增加(>20％)，包括RANTES、IL-1α、IL-2、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、IL-6、MCP-1、sTNFRI、sTNFRII、IL-12p40、MIP-1α和G-CSF。在幾種情形下，這些增加被EM-1421(圖6B中的“LPS+EM-1421”組)部分地或完全地抵消。在高水平產(chǎn)生的細(xì)胞因子中，EM-421抑制LPS誘導(dǎo)的IL-1α約20％，TNF-α約24％，MCP-I約33％，sTNFRI約63％以及sTNFRII約20％。在低水平產(chǎn)生的細(xì)胞因子中，EM-421抑制LPS誘導(dǎo)的I-TAC約100％，IL-2約100％，TIMP-1約30％，TIMP-2約100％，BLC約100％以及IL-3約100％。然而，由于這些細(xì)胞因子以低水平產(chǎn)生，因此預(yù)測這些觀察結(jié)果的意義是困難的。有趣地，EM-1421不抑制LPS誘導(dǎo)的RANTES、IL-6、IL-12p70、MIP1-α以及G-CSF的產(chǎn)生，并且增加LPS誘導(dǎo)的IL-12p40p70的產(chǎn)生約43％。
更具體而言，關(guān)于用于測定M4N對細(xì)胞因子產(chǎn)生的效應(yīng)的方法，在所述方法中使用了“鼠炎癥芯片-1”(陣光生物技術(shù)股份公司，亞特蘭大，喬治亞州(RayBiotech，Inc.，Atlanta，GA))。購買RAW264.7巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)，使用LPS(1μg/ml)刺激，使用EM-1421(25μM)處理，根據(jù)實施例1中描述的采集細(xì)胞。根據(jù)制造商的說明書使用鼠炎癥芯片-1，使用或未使用LPS(1μg/ml)刺激和使用或未使用EM-1421(25μM)處理，測量RAW264.7巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子。簡而言之，使用硝化纖維素Ab芯片孵育培養(yǎng)上清液約2h，清洗，與第二種Ab溶液接觸，使用ECL溶液培養(yǎng)，并與X光膠卷接觸。掃描芯片放射自顯影。使用Photoshop(Adobe)分析并測定各陣列位置的平均像素灰度。在圖6A和圖6B中標(biāo)出了復(fù)制點(duplicate spots)的平均值。在各個芯片上陽性對照點為約100單位，對于所有復(fù)制點而言SEM低于10％，對于大多數(shù)復(fù)制點而言SEM低于1％。
該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制響應(yīng)LPS刺激的，除了TNF-α外還有其它幾種細(xì)胞因子的過多地產(chǎn)生，說明所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治療在流感感染時由高水平細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病或紊亂。
實施例5 研究應(yīng)用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對由MDCK細(xì)胞和RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的流感株A/WS/33的作用以測定M4N在這些細(xì)胞中抑制流感病毒生長的能力。與該實施例的方法類似的方法可以用于測定通式(I)的任何兒茶酚丁烷在任何類型的細(xì)胞中對流感病毒的任何株的生長或復(fù)制的效應(yīng)。
A/WS/33是一種可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection)(ATCC)(馬納薩斯，弗吉尼亞洲(Manassas，VA))商業(yè)獲得的流感病毒A毒株。其從患有流感的患者分離。推薦的A/WS/33的宿主包括雞胚、雪貂和鼠。
MDCK細(xì)胞為衍生于外表正常的成年雌性考克斯班尼犬的腎臟的上皮樣細(xì)胞。其顯示出支持各種類型的病毒，包括流感A病毒的生長。使用MDCK細(xì)胞產(chǎn)生高滴度儲備(stocks)的A/WS/33并且用于定量測定以測量試驗中的培養(yǎng)上清液中的感染病毒的數(shù)量。確定可以用于MDCK細(xì)胞中而不引起毒性作用的EM-1421的最高濃度為25μM。確定了多種定量分析法以監(jiān)測A/WS/33復(fù)制，包括但不限于細(xì)胞病變(TCID50)、斑塊、免疫聚焦(immunofocus)和熒光免疫檢測法。
如圖7所示，組A和組B顯示了同樣的數(shù)據(jù)，但是分別具有線性和對數(shù)y軸，濃度為25μM的EM-1421抑制MDCK細(xì)胞中的A/WS/33復(fù)制約75％。通常用于使病毒滴定巨大差異可視化的對數(shù)坐標(biāo)圖表明EM-1421的抑制作用低于1對數(shù)單位。
如圖8所示，組A和組B顯示了同樣的數(shù)據(jù)，但是分別具有線性和對數(shù)y軸，在不同測試濃度(3μM、6μM、12μM和25μM)的EM-1421沒有抑制RAW 264.7巨噬細(xì)胞中A/WS/33的復(fù)制。相反，EM-1421促進(jìn)了由RAW 264.7產(chǎn)生A/WS/33。然而，此外，該效應(yīng)相對適度地，即低于1對數(shù)增長(圖8B)。使用EM-1421預(yù)處理RAW 264.7細(xì)胞還促進(jìn)了A/WS/33的生長。如圖9中的組A和組B所示，EM-1421的濃度在25μM時所述促進(jìn)作用尤其顯著，在36小時的時間點測得1個對數(shù)增量。
EM-1421抑制MDCK細(xì)胞流感毒株A/WS/33的生長，但是促進(jìn)RAW264.7巨噬細(xì)胞的生長。在兩種情形下，這些作用都相對地適度，即病毒滴度約1個對數(shù)的變化。為完全地確定EM-1421對流感病毒復(fù)制的效應(yīng)，需要檢查其它的病毒和細(xì)胞類型。此外，為確定這些效應(yīng)是否顯著地影響病毒裝載，體內(nèi)試驗是必需的。
更具體而言，關(guān)于用于測定M4N對由MDCK細(xì)胞或RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的A/WS/33的效應(yīng)的方法，MDCK細(xì)胞或RAW 264.7巨噬細(xì)胞分別以0.001或0.002的感染復(fù)數(shù)(MOI)進(jìn)行預(yù)防注射。除了對照樣本沒有添加藥物外，在發(fā)生流感感染30分鐘后，EM-1421以希望的濃度被添加至細(xì)胞，并且在整個試驗期間保持該濃度。在希望的時間點收集培養(yǎng)上清液。
然后使用基于MDCK的免疫聚焦檢測法定量分析這些上清液中的感染病毒。在24孔板中平鋪MDCK細(xì)胞(5 x 105/孔)，并在病毒培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有含有10％的胎牛血清(亞特蘭大生物制品公司，喬治亞州亞特蘭大)的DME基礎(chǔ)培養(yǎng)基(#10-013-CV，(梅地亞技術(shù)公司，弗吉尼亞州赫恩登(MediaTech，Hemdon VA))，25mM HEPES緩沖液(#25-060-CL，梅地亞技術(shù)公司)，1100抗生素/抗真菌的溶液(#A5955-Sigma-Aldrich，密蘇里州圣路易斯(St.Louis Mo))，1.8μg/ml胎牛血清(#A7906 Sigma-Aldrich)以及2mg/ml胰蛋白酶(#3740，沃辛頓公司(Worthington)，新澤西州萊克伍德(Lakewood NJ))。然后在沒有胎牛血清的同樣的培養(yǎng)基中清洗兩次細(xì)胞。然后在30分鐘內(nèi)添加含有病毒的上清液的系列稀釋液，然后使用含有0.6％的黃蓍膠(#104792，MP生物醫(yī)藥股份公司，俄亥俄州索倫(MP Biomedicals Inc.，Solon OH))覆蓋病毒培養(yǎng)基。在孵育24和48小時后，抽出覆蓋物，使用PBS清洗細(xì)胞并使用50:50的丙酮/甲醇固定。然后使用抗HA抗體染色細(xì)胞以聚焦檢測。
為測定M4N對由EM-1421預(yù)處理的RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生A/WS/33的效應(yīng)，首先使用希望濃度的EM-1421孵育RAW 264.7巨噬細(xì)胞2小時。然后在MOI為0.002時使用A/WS/33孵育細(xì)胞。在整個試驗期間EM-1421都存在于細(xì)胞培養(yǎng)液中并維持同樣的濃度。在希望的時間點收集培養(yǎng)上清液。然后使用上述基于MDCK的免疫聚焦檢測法定量分析這些上清液中的感染病毒。
該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制一些宿主細(xì)胞中流感病毒的復(fù)制，說明所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于抑制宿主中流感病毒的復(fù)制或生長。
實施例6 研究應(yīng)用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對由感染流感毒株A/WS/33的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的效果以測定M4N抑制由于流感感染引起的TNF-α誘導(dǎo)的能力?？梢允褂门c該實施例的方法類似的方法測定通式(I)的任何兒茶酚丁烷對在感染了任何流感病毒的巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生任何促炎細(xì)胞因子的作用。
在該研究中使用了兩種模型系統(tǒng)，低復(fù)數(shù)感染模型和高復(fù)數(shù)感染模型。在低復(fù)數(shù)感染模型中，使用非常低劑量的流感病毒(MOI＝0.002)啟動RAW 264.7巨噬細(xì)胞的感染，然后所述流感病毒在接下來的24-48小時期間分布在整個培養(yǎng)液中。該模型試圖接近在自然感染期間體內(nèi)觀察到的狀況。然而，在該模型中，感染必需在包括2μg/ml胰蛋白酶的不含血清的感染培養(yǎng)基中進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)當(dāng)RAW 264.7細(xì)胞從其生長培養(yǎng)基(含有10％FCS的DEM)轉(zhuǎn)換至不含血清的感染培養(yǎng)基時，感染培養(yǎng)基自身刺激巨噬細(xì)胞并提高細(xì)胞因子和脂質(zhì)介質(zhì)的產(chǎn)生的背景值。胰蛋白酶包括在感染培養(yǎng)基中，由于流感病毒從細(xì)胞傳播至細(xì)胞(體內(nèi)或體外)，其必須通過胞外蛋白酶起作用。
在高M(jìn)OI模型中，使用高劑量的流感病毒(MOI＝5)啟動感染，確保所有的細(xì)胞實際上迅速地且同時地感染所述流感病毒。在啟動這些感染后，觀察強(qiáng)的病毒血凝素染色8小時。在細(xì)胞因子和脂質(zhì)介質(zhì)的背景值保持為低值的通常的培養(yǎng)基中進(jìn)行感染。然而，在這些條件下，不產(chǎn)生有感染性的病毒粒子。缺乏病毒離子的產(chǎn)生以及高的流感病毒啟動劑量意味著該模型不接近于體內(nèi)的流感病毒感染。
因此，低MOI和高M(jìn)OI模型都被用于獲得流感病毒和EM-1421對RAW 264.7的新陳代謝的效應(yīng)的更完整的視角。
圖10-12描述了低MOI檢測模型的結(jié)果。在圖10中，當(dāng)RAW 264.7細(xì)胞從其生長培養(yǎng)基變換至不含血清的感染培養(yǎng)基時，細(xì)胞產(chǎn)生約750pg/ml的TNF-α(“培養(yǎng)基”條)，其高于當(dāng)細(xì)胞保持在生長培養(yǎng)基中時通常測得的100pg/ml。EM-1421(25μM)單獨降低該值約67％，明顯地抵消與培養(yǎng)基(“EM-1421”條)變換相關(guān)的“應(yīng)激”或“激活”信號。如已經(jīng)報道的，發(fā)現(xiàn)流感病毒感染導(dǎo)致TNF-α的值增加(“流感”條)。在該研究中，在感染流感病毒(毒株A/WS/33)后測得的TNF-α的值通常增加約80-85％。EM-1421(25μM)毒株完全地阻斷了該流感病毒誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的增加(“流感/EM-1421”條)。
圖11描述了在不同濃度的EM-1421時劑量反應(yīng)試驗的結(jié)果。EM-1421培養(yǎng)基單獨或培養(yǎng)基和最終濃度低如0.1μM的流感病毒感染一起都抑制TNF-α的產(chǎn)生的增加。增加EM-1421的濃度引起抑制增加。
圖12示出了時程實驗的結(jié)果。在接種或不接種流感毒株A/WS/33(“流感”)，以及使用或不使用EM-1421(“EM-1421”)孵育細(xì)胞。在圖中示出的時間點測定培養(yǎng)上清液中的TNF-α的量。發(fā)現(xiàn)EM-1421的抑制作用似乎緊接TNF-α的誘導(dǎo)，TNF-α的誘導(dǎo)在整個24小時期間都保持抑制。
圖13-15描述了高M(jìn)OI檢測模型的結(jié)果。RAW 264.7細(xì)胞在不存在病毒感染和使用EM-1421(“培養(yǎng)基”條)處理時產(chǎn)生約100pg/ml的TNF-α。EM-1421(25μM)單獨降低該值約35％(“EM-1421”條)。此外，發(fā)現(xiàn)流感感染引起TNF-α值增加，圖示約135％(“流感”條)。EM-1421(25μM)也完全地阻斷了流感病毒誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的增加(“流感/EM-1421”條)。圖14描述了劑量響應(yīng)試驗的結(jié)果。最終濃度約10μM和25μM的EM-1421通過流感病毒感染分別抑制TNF-α產(chǎn)量增加約34％和60％。圖15示出了時程試驗的結(jié)果。EM-1421的抑制作用似乎緊接TNF-α的誘導(dǎo)，TNF-α的誘導(dǎo)在12小時和24小時分別抑制51％和55％。
如上所述，M4N在低和高M(jìn)OI模型系統(tǒng)中都強(qiáng)烈地抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞中流感病毒誘導(dǎo)的TNF-α的過表達(dá)。因此，M4N可能類似地抑制感染了流感病毒，尤其是感染了H5N1流感病毒亞型的人巨噬細(xì)胞中的TNF-α響應(yīng)。TNF-α是在感染有高致命的H5N1亞型流感的肺中通常致命的炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用者之一。因此，通過控制細(xì)胞因子的失調(diào)，EM-1421可以顯著地減少與致命性流感病毒感染相關(guān)的肺部炎癥和死亡，以及降低人H5N1疾病的嚴(yán)重性。時程試驗表明EM-1421在感染早期抑制TNF-α的誘導(dǎo)，表明EM-1421可能起作用以抑制TNF-α的合成和/或釋放，而非引起TNF-α的降解。
更具體而言，關(guān)于使用的低MOI模型，1.5 x 105個RAW 264.7巨噬細(xì)胞/孔平鋪于含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基中(#D5648，Sigma Aldrich，圣路易絲，密蘇里州)過夜。移去培養(yǎng)基，在病毒生長培養(yǎng)基中(含有2μg/ml的胰蛋白酶、2.5％HEPES緩沖劑和0.2％BSA的DME基)使用MOI為0.002的200μl的接種病毒(毒株A/WS/33)替換，并允許病毒吸附30分鐘。然后增加培養(yǎng)基的體積至1ml。當(dāng)體積增加至1ml時，EM-1421的最終濃度增加至25μM。不含有病毒和EM-1421(“培養(yǎng)基”)的孔或僅含有EM-1421(“EM-1421”)被作為“模擬感染”孔，其與感染的孔受到相同的處理但沒有病毒。在孵育約24小時后，收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測TNF-α。示出的數(shù)據(jù)為兩個獨立試驗的平均+/-SEM，每個試驗進(jìn)行兩次重復(fù)的感染。所有的ELISA點檢測兩次。
在使用的高M(jìn)OI模型中，1.5 x 105個RAW 264.7巨噬細(xì)胞/孔平鋪于含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基中過夜。移去培養(yǎng)基，在含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基中使用MOI為5的200μl的接種病毒(毒株A/WS/33)替換，并允許病毒吸附30分鐘。然后增加培養(yǎng)基的體積至1ml。當(dāng)體積增加至1ml時，EM-1421的最終濃度增加至25μM。不含有病毒和EM-1421(“培養(yǎng)基”)的孔或僅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作為“模擬感染”孔，其與感染的孔受到相同的處理但沒有病毒。在孵育約24小時后，收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測TNF-α。示出的數(shù)據(jù)為兩個獨立試驗的平均+/-SEM，每個試驗進(jìn)行兩次重復(fù)的感染。所有的ELISA點檢測兩次。
在劑量響應(yīng)試驗中，當(dāng)培養(yǎng)基的體積增至1ml時，添加至培養(yǎng)基的EM-1421的最終濃度為0.1、1、10或25μM。
在時程試驗中，在細(xì)胞培養(yǎng)液接種流感病毒后孵育約4、12或24小時后，收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測TNF-α。
該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制響應(yīng)于流感病毒感染的過多的TNF-α產(chǎn)生，說明所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治療在流感感染時由高水平TNF-α介導(dǎo)的疾病或紊亂。
實施例7 研究應(yīng)用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對感染流感毒株A/WS/33的RAW 264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的效果以測定M4N抑制由流感病毒感染誘導(dǎo)PGE2的能力?？梢允褂门c該實施例的方法類似的方法測定通式(I)的任何兒茶酚丁烷對在感染了任何流感病毒的巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生任何促炎脂質(zhì)介質(zhì)的效應(yīng)。
如圖16和17以及下文所述，M4N抑制RAW 264.7巨噬細(xì)胞中流感誘導(dǎo)的PGE2的過表達(dá)。因此，M4N可能類似地抑制感染了流感病毒，尤其是感染了H5N1流感病毒亞型的人巨噬細(xì)胞中的TNF-α響應(yīng)。此外，通過控制細(xì)胞因子的失調(diào)，M4N可以用于降低人的H5N1疾病的嚴(yán)重性。
還沒有廣泛地研究在流感感染期間的PGE2的產(chǎn)生。在該研究中既使用了低MOI模型也使用了高M(jìn)OI模型。
圖16描述了低MOI檢測模型的結(jié)果。當(dāng)RAW264.7細(xì)胞從其生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至不含血清的感染培養(yǎng)基時，細(xì)胞產(chǎn)生約1ng/ml的PGE2(“培養(yǎng)基”條)。EM-1421(25μM)單獨地強(qiáng)烈誘導(dǎo)出該值(“EM-1421”條)。流感病毒感染可重復(fù)地導(dǎo)致PGE2的值增加約30％(“流感”條)。EM-1421(25μM)也強(qiáng)烈地阻斷了該流感病毒誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生的增加(“流感/EM-1421”條)。
圖17描述了高M(jìn)OI檢測模型的結(jié)果。RAW 264.7細(xì)胞在不存在病毒感染和使用EM-1421(“培養(yǎng)基”條)處理時產(chǎn)生非常低的PGE2值(約75pg/ml)。EM-1421(25μM)單獨增加PGE2的值約兩倍(“EM-1421”條)。然而，由于PGE2在“培養(yǎng)基”和“EM-1421”孔中低水平地產(chǎn)生，因此預(yù)測這些觀察結(jié)果的意義是困難的。流感病毒感染導(dǎo)致PGE2水平顯劇增加，圖中示出增加約1,300％至約1,100pg/ml(“流感”條)。EM-1421(25μM)減少流感病毒誘導(dǎo)的PGE2的產(chǎn)生增長的約32％(“流感/EM-1421”條)。
脂質(zhì)介質(zhì)在流感病毒誘導(dǎo)的肺部炎癥中所起的作用尚未很好地被表征。在該研究中獲得的結(jié)果揭示了新的信息。在低MOI的模型中(圖16)，不含血清的感染培養(yǎng)基導(dǎo)致高背景值的PGE2的產(chǎn)生；流感病毒感染引起PGE2的值的額外的小的且可重復(fù)的增加；EM-1421既通過培養(yǎng)基感染也通過流感感染完全地抑制PGE2的產(chǎn)生的增加。低MOI模型的結(jié)果與觀察到的通過EM-1421對LPS誘導(dǎo)的PGE2產(chǎn)生的強(qiáng)烈抑制相一致。相反，高M(jìn)OI模型(圖17)揭示了流感病毒感染對PGE2的強(qiáng)的誘導(dǎo)(低背景)，但EM-1421對該誘導(dǎo)僅有中等的抑制。進(jìn)行了另外的試驗以說明由低MOI模型系統(tǒng)和高M(jìn)OI模型系統(tǒng)觀察到的不同的結(jié)果。
更具體而言，關(guān)于使用的低MOI模型，1.5 x 105個RAW264.7巨噬細(xì)胞/孔平鋪在含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基中過夜。移去培養(yǎng)基，在病毒生長培養(yǎng)基中(含有2μg/ml胰蛋白酶、2.5％HEPES緩沖液和0.2％BSA的基礎(chǔ)DME)使用MOI為0.002的200μl的接種病毒(菌株A/WS/33)替換，并允許病毒吸附30分鐘。然后增加培養(yǎng)基的體積至1ml。當(dāng)體積增加至1ml時，EM-1421的最終濃度增加至25μM。不含有病毒和EM-1421(“培養(yǎng)基”)的孔或僅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作為“模擬感染”孔，其與感染的孔受到相同的處理但沒有病毒。在孵育約24小時后，收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測PGE2。示出的數(shù)據(jù)為兩個獨立試驗的平均+/-SEM，每個試驗進(jìn)行兩次重復(fù)的感染。所有的ELISA點檢測兩次。
在使用的高M(jìn)OI模型中，1.5x105個RAW 264.7巨噬細(xì)胞/孔平鋪于含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基中過夜。移去培養(yǎng)基，在含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基中使用MOI為5的200μl的接種病毒(菌株A/WS/33)替換，并允許病毒吸附30分鐘。然后增加培養(yǎng)基的體積至1ml。當(dāng)體積增加至1ml時，EM-1421的最終濃度增加至25μM。不含有病毒和EM-1421(“培養(yǎng)基”)的孔或僅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作為“模擬感染”孔，其與感染的孔受到相同的處理但沒有病毒。在孵育約24小時后，收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測PGE2。示出的數(shù)據(jù)為兩個獨立試驗的平均+/-SEM，每個試驗進(jìn)行兩次重復(fù)的感染。所有的ELISA點檢測兩次。
該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制響應(yīng)于流感病毒感染的PGE2的過多產(chǎn)生，說明通過提高PGE2的水平所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治療在流感病毒感染時由高水平PGE2介導(dǎo)的疾病或紊亂。
實施例8 研究應(yīng)用通式(I)的兒茶酚丁烷，即M4N對RAW 264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用以測定流感病毒誘導(dǎo)的除了TNF-α外的細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及M4N對誘導(dǎo)產(chǎn)生的抑制能力。
在該研究中使用了抗體(“Ab”)芯片技術(shù)。如圖18所示，在芯片上的40種細(xì)胞因子、趨化因子、受體和蛋白酶中，在該試驗中檢測出了8種。此外，在低MOI條件下，RAW264.7細(xì)胞從生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換至含有胰蛋白酶的不含血清的感染培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的TNF-α、高水平的MIP-1γ，以及sTNFRII和趨化因子MIP-1水平的相對適中的增加。流感感染也誘導(dǎo)細(xì)胞因子G-CSF的產(chǎn)生，在對照樣本培養(yǎng)基中未檢測出細(xì)胞因子G-CSF。EM-1421(25μM)阻斷了這些效應(yīng)中的許多種。如流感病毒誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生一樣，EM-1421完全地阻斷了培養(yǎng)基誘導(dǎo)的TNF-α和MIP-1γ的產(chǎn)生。流感病毒誘導(dǎo)的M1P-1γ的產(chǎn)生被阻斷約60％，G-CSF的產(chǎn)生被完全地阻斷。相反，EM-1421不抑制流感病毒誘導(dǎo)的sTNFRII或MCP-1的產(chǎn)生。
進(jìn)行ELISA檢測細(xì)胞因子β干擾素(IFN-β)和IL-6。在芯片上不包括IFN-β，感染流感病毒A可以誘導(dǎo)該細(xì)胞因子。然而，在低(A)和高(B)MOI兩種條件下，在接種病毒24小時后從感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中未檢測出顯著量的IFN-β(數(shù)據(jù)未示出)。流感病毒A誘導(dǎo)β干擾素的能力是呈高度毒株依賴的(Hayman等人2006，病毒學(xué)(Virology)，34752)，顯然毒株A/WS/33是非誘導(dǎo)劑。EM-1421也不誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生。
雖然已經(jīng)報告某些流感毒株誘導(dǎo)IL-6，但是如上文所描述的沒有從芯片分析檢測出IL-6誘導(dǎo)，這表明毒株A/WS/33也不是該細(xì)胞因子的誘導(dǎo)劑。在感染毒株A/WS/33后，在低(A)或高(B)MOI都沒有由ELISA檢測法檢測出高的IL-6值，這確認(rèn)了芯片分析的結(jié)果。在低MOI條件下，在使用EM-1421后，檢測出低的IL-6值。然而，由于IL-6的值非常低(10pg/ml)，預(yù)測該觀察結(jié)果的意義是困難的。
除了TNF-α外，我們進(jìn)行的芯片分析還揭示EM-1421也阻斷流感病毒誘導(dǎo)的MIP-1γ和G-CSF的產(chǎn)生。MIP1-γ也稱為CCL9是一種趨化因子，其活性與包括肺部炎癥在內(nèi)的許多細(xì)胞過程相關(guān)(Rosenblum-Lichtenstein等人，2006，美國呼吸系統(tǒng)細(xì)胞和分子生物學(xué)雜志(Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.)35415)。G-CSF在調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生方面是關(guān)鍵的，缺少這種基因的鼠表現(xiàn)出進(jìn)入肺中的中性粒細(xì)胞浸潤水平的降低(Gregory等人，2006，血液(Blood)，早于印刷刊物的電子版)。EM-1421對這兩種分子的抑制進(jìn)一步增加了對EM-1421可以預(yù)防肺部與流感相關(guān)的炎癥的支持。在這些試驗中使用的流感A/WS/33株不誘導(dǎo)已經(jīng)報告的附隨流感感染的幾種細(xì)胞因子和趨化因子，包括IFN-β、IL-6和RANTES。流感病毒A毒株在其誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子方面的能力變化廣泛。試驗與其它流感毒株一起進(jìn)行，例如A/PR/8/34，已經(jīng)報告其除了誘導(dǎo)TNF-α外還誘導(dǎo)許多導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子(Wareing等人，2004，白血球生物學(xué)雜志(J.Leukoc.Biol.)76886)。
更具體而言，關(guān)于用于測定M4N對細(xì)胞因子的產(chǎn)生的方法，在所述方法中使用了“鼠炎癥芯片-1”，陣光生物技術(shù)股份公司，亞特蘭大，喬治亞州)。根據(jù)實施例1中描述的程序，購買RAW264.7巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)，使用LPS(1μg/ml)刺激，使用EM-1421(25μM)處理，采集細(xì)胞。在與培養(yǎng)基(含有2mg/ml胰蛋白酶、2.5％HEPES緩沖液和0.2％BSA的基礎(chǔ)DME)、0.002 MOI的A/WS/33流感病毒A或流感病毒和EM-1421一起孵育24小時后從RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液(1.5 x 105細(xì)胞/孔)收集上清液。根據(jù)制造商的說明書使用鼠炎癥芯片-1測量上清液中的細(xì)胞因子。簡而言之，使用硝化纖維素Ab芯片孵育培養(yǎng)上清液約2h，清洗，與第二種Ab溶液接觸，使用ECL溶液培養(yǎng)，并與X光膠卷接觸。掃描芯片放射自顯影。使用Photoshop(Adobe)分析并測定各芯片位置的平均像素灰度。對8種檢測產(chǎn)品的兩個重復(fù)點的平均值進(jìn)行作圖。芯片上未檢測的其它32種產(chǎn)品未示出。在各個芯片上陽性對照點為約100-110單位，在重復(fù)點之間SEM低于5％。淋巴(Lymph.)＝淋巴細(xì)胞趨化因子(lymphotactin)。
更具體而言，關(guān)于使用的用于由RAW 264.7巨噬細(xì)胞檢測產(chǎn)生IFN-β或IL-6的ELISA法，1.5 x 105個RAW 264.7巨噬細(xì)胞/孔平鋪于含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基的24孔板中過夜。在低MOI檢測條件下，移去培養(yǎng)基，在病毒生長培養(yǎng)基中(含有2μg/ml的胰蛋白酶、2.5％HEPES緩沖液和0.2％ BSA的基礎(chǔ)DME)使用MOI為0.002的200μl的接種病毒(毒株A/WS/33)替換，并允許病毒吸附30分鐘。在使用的高M(jìn)OI檢測條件下，1.5 x 105個RAW 264.7巨噬細(xì)胞/孔平鋪于含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基的24孔板中過夜。移去培養(yǎng)基，在含有10％的FCS的DME培養(yǎng)基中使用MOI為5的200μl的接種病毒(毒株A/WS/33)替換，并允許病毒吸附30分鐘。然后增加培養(yǎng)基的體積至1ml。當(dāng)體積增加至1ml時，EM-1421的最終濃度增加至25μM。不含有病毒和EM-1421(“培養(yǎng)基”)的孔或僅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作為“模擬感染”孔，其與感染的孔受到相同的處理但沒有病毒。在孵育約24小時后，收集培養(yǎng)上清液，通過ELISA檢測IFN-β或IL-6。示出的數(shù)據(jù)為兩個獨立試驗的平均值，每個試驗進(jìn)行兩次重復(fù)的感染。未示出之處，SEM低于標(biāo)志大小。ELISA點檢測兩次。
該實施例的結(jié)果表明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制響應(yīng)于流感病毒感染除TNF-α其它幾種細(xì)胞因子的過多產(chǎn)生，說明所述化合物和相關(guān)的兒茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治療在流感感染時由高水平的所述細(xì)胞因子介導(dǎo)的疾病或紊亂。
本發(fā)明的實施例說明通式(I)的兒茶酚丁烷可以抑制由流感病毒感染的引起的促炎細(xì)胞因子，例如TNF-α的過量產(chǎn)生，以及促炎脂質(zhì)介質(zhì)，PGE2的過量產(chǎn)生，例如，且說明式(I)的兒茶酚丁烷也可以減少TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而減少宿主細(xì)胞中流感病毒的復(fù)制。這些結(jié)果說明兒茶酚丁烷可用于治療流感病毒感染和相關(guān)的疾病和失調(diào)。
可以理解本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對上述實施方案進(jìn)行改變而不偏離本發(fā)明的寬泛的發(fā)明構(gòu)思。因此，可以理解本發(fā)明不限于所公開的特定的實施方案，而是意欲包括在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的主旨和范圍內(nèi)的修改。
權(quán)利要求
1.一種治療受試對象中流感病毒感染的方法，所述方法包括給受試對象施用有效治療量的通式(I)的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；?、亞烴基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)；條件是當(dāng)R7、R8和R9之一表示氫時，那么-OR1、-OR2與R7、R8和R9中的其它兩者不同時表示-OH。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽通過選自包括下述組的一種或多種給藥途徑給藥鼻內(nèi)給藥；口服；吸入給藥；皮下給藥；透皮給藥；靜脈給藥；口腔給藥；腹膜內(nèi)給藥；眼內(nèi)給藥；眼周給藥；肌肉內(nèi)給藥；植入給藥；輸注以及中央靜脈給藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽通過口服或靜脈給藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽通過一種組合物給藥，所述組合物包括兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括(a)水溶性有機(jī)溶劑；(b)環(huán)糊精或改性環(huán)糊精；(c)離子、非離子或兩性表面活性劑；(d)改性纖維素；或(e)不溶于水的脂質(zhì)；或(a)-(e)中的任意組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括下述物質(zhì)的至少一種或混合物二甲基亞砜(DMSO)、磷酸緩沖鹽水、鹽水、脂質(zhì)基制劑、脂質(zhì)體制劑、納米顆粒制劑、膠束制劑、水溶性制劑、生物可降解聚合物、水溶液制劑、疏水制劑、脂質(zhì)基載體、聚合物制劑、環(huán)糊精、改性環(huán)糊精、緩釋制劑、表面活性劑、食用脂或食用油。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述納米顆粒制劑包括包括下述物質(zhì)的至少一種或混合物聚(DL-丙交酯-乙交酯)共聚物、聚乙烯醇、D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽和聚(丙交酯-乙交酯)共聚物-單甲氧基-聚(聚乙二醇)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體制劑包括下述物質(zhì)的至少一種或混合物卵磷脂、膽固醇、PEG-DPPE、二硬脂酰卵磷脂、膽固醇和PEG-DPPE，以及包括下述物質(zhì)的一種制劑1-2-二油酰-sn-甘油-3-膽堿磷酸、1-2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)鈉鹽、膽固醇、三油精和三辛酸甘油酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括下述物質(zhì)的至少一種或混合物玉米油、蓖麻油、花生油或二甲基亞砜。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述聚合物制劑選自包括下述組的一種成分1，3-雙-(對羧基苯氧基)丙烷、癸二酸、聚(乙烯-醋酸乙烯酯)共聚物以及聚(丙交酯-乙交酯)共聚物。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑使得兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽采以局部高濃度和在一定期間的緩釋中的至少一種或混合形式。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述組合物為選自包括下述組的一種形式粉末、氣溶膠、乳油、軟膏、凝膠體、片劑、膠囊、丸劑、囊片、微粒、糖漿、溶液、漱口液、酏劑、乳化液、栓劑、懸浮液、噴霧劑和滴劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷在給藥前溶解在鹽水、二甲基亞砜或乙醇中。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽與選自包括下述組的第二種藥劑組合給藥第二抗流感劑、抗炎劑、抗感染劑以及其組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗炎劑選自包括皮質(zhì)類固醇和非甾體的抗炎藥物的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗感染劑選自包括抗生素藥物、乙醇和聚維酮的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二抗流感劑選自包括通式(I)的第二種兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽、金剛胺、，奧塞米韋、帕拉米韋、金剛乙胺、扎那米韋和阿比多爾的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，在給藥兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽之前、基本上同時或之后給藥所述第二藥劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地表示-H、低級烷基、低級?；?，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基；R5、R6、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R7、R8和R9獨立地為-H、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中未取代的或取代的氨基酸殘基在其羧基末端與芳環(huán)相連。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地表示-H、低級烷基、低級?；?OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基；R5、R6、R7、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R8和R9獨立地為-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中未取代的或取代的氨基酸殘基在羧基末端與芳環(huán)相連。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3或-(C＝O)CH2N(CH3)2或其藥學(xué)上可接受的鹽。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，R8和R9獨立地為-OCH3或-O(C＝O)CH2N(CH3)2或其藥學(xué)上可接受的鹽。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3、-(C＝O)CH2N(CH3)2或-(C＝O)CH2N+H(CH3)2·Cl-，以及R8和R9獨立地為-OCH3、-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-O(C＝O)CH2N+H(CH3)2·2Cl-。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-H或-CH3，以及R8和R9獨立地為-OH或-OCH3，條件是所述兒茶酚丁烷不為NDGA。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3，以及R8和R9獨立地為-OCH3。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽以選自包括下述量的組給受試對象給藥約0.01、約0.05、約0.1、約0.5、約1.0、約2.5、約5.0、約10、約15、約25、約50、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400mg/kg體重每次劑量。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述流感病毒感染是由禽流感病毒引起。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒是流感病毒亞型H5N1。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述受試對象為人。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療流感病毒感染包括阻斷、預(yù)防、減輕或緩解受試對象中與流感病毒感染相關(guān)的疾病或紊亂。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述與流感病毒感染相關(guān)的疾病或紊亂選自包括系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙、急性呼吸窘迫綜合癥、反應(yīng)性的噬紅細(xì)胞作用以及淋巴細(xì)胞減少的組。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述與流感病毒感染相關(guān)的疾病或紊亂為氣喘、肺炎、流感后腦炎、細(xì)菌性肌炎、心臟心電圖的變化、支氣管炎、肺結(jié)核、癌、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、硬皮病系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、囊性纖維化、惡病質(zhì)、整體肌無力失調(diào)、心力衰竭、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化或格林-巴利綜合癥。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述治療流感病毒感染包括抑制、預(yù)防或減少受試對象中流感病毒的生長。
34.一種治療受試對象中流感病毒感染的方法，所述方法包括給受試對象施用有效治療量的通式(II)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R14、R15、R16和R17分別獨立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，R18和R19分別獨立地表示-H或低級烷基；條件是R14、R15、R16和R17不同時為-OH。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，R14、R15、R16和R17分別表示-OCH3。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，R14、R15、R16和R17分別表示未取代的或取代的氨基酸殘基和其藥學(xué)上可接受的鹽，其中未取代的或取代的氨基酸殘基在其羧基末端與芳環(huán)相連。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述未取代的或取代的氨基酸殘基包括未取代的或取代的甘氨酸殘基和其藥學(xué)上可接受的鹽。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，R18和R19分別獨立地表示-CH3或-CH2CH3。
39.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽通過選自包括下述組的一種或多種給藥途徑給藥鼻內(nèi)給藥；口服；吸入給藥；皮下給藥；透皮給藥；靜脈給藥；口腔給藥；腹膜內(nèi)給藥；眼內(nèi)給藥；眼周給藥；肌肉內(nèi)給藥；植入給藥；輸注以及中央靜脈給藥。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽通過口服或靜脈給藥。
41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽以選自包括下述量的組給受試對象給藥約0.01、約0.05、約0.1、約0.5、約1.0、約2.5、約5.0、約10、約15、約25、約50、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400mg/kg體重每次劑量。
42.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述流感病毒感染是由禽流感病毒引起的。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒是流感病毒亞型H5N1。
44.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述受試對象為人。
45.一種治療受試對象中禽流感病毒感染的方法，所述方法包括給受試對象施用有效治療量的通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R20、R21、R22和R23分別獨立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，條件是R20、R21、R22和R23不同時為-OH。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，R20、R21、R22和R23分別獨立地表示-OCH3。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，R20、R21、R22和R23分別表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中未取代的或取代的氨基酸殘基在其羧基末端與芳環(huán)相連。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述未取代的或取代的氨基酸殘基包括未取代的或取代的甘氨酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽通過選自包括下述組的一種或多種給藥途徑給藥鼻內(nèi)給藥；口服；吸入給藥；皮下給藥；透皮給藥；靜脈給藥；口腔給藥；腹膜內(nèi)給藥；眼內(nèi)給藥；眼周給藥；肌肉內(nèi)給藥；植入給藥；輸注以及中央靜脈給藥。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽通過口服或靜脈給藥。
51.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽以選自包括下述量的組給受試對象給藥約0.01、約0.05、約0.1、約0.5、約1.0、約2.5、約5.0、約10、約15、約25、約50、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400mg/kg體重每次劑量。
52.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述流感病毒感染是由禽流感病毒引起的。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒是流感病毒亞型H5N1。
54.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述受試對象為人。
55.一種治療受試對象中流感病毒感染的方法，所述方法包括給受試對象施用有效治療量的下述組合物，所述組合物含有選自包括三-O-甲基去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)、四-O-甲基NDGA、四-甘氨酰NDGA、四-二甲基甘氨酰NDGA的組的兒茶酚丁烷，或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽通過選自包括下述組的一種或多種給藥途徑給藥鼻內(nèi)給藥；口服；吸入給藥；皮下給藥；透皮給藥；靜脈給藥；口腔給藥；腹膜內(nèi)給藥；眼內(nèi)給藥；眼周給藥；肌肉內(nèi)給藥；植入給藥；輸注以及中央靜脈給藥。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽通過口服或靜脈給藥。
58.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽以選自包括下述量的組給受試對象給藥約0.01、約0.05、約0.1、約0.5、約1.0、約2.5、約5.0、約10、約15、約25、約50、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400mg/kg體重每次劑量。
59.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述流感病毒感染是由禽流感病毒引起的。
60.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒是流感病毒亞型H5N1。
61.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述受試對象為人。
62.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括油。
63.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑包括聚氧乙烯蓖麻油、乙醇和鹽。
64.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述組合物包括每次劑量至少約7mg的三-O-甲基NDGA或四-O-甲基NDGA。
65.一種治療人受試對象中H5N1亞型流感病毒感染的方法，所述方法包括口服給人受試對象施用有效治療量的通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽，使用的量為約0.01至約400mg/kg體重每次劑量
其中R20、R21、R22和R23分別表示-OCH3。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述治療H5N1亞型流感病毒感染的方法包括阻斷、預(yù)防、減輕或緩解伴隨人受試對象H5N1亞型流感病毒感染的疾病或紊亂。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，在人受試對象中與H5N1亞型流感病毒感染相關(guān)的的所述疾病或紊亂選自包括系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)、多器官功能障礙、急性呼吸窘迫綜合癥、反應(yīng)性的噬紅細(xì)胞作用以及淋巴細(xì)胞減少的組。
68.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，在人受試對象中與H5N1亞型流感病毒感染相關(guān)的所述疾病或紊亂為氣喘、肺炎、流感后腦炎、細(xì)菌性肌炎、心臟心電圖的變化、支氣管炎、肺結(jié)核、癌、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、硬皮病、系統(tǒng)性紅斑性狼瘡、囊性纖維化、惡病質(zhì)、整體肌無力失調(diào)、心力衰竭、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化或格林-巴利綜合癥。
69.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于，所述治療H5N1亞型流感病毒感染的方法包括抑制、預(yù)防或減少人受試對象中H5N1亞型流感病毒的生長。
70.一種抑制由于流感病毒感染而誘導(dǎo)細(xì)胞中的促炎細(xì)胞因子的方法，所述方法包括對細(xì)胞施用有效量的通式(I)的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；啛N基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述促炎因子選自包括趨化因子、白細(xì)胞介素(IL)、淋巴因子、腫瘤壞死因子(TNF)以及干擾素(IFN)的組。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述促炎因子選自包括TNF-α、巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)蛋白1γ(MIP-1γ)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、IL-1α、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞α趨化物(I-TAC)、IL-2、金屬蛋白酶-1組織抑制因子(TIMP-1)、TIMP-2、B細(xì)胞趨化因子(BLC)、IL-3以及活性調(diào)節(jié)的、正常T細(xì)胞表達(dá)以及分泌的趨化因子(RANTES)的組。
73.根據(jù)權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述促炎因子為TNF-α。
74.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述巨噬細(xì)胞為人巨噬細(xì)胞。
76.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，所述流感病毒為禽流感病毒。
77.根據(jù)權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒為流感病毒亞型H5N1。
78.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-H、低級烷基、低級?；?，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基；R5、R6、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R7、R8和R9獨立地為-H、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中未取代的或取代的氨基酸殘基在其羧基末端與芳環(huán)相連。
79.根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-H、低級烷基、低級酰基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基；R5、R6、R7、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R8和R9獨立地為-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中未取代的或取代的氨基酸殘基在其羧基末端與芳環(huán)相連。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3或-(C＝O)CH2N(CH3)2或其藥學(xué)上可接受的鹽。
81.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，R8和R9獨立地為-OCH3或-O(C＝O)CH2N(CH3)2或其藥學(xué)上可接受的鹽。
82.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3、-(C＝O)CH2N(CH3)2或-(C＝O)CH2N+H(CH3)2·Cl-，以及R8和R9獨立地為-OCH3、-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-O(C＝O)CH2N+H(CH3)2·2Cl-。
83.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-H或-CH3以及R8和R9獨立地為-OH或-OCH3。
84.根據(jù)權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3以及R8和R9獨立地為-OCH3。
85.一種抑制由于流感病毒感染而誘導(dǎo)細(xì)胞中促炎脂質(zhì)介質(zhì)的方法，所述方法包括對細(xì)胞施用有效量的通式(I)的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；啛N基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)。
86.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述促炎脂質(zhì)介質(zhì)為前列腺素或白三烯。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于，所述前列腺素選自包括前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F1α(PGF1α)、前列腺素F2α(PGF2α)、前列腺素H2(PGH2)以及環(huán)前列腺素的組。
88.根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其特征在于，所述前列腺素為PGE2。
89.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。
90.根據(jù)權(quán)利要求89所述的方法，其特征在于，所述巨噬細(xì)胞為人巨噬細(xì)胞。
91.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述流感病毒為禽流感病毒。
92.根據(jù)權(quán)利要求91所述的方法，其特征在于，所述禽流感病毒為流感病毒亞型H5N1。
93.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-H、低級烷基、低級酰基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基；R5、R6、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R7、R8和R9獨立地為-H、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中未取代的或取代的氨基酸殘基在其羧基末端與芳環(huán)相連。
94.根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-H、低級烷基、低級?；?，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4獨立地為低級烷基，R5、R6、R7、R10、R11、R12和R13獨立地為-H；R8和R9獨立地為-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；其中未取代的或取代的氨基酸殘基在其羧基末端與芳環(huán)相連。
95.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3或-(C＝O)CH2N(CH3)2或其藥學(xué)上可接受的鹽。
96.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，R8和R9獨立地為-OCH3或-O(C＝O)CH2N(CH3)2或其藥學(xué)上可接受的鹽。
97.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3、-(C＝O)CH2N(CH3)2或-(C＝O)CH2N+H(CH3)2·Cl-以及R8和R9獨立地為-OCH3、-O(C＝O)CH2N(CH3)2或-O(C＝O)CH2N+H(CH3)2·2C-。
98.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-H或-CH3，以及R8和R9獨立地為-OH或-OCH3。
99.根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法，其特征在于，R1和R2獨立地為-CH3，以及R8和R9獨立地為-OCH3。
100.一種抑制由于H5N1亞型流感病毒感染而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中腫瘤壞死因子α的方法，所述方法包括給巨噬細(xì)胞施用有效量的通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R20、R21、R22和R23分別表示-OCH3。
一種抑制由于H5N1亞型流感病毒感染而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中前列腺素E2(PGE2)的方法，所述方法包括給巨噬細(xì)胞施用有效量的通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R20、R21、R22和R23分別表示-OCH3。
一種含有通式I的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽的試劑盒
其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；啛N基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)；條件是當(dāng)R7、R8和R9之一表示氫時，那么-OR1、-OR2與R7、R8和R9中的其它兩者不同時表示-OH；以及通過使用兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽治療受試對象流感病毒感染的說明書。
根據(jù)權(quán)利要求102所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括通式(II)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R14、R15、R16和R17分別獨立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，R18和R19分別獨立地表示-H或低級烷基；條件是R14、R15、R16和R17不同時為-OH；以及通過使用NDGA衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽治療受試對象流感病毒感染的說明書。
根據(jù)權(quán)利要求103所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括通式(III)的去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物或其藥學(xué)上可接受的鹽
其中R20、R21、R22和R23分別獨立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽，條件是R20、R21、R22和R23不同時為-OH。
根據(jù)權(quán)利要求104所述的試劑盒，其特征在于，R20、R21、R22和R23分別獨立地表示-OCH3以及用于治療人受試對象中H5N1亞型流感病毒感染的說明書。
根據(jù)權(quán)利要求102所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于將兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽給受試對象給藥的給藥裝置。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于治療受試對象中流感病毒感染或相關(guān)的疾病、失調(diào)或機(jī)理的方法，所述方法包括給受試對象施用有效治療量的通式(I)的兒茶酚丁烷或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中R1和R2分別獨立地表示氫、低級烷基、低級?；?、亞烴基，或-OR1和-OR2分別獨立地表示未取代的或取代的氨基酸殘基或其藥學(xué)上可接受的鹽；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分別獨立地表示氫或低級烷基；以及R7、R8和R9分別獨立地表示氫、-OH、低級烷氧基、低級酰氧基、未取代的或取代的氨基酸殘基或其鹽，或一起可以形成烷撐二氧基的任何兩個相鄰的基團(tuán)；條件是當(dāng)R7、R8和R9之一表示氫時，那么-OR1、-OR2與R7、R8和R9中的其它兩者不同時表示-OH。
文檔編號A61K31/05GK101389319SQ200780006666
公開日2009年3月18日 申請日期2007年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月23日
發(fā)明者喬納森·丹尼爾·赫勒, 斯科特·馬修·拉斯特, 羅西奧·亞歷杭德雷·洛佩斯, 尼爾·弗雷澤 申請人:埃里莫斯醫(yī)藥品有限公司, 北卡羅萊納州大學(xué)