專利名稱：半乳糖衍生物、藥物載體及醫(yī)藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及半乳糖衍生物、藥物載體及醫(yī)藥組合物。
技術(shù)背景肝細(xì)胞的膜表面上存在識(shí)別脫唾液酸糖蛋白的受體。所述受體具有識(shí) 別脫唾液酸糖蛋白中的半乳糖殘基，將脫唾液酸糖蛋白攝入肝細(xì)胞的功能 (例如參照非專利文獻(xiàn)l)。目前，正在研究通過(guò)利用這樣的底物特異性在構(gòu)成脂質(zhì)體的脂質(zhì)上添 加半乳糖來(lái)提高脂質(zhì)體對(duì)肝臟的指向性，但均未獲得令人滿意的結(jié)果(例如參照專利文獻(xiàn)1和2)。另一方面，近年來(lái)利用RNA干擾(以下稱為"RNAi")的被稱為短干擾R NA(以下稱為"siRNA")的核酸藥物受到注目，開展了大量的研究(例如參 照專利文獻(xiàn)3和4)。 siRNA即使單獨(dú)對(duì)人體投與也難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此需 要例如包含于適當(dāng)?shù)妮d體中來(lái)給藥。專利文獻(xiàn)l:日本專利特開平6-271597號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2:日本專利特開平9-235292號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開第02/055692號(hào)文本專利文獻(xiàn)4:國(guó)際公開第02/055693號(hào)文本非專利文獻(xiàn)l:M. Spiess， "Biochemistry", 1990年，29巻，10009-10 018頁(yè)發(fā)明的揭示本發(fā)明的目的主要在于提供新型有用的半乳糖衍生物、含有其作為必需 構(gòu)成成分的藥物載體以及含有包含藥物的該藥物載體的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明人反復(fù)認(rèn)真研究后發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將具有某種特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)的半乳糖
衍生物用作藥物載體的構(gòu)成成分，對(duì)肝臟的指向性和所含藥物的藥效發(fā)揮顯著 提高，從而完成了本發(fā)明。作為本發(fā)明，例如可以例舉下述1 3所述的發(fā)明。1.以下述通式(I)表示的半乳糖衍生物(以下稱為"本發(fā)明衍生物")。式(I)中，W表示氫、可取代的碳數(shù)1 10的垸基或者1-(D)-脫氧乳糖-l-基(1-(D)-deoxylactito-1-yl)。R2表示碳數(shù)10 30的飽和或不飽和的脂肪酸殘基。2. 含有上述1所述的半乳糖衍生物和陽(yáng)離子性脂質(zhì)作為必需的構(gòu)成成分的 藥物載體(以下稱為"本發(fā)明載體")。3. 包含藥物和上述2所述的藥物載體的醫(yī)藥組合物(以下稱為"本發(fā)明組 合物")。作為R'中所述的碳數(shù)1 10的烷基，可以是直鏈狀或分支狀，沒(méi)有特別限 定，可以例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、 叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基。其中，較好是碳數(shù)1 4的直 鏈狀或分支狀的垸基，特別好是甲基、乙基。作為被取代的該烷基，可以例舉 烷氧基烷基、鹵代烷基。作為所述垸氧基烷基，可以例舉例如甲氧基甲基、甲氧基乙基、乙氧基甲 基、乙氧基乙基。其中，較好是碳數(shù)1 4的垸氧基垸基，特別好是甲氧基乙基、 乙氧基乙基。鹵代烷基的垸基部分與上述垸基同義。此外，作為鹵代烷基的齒 素，可以例舉例如氟、氯、溴。具體來(lái)說(shuō)，可以例舉例如氯甲基、氯乙基、氟 甲基、溴甲基、三氟甲基。作為R2中所述的碳數(shù)10 30的飽和的脂肪酸殘基，可以例舉例如己?；?、 十二烷酰基、十四垸酰基、十八垸?；?、二十垸酰基、二十二烷?；⒍?烷?；⒍轷；?、二十九垸酰基、三十烷?；Ｆ渲?，較好是碳數(shù)10 20的飽和的脂肪酸殘基，特別好是十八烷?；?。此外，作為碳數(shù)10 30的不飽 和的脂肪酸殘基，可以例舉例如油?；?、亞油?；?、花生四烯?；⑸窠?jīng)?；?。其中，較好是碳數(shù)10 20的不飽和的脂肪酸殘基，特別好是油?；?。作為優(yōu)選的本發(fā)明衍生物，可以例舉例如N-[1-(D)-脫氧乳糖-l-基] 油酰胺、N,N-二[1-(D)-脫氧乳糖-l-基]油酰胺。附圖
的簡(jiǎn)單說(shuō)明圖l表示對(duì)肝臟的指向性?？v軸表示放射活性(dpm)，橫軸表示實(shí)施例l 的本發(fā)明化合物的含量(mg)。圖2表示丙型肝炎病毒(以下稱為"HCV")的復(fù)制子的復(fù)制抑制活性。 縱軸表示將對(duì)照的產(chǎn)生量設(shè)為100%時(shí)的NS5A蛋白的產(chǎn)生量(對(duì)照的％)。此 外，空白的柱表示siRNA的處理濃度為30nM的細(xì)胞的結(jié)果，涂黑的柱表示 siRNA的處理濃度為100nM的細(xì)胞的結(jié)果。圖3表示HCV的復(fù)制子的復(fù)制抑制活性。縱軸表示將對(duì)照的產(chǎn)生量設(shè)為 100%時(shí)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶11蛋白(以下稱為"NPTII蛋白")的產(chǎn)生量(對(duì) 照的％)。此外，空白的柱表示siRNA的處理濃度為30nM的細(xì)胞的結(jié)果，涂 黑的柱表示siRNA的處理濃度為100nM的細(xì)胞的結(jié)果。圖4表示人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生抑制活性?？v軸表示將對(duì)照的產(chǎn)生量設(shè)為 100X時(shí)的人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量(對(duì)照的M)。此外，空白的柱表示siRNA 的處理濃度為30nM的細(xì)胞的結(jié)果，涂黑的柱表示siRNA的處理濃度為100nM 的細(xì)胞的結(jié)果。圖5表示人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生抑制活性?？v軸表示將對(duì)照的產(chǎn)生量設(shè)為 100X時(shí)的人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量(對(duì)照的X)。此外，空白的柱表示siRNA 的處理濃度為30nM的細(xì)胞的結(jié)果，涂黑的柱表示siRNA的處理濃度為100nM 的細(xì)胞的結(jié)果。圖6表示細(xì)胞毒性?？v軸表示將對(duì)照的細(xì)胞數(shù)設(shè)為100%時(shí)的細(xì)胞數(shù)(對(duì) 照的％)。此外，空白的柱表示siRNA的處理濃度為30nM的細(xì)胞的結(jié)果，涂 黑的柱表示siRNA的處理濃度為100nM的細(xì)胞的結(jié)果。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式I .本發(fā)明衍生物的制造方法本發(fā)明衍生物(I )可以通過(guò)將以下述通式(l)表示的胺衍生物和以下述通式(2)表示的羧酸衍生物溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲校谶m當(dāng)?shù)目s合劑的存在 下使其反應(yīng)來(lái)進(jìn)行制造。作為適當(dāng)?shù)娜軇?，只要不參與反應(yīng)即可，沒(méi)有特 別限定，可以例舉例如鹵代烴(例如二氯甲烷、三氯甲垸、四氯化碳、1，2-二氯乙烷)、乙腈、二甲基甲酰胺、它們的混合溶劑。作為縮合劑，可以例 舉例如N，N，-二環(huán)己基碳二亞胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺、 1-羥基苯并三唑。反應(yīng)溫度以在0 80'C的范圍內(nèi)為宜。此外，反應(yīng)時(shí)間根 據(jù)使用原料的種類、反應(yīng)溫度等而不同，通常以在1 30小時(shí)的范圍內(nèi)為宜。(式中，R1、 R2與前述同義)R'為氫或1- (D)-脫氧乳糖-l-基的胺衍生物(1)可以通過(guò)將D- (+)-乳糖(3) 和適當(dāng)?shù)匿@鹽(例如四硼酸銨四水合物、乙酸銨、碳酸銨)溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲校?在酸性條件下使還原劑與之作用來(lái)進(jìn)行制造。作為適當(dāng)?shù)娜軇?，只要不參與 反應(yīng)即可，沒(méi)有特別限定，可以例舉例如水、醇類(例如甲醇、乙醇、異丙 醇)、鹵代烴(例如二氯甲烷、二氯乙垸、三氯甲烷)、它們的混合溶劑。作 為酸，可以例舉例如乙酸、鹽酸、甲苯磺酸。作為還原劑，可以例舉例如 硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、氫化鋰鋁。反應(yīng)溫度以在0 8(TC的范圍內(nèi)為宜。 此外，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)使用原料的種類、反應(yīng)溫度等而不同，通常以在1 100 小時(shí)的范圍內(nèi)為宜。另外，制造Ri為氫的胺衍生物(l)時(shí)，相對(duì)于l當(dāng)量的D-(-)-乳糖，最好 使用1 10當(dāng)量的范圍內(nèi)的銨鹽。此外，制造W為1-(D)-脫氧乳糖-1-基的胺衍 生物(1)時(shí)，相對(duì)于l當(dāng)量的銨鹽，最好使用2當(dāng)量以上的D-(+)-乳糖。R2-OH ( 2 〉縮合劑(3) (la)(式中，R3表示氫或1-(D)-脫氧乳糖-l-基)R'為可取代的碳數(shù)l 10的垸基的胺衍生物(l)可以通過(guò)在上述的Ri為氫 或1- (D)-脫氧乳糖-l-基的胺衍生物(1)的胺衍生物(1)的制造方法中，使用可 取代的碳數(shù)1 10的烷基胺代替銨鹽來(lái)進(jìn)行制造。作為所述的烷基胺的烷基部分，可以是直鏈狀或分支狀，沒(méi)有特別限定， 可以例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁 基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基。其中，較好是碳數(shù)1 4的直鏈狀 或分支狀的垸基，特別好是甲基、乙基。作為被取代的烷基胺，可以例舉垸氧 基胺。作為所述烷氧基胺，可以例舉例如甲氧基甲基胺、甲氧基乙基胺、乙氧 基甲基胺、乙氧基乙基胺。(3 ) O "(式中，W表示可取代的碳數(shù)l 10的烷基)^為氫的本發(fā)明衍生物(I )也可以通過(guò)在上述的本發(fā)明衍生物(I )的制 造方法中，胺衍生物使用包含R'為氫的胺衍生物(l)和R'為l-(D)-脫氧乳糖-l-基的胺衍生物(l)的胺衍生物，反應(yīng)后，用適當(dāng)?shù)娜軇┹腿?lái)進(jìn)行制造。作為 使用的溶劑，沒(méi)有特別限定，可以例舉例如水、醇類(例如甲醇、乙醇、異 丙醇)、鹵代烴(例如二氯甲垸、二氯乙垸、三氯甲垸)、它們的混合溶劑。II.本發(fā)明載體本發(fā)明載體以本發(fā)明衍生物和陽(yáng)離子性脂質(zhì)為必需的構(gòu)成成分，具有能
夠?qū)⒑笫龅乃幬镞f送至細(xì)胞內(nèi)的性質(zhì)。具體來(lái)說(shuō)，可以采用脂質(zhì)體或脂肪乳劑 等形態(tài)。作為本發(fā)明載體的必需構(gòu)成成分的陽(yáng)離子性脂質(zhì)，只要是醫(yī)藥上允許的 陽(yáng)離子性脂質(zhì)即可，沒(méi)有特別限定，可以例舉例如2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基 甲?；?1， 3-0-二油?；视?、氯化N- U- (2， 3-二油基氧基)丙基} -N， N， N-三甲 基銨、溴化二甲基二(十八烷基)銨、溴化l，2-二(十四垸基氧基丙基)-3-二甲 基-羥乙基銨、N，N'，N"，N111-四甲基-N，N'，N"，N111-四(十六垸基)精胺、2， 3-二油 基氧基-N-{2-(精胺酰胺基)乙基}-N， N-二甲基-l-丙基銨三氟乙酸鹽(2， 3-dio leyloxy-N- {2- (spermine carboxamido) ethyl卜N， N-dimethyl-1-propana minium trif luoroacetate)?？梢允褂闷渲械囊环N或兩種以上。其中，特別 好是2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1, 3-0-二油?；视?。本發(fā)明載體中的本發(fā)明衍生物和陽(yáng)離子性脂質(zhì)的配比為，相對(duì)于l重量 份陽(yáng)離子性脂質(zhì)，本發(fā)明衍生物以在0.01 10重量份的范圍內(nèi)為宜，較好 是0.05 5重量份的范圍內(nèi)，更好是0.5 3重量份的范圍內(nèi)。本發(fā)明載體中，除了作為必需構(gòu)成成分的本發(fā)明衍生物和陽(yáng)離子性脂 質(zhì)之外，可以再加入磷脂。作為所述磷脂，只要是醫(yī)藥上允許的磷脂即可， 沒(méi)有特別限定，可以例舉例如磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂 酰絲氨酸、鞘磷脂、卵磷脂、二棕櫚?；字Ｄ憠A、二硬脂?；字Ｄ憠A、 二棕櫚酰基磷脂酰甘油。可以使用其中的一種或兩種以上。其中，特別好是蛋 黃磷脂酰膽堿、蛋黃卵磷脂、大豆卵磷脂。在還加入磷脂的情況下，本發(fā)明載體中的本發(fā)明衍生物和磷脂的配比 為，相對(duì)于l重量份磷脂，本發(fā)明衍生物以在0.01 100重量份的范圍內(nèi)為 宜，較好是O. 1 10重量份的范圍內(nèi)，更好是O. 3 2重量份的范圍內(nèi)。此外， 相對(duì)于l重量份陽(yáng)離子性脂質(zhì)，本發(fā)明衍生物和磷脂的總和以在0.01 10重 量份的范圍內(nèi)為宜，較好是0.05 5重量份的范圍內(nèi)，更好是0.5 3重量份 的范圍內(nèi)。本發(fā)明載體的分散液可以通過(guò)將本發(fā)明衍生物和陽(yáng)離子性脂質(zhì)或者本 發(fā)明衍生物、陽(yáng)離子性脂質(zhì)和磷脂混合，用常規(guī)方法將其分散于水溶液中 來(lái)調(diào)制。分散可以適當(dāng)采用超聲波分散裝置、乳化分散裝置等裝置。m.本發(fā)明組合物作為可用于本發(fā)明組合物的"藥物"，可以例舉例如水溶性陰離子性 化合物、抗腫瘤劑、抗病毒劑、抗生素。具體來(lái)說(shuō)，可以例舉作為核酸化合物的雙鏈RNA、雙鏈DNA或低聚核酸，作為酸性糖的硫酸乙酰肝素或硫酸 葡聚糖等，細(xì)胞因子類，環(huán)狀A(yù)MP、 ATP和IP3等第二信使類，青霉素類和頭 孢菌素類，維生素C和視黃醇類等維生素類，其它具有酸性基團(tuán)的已知藥物， 干擾素(a、 3、 Y)，白細(xì)胞介素(IL-1、 IL-2)，集落刺激因子(CSF)，腫 瘤壞死因子(TNF)，左旋咪唑，苯丁抑制素，視黃酸，5-氟尿嘧啶(5-FU)， 阿糖胞苷(Am-C)，阿糖腺苷(Ara-A)，順式鉑氨(CDDP)，環(huán)磷酰胺，疊氮 胸苷(AZT)等。作為雙鏈RNA，可以例舉例如以下的物質(zhì)。1. 均聚物 均聚物復(fù)合體 聚肌苷酸 聚胞苷酸、 聚肌苷酸 聚(5-溴胞苷酸)、 聚肌苷酸 聚(2-硫代胞苷酸)、 聚(7-脫氮肌苷酸) 聚胞苷酸、 聚(7-脫氮肌苷酸)，聚(5-溴胞苷酸)、 聚(2'-疊氮肌苷酸) 聚胞苷酸、 聚肌苷酸 聚(胞苷-5'-硫代磷酸)。2. 均聚物 共聚物復(fù)合體 聚肌苷酸 聚(胞苷酸，尿苷酸)、 聚肌苷酸 聚(胞苷酸，4-硫代尿苷酸)。3. 合成核酸和聚陽(yáng)離子的復(fù)合體 聚肌苷酸 聚胞苷酸 聚-L-賴氨酸。4. 其它聚肌苷酸 聚(l-乙烯基胞苷酸)。作為低聚核酸，可以例舉一分子內(nèi)具有10 50、較好是15 30、更好 是18 25個(gè)核酸堿基的RNA、 DNA及它們的衍生物。例如，可以例舉siRNA、 微腿(miRNA)、短發(fā)卡RNA(shRNA)、反義DNA、反義RNA、 DNA酶、核酶、適
體、非編碼RNA。上述低聚核酸并不局限于天然型，為了提高核酸酶耐性等、體內(nèi)的穩(wěn) 定性，構(gòu)成該核苷酸的糖或磷酸主鏈等的至少一部分可以被修飾。作為所 述修飾，可以例舉例如核糖的2'位的修飾、核糖的其它部分的修飾、磷酸主鏈的修飾。作為核糖的2'位的修飾，可以例舉例如將核糖的2'位的羥基取 代為H、 0R5、 R5、 R60R5、 SH、 SR5、 NH2、 NHR5、 N(R5)2、 N3、 CN、 F、 Cl、 Br、 I的修飾。在這里，R5表示垸基或芳基。此外，R6表示亞烷基。作為R5的垸基，可以是直鏈狀或分支狀，沒(méi)有特別限定，可以例舉例如碳 數(shù)1 6的烷基。具體來(lái)說(shuō)，可以例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁 基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、正己基、 異己基。該烷基可以被取代，作為所述取代基，可以例舉例如鹵素、垸基、垸 氧基、氰基、硝基，可以被1 3個(gè)這些基團(tuán)取代。作為所述鹵素，可以例舉氟、 氯、溴、碘。作為所述垸基，可以例舉與上述垸基同樣的基團(tuán)。作為所述垸氧 基，可以是直鏈狀或分支狀，沒(méi)有特別限定，可以例舉例如碳數(shù)1 6的垸氧基。 具體來(lái)說(shuō)，可以例舉甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁 氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、異戊氧基、正己氧基、異己氧基。其 中，特別好是碳數(shù)1 3的垸氧基。作為R5的芳基，可以例舉例如碳數(shù)6 10的芳基。具體來(lái)說(shuō)，可以例舉 例如苯基、a-萘基、P-萘基。其中，特別好是苯基。作為R6的亞垸基，可以是直鏈狀或分支狀，沒(méi)有特別限定，可以例舉例 如碳數(shù)1 6的亞垸基。具體來(lái)說(shuō)，可以例舉例如亞甲基、亞乙基、1，3-亞丙基、 1， 4-亞丁基、1， 5-亞戊基、1, 6-亞己基、2-(乙基)-1, 3-亞丙基、1-(甲基)-1， 4-亞丁基。作為核糖的其它部分的修飾，可以例舉例如使4'位硫代的修飾。作為磷酸 主鏈的修飾，可以例舉例如形成硫代磷酸酯體、二硫代磷酸酯體、垸基磷酸酯 體或氨基磷酸鹽體的修飾。本發(fā)明組合物中所含的本發(fā)明載體和藥物的重量比(本發(fā)明載體/藥物)根 據(jù)藥物的種類、本發(fā)明載體中的本發(fā)明衍生物和陽(yáng)離子性脂質(zhì)的配比等而不 同，以在O. 01 1000的范圍內(nèi)為宜，較好是在10 300的范圍內(nèi)，更好是在100 200的范圍內(nèi)。另外，在含有藥物為低聚核酸的情況下，以在0.01 100的范圍 內(nèi)為宜，較好是在1 30的范圍內(nèi)，更好是在10 20的范圍內(nèi)。本發(fā)明組合物中，除上述的本發(fā)明載體和藥物之外，可以任意地?fù)饺?醫(yī)藥上允許的添加劑。作為所述添加劑，可以例舉例如乳化助劑(例如碳數(shù) 6 22的脂肪酸或其醫(yī)藥上允許的鹽、白蛋白、葡聚糖)、穩(wěn)定劑(例如膽固 醇、磷脂酸)、等滲劑(例如氯化鈉、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻 糖)、pH調(diào)整劑(例如鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、三 乙醇胺)。可以使用其中的一種或兩種以上。本發(fā)明組合物中的該添加劑的含 量以90重量％以下為宜，較好是70重量％以下，更好是50重量％以下。本發(fā)明組合物可以通過(guò)在本發(fā)明載體的分散液中加入藥物并適當(dāng)攪拌來(lái) 調(diào)制。此外，也可以通過(guò)在本發(fā)明載體的制造過(guò)程中加入藥物來(lái)調(diào)制。上述添 加劑可以在分散前或分散后在適當(dāng)?shù)墓ば蛑刑砑?。本發(fā)明組合物例如可以制成液體制劑或其冷凍干燥制劑。制成液體制劑的 情況下，本發(fā)明組合物中所含的本發(fā)明載體的濃度以在O. 001 25Xw/v的范圍 內(nèi)為宜，較好是在0.01 5^w/v的范圍內(nèi)，更好是在O. 1 2Xw/v的范圍內(nèi)。上述冷凍干燥制劑可以通過(guò)用常規(guī)方法將具有液體制劑形態(tài)的本發(fā)明組 合物進(jìn)行冷凍干燥處理來(lái)調(diào)制。例如，將具有液體制劑形態(tài)的本發(fā)明組合物進(jìn) 行適當(dāng)?shù)臏缇?，將?guī)定量分注到玻璃瓶中，在約-40 -2(TC的條件下進(jìn)行約 2小時(shí)的預(yù)冷凍，在約0 1(TC下于減壓下進(jìn)行第一次干燥，然后在約15 25'C 下于減壓下進(jìn)行第二次干燥，從而將其冷凍干燥。接著， 一般將玻璃瓶?jī)?nèi)部用 氮?dú)庵脫Q，加塞后即可獲得本發(fā)明組合物的冷凍干燥制劑。本發(fā)明組合物的冷凍干燥制劑一般可以通過(guò)添加任意的適當(dāng)溶液(再溶解 液)進(jìn)行再溶解來(lái)使用。作為這樣的再溶解液，可以例舉注射用水、生理鹽水、 其它一般輸液用液。該再溶解液的液量根據(jù)用途等而不同，沒(méi)有特別限定，以 冷凍干燥前的液量的O. 5 2倍的量或500mL以下為宜。本發(fā)明組合物可以用于例如癌癥、病毒性疾病、炎癥性疾病、代謝性疾病、 神經(jīng)疾病的治療。本發(fā)明組合物的給藥形式只要是醫(yī)藥上允許的給藥形式即可，沒(méi)有特別限 定，可以根據(jù)治療方法進(jìn)行選擇。例如，可以例舉靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、口服給藥、經(jīng)肺給藥、組織內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、粘膜給藥、直腸內(nèi)給藥、膀胱 內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、眼內(nèi)給藥、腦內(nèi)給藥、胸腔內(nèi)給藥。其中，特別好是靜 脈內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、粘膜給藥。此外，作為本發(fā)明組合物可采用的劑型，沒(méi) 有特別限定，例如可以制成各種注射劑、口服劑、滴劑、吸入劑、滴眼劑、軟 膏劑、洗劑、栓劑來(lái)給藥。例如，本發(fā)明組合物作為藥物時(shí)的用量最好根據(jù)藥物的種類、劑型、 年齡和體重等患者的狀態(tài)、給藥形式、疾病的性質(zhì)和程度來(lái)進(jìn)行調(diào)整，成人的藥量一般每天在O. 01mg 10g/人的范圍內(nèi)，較好是在O. lrag 5g/人的 范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明組合物所含的藥物為低聚核酸的情況下，給與成人 的低聚核酸量一般每天在O. lmg 10g/人的范圍內(nèi)，較好是在lmg 5g/人的 范圍內(nèi)。該數(shù)值會(huì)根據(jù)目標(biāo)疾病的種類、給藥形式、靶分子而不同。因此， 有時(shí)在該值以下就已足夠，或者有時(shí)反而需要該值以上的用量。此外，可 以1天給藥1次 數(shù)次，或者以1天 數(shù)天的間隔進(jìn)行給藥。 實(shí)施例以下，列舉參考例、實(shí)施例、比較例和試驗(yàn)例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì) 的說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定在實(shí)施例所示的范圍內(nèi)。實(shí)施例l N-[l-(D)-脫氧乳糖-l-基]油酰胺的合成工序l 1-(D)-脫氧乳糖-l-基胺、二[l-(D)-脫氧乳糖-l-基]胺的混合 物的合成將20g乳糖一水合物和22g四硼酸銨四水合物懸浮于300mL甲醇、80mL H20和100mL乙酸的混合液中，滴加100mL7X氰基硼氫化鈉/甲醇溶液，在室 溫下攪拌一整夜。將該反應(yīng)液在7(TC下再攪拌3小時(shí)后，將該反應(yīng)液在減壓 下濃縮。向其殘?jiān)尤爰状?，濾取不溶物，將該濾取的不溶物在減壓下干 燥。將所得的粉末溶解于少量的&0，使該溶液通過(guò)填充有500mL陽(yáng)離子交換 樹脂[D0WEX(注冊(cè)商標(biāo))50WX2(吡啶型)]的柱，將柱充分水洗。接著，使3 %氨水通過(guò)柱，將所得的洗脫液在減壓下濃縮，獲得12g目標(biāo)混合物。工序2 N-[1-(D)-脫氧乳糖-l-基]油酰胺的合成將4.9g油酸、4. 36g二環(huán)己基碳二亞胺溶解于100mL二甲基甲酰胺，在 室溫下攪拌15分鐘。在該反應(yīng)液中加入上述工序1中得到的5. 5g混合物，再
加入50mL二甲基甲酰胺。將該溶液在室溫下攪拌3小時(shí)后，在減壓下濃縮。 向殘?jiān)尤攵燃综?甲醇(2/l)的混合液，進(jìn)行離心分離，回收上清的二 氯甲烷/甲醇(2/l)的混合液。再進(jìn)行3次該操作，將回收的二氯甲垸/甲醇 (2/1)的混合液在減壓下濃縮。向殘?jiān)尤?4mL H20、 60mL甲醇和30mL二氯 甲垸并溶解，再加入30mL二氯甲垸和30mLH20，充分混合。然后，離心分離， 回收水層，進(jìn)行冷凍干燥。將殘?jiān)ㄟ^(guò)硅膠柱色譜法進(jìn)行純化，獲得13g目 標(biāo)物(本發(fā)明衍生物)。MALDI-TOF Mass (m/z) =608. 287([M+H]+)MALDI-TOF Mass (m/z) =630. 448 ([M+Na] +)實(shí)施例2本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(l)將60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-0-二油酰基甘油、20mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和80mg蛋黃卵磷脂(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社(和光純薬 工業(yè)社)制，下同)在玻璃瓶中溶解于2mL三氯甲烷，向其中通入氮?dú)舛ト?氯甲垸，在玻璃瓶的壁面形成薄膜。將其再在減壓下放置一晚后，加入4. 920mL 10X麥芽糖和80"L1N鹽酸，用旋渦混合器使薄膜分散。然后，在4'C放置3小 時(shí)后，使用微探針，進(jìn)行l(wèi)分鐘的超聲波處理，制成32mg/mL的本發(fā)明載體的分 散液。實(shí)施例3本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(2)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1， 3-0-二油?；视?、40mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和60mg蛋黃卵磷脂，與實(shí)施例2同樣地制成本發(fā)明載體 的分散液。實(shí)施例4本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(3)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1， 3-0-二油?；视?、60mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和40mg蛋黃卵磷脂，與實(shí)施例2同樣地制成本發(fā)明載體 的分散液。實(shí)施例5本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(4)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1, 3-0-二油?；视汀?0mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和20mg蛋黃卵磷脂，與實(shí)施例2同樣地制成本發(fā)明載體 的分散液。
實(shí)施例6本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(5)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-O-二油?；视?、 100mg實(shí)施例l的本發(fā)明化合物，與實(shí)施例2同樣地制成本發(fā)明載體的分散液。 實(shí)施例7本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(6)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-0-二油?；视?、20mg 實(shí)施例1的本發(fā)明化合物和80mg二棕櫚?；字Ｄ憠A(日本油脂株式會(huì)社(曰 本油脂社)制，下同)中，加入4.920mL 10%麥芽糖和80u L 1N鹽酸，用旋渦混 合器使其分散。然后，使用微探針，進(jìn)行l(wèi)分鐘的超聲波處理，制成32mg/mL的 本發(fā)明載體的分散液。實(shí)施例8本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(7)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1， 3-0-二油?；视?、60mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和40mg二棕櫚?；字Ｄ憠A，與實(shí)施例7同樣地制成 本發(fā)明載體的分散液。實(shí)施例9本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(8)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-0-二油?；视?、20mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和80mg大豆卵磷脂(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社(和光純薬 工業(yè)社)制，下同)中，加入4.920mL 0. 9XNaCl溶液和80 y L 1N鹽酸，用旋渦 混合器使其分散。然后，在4'C放置3小時(shí)后，使用微探針，進(jìn)行l(wèi)分鐘的超聲 波處理，制成32mg/mL的本發(fā)明載體的分散液。實(shí)施例IO本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(9)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油酰基甘油、60mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和40mg大豆卵磷脂，與實(shí)施例9同樣地制成本發(fā)明載體 的分散液。實(shí)施例ll本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(10)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-0-二油?；视?、20mg 實(shí)施例1的本發(fā)明化合物和80mg二硬脂酰基磷脂酰膽堿(日本油脂株式會(huì)社(日 本油脂社)制，下同)中，加入4.920mL 5%D-甘露糖醇和80 u L 1N鹽酸，用旋 渦混合器使薄膜分散。然后，在4t:放置3小時(shí)后，使用微探針，進(jìn)行l(wèi)分鐘的 超聲波處理，制成32mg/mL的本發(fā)明載體的分散液。
實(shí)施例12本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(ll)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1， 3-0-二油?；视汀?0mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和40mg二硬脂?；字Ｄ憠A，與實(shí)施例ll同樣地制成本發(fā)明載體的分散液。實(shí)施例13本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(12)在60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-0-二油?；视?、20mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和80mg二棕櫚?；字８视?日本油脂株式會(huì)社(曰 本油脂社)制，下同)中，加入4.920mL 5X葡萄糖和80pL 1N鹽酸，用旋渦混 合器使薄膜分散。然后，在4'C放置3小時(shí)后，使用微探針，進(jìn)行l(wèi)分鐘的超聲 波處理，制成32mg/mL的本發(fā)明載體的分散液。實(shí)施例14本發(fā)明載體的分散液的調(diào)制(13)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1， 3-0-二油?；视?、60mg 實(shí)施例l的本發(fā)明化合物和40mg二棕櫚?；字８视?，與實(shí)施例13同樣地制 成本發(fā)明載體的分散液。比較例l比較對(duì)照用載體的分散液的調(diào)制(1)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1, 3-0-二油酰基甘油、 100mg蛋黃卵磷脂，與實(shí)施例2同樣地制成比較對(duì)照用載體的分散液。 比較例2比較對(duì)照用載體的分散液的調(diào)制(2)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-0-二油?；视汀?100mg二棕櫚?；字Ｄ憠A，與實(shí)施例7同樣地制成比較對(duì)照用載體的分散 液。比較例3比較對(duì)照用載體的分散液的調(diào)制(3)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1, 3-0-二油?；视?、 100mg大豆卵磷脂，與實(shí)施例9同樣地制成比較對(duì)照用載體的分散液。 比較例4比較對(duì)照用載體的分散液的調(diào)制(4)使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1,3-0-二油酰基甘油、 100mg二硬脂?；字Ｄ憠A，與實(shí)施例ll同樣地制成比較對(duì)照用載體的分散液。比較例5比較對(duì)照用載體的分散液的調(diào)制(5)
使用60mg 2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲?；?1，3-0-二油酰基甘油、 lOOmg二棕櫚酰基磷脂酰甘油，與實(shí)施例13同樣地制成比較對(duì)照用載體的分散 液。試驗(yàn)例l對(duì)肝臟的指向性的評(píng)價(jià)(1) 核酸溶液的調(diào)制含有由具有序列編號(hào)1的堿基序列的低聚RNA和具有序列編號(hào)2的堿基 序列的低聚RNA構(gòu)成的氚標(biāo)記了的siRNA的核酸溶液通過(guò)使用體外轉(zhuǎn)錄T7試 劑盒(寶生物技術(shù)株式會(huì)社(夕力，才社)制)，使其含有氚標(biāo)記了的 [25，8-3H]腺苷5，-三磷酸銨鹽(安瑪西亞生物科技公司(77、>亇厶 才 廿^工y7社)制)來(lái)調(diào)制。另外，所述核酸溶液中的siRNA的濃度為20uM。 此外，比活性為6. 4X105dpm/u g。向8. 75u L上述工序中制成的核酸溶液中，添加341. 25w L以20u M的濃 度含有由具有序列編號(hào)1的堿基序列的低聚RNA和具有序列編號(hào)2的堿基序 列的低聚RNA構(gòu)成的未標(biāo)記氚的siRNA的核酸溶液，制成比活性為1.6X 104dpm/u g的核酸溶液。(2) 組合物的調(diào)制向10u L上述(l)中制成的比活性為1.6X10Mpm/u g的核酸溶液中添 加90uL10X麥芽糖，制成以2uM的濃度含有siRNA的核酸溶液。此外，向 實(shí)施例2 6或比較例1的載體的分散液中加入10%麥芽糖進(jìn)行稀釋，制成 429p g/mL的載體分散液。向各載體分散液(429 n g/mL)添加等量的核酸溶液(2 u M)，使用旋渦混 合器混合。然后，在室溫下靜置15分鐘，進(jìn)行15秒的超聲波處理，制成以l u M的濃度含有siRNA的組合物。(3) 實(shí)驗(yàn)方法在6孔板中以2. 5X105細(xì)胞/孔接種作為來(lái)源于人肝細(xì)胞癌的細(xì)胞株的 HuH-7細(xì)胞，在37'C、 5%0)2的條件下培養(yǎng)18小時(shí)。更換培養(yǎng)基后，每孔添 加100ixL上述(2)中制成的組合物，使siRNA的最終濃度達(dá)到100nM，再進(jìn)行 培養(yǎng)。添加組合物8小時(shí)后，用lmL磷酸緩沖鹽溶液(以下稱為"PBS")將細(xì) 胞清洗2次，用400 " L胰蛋白酶/EDTA(西格馬公司(SIGMA社)帝lj)使細(xì)胞剝
離，回收至微量離心管中。為了不殘留細(xì)胞，在回收后的孔中再加入800u LPBS，回收至與上述同一管中。將其以3000rpm離心2分鐘后，除去800uL 上清，將剩下的全部移至閃爍用玻璃瓶中。各玻璃瓶中加入4mL液體閃爍劑 混合物(Emulsifier Scintillator Plus,珀金埃爾默公司(Perkin Elmer 社)制)，充分混合，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)器(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer 社)帝'J)測(cè)定放射活性。 (4)試驗(yàn)結(jié)果其結(jié)果如圖l所示，證實(shí)對(duì)肝臟的指向性隨實(shí)施例l的本發(fā)明化合物的 含量而提高。試驗(yàn)例2藥理活性的評(píng)價(jià)(l)以作為HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白的NS5A蛋白的產(chǎn)生量為指標(biāo)，評(píng)價(jià)含有實(shí)施例 7或8的本發(fā)明載體和具有抑制HCV復(fù)制的活性的siRNA的本發(fā)明組合物的藥 理活性。(1) 核酸溶液的調(diào)制使具有序列編號(hào)3的堿基序列的低聚RNA和具有序列編號(hào)4的堿基序列 的低聚RNA分別溶解于注射用水，使?jié)舛冗_(dá)到100uM，制成低聚RNA的原液。 然后，將各20nL在試管內(nèi)混合，再向其中添加60iiL注射用水，制成以20 u M的濃度含有siRNA的核酸溶液。另外，上述2種低聚RNA的合成委托日本生物服務(wù)株式會(huì)社(日本/《,才 寸一匕、、只)。(2) 組合物的調(diào)制向10u L上述(l)中制成的核酸溶液(20y M)中添加90u L 10%麥芽糖， 制成以2uM的濃度含有siRNA的核酸溶液。此外，向1.3uL實(shí)施例7、 8或比 較例2的載體的分散液中添加98. 7uL 10%麥芽糖，制成428. 8mg/mL的載體 分散液。將100 " L核酸溶液(2 u M)和100 u L載體分散液(428. 8mg/mL)在試管內(nèi) 混合，在4t:靜置15分鐘后，進(jìn)行超聲波處理，制成以lwM的濃度含有siRNA 的組合物。將該組合物用10%麥芽糖進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用于以下的實(shí)驗(yàn)。(3) 實(shí)驗(yàn)方法
在6孔板中以lX105細(xì)胞/孔接種保持有HCV的復(fù)制子的HuH-7細(xì)胞[關(guān) 于所述細(xì)胞的詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參照文獻(xiàn)(Biochemical and Biophysical Res earch Communications, 2000年，293巻，993-999頁(yè))]，在37。C、 5%C02 的條件下培養(yǎng)20小時(shí)。然后，每孔添加100uL上述(2)中制成的組合物，使 siRNA的最終濃度達(dá)到30nM或100nM，再在同樣的條件下培養(yǎng)96小時(shí)。將培 養(yǎng)后的細(xì)胞用PBS清洗后，回收細(xì)胞，制成細(xì)胞溶解液。使蛋白質(zhì)總量為5ug的細(xì)胞溶解液熱變性后，通過(guò)SDS-PAGE分離，電 轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(以下稱為"PVDF膜")(密理博公司(3 y求7社) 制)。將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用抗NS5A多克隆抗體(維絡(luò)金公司(Viro Gen社)帝U) 和辣根過(guò)氧化物酶(以下稱為"HRP")標(biāo)記抗兔IgG抗體(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司 (Cell signaling technologies社)制)染色。將染色后的PVDF膜用Chemilu minescence Reagent Plus (珀金埃爾默公司(Perkin Elmer社)制)使其化 學(xué)發(fā)光，將對(duì)應(yīng)于NS5A蛋白的條帶的發(fā)光強(qiáng)度通過(guò)圖像分析儀(伯樂(lè)公司(B ioRad社)制)定量而數(shù)值化。此外，用抗ci-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(西格馬公 司(SIGMA社)制)和服P標(biāo)記抗小鼠IgG抗體(細(xì)胞信號(hào)技術(shù)公司(Cell signa ling technologies社)制)，也同樣地算出對(duì)應(yīng)于a -肌動(dòng)蛋白的條帶強(qiáng)度。將對(duì)應(yīng)于NS5A蛋白的條帶的定量值除以對(duì)應(yīng)于a-肌動(dòng)蛋白的條帶的 定量值所得的數(shù)值作為單位蛋白質(zhì)量的NS5A蛋白的產(chǎn)生量。(4) 評(píng)價(jià)方法通過(guò)將添加10X麥芽糖的細(xì)胞的單位蛋白質(zhì)量的NS5A蛋白的產(chǎn)生量設(shè) 為100%，比較添加各本發(fā)明組合物的細(xì)胞的NS5A蛋白的產(chǎn)生量來(lái)進(jìn)行評(píng) 價(jià)。另外，NS5A蛋白的產(chǎn)生量越少，則表示HCV的復(fù)制子的復(fù)制越受到抑制。(5) 試驗(yàn)結(jié)果其結(jié)果如圖2所示，可知使用實(shí)施例7和8的本發(fā)明載體的情況與使用比 較例2的載體的情況相比，更強(qiáng)地抑制HCV的復(fù)制子的復(fù)制。 試驗(yàn)例3藥理活性的評(píng)價(jià)(2)以作為新霉素耐性基因的產(chǎn)物的NPTII蛋白的產(chǎn)生量為指標(biāo)，評(píng)價(jià)含有 實(shí)施例9或10的本發(fā)明載體和具有抑制HCV的復(fù)制的活性的siRNA的本發(fā)明 組合物的藥理活性。(1) 組合物的調(diào)制使用實(shí)施例9、 10或比較例3的載體的分散液和上述試驗(yàn)例2中制成的核酸溶液(2uM)，與試驗(yàn)例2同樣地操作，制成以l&M的濃度含有siRNA的組 合物。將該組合物用10%麥芽糖進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用于以下的實(shí)驗(yàn)。(2) 實(shí)驗(yàn)方法在12孔板中以5X104細(xì)胞/孔接種保持有HCV的復(fù)制子的HuH-7細(xì)胞[關(guān) 于所述細(xì)胞的詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參照文獻(xiàn)(Biochemical and Biophysical Res earch Communications, 2000年，293巻，993-999頁(yè))]，在37。C、 5%C02 的條件下培養(yǎng)一晚。翌日，從培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基，加入0.9mL培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行 培養(yǎng)基更換。每孔添加100pL上述(l)中制成的組合物，使siRNA的最終濃 度達(dá)到30nM或100nM，再在同樣的條件下培養(yǎng)96小時(shí)。將培養(yǎng)后的細(xì)胞用PB S清洗后，回收細(xì)胞，制成蛋白質(zhì)提取液。使用市售的測(cè)定試劑盒(PathoSc reen Kit for NPTII，阿戈地亞公司(Agdia社)帝1」)測(cè)定該蛋白質(zhì)提取液中 的NPTII蛋白的量。蛋白質(zhì)提取液的調(diào)制使用試劑盒附帶的提取用緩沖液。 此外，使用市售的試劑盒(BCA Protein Assay Kit，皮爾斯公司(Pierce社)制)測(cè)定提取的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)總量。(3) 評(píng)價(jià)方法通過(guò)將添加10^麥芽糖的細(xì)胞的單位蛋白質(zhì)量的NPTII蛋白的產(chǎn)生量 設(shè)為100%，比較添加各本發(fā)明組合物的細(xì)胞的NPTII蛋白的產(chǎn)生量來(lái)進(jìn)行 評(píng)價(jià)。另外，NPTII蛋白的產(chǎn)生量越少，則表示HCV的復(fù)制子的復(fù)制越受到 抑制。(4) 試驗(yàn)結(jié)果其結(jié)果如圖3所示，可知使用實(shí)施例9和10的本發(fā)明載體的情況與使用 比較例3的載體的情況相比，更強(qiáng)地抑制HCV的復(fù)制子的復(fù)制。 試驗(yàn)例4藥理活性的評(píng)價(jià)(3)以人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量為指標(biāo)，評(píng)價(jià)含有實(shí)施例11或12的本發(fā)明載 體和針對(duì)人VEGF-A基因的siRNA的本發(fā)明組合物的藥理活性。 (l)組合物的調(diào)制將由具有序列編號(hào)5的堿基序列的低聚RNA和具有序列編號(hào)6的堿基序
列的低聚RNA構(gòu)成的針對(duì)人VEGF-A基因的s i RNA (安比昂公司(Amb i on社)帝lj) 用注射用水稀釋，制成以20uM的濃度含有siRNA的核酸溶液。向10uL核酸 溶液(20pM)中添加90uL 10%麥芽糖，制成以2uM的濃度含有siRNA的核 酸溶液。此外，向l. 3 u L實(shí)施例ll、 12或比較例4的載體的分散液中添加98. 7 uL 10%麥芽糖，制成428. 8mg/mL的載體分散液。將100 " L核酸溶液(2 u M)和100 u L載體分散液(428. 8mg/mL)在試管內(nèi) 混合，在4X:靜置15分鐘后，進(jìn)行超聲波處理，制成以lpM的濃度含有siMA 的組合物。將該組合物用10%麥芽糖進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用于以下的實(shí)驗(yàn)。(2) 實(shí)驗(yàn)方法在12孔板中以lX10s細(xì)胞/孔接種HuH-7細(xì)胞，在37。C、 5%(:02的條件下 培養(yǎng)18小時(shí)。翌日，從培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基，加入0.9mL培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)基 更換。每孔添加100uL上述(l)中制成的組合物，使siRNA的最終濃度達(dá)到3 OnM或100nM，再在同樣的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。然后，從培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基， 加入0.9mL培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)基更換，再在同樣的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng) 后，使用市售的試劑盒(Human VEGF Immunoassay Kit,安迪系統(tǒng)公司(R& D systems社)制)測(cè)定培養(yǎng)上清中的人VEGF-A蛋白的量。(3) 評(píng)價(jià)方法通過(guò)將添加10X麥芽糖的細(xì)胞的人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量設(shè)為100X，比 較添加各本發(fā)明組合物的細(xì)胞的人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。(4) 試驗(yàn)結(jié)果其結(jié)果如圖4所示，可知使用實(shí)施例11和12的本發(fā)明載體的情況與使用 比較例4的載體的情況相比，同等或更強(qiáng)地抑制人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生。 試驗(yàn)例5藥理活性的評(píng)價(jià)(4)以人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量為指標(biāo)，評(píng)價(jià)含有實(shí)施例13或14的本發(fā)明載 體和針對(duì)人VEGF-A基因的siRNA的本發(fā)明組合物的藥理活性。 (l)組合物的調(diào)制使用實(shí)施例13、 14或比較例5的載體的分散液和上述試驗(yàn)例4中制成的 核酸溶液(2uM)，與試驗(yàn)例4同樣地操作，制成以l"M的濃度含有siRNA的 組合物。將該組合物用10%麥芽糖進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用于以下的實(shí)驗(yàn)。 (2) 實(shí)驗(yàn)方法在12孔板中以2 X 105細(xì)胞/孔接種作為來(lái)源于人肝癌的細(xì)胞株的H印G2 細(xì)胞，在37。C、 5%0)2的條件下培養(yǎng)18小時(shí)。翌日，從培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基， 加入0.9mL培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)基更換。每孔添加100"L上述(1)中制成的組 合物，使siRNA的最終濃度達(dá)到30nM或100nM，再在同樣的條件下培養(yǎng)24小 時(shí)。然后，從培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基，加入0.9mL培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)基更換，再 在同樣的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，使用市售的試劑盒(Human VEGF Imm unoassay Kit,安迪系統(tǒng)公司(R&D systems社)制)測(cè)定培養(yǎng)上清中的人VEG F-A蛋白的量。(3) 評(píng)價(jià)方法通過(guò)將添加10X麥芽糖的細(xì)胞的人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量設(shè)為100X，比 較添加各本發(fā)明組合物的細(xì)胞的人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生量來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。(4) 試驗(yàn)結(jié)果其結(jié)果如圖5所示，可知使用實(shí)施例13和14的本發(fā)明載體的情況與使用 比較例5的載體的情況相比，更強(qiáng)地抑制人VEGF-A蛋白的產(chǎn)生。 試驗(yàn)例6細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)(1) 組合物的調(diào)制使用實(shí)施例2、 4、 6或比較例1的載體的分散液和上述試驗(yàn)例2中制成的 核酸溶液(2nM)，與試驗(yàn)例2同樣地操作，制成以luM的濃度含有siRNA的 組合物。將該組合物用10%麥芽糖進(jìn)行適當(dāng)稀釋后用于以下的實(shí)驗(yàn)。(2) 實(shí)驗(yàn)方法在96孔板中以3X10，胞/孔接種HuH-7細(xì)胞，在37。C、 5%(^02的條件下 培養(yǎng)18小時(shí)。然后，每孔添加ll. 1PL上述(1)中制成的組合物，使siRNA的 最終濃度達(dá)到30nM或100nM。然后，在同樣的條件下培養(yǎng)96小時(shí)后，使用市 售的試劑盒(Cell Proliferation Kit II，羅氏公司(Roche社)制)測(cè)定細(xì) 胞數(shù)。(3) 評(píng)價(jià)方法通過(guò)將添加10%麥芽糖的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)設(shè)為100%，比較添加各本發(fā)明 組合物的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 (4)試驗(yàn)結(jié)果其結(jié)果如圖6所示，可知使用實(shí)施例2、 4、 6的本發(fā)明載體對(duì)細(xì)胞的毒性與比較例l的載體同等程度。
權(quán)利要求
1. 以下述通式(I)表示的半乳糖衍生物；式(I)中，R1表示氫、可取代的碳數(shù)1～10的烷基或者1-(D)-脫氧乳糖-1-基，R2表示碳數(shù)10～30的飽和或不飽和的脂肪酸殘基。
2. 如權(quán)利要求l所述的半乳糖衍生物，其特征在于，半乳糖衍生物為N-[1 - (D)-脫氧乳糖-l-基]油酰胺或N， N-二 [1- (D)-脫氧乳糖-1-基]油酰胺。
3. 藥物載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1或2所述的半乳糖衍生物和陽(yáng) 離子性脂質(zhì)作為必需的構(gòu)成成分。4. 如權(quán)利要求3所述的藥物載體，其特征在于，陽(yáng)離子性脂質(zhì)為2-0-(2-二乙氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-0-二油?；视?。5. 如權(quán)利要求3或4所述的藥物載體，其特征在于，還將磷脂作為構(gòu)成成分。6. 醫(yī)藥組合物，其特征在于，包含藥物和權(quán)利要求3 5中的任一項(xiàng)所述 的藥物載體。7. 如權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，藥物為雙鏈RNA、雙 鏈DNA、低聚核酸或水溶性陰離子化合物。8. 如權(quán)利要求7所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，低聚核酸為短干擾RNA、 微脂A、短發(fā)卡RNA、反義DNA、反義RNA、 DNA酶、核酶、適體、非編碼RNA。9. 如權(quán)利要求6 8中的任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，用于 癌癥的治療和/或預(yù)防。10. 如權(quán)利要求6 8中的任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，用于 病毒性疾病的治療和/或預(yù)防。
11. 如權(quán)利要求6 8中的任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，用于炎癥性疾病的治療和/或預(yù)防。12. 如權(quán)利要求6 8中的任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，用于 代謝性疾病的治療和/或預(yù)防。13. 如權(quán)利要求6 8中的任一項(xiàng)所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于，用于 神經(jīng)疾病的治療和/或預(yù)防。全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟的指向性的提高和高效的藥效發(fā)揮作為藥物載體的構(gòu)成成分的新型有用的半乳糖衍生物、含有該衍生物的藥物載體以及包含該載體和藥物的醫(yī)藥組合物。本發(fā)明涉及以上述通式(I)表示的半乳糖衍生物、含有該衍生物和陽(yáng)離子性脂質(zhì)的藥物載體以及包含該載體和優(yōu)選雙鏈RNA、雙鏈DNA、低聚核酸的藥物的醫(yī)藥組合物。式(I)中，R¹表示氫、可取代的碳數(shù)1～10的烷基或者1-(D)-脫氧乳糖-1-基。R²表示碳數(shù)10～30的飽和或不飽和的脂肪酸殘基。
文檔編號(hào)A61K47/26GK101395168SQ20078000734
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2007年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月1日
發(fā)明者上田稔浩, 園家曉, 大木忠明 申請(qǐng)人:日本新藥株式會(huì)社