專(zhuān)利名稱：一種抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物及其制劑領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是涉及一種抗雞傳染性法氏 嚢病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
背景技術(shù)：
雞傳染性法氏嚢病又稱雞傳染性腔上嚢病，是由傳染性法氏羹病毒引起的 一種急性、接觸傳染性疾病。以法氏嚢發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏嚢內(nèi)淋巴細(xì)胞 嚴(yán)重受損為特征。從而引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。發(fā)
病率高，幾乎達(dá)100%,死亡率低， 一般為5%~15%，是目前養(yǎng)禽業(yè)最重要的 疾病之一。自然條件下，本病只感染雞，所有品種的雞均可感染，但不同品種 的雞中，白來(lái)航雞比重型品種的雞敏感，肉雞較蛋雞敏感。本病僅發(fā)生于2周 至開(kāi)產(chǎn)前的小雞，3 7周齡為發(fā)病高峰期。雛雞群突然大批發(fā)病，2~3天內(nèi)可 波及60% ~ 70%的雞，發(fā)病后3 4天死亡達(dá)到高峰，7~8天后死亡停止。病初 精神沉郁，采食量減少，飲水增多，有些自詠肛門(mén)，排白色水樣稀糞，重者脫 水，臥地不起，極度虛弱、最后死亡。耐過(guò)雛雞貧血消瘦，生長(zhǎng)緩慢。
盡管目前已經(jīng)有一些抗雞傳染性法氏嚢病毒的藥品或制劑但是由于現(xiàn)有 藥品制劑的針對(duì)性不強(qiáng)，療效有限，而且，治療性制劑多是在發(fā)病后才應(yīng)用的， 不能起預(yù)防作用。對(duì)于雞傳染性法氏嚢病的易感雞群，每年定期對(duì)雞接種雞傳 染性法氏嚢疫苗是預(yù)防雞傳染性法氏嚢的有效方法。其次應(yīng)增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)或藥物干 預(yù)，提高自身免疲力。通過(guò)藥物提高機(jī)體抵杭力或調(diào)節(jié)免疫力也是一種預(yù)防雞 傳染性法氏嚢的有效方法，轉(zhuǎn)移因子可起到此作用。
轉(zhuǎn)移因子(TF， Transfer Factor)是T淋巴細(xì)胞釋放的一種能夠轉(zhuǎn)移致敏信 息的低分子量多肽-核香酸復(fù)合物，它能將供體的某種特定的細(xì)胞免疫功能特異地轉(zhuǎn)移給受體正常的淋巴細(xì)胞，參與機(jī)體的免疫反應(yīng)，提高受體機(jī)體的細(xì)胞
免疫功能，抵抗真菌、病毒等非細(xì)菌性感染；同時(shí)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的抗體分泌作 用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞釋放干擾素和白介素，從而增強(qiáng)受體的免疫功能。
法。例如，中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)"制備轉(zhuǎn)移因子的工藝方法一一全濾法"(專(zhuān)利申 請(qǐng)?zhí)?00310118439. 6)則公開(kāi)了采用壓濾、超濾、納濾幾'種方法連續(xù)過(guò)濾的制 備工藝。另 一份中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)"制備轉(zhuǎn)移因子的工藝方法一一加熱法"(專(zhuān) 利申請(qǐng)?zhí)?00410039444. 2)是由同一申請(qǐng)人在前一^f分申請(qǐng)的基礎(chǔ)上加上加熱 處理的步驟，仍然是連續(xù)釆用多種過(guò)濾法的制備工藝。上述專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容是 對(duì)破碎后的組織經(jīng)冷凍離心后直接進(jìn)行過(guò)濾提取，同樣存在細(xì)胞破碎不完全的 缺陷，而且其工藝煩瑣，時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)產(chǎn)物的活性損失也較大，因此得率很難 提高。
豬脾臟和胸腺是免疫活性細(xì)胞聚集的場(chǎng)所，而且材料來(lái)源非常廣泛，因此 從這類(lèi)細(xì)胞中提取特異性轉(zhuǎn)移因子，有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義，但目前尚 未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種天 然高效純生物活性物質(zhì)抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。
本發(fā)明抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，^接照以下步驟進(jìn)行
(1) 制備病毒抗原將雞傳染性法氏嚢病毒接種于10天齡雞胚尿嚢液，33°C 下48 - 72小時(shí)，fL雞胚尿嚢液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心20 分鐘，棄去沉渣留上清；
(2) 提取病毒抗原取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗 原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15%、 30%、 45%及60%的蔗糖制備的 不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000轉(zhuǎn)/分3小時(shí)，根據(jù)雞傳染性法氏 嚢病毒的分子量確定雞傳染性法氏嚢病毒所在離心管位置，吸出備用；(3) 用上述提取的病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原，
用上述提取病毒抗原皮下多點(diǎn)注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全
佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勾漿機(jī)打勻，在動(dòng)物皮內(nèi)或
皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動(dòng)物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔 一周，最后一次免疫7-10天后取動(dòng)物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢 測(cè)上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價(jià)后，宰殺動(dòng)物，取脾 臟和胸腺于冰上，轉(zhuǎn)移至-20'C保存，備用；
(4) 從免疫豬中提^U元雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子
① 原材料的制備及預(yù)處理將上述接種病毒免疫豬的脾及淋巴結(jié)組織，用 冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；
② 破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在水凍的條 件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；
(D凍融將勻漿液置于-80。C快速冷凍，水浴30。C中融化，交替凍融4-6 次，每次融化后均以組織勻漿機(jī)高速勻漿粉碎；
④ 揭::取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于水凍離心^L于5。C以4000r/min離 心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過(guò)濾，取濾液；
⑤ 超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾， 濾液為分子量小于6000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；
除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0. 22 u m的濾膜加壓過(guò)濾除菌； ⑦分裝4。C密封保存，即得所述的抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子提取液。
本發(fā)明一種抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，具有以下憂點(diǎn)
(1) 原材料來(lái)源容易，無(wú)污染，價(jià)廉。豬脾臟和胸腺屬于屠宰后豬的下腳料。
(2) 破碎組織后，加入低溫凍融處理的步驟，特別是在3(TC下溶解，不使小 分子物質(zhì)活性喪失，并能夠使雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移園子得以充分地提取。
(3) 工藝采用了比較先進(jìn)的中空纖維超濾膜超過(guò)濾法，從而縮短了制備時(shí) 間，保證物質(zhì)分離過(guò)程中活性不被破壞。(4)提取物經(jīng)生化測(cè)定和若千成分分析，是一種低分子量多肽-核苷酸復(fù)合 物，是一種不含蛋自質(zhì)、可溶的小分子物質(zhì)，分子量在6000道爾頓以下。經(jīng)體 內(nèi)外生物活性試驗(yàn)以及藥理、毒性試驗(yàn)等證明，具有純度高、免疫活性強(qiáng)、起 效快而維持時(shí)間長(zhǎng)、易吸收、無(wú)任何不良反應(yīng)等特點(diǎn)，其療效確切，安全可靠， 既可治療又可增強(qiáng)抗病能力。該提取物可做成口服液等劑型，便于應(yīng)用。
本發(fā)明的抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子可以全面或部分抑制雞傳染性 法氏嚢病毒，能保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受病毒感染。因此使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子 可以起到預(yù)防雞傳染性法氏嚢病毒感染、能夠保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受雞傳染性 法氏嚢病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。同時(shí)對(duì)于遭到雞傳染性法氏嚢病毒 感染的雞使用轉(zhuǎn)移因子進(jìn)行治療，可有效的改善臨床癥狀，提高治愈率、降低 死亡率。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。 實(shí)施例l:
抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備
1. 制備病毒抗原將雞傳染性法氏嚢病毒接種于10天齡雞胚尿嚢液，33°C 下48-72小時(shí)，取雞胚尿嚢液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心20 分鐘，棄去沉渣留上清；
2. 取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗原；將病毒抗原 離心后，取上清液裝入以15%、 30%、 45°/。及60°/。的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度 離心管，超速離心，165000轉(zhuǎn)/分3小時(shí)，根據(jù)不同病毒的分子量確定該病毒 所在離心管位置，吸出備用；
3. 用上述^是取的病毒抗原免疫豬用上述提取病毒抗原皮下多點(diǎn)注射免疫 豬，共免疫4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以 高速組織勻漿機(jī)打勻，在動(dòng)物皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動(dòng) 物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動(dòng)物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測(cè)上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒 特異性免疫效價(jià)后，宰殺動(dòng)物，取脾臟和胸腺于冰上，轉(zhuǎn)移至-"。c保存，備 用；
4.從免疫豬中^是:取抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子
(1)原材料的制備及預(yù)處理將病毒免疫豬的脾及淋巴結(jié)組織，用冷三蒸 水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；
(2 )破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在水凍的 條件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次3min,制得勻漿液；
(3)凍融將勻漿液置于-80。C快速冷凍，水浴3(TC中融化，交替凍融4-6次，每次融化后均以組織勻漿機(jī)高速勻漿粉碎；
(4 )提耳又加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心才幾于5。C以4000r/min 離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過(guò)濾，取濾液；
(5 )超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超 濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；
(6)除菌將超濾得到的濾液用孔徑為O. 22 u m的濾膜加壓過(guò)濾除菌； (7 )包裝:按口服液的要求，加15%的糖漿，加標(biāo)準(zhǔn)防腐劑(笨曱酸鈉O. 25% ) 后分裝，10ml/瓶;
(8)分裝，4。C密封保存，即得所述的抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子提取液。
實(shí)施例2:
抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子的制備
(1) 原材料的制備:選健康無(wú)病史的6月齡豬10頭，用雞傳染性法氏囊病毒疫 苗皮下注射免疫，15天后，再免疫一次，方法劑同上。二次免疫后15-20天宰 殺，取脾臟和胸腺于水上，轉(zhuǎn)移置-2(TC保存，備用；
(2) 預(yù)處理稱量豬脾后，用冷三蒸水洗凈豬脾，用剪刀剪去其筋膜及脂肪 組織，再用冷三蒸水洗滌干凈；(3) 破碎:將以上洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍 的條件下用高速組織搗碎機(jī)(lG00r/min)搗碎3次，每次3min,制得勻漿液；
(4) 凍融將勻漿液(用器皿裝)至于超低溫水箱(-80°C)里快速冷凍，水浴 30。C中融化，交替凍融10次；
(5) 提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機(jī)離心 30min(4000r/min， 5°C),取上層液體(血紅色)，再用G2砂心漏斗過(guò)濾，取濾液；
(6) 超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾， 濾液為分子量小于6000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；
(7) 除菌分別用無(wú)菌濾器(濾膜孔徑為O. 22um)加壓過(guò)濾；
(8) 包裝:按注射劑液的要求，加標(biāo)準(zhǔn)防腐劑(苯甲酸鈉O. 25%)后分裝，2ml/
瓶；
(9) 保存4。C密封貯存。
實(shí)施例3:
對(duì)本發(fā)明所述工藝制備的抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子的檢測(cè) 對(duì)實(shí)施例l所述工藝制備的抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子(下稱"本品") 進(jìn)行以下4全測(cè)
(1) 紫外線分光光度測(cè)定本品在250. 0 - 252. Onm處有一高吸收峰，且 ABS260/ABS280>2. 0。
(2) 標(biāo)準(zhǔn)液為淡黃色，pH值在6. 0-6. 5之間。
(3) 20°/。磺基水楊酸檢測(cè)本品無(wú)渾濁及沉淀現(xiàn)象，說(shuō)明蛋白反應(yīng)均為陰性， 其不含大分子蛋白質(zhì)。
(4) 多肽含量測(cè)定本品經(jīng)雙縮脲法測(cè)定多肽含量為l. 460mg/ml。
(5) 核酸含量測(cè)定本品經(jīng)地衣酚法測(cè)定核酸含量為581. 56 u g/ml。
(6) 細(xì)菌學(xué)檢測(cè)本品中無(wú)需氧、厭氧、腐生菌和真菌存在。
(7) E -玫瑰花結(jié)形成率比較雞外周血淋巴細(xì)胞表面有鼠紅細(xì)胞受體，并能 與之結(jié)合形成E -玫瑰花結(jié)。而轉(zhuǎn)移因子對(duì)淋巴細(xì)胞和大鼠紅細(xì)胞的結(jié)合有一
8定的促進(jìn)作用。本品的E-玫瑰花結(jié)形成率平均為29. 4%，比對(duì)照組的增加 28. 7%(P《0. 01)。
(8) 取健康小白鼠5只，口服本品濃縮液，相當(dāng)于正常口服液劑量的50倍， 觀察小白鼠的生存能力變化，結(jié)果無(wú)任何毒性反應(yīng)，也無(wú)死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，說(shuō) 明本品是安全的，無(wú)任何毒性和副作用。
(9) 用PPD做家兔皮試實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)本品具有轉(zhuǎn)移免疫活性的功能。
(10) 用雞傳染性法氏嚢病毒抗原做皮試檢測(cè)，有微弱的陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明本品 具有良好的轉(zhuǎn)移活性和特異性。
除上述糖漿劑型外，本發(fā)明所述的抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子還可制 成其他口服液。
此外，通過(guò)常規(guī)凍干工藝進(jìn)一步可得到抗雞傳染性法氏嚢病毒轉(zhuǎn)移因子的 粉末，結(jié)合常規(guī)輔料，可制成膠嚢、片劑等劑型。
權(quán)利要求
1.一種抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行(1)制備病毒抗原將雞傳染性法氏囊病毒接種于10天齡雞胚尿囊液，33℃下48-72小時(shí)，取雞胚尿囊液，裝厚壁小瓶子內(nèi)，超聲打碎，5000rpm離心20分鐘，棄去沉渣留上清；(2)提取病毒抗原取離心上清，然后不連續(xù)梯度密度離心純化提取病毒抗原；將病毒抗原離心后，取上清液裝入以15％、30％、45％及60％的蔗糖制備的不連續(xù)梯度密度離心管，超速離心，165000轉(zhuǎn)/分3小時(shí)，根據(jù)雞傳染性法氏囊病毒的分子量確定雞傳染性法氏囊病毒所在離心管位置，吸出備用；(3)用上述提取的病毒抗原免疫豬挑選健康免疫豬，取制備的病毒抗原，用上述提取病毒抗原皮下多點(diǎn)注射免疫豬，共免疫3-4次，前兩次分別以完全佛氏佐劑及不完全佛氏佐劑混合抗原，以高速組織勻漿機(jī)打勻，在動(dòng)物皮內(nèi)或皮下多點(diǎn)注射免疫，第3次和第4次后在動(dòng)物的肌肉或靜脈注射，每次免疫間隔一周，最后一次免疫7-10天后取動(dòng)物靜脈血，以免疫熒光方法或ELISA方法檢測(cè)上述病毒的特異性抗體效價(jià)，出現(xiàn)病毒特異性免疫效價(jià)后，宰殺動(dòng)物，取脾臟和胸腺于冰上，轉(zhuǎn)移至-20℃保存，備用；(4)從免疫豬中提取抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子①原材料的制備及預(yù)處理將上述接種病毒免疫豬的脾及淋巴結(jié)組織，用冷三蒸水洗凈豬脾，去其表面的筋膜、脂肪等組織，再滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗；②破碎將洗干凈的豬脾臟剪碎，加入2倍體積的冷生理鹽水，在冰凍的條件下用高速組織搗碎機(jī)以1000r/min搗碎3次，每次3min，制得勻漿液；③凍融將勻漿液置于-80℃快速冷凍，水浴30℃中融化，交替凍融4-6次，每次融化后均以組織勻漿機(jī)高速勻漿粉碎；④提取加入3倍體積的冷生理鹽水，置于冰凍離心機(jī)于5℃以4000r/min離心30分鐘，取上層血紅色液體，再用G2砂心漏斗過(guò)濾，取濾液；⑤超濾將上述濾液用截流值為6000道爾頓的中空纖維超濾膜加壓超濾，濾液為分子量小于6000道爾頓的轉(zhuǎn)移因子；⑥除菌將超濾得到的濾液用孔徑為0.22um的濾膜加壓過(guò)濾除菌；⑦分裝4℃密封保存，即得所述的抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子提取液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種天然高效純生物活性物質(zhì)抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子的制備方法。本發(fā)明按照以下步驟進(jìn)行將雞傳染性法氏囊病毒接種于10天齡雞胚尿囊液制備病毒抗原；提取病毒抗原；用上述提取的病毒抗原免疫豬；從免疫豬中提取抗雞傳染性法氏囊病毒轉(zhuǎn)移因子。因此使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)移因子可以起到預(yù)防雞傳染性法氏囊病毒感染、能夠保護(hù)正常機(jī)體細(xì)胞免受雞傳染性法氏囊病毒侵害的作用，從而降低發(fā)病率。
文檔編號(hào)A61P31/14GK101293914SQ20081005354
公開(kāi)日2008年10月29日 申請(qǐng)日期2008年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月17日
發(fā)明者王連民, 田杏芳 申請(qǐng)人:天津生機(jī)集團(tuán)股份有限公司