專利名稱：通過中和神經(jīng)氈蛋白-2來誘導p53表達以用于治療癌癥的制作方法
通過中和神經(jīng)氈蛋白-2來誘導P53表達以用于治療癌癥本發(fā)明涉及通過靶向神經(jīng)氈蛋白-2來過表達P53腫瘤阻抑基因并誘導腫瘤細胞凋亡，從而治療癌癥。癌癥的特征在于不受控的細胞增殖，其通常是由于上調(diào)(致癌基因)或下調(diào)(腫瘤阻抑基因)細胞增殖之基因中的突變所致。由于其不受控的增殖，腫瘤細胞在局部侵入健康組織，并可在發(fā)生進一步突變之后獲得遷移進血流并從原始腫瘤增殖到遠處從而形成轉(zhuǎn)移的能力。但是，通過血管發(fā)生機制實現(xiàn)腫瘤新血管形成(neovascularization)對于腫瘤生長來說是必需的，因為任何細胞(特別是具有很高的氧和能量需求的腫瘤細胞)無法在遠離血管超過幾十毫米以外的地方存活。因此，目前的抗癌治療一方面將腫瘤細胞本身作為主要的靶標，另一方面將腫瘤血管發(fā)生作為主要靶標。關(guān)于抗血管發(fā)生的策略，已經(jīng)證明癌癥發(fā)展和血管發(fā)生中涉及生長因子，特別是 EGF或VEGF (血管內(nèi)皮生長因子)。已開發(fā)了一些靶向VEGF作用的分子作為抗血管發(fā)生藥物貝伐單抗(安維汀 (Avastin ))，其為抗VEGF的人源化單克隆抗體，自2004年以來已用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌；舒尼替尼(simitinib)和索拉非尼(sorafenib)，其為抑制 VEGF/VEGF-受體通路中信號轉(zhuǎn)導的分子，已用于抗血管發(fā)生策略以治療轉(zhuǎn)移性腎癌。關(guān)于靶向腫瘤和腫瘤細胞的策略，手術(shù)切除腫瘤組織(在其可行時)、實體瘤放射療法、目標為增強針對癌細胞的免疫應答的免疫療法以及化學療法代表了標準的治療。在認識癌形成分子機制方面的重大進展使得有可能開發(fā)出新的化學療法，但是其有效性取決于待治療癌癥的類型以及所影響的器官。另外，許多癌癥也產(chǎn)生嚴重的公共衛(wèi)生問題，并已證明對常規(guī)治療有抗性。例如，胃腸癌癥(胰癌、膽管癌、結(jié)腸直腸癌)在其自然病程中很快變得對化學療法有抗性。編碼P53蛋白的腫瘤阻抑基因的喪失是解釋腫瘤細胞對凋亡的抗性以及對常規(guī)抗贅生物治療(如化學療法或放射療法)的抗性的主要機制之一。這是因為P53蛋白的功能是停滯細胞周期或者誘導細胞應答于細胞DNA損傷或致癌基因活化而凋亡。因此，p53蛋白在細胞周期控制以及基因組完整性的維持方面起中心作用，這通過允許細胞周期中斷以修復基因異常或者使細胞通過凋亡而破壞來實現(xiàn)。由于P53對于保護生物體對抗異?；蚍鞘芸丶毎至训淖饔脕碚f必不可少，因此，P53的缺少、其低表達或者非功能性P53蛋白的表達導致腫瘤細胞的存活。在體外研究模型和小鼠模型中，已經(jīng)顯示通過基因轉(zhuǎn)移而恢復的p53表達促進了癌癥消退，并改善細胞毒治療的有效性。體外研究還顯示，在表達野生型蛋白質(zhì)和相對于野生型蛋白質(zhì)具有顯性失活作用的突變體P53蛋白的細胞中，用特異性靶向編碼突變體p53 蛋白之 mRNA 的 siRNA 進行的干擾重建了 p53 功能(Martinez et al. P. N. Α. S. ,99(23) 14849-54,2002)。另外，還顯示了，可以通過使這些蛋白質(zhì)功能性構(gòu)象穩(wěn)定而“重新活化”突變體Ρ53蛋白。CP-31398、PRIMA-I和MIRA-I分子(所開發(fā)的第一批具有此能力的分子) 已經(jīng)在人異種移植模型中成功地用于抑制腫瘤生長(綜述參見，例如Levesque & festman， Carcinogenesis.，28(1) 13-20，2007)。因此，功能性p53蛋白表達的恢復以及此蛋白質(zhì)過表達的誘導代表了抗腫瘤治療開發(fā)中的關(guān)鍵目標。本發(fā)明人目前已經(jīng)證明，神經(jīng)氈蛋白-2(neur0pilin-2，NRP-2)與p53蛋白表達之間存在負相關(guān)，并出人意料地顯示，可通過使用siRNA抑制神經(jīng)氈蛋白-2表達來誘導或提高p53表達。神經(jīng)氈蛋白-2是一種約130kDa的跨膜糖蛋白，是信號素(semaphorin)(特別是信號素3F)和VEGF家族生長因子的受體。它在人中在神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞和成骨細胞以及眾多贅生物中表達。其由以下構(gòu)成約40個氨基酸的胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，以及胞外結(jié)構(gòu)域。該胞外結(jié)構(gòu)域由以下構(gòu)成由2個亞結(jié)構(gòu)域(ala2)組成的結(jié)構(gòu)域Α、由2個亞結(jié)構(gòu)域(blb2)組成的結(jié)構(gòu)域B，以及結(jié)構(gòu)域C。已顯示，B結(jié)構(gòu)域構(gòu)成VEGF結(jié)合位點，而與信息素3F的結(jié)合則同時涉及A結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域(Geretti et al.，J. Biol. Chem.，282， 25698-707,2007) ；C結(jié)構(gòu)域部分涉及NRP-2的寡聚化。在許多情況下，神經(jīng)氈蛋白是癌細胞表達的唯一的VEGF受體。(Bielenberg et al. Exp. Cell. Res. ,312(5) :584_593，2006)，一些研究顯示，神經(jīng)氈蛋白的表達(或者甚至過表達)通常與腫瘤生長的提高以及與癌癥的侵襲及轉(zhuǎn)移性特征的提高相關(guān)聯(lián)，還與不良的預后相關(guān)聯(lián)。另外，許多觀測結(jié)果表明，這些受體通過活化血管發(fā)生而在腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用特別地，VEGF與NRP-2 二者的結(jié)合負責促血管發(fā)生活性，由VEGF受體VEGFRl和NRP-2 的短胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)作所介導。已有報道稱，NRP-2能夠誘導VEGFRl受體以及AKT蛋白的磷酸化，由此利于癌癥的發(fā)展，并且在異種移植物中通過siRNA對神經(jīng)氈蛋白-2的阻抑對抗了轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)并減小腫瘤大小(Gray et al. J. Natl. Cancer Inst. , 100 :109-120， 2008)。另外，已顯示針對NRP-2的B結(jié)構(gòu)域中VEGF結(jié)合位點的抗NRP-2抗體(也稱為抗 Nrp2B)可減少腫瘤的淋巴血管發(fā)生并減少轉(zhuǎn)移的形成；該抗體通過抑制淋巴內(nèi)皮細胞遷移而起作用，但是對腫瘤細胞的遷移、增殖或凋亡沒有作用(Caunt et al. ,Cancer Cell, 13, 331-42,2008)。本發(fā)明人已產(chǎn)生了抗NRP-2抗體，并注意到其中一些在p53表達和腫瘤細胞凋亡誘導方面產(chǎn)生與siRNA抑制NRP-2相同的作用，并且這些作用是不依賴于VEGF的。另外， 已注意到，在體外和在小鼠模型中體內(nèi)，這些抗體增強了抗癌治療的有效性。這些數(shù)據(jù)開創(chuàng)了新的治療思路，特別是在開發(fā)針對化學療法或放射療法或其他抗癌劑致敏的新策略的可能性方面。因此，本發(fā)明的一個主題是抗人神經(jīng)氈蛋白-2抗體，或者來源于所述抗體的人神經(jīng)氈蛋白-2的配體，其特征在于其與表達人神經(jīng)氈蛋白-2之腫瘤細胞的結(jié)合誘導所述腫瘤的凋亡。有利地，除了誘導表達人神經(jīng)氈蛋白-2的腫瘤細胞凋亡的能力之外，本發(fā)明的抗人神經(jīng)氈蛋白-2抗體或配體還具有下列特征-它們誘導P53表達，并且它們誘導凋亡的能力依賴于此p53表達(其被p53抑制劑 pifithrin-α 降低)；-它們與神經(jīng)氈蛋白結(jié)合的特性以及它們誘導凋亡的能力不依賴于VEGF(VEGF的存在不改變它們與表達人神經(jīng)氈蛋白-2的腫瘤細胞表面結(jié)合及其誘導所述細胞凋亡的能力)。
由此，可根據(jù)誘導表達人神經(jīng)氈蛋白-2之腫瘤細胞凋亡的能力和/或根據(jù)上述一個或多個其他特征，從抗人神經(jīng)氈蛋白-2抗體或其衍生配體中選擇本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以是天然的多克隆或單克隆抗體，或是重組抗體，特別是嵌合或人源化抗體。術(shù)語“嵌合抗體”旨在表示這樣的抗體，即具有其來源單克隆抗體的可變結(jié)構(gòu)域，該可變結(jié)構(gòu)域與另一種抗體(優(yōu)選人抗體)的恒定結(jié)構(gòu)域相偶聯(lián)。術(shù)語“人源化抗體”表示最初由非人動物(優(yōu)選小鼠)產(chǎn)生的抗體，其保留神經(jīng)氈蛋白-2結(jié)合特異性，但是其中為減少其在人中的免疫原性，將盡可能多的小鼠序列替換為相應的人序列。對于可變結(jié)構(gòu)域，所替換的序列一般為FR(構(gòu)架)區(qū)，即位于高變環(huán)(CDR) 之間的序列。 本發(fā)明的嵌合或人源化抗體優(yōu)選是IgG類免疫球蛋白，特別是IgGl、2、3或4同種型?！皝碓从诳股窠?jīng)氈蛋白-2抗體的人神經(jīng)氈蛋白-2配體”的表述旨在表示包含所述抗體的至少重鏈⑶R3和輕鏈⑶R3的任何神經(jīng)氈蛋白-2配體，優(yōu)選還包含所述抗體重鏈和輕鏈的⑶R2和/或⑶R1。具體地，根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)氈蛋白-2配體可以是-本發(fā)明的抗神經(jīng)氈蛋白-2抗體的任何片段，其包含所述抗體中至少重鏈和輕鏈的⑶R3 (優(yōu)選還包含⑶R2和/或⑶Rl)；-任何重組蛋白，包括重組免疫球蛋白分子，其包含如上所定義的本發(fā)明抗神經(jīng)氈蛋白-2抗體片段。特別地，本發(fā)明的抗神經(jīng)氈蛋白-2抗體片段是Fv、dsFv、Fab、Fab' 2或scFv片段。Fv片段由抗體重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL構(gòu)成，其彼此通過疏水相互作用結(jié)合。 dsFv片段由通過二硫橋連接的VH: VL 二聚體構(gòu)成。scFv片段由抗體重鏈和輕鏈的可變部分構(gòu)成，其彼此通過柔性接頭相連(Clackson et al. ,Nature, 352 :624_628，1991)，從而形成單鏈蛋白質(zhì)。Fab片段由木瓜蛋白酶對免疫球蛋白分子的作用產(chǎn)生，每個片段含有輕鏈以及重鏈的前半部分，彼此通過二硫橋相連?？赏ㄟ^用胃蛋白酶處理抗體而獲得F (ab' )2 片段該片段包含兩個Fab片段以及鉸鏈區(qū)的一部分。可通過切割鉸鏈區(qū)中的二硫橋而從 F(ab' ) 2片段獲得Fab'片段。也可組合這些抗原結(jié)合片段以獲得多價衍生物，例如“雙抗體(diabody) ”或“三抗體(triabody) ”，其產(chǎn)生自2個或3個這些抗原結(jié)合片段的結(jié)合。特別地，包含本發(fā)明抗神經(jīng)氈蛋白-2抗體片段的重組蛋白可以是-將至少一個本發(fā)明抗神經(jīng)氈蛋白-2抗體片段與至少一個其它抗體片段相連的蛋白質(zhì)；例如，雙特異性免疫球蛋白，抗神經(jīng)氈蛋白-2抗體的Fv或Fab片段與具有不同特異性之抗體的Fv或Fab片段的綴合物，由抗神經(jīng)氈蛋白-2片段的scFv片段與具有不同特異性之抗體的Fv或Fab片段相連而產(chǎn)生的“雙特異性雙抗體”；-將至少一個本發(fā)明抗神經(jīng)氈蛋白-2片段與延長其體內(nèi)施用時的血漿半衰期的分子相連的蛋白質(zhì)，所述分子特別是分子量足以使得由此獲得的融合多肽的分子量大于腎過濾閾值的水溶性多肽。嵌合或重組抗體、scFv片段及其衍生物等可通過常規(guī)遺傳工程技術(shù)獲得，例如 Sambrook et al.所描述的(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N· Y·，1989)。編碼本發(fā)明抗神經(jīng)氈蛋白-2抗體可變區(qū)的多核苷酸可通過從產(chǎn)生所述抗體的雜交瘤cDNA文庫中克隆所述區(qū)域而獲得。也可基于所述可變區(qū)的核苷酸序列而完全或部分地通過核酸合成來制備它們。獲得人源化抗體的多種方法本身也是公知的(綜述參見例如，Almagro & Fransson, Frontiers in Bioscience,13,1619-1633,2008)?？梢蕴峒暗氖腔贑DR接枝的方法，其將非人抗體的CDR轉(zhuǎn)移到人來源抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)中(參見例如，Routledge et al. , ‘‘ Reshaping antibodies for therapy", JAL Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylatic and Therapeutic Applications in Man, 13-44, Academic Titles, Nottingham, England, 1993,或 Roguska et al. ,Protein Engineering, 9 (10) :895-904,1996)。CDR 接枝通常通過優(yōu)化構(gòu)架區(qū)來完成，其修飾構(gòu)架區(qū)的一些殘基，以增加人源化抗體的抗原結(jié)合親和力。組合文庫的使用使得有可能簡化此優(yōu)化步驟(Rosok et al. J. Biol. Chem. 271 :22611-22618,1996 ；Baca et al. J. Biol. Chem. 272 10678-10684，1997)?？贵w人源化的另一種策略由以下組成僅僅保留原始抗體重鏈和輕鏈的CDR3，以及從人V基因的天然文庫中選擇剩余的序列(Rader et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 95 :8910-8915,1998)。本發(fā)明抗人神經(jīng)氈蛋白-2單克隆抗體的兩個實例是如下所述的抗體ITAC-Bl和 ITAC-B2。這些單克隆抗體是本發(fā)明人根據(jù)其誘導表達NRP-2之腫瘤細胞發(fā)生凋亡的能力來選擇的。測定了 ITAC-Bl和ITAC-B2重鏈和輕鏈的序列。這些序列以及推出的多肽序列顯示于下表KITAC-Bl的輕鏈和重鏈)和下表2(ITAC-B2的輕鏈和重鏈)中。核苷酸序列還顯示于附帶的序列表中，分別為編號SEQ ID No. 1、3、5和7，多肽序列也分別顯示于編號SEQ ID No. 2、4、6 和 8。另外，根據(jù)布達佩斯條約，產(chǎn)生ITAC-Bl抗體的CNCM 1-4054雜交瘤于2008年7月 30日以保藏號CNCM I-40M保藏于法國國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15, France)。表 權(quán)利要求
1.抗人神經(jīng)氈蛋白-2抗體，其特征在于其與表達人神經(jīng)氈蛋白-2的腫瘤細胞的結(jié)合誘導所述腫瘤細胞發(fā)生凋亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗人神經(jīng)氈蛋白-2抗體，其選自i)包含ITAC-Bl抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，所述結(jié)構(gòu)域分別由序列 SEQ ID No. 2 和 SEQ ID No. 4 定義； )包含ITAC-B2抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體，所述結(jié)構(gòu)域分別由序列 SEQ ID No. 6 和 SEQ ID No. 8 定義。
3.人神經(jīng)氈蛋白-2的配體，其特征在于其至少包含權(quán)利要求1和2中任一項所述抗體的重鏈⑶R3和輕鏈⑶R3。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的人神經(jīng)氈蛋白-2的配體，其特征在于其還包含ITAC-Bl或 ITAC-B2抗體的重鏈和輕鏈的⑶R2和/或⑶R1。
5.權(quán)利要求1或2所述抗體或者權(quán)利要求3或4所述配體用于制備抗腫瘤藥物的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的用途，其特征在于所述藥物通過在表達人神經(jīng)氈蛋白-2的腫瘤細胞中提高P53的表達來誘導所述細胞發(fā)生凋亡。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人神經(jīng)氈蛋白-2抗體或來源于這些抗體的配體用于獲得在抗癌治療中旨在增加p53表達和誘導腫瘤細胞凋亡的藥物的用途。
文檔編號A61K39/395GK102498130SQ200980142192
公開日2012年6月13日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月27日
發(fā)明者克里斯托夫·博爾格, 卡米耶·格倫德克萊門特, 約翰·維德內(nèi)斯 申請人:Efs勃艮第弗郎什孔泰, 弗郎什孔泰大學, 艮-普魯勃迪亞克隆公司