專利名稱：人參皂甙Rg1在醫(yī)療保健品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及人參皂甙Rgl在制備預(yù)防和治療甲醛對(duì) 機(jī)體的損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用，以及在制備與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一種普遍存在于原核生物和真核生物中的小 分子蛋白質(zhì)，它與NAPDH和硫氧還蛋白還原酶組成細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原系統(tǒng)。根據(jù)表達(dá) 部位的不同，硫氧還蛋白分為3類Trx-1、Trx-2和spTrx。到目前為止，人類疾病中有關(guān) Trx的研究大都集中在Trx-1。Trx-1是生物體所必須的基因，如果選擇性地敲除小鼠的 Trx-1基因，小鼠則早期胚胎致死，不能存活(Matsui M.，Oshima M.，Oshima H.，Takaku K. , Maruyama T. , Yodoi J. , andTaketo M. M. Early embryonic lethality caused by targeted disruption ofthe mouse thioredoxin gene. Dev. Biol. 1996,178 :179-185)。 Trx-1是細(xì)胞內(nèi)一種有效的抗氧化劑，能保護(hù)細(xì)胞、減輕氧化應(yīng)激所致的損傷。Trx-1能 抑制P38MAPK和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1相關(guān)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑，增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力 (Saito M. , Nishitoh, H. , Fujii, M. , Takeda, K. , Tobiume, K. , Sawada, Y. , Kawabata, M. , Miyazono, K. , and Ichijyo, H. Mammalian thioredoxin is adirect inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1. EMB0,1998,17 :2596_2606 ；Hashimoto S., Matsumoto K. , Gon Y. , Furuichi S. , MaruokaS. , Takeshita I. , Hirota K. , Yodoi J., and Horie T. Thioredoxin negativelyregulates p38 MAP kinase act ivation and IL-6 production by tumor necrosisfactor-alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999,258 443-447.)。同時(shí)，硫氧還蛋白在神經(jīng)生長因子調(diào)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)突起生長中起著重要作 用，是神經(jīng)生長因子的一個(gè)重要候補(bǔ)要素(Bai J.，Nakamura H.，Kwon Y. ff.，Hattori I.， Yamaguchi Y. , Kim Y. C. , Kondo N. , Oka S. , Ueda S. , MasutaniH. , and Yodoi J. Critical roles of thioredoxin in nerve growthfactor-mediated signal transduction and neurite outgrowth in PC12 cells. J. Neurosci, 2003,23:503-509.)。與對(duì)照組小鼠相 比，硫氧還蛋白高表達(dá)小鼠的壽命增加了 30% (Mitsui A，Hamuro J,Nakamura H,Kondo N, Hirabayashi Y,Ishizaki—Koizumi S, Hirakawa T,Inoue T,Yodoi J. Overexpression of humanthioredoxin in transgenic mice controls oxidative stress and life span. Antioxid Redox Signal. 2002，(4) =693-6.) 0隨著研究的深入，硫氧還蛋白在人類各種疾 病中的作用越來越受到人們的重視，并成為藥物治療的重要靶點(diǎn)。甲醛(HCH0)會(huì)強(qiáng)烈刺激眼睛、皮膚、呼吸道黏膜等，造成免疫功能異常、肝損傷及 神經(jīng)毒害，會(huì)導(dǎo)致胎兒畸形、白血病、慢性呼吸道疾病、女性月經(jīng)紊亂、急性精神抑郁癥、鼻 咽癌等疾病。同時(shí)其也是導(dǎo)致心血管疾病的一個(gè)潛在危險(xiǎn)因素。目前，人造板、家具、塑料 壁紙和涂料等大量使用的粘合劑的使用十分廣泛，而一旦家裝家具遇熱、變潮，甲醛就會(huì)從 這些材料中揮發(fā)出來，損害人類的健康。尋找和研發(fā)增強(qiáng)機(jī)體抵抗甲醛損傷的醫(yī)藥保健用品顯得越來越迫切。人參皂甙Rgl是一種存在于許多植物如人參中的已知化學(xué)單體，藥理作用廣泛， 如具有抗疲勞、抗衰老、降血脂、抗癌、提高機(jī)體免疫功能、清除自由基、抗炎、抗氧化等藥理 作用。但是到目前為止，人參皂甙Rgl具有誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白表達(dá)增加的作用，以及可 以預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷卻未見報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在尋找硫氧還蛋白誘導(dǎo)物以用于防治甲醛對(duì)機(jī)體的損傷。本發(fā)明旨在提 供人參皂甙Rgl在醫(yī)療保健品中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案人參皂甙Rgl在制備預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用。人參皂甙Rgl在制備預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷的醫(yī)療保健品中的應(yīng)用。人參皂甙Rgl在制備與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的保健品中的應(yīng)用。
圖1是人參皂甙Rgl對(duì)PC12細(xì)胞中Trx-1含量的影響；圖2是人參皂甙Rgl對(duì)甲醛(HCH0)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞增殖降低的拮抗作用；圖3是人參皂甙Rgl減弱甲醛(HCH0)引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；圖4是人參皂甙Rgl減弱甲醛(HCH0)對(duì)caspase-12的激活作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過下列實(shí)施方式證明了人參皂甙Rgl誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達(dá)的增加并能 用于防治甲醛對(duì)細(xì)胞的損傷作用，但是本發(fā)明的內(nèi)容不局限于此。實(shí)施例1 一、使用的試劑和儀器1.細(xì)胞PC12細(xì)胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞，購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物所。2.藥品及主要試劑甲醛，購自成都市科龍化工試劑廠；人參皂甙Rgl，由昆明制藥集團(tuán)股份有 限公司提供；一抗Anti-mouse Trx由日本京都大學(xué)淀井溶司教授提供；一抗CHOP和 pro-caspasel2,購自 Santa 公司；Protein Marker,購自 Fermentas 公司；RPMIMedium 1640，購自 Invitrogen corporation ；蛋白質(zhì)定量試劑盒,購自 R&D 公司；Chemiluminesent substrate，購自生物晶美公司；PVDF膜，購自Millipore公司；TRIS Base，購自N0V0N公 司；Acrylamide,購自 Solarbio 公司；十二燒基硫酸鈉，購自 xiamen sanland chemicals company limited；Aprotimin、 PMSF 禾口 NP-40,均購自 Sanland-chem International InC ；TEMED,購自HUALVYUANB10TECHN0L0GY ；X射線膠片，購自中國樂凱膠片集團(tuán)公司； 二 抗 affinitypurified antibody peroxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L) HSA liquidconjugate 禾口 affinity purified antibody peroxidase labled goat anti-rabbitlgG(H+L)HSA liquid conjugate,購自美國 Kirkegaard & laboratories。四噻唑藍(lán)(MTT)，購自美國Promega公司。3.主要實(shí)驗(yàn)儀器BHC-1300II A/B3生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；TDL-40B臺(tái)式離 心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；TS-1脫色搖床，金紜市杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)；電子分 析天平，北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)；旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有 限公司生產(chǎn)；BYY-6C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀，北京六一儀器有限公司生產(chǎn)；TS100生物倒置相差 顯微鏡，日本NIKON公司生產(chǎn)；DYCP-31D水平電泳槽，北京六一儀器有限公司生產(chǎn)；C02培 養(yǎng)箱，美國NBS公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，美國MD公司生產(chǎn)J-25離心機(jī)，美國貝克曼公司生產(chǎn)； BG-transBLOT轉(zhuǎn)移芯，北京百晶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；XJX-IIX射線攝影暗匣，上海躍進(jìn) 醫(yī)用光學(xué)器械廠生產(chǎn)。二、人參皂甙Rgl可作為唯一活性成分按常規(guī)藥用劑型制成各種藥劑，也可利用 人參皂甙Rgl抵抗甲醛對(duì)機(jī)體的損傷作用的活性與其他活性成分配合使用按常規(guī)藥用劑 型制成各種醫(yī)療用劑型，制成各種預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷的產(chǎn)品，用于預(yù)防和治療 甲醛對(duì)機(jī)體的損傷。在本發(fā)明中這些常規(guī)藥用劑型就不再一一舉例說明。三、人參皂甙Rgl誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白表達(dá)的增加試驗(yàn)(一 )細(xì)胞株培養(yǎng)和人參皂甙Rgl刺激處理PC12細(xì)胞用含10%馬血清、5%胎牛血清、100U/mL青霉素和100 i g/mL鏈霉素的 1640培養(yǎng)基，于37°C、5% C02和95%濕度下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。每2_3天更換培養(yǎng)基一次，細(xì) 胞達(dá)約70% 80%融合時(shí)，傳代或用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞接種于平板中，培養(yǎng)過夜后，人參皂甙Rgl處理細(xì)胞。分組處理方式如下 對(duì)照組不加藥；實(shí)驗(yàn)組分別加0. 1 y M，1 y M，10 y M的人參皂甙Rgl。上述處理后，置于37°C 和5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，然后收集細(xì)胞，提取蛋白離心lOOOrpmXIOmin收獲細(xì) 胞，分別加入 80ul 細(xì)胞裂解液(150mM NaCl，0. 5% NP-40，10mM Tris-HCl, pH 7. 2,0. ImM PMSF，2ug/ml aprotinin，200ug/mlNaN3)，充分混懸后于冰浴下放置裂解40min (中間振蕩 2 3次)，4°C下15000rpm離心15min，轉(zhuǎn)上清至新離心管中，-80°C保存。( 二 )免疫印跡1.蛋白含量的測定用BCA試劑盒測定將10ul標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本與200ulWR工作溶液混合，37°C孵 育30min，將反應(yīng)管溫度冷卻至室溫。測定562nm光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算蛋白濃度。2.蛋白免疫印跡總蛋白加樣量為7 u g(Trx)和 20 u g(CH0P 和 pro-caspasel2)，與 2XSDS 凝膠加 樣緩沖液混合后，95°C熱變性5min，用15%的SDS-PAGE膠電泳分離后，將蛋白條帶用電轉(zhuǎn) 移到PVDF膜上，用10%脫脂牛奶4°C封閉過夜；取出PVDF膜，用含0. 1 % Tween-20的TPBS 沖洗后，加入2000倍稀釋的一抗室溫孵育60min ；用含0. 1% Tween-20的TPBS沖洗，加入 5000倍稀釋的二抗室溫孵育60min ；用含0. 1 % Tween-20的TPBS沖洗，將PVDF膜浸入發(fā) 光底物溶液中反應(yīng)lmin，X射線膠片曝光。結(jié)果顯示人參皂甙Rgl在PC12細(xì)胞中能誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達(dá)的增加(見圖1)。四、人參皂甙Rgl保護(hù)細(xì)胞免于甲醛的損傷試驗(yàn)
(一 )實(shí)驗(yàn)分組和處理細(xì)胞的初始密度為5X104Cell/Well。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求，分為以下各組①空 白對(duì)照組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中未加任何藥物；②甲醛處理組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中只加入 100 i! M甲醛；③人參皂甙Rgl預(yù)處理組先加入人參皂甙Rgl (10 u M)預(yù)處理8h后，再加入 100 ii M甲醛；④人參皂甙Rgl單獨(dú)處理組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中只加入10 ii M人參皂甙Rgl。 上述各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，按不同實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞。( 二)檢測方法1.四噻唑藍(lán)(MTT)試驗(yàn)取出待測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10ul，繼續(xù)孵育4h后，每 孔加入lOOul的0. 04N鹽酸的異丙醇溶液，混勻吹打20 30次后，用酶標(biāo)儀在波長570nm 處測定吸光度值(見圖2)。2.免疫印跡(1)人參皂甙Rgl減弱甲醛(HCH0)引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激①空白對(duì)照組在細(xì)胞培 養(yǎng)體系中未加任何藥物；②甲醛處理組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中只加入lOOyM甲醛；③人參皂 甙Rgl預(yù)處理組先加入人參皂甙Rgl (10 yM)預(yù)處理8h后，再加入lOOiiM甲醛；④人參皂 甙Rgl單獨(dú)處理組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中只加入10 y M人參皂甙Rgl。上述各組細(xì)胞繼續(xù)培 養(yǎng)24h后，然后收集細(xì)胞，提取蛋白，做蛋白免疫印跡。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法見前(見圖3)。(2)人參皂甙Rgl減弱甲醛(HCH0)對(duì)caspase-12的激活作用①空白對(duì)照組在 細(xì)胞培養(yǎng)體系中未加任何藥物；②甲醛處理組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中只加入100yM甲醛；③ 人參皂甙Rgl預(yù)處理組先加入人參皂甙Rgl (10 u M)預(yù)處理8h后，再加入100 y M甲醛；④ 人參皂甙Rgl單獨(dú)處理組在細(xì)胞培養(yǎng)體系中只加入10 yM人參皂甙Rgl。上述各組細(xì)胞繼 續(xù)培養(yǎng)24h后，然后收集細(xì)胞，提取蛋白，做蛋白免疫印跡。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法見前(見圖4)。上述試驗(yàn)結(jié)果顯示甲醛引起PC12細(xì)胞的活力下降，而人參皂甙Rgl的預(yù)處理能 減弱甲醛對(duì)PC12細(xì)胞的損傷(圖2，圖3和圖4)。這說明人參皂甙Rgl能誘導(dǎo)硫氧還蛋白 表達(dá)的增加，可用于預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷。人參是藥用價(jià)值極高的傳統(tǒng)名貴藥材，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人參具有大補(bǔ)元?dú)?、補(bǔ)脾 益肺、生津止渴、安神益智、補(bǔ)氣生血的作用。提示本發(fā)明對(duì)來源于人參的成分人參皂甙Rgl 是否能誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達(dá)的增加進(jìn)行探索，以拓寬人參皂甙Rgl的藥用保健領(lǐng)域。結(jié)果 表明人參皂甙Rgl在PC12細(xì)胞中能誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達(dá)的增加(圖1)；甲醛引起PC12 細(xì)胞的活力下降，而人參皂甙Rgl的預(yù)處理能減弱甲醛對(duì)PC12細(xì)胞的損傷(圖2，圖3和圖 4)。這說明人參皂甙Rgl能誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達(dá)的增加，可用于預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的 損傷。由于人參皂甙Rgl誘導(dǎo)硫氧還蛋白表達(dá)的增加及其在防治甲醛對(duì)細(xì)胞的損傷中 的應(yīng)用是本發(fā)明的首次發(fā)現(xiàn)，因此，無論是人參皂甙Rgl單獨(dú)使用為活性成分制成的藥劑， 還是利用人參皂甙Rgl抵抗甲醛對(duì)機(jī)體的損傷作用與其他活性成分配合使用制成的藥劑， 均應(yīng)理解為未超出本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
人參皂甙Rg1在制備預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.人參皂甙Rgl在制備預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷的醫(yī)療保健品中的應(yīng)用。
3.人參皂甙Rgl在制備與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了人參皂甙Rg1具有誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白表達(dá)增加的作用，提出人參皂甙Rg1能用于預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷。提供人參皂甙Rg1在制備預(yù)防和治療甲醛對(duì)機(jī)體的損傷的產(chǎn)品特別是醫(yī)療保健品中的應(yīng)用，以及人參皂甙Rg1在制備與氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的保健品中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101829131SQ20101017246
公開日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者楊兆祥, 王晟東, 白潔, 羅富成 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)