一種玫瑰葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種玫瑰葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取方法。該方法包括如下步驟：（1）新鮮的玫瑰葉經(jīng)曬干后經(jīng)粉碎過篩得到玫瑰葉顆粒；（2）用提取溶劑提取所述玫瑰葉顆粒，得到提取液；（3）所述提取液經(jīng)離心得到上清液；所述上清液經(jīng)濃縮得到濃縮液；（4）將所述濃縮液依次用乙醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇溶液進行萃取，分別得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液，再分別經(jīng)濃縮得到乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，分別標記為Fa、Fb、Fc和Fd，即提取得到了玫瑰葉中的抗氧化物質(zhì)。本發(fā)明提供的抗氧化活性物質(zhì)篩選方法采用自由基溶液與液相色譜柱分離后產(chǎn)物在線反應，分離篩選連續(xù)進行，能快速的檢測出具有抗氧化活性成分。
【專利說明】一種玫瑰葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種玫瑰葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取方法。
【背景技術】
[0002]人體正常代謝或在各種應激條件下都會產(chǎn)生自由基，過量的自由基會導致癌癥、衰老、糖尿病等一系列疾病，這時就需要補充外源性抗氧化劑來維持體內(nèi)自由基平衡。抑制自由基的產(chǎn)生，使其快速猝滅，修復其對肌體造成的氧化傷害對人體健康有重要意義，尋找天然抗氧化活性成分以及抗氧化活性的測定已成為當前的熱點。
[0003]玫瑰葉是薔薇科薔薇屬落葉灌木玫瑰的葉，玫瑰葉含有大量的黃酮類化合物。該類化合物在抗氧化反應中不僅能清除鏈引發(fā)階段的自由基，而且可以直接捕獲自由基反應鏈中的自由基，阻斷自由基鏈式反應，起到預防和斷鏈的雙重作用。目前，已有從植物中提取黃酮類化合物的提取技術，但國內(nèi)外對于從玫瑰葉中提取黃酮類化合物的報道不多，僅發(fā)現(xiàn)賈長虹等采用微波提取玫瑰葉黃酮，但是該方法對儀器設備要求高，運行成本高，且應用范圍較窄，不能大范圍推廣，因此目前市場上還沒有標準化的產(chǎn)品出現(xiàn)。
[0004]在抗氧化活性的測定方面，目前可以采用提取物對ABTS自由基和DPPH自由基清除能力來快速測定其抗氧化活性，但是，這些方法測定的是提取物的總活性，而非單一組分，并且該方法采用比色法進行測定，容易受到底物的干擾。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種玫瑰葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取方法。
[0006]本發(fā)明所提供的一種玫瑰葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取方法，包括如下步驟:
[0007]( I)新鮮的玫瑰葉經(jīng)曬干后經(jīng)粉碎過篩得到玫瑰葉顆粒；
[0008](2)用提取溶劑提取所述玫瑰葉顆粒，得到提取液；所述提取溶劑為水或乙醇水溶液；
[0009](3)所述提取液經(jīng)離心得到上清液；所述上清液經(jīng)濃縮得到濃縮液；
[0010](4)將所述濃縮液依次用乙醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇溶液進行萃取，分別得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液，再分別經(jīng)濃縮得到乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，分別標記為Fa、Fb、Fc和Fd，即提取得到了玫瑰葉中的抗氧化物質(zhì)。
[0011]所述方法還包括對所述Fa、Fb、Fe和Fd中的抗氧化物質(zhì)進行提取的步驟:
[0012]將所述Fa、Fb、Fc和Fd分別進行液相色譜分離，依次在檢測波長為270nm和350nm的條件下得到萃取物的液相色譜圖1 ;經(jīng)分離后的各組分與自由基溶液進行反應，然后進入檢測器進行檢測，在檢測波長為270nm、350nm和747nm的條件下得到各萃取物與所述自由基溶液反應后的化學成分圖譜II ;對比所述化學成分圖譜II中270nm、350nm和747nm條件下的吸收峰，在相同的保留·時間下，若270nm和350nm條件下的吸收峰在747nm條件下為負吸收峰時，則該保留時間對應的組分即為抗氧化活性物質(zhì)，收集該保留時間下的組分即為抗氧化活性物質(zhì)。
[0013]上述的方法中，步驟(1)中，經(jīng)所述曬干后的玫瑰葉的含水率可為4%~8% ；
[0014]所述玫瑰葉顆粒的粒度可為20~80目。
[0015]上述的方法中，步驟(2)中，所述乙醇水溶液中乙醇的體積含量可為10%~90% ；
[0016]所述提取的溫度可為40~80°C，所述提取的時間可為60~80min ；
[0017]所述提取溶劑與所述玫瑰葉顆粒的質(zhì)量比可為5~30:1 ;
[0018]所述提取的次數(shù)可為I~3次。
[0019]上述的方法中，步驟(3)中，所述離心的轉速可為3000~4800r/min，所述離心的時間可為5~30min ；
[0020]所述濃縮的溫度可為40~80°C ;
[0021]所述濃縮液的濃度可為5~8° Brix0
[0022]上述的方法中，步驟(4)中，所述濃縮液與所述乙醚的體積比可為1:2~3 ;
[0023]乙醚萃余液與所述乙酸乙酯的體積比可為1:2~3 ;
[0024]乙酸乙酯萃余液與所述水飽和正丁醇的體積比可為1:2~3 ;
[0025]所述提取的次數(shù)可為I~2次；
[0026]所述濃縮的溫度可為40~70°C。
[0027]上述的方法中，所述自由基溶液可為2，2-聯(lián)氮-二( 3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)的水溶液；
[0028]所述自由基溶液在747nm處的吸光度值可為0.65~0.75 ；
[0029]所述液相色譜圖1I中的負峰是所述自由基溶液與提取物中的抗氧化活性成分反應產(chǎn)生褪色，吸光度值降低引起的。
[0030]上述的方法中，所述反應的溫度可為25~35°C。
[0031]上述的方法中,所述液相色譜分離的條件如下:色譜柱為Agilent Zorbax AQ柱；流動相A相為水(含質(zhì)量濃度2%的甲酸)，流動相B相為乙腈；梯度洗脫程序:0~15min，0%~10% B ；15 ~20min，10% B ；20 ~30min，10%~15% B ；30 ~40min，15% B ；40 ~50min, 15%~20% B ；50 ~60min,20% B ；60 ~65min,20%~30% B。
[0032]上述的方法中，可通過液質(zhì)聯(lián)用檢測篩選出的所述抗氧化活性物質(zhì)。然后可通過標準品對鑒定出的抗氧化成分進行定量，參考標準抗氧化物建立的清除自由基能力的標準曲線，對不同抗氧化成分的清除自由基能力進行定量比較。
[0033]本發(fā)明具有如下有益效果:
[0034]1、本發(fā)明提供的方法中，玫瑰葉來源廣泛，生產(chǎn)技術簡單，工藝參數(shù)合理，設備投入成本低，具有較高的社會經(jīng)濟效益和廣闊的工業(yè)化前景。
[0035]2、本發(fā)明提供的抗氧化活性物質(zhì)篩選方法，可解決常用方法只能測定總萃取物的抗氧化能力，不能測定單體的抗氧化能力的不足。
[0036]3、本發(fā)明提供的抗氧化活性物質(zhì)篩選方法采用自由基溶液與液相色譜柱分離后產(chǎn)物在線反應，分離篩選連續(xù)進行，能快速的檢測出具有抗氧化活性成分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明的方法的工藝流程圖。[0038]圖2為本發(fā)明方法中在線篩選抗氧化成分(步驟(6))的方法的流程圖。
[0039]圖3為實施例1中乙醚萃取液的液相色譜的對比圖。
[0040]圖4為實施例1中乙酸乙酯萃取液中液相色譜的對比圖。
[0041]圖5為實施例1中正丁醇萃取液中液相色譜的對比圖。
[0042]圖6為實施例1中水萃取液中液相色譜的對比圖。
【具體實施方式】
[0043]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045]ABTS自由基溶液配制:取7mmol/L的ABTS(Sigma公司，上海)水溶液與2.45mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，避光反應12h以上，實驗前用甲醇將ABTS儲備液稀釋至747nm處吸光度值為0.65~0.75。
[0046]實施例1、
[0047]將新鮮玫瑰葉曬干后(其含水量為5%)，粉碎過20目篩得到玫瑰葉顆粒。稱取50g玫瑰葉顆粒加入三角瓶后，加入500g去離子水，在70°C下提取3次，每次提取60min，合并得到的提取液。將合并后的提取液在4500r/min離心15min后得到1.5° Brix上清液，60°C減壓濃縮，得到6° Brix濃縮液。將該濃縮液以1:2體積比依次加入乙醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇溶液，均萃取2次依次得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液。將上述各萃取液分別在50°C下減壓濃縮至干，得到乙醚萃取物(Fa)2.36g，乙酸乙酯萃取物(Fb) 3.85g，正丁醇萃取物(Fe) 3.94g，和水萃取物(Fd) 2.97g，用甲醇溶液分別溶解定容至200mL,分別過0.45 μ m膜,經(jīng)高效液相色譜分離,分離條件為:Agilent ZorbaxAQ柱(250mmX4.6mm 1.d.,5ym);流動相A相為水(含濃度2%甲酸)，流動相B相為乙腈；梯度洗脫程序:0 ~15min，0%~10% B ；15 ~20min，10% B ；20 ~30min，10%~15% B ；30 ~40min, 15% B ；40 ~50min, 15%~20% B ;50 ~60min, 20% B ；60 ~65min, 20%~30% B。進樣量10 μ L ;流速為0.8ml/min ;柱溫25°C;檢測波長270nm和356nm。經(jīng)檢測器檢測，得到四種萃取物的液相色譜圖，記作成分圖譜，并收集分離得到的各組分。
[0048]將配制好的ABTS自由基溶液以0.5mL/min流速泵入柱后反應系統(tǒng)，控溫器溫度為30°C,ABTS溶液流經(jīng)反應系統(tǒng)后進入檢測器，在747nm處吸光度值平衡后，基線調(diào)零。按上述條件將四種萃取物溶液分別進樣，液相色譜分離得到的各組分與ABTS自由基溶液在柱后反應系統(tǒng)反應后進入檢測器，記錄270nm、356nm和747nm下的保留時間，分別得到相應的圖譜，記作反應后圖譜；對比反應后圖譜中在270nm、350nm和747nm條件下的吸收峰，在相同的保留時間下，若270nm和350nm條件下的吸收峰在747nm條件下為負吸收峰時，則該保留時間對應的組分即為抗氧化活性物質(zhì)，收集該保留時間下的組分即得到抗氧化活性物質(zhì)。
[0049]其中，乙醚萃取物(Fa)的對比圖如圖3所示，乙酸乙酯萃取物(Fb)的對比圖如圖
4所示,正丁醇萃取物(Fe)的對比圖如圖5所示,水萃取物(Fd)的對比圖如圖6所示,篩選出具有負峰的組分即為抗氧化活性物質(zhì)。
[0050]對各萃取物中篩選出的抗氧化活性物質(zhì)采用液質(zhì)聯(lián)用技術進行定性分析。
[0051]結合各抗氧化物質(zhì)的標準圖譜，可以得知，乙醚萃取物中總共檢測出槲皮素、槲皮素3-β -D-葡萄糖甙、牡荊苷等10種抗氧化物質(zhì)；乙酸乙酯萃取物中檢測出兒茶素、蘆丁等14種抗氧化物質(zhì)；正丁醇萃取物中檢測出綠原酸等15種抗氧化物質(zhì)；水萃取物中檢測出中奎寧酸等11種抗氧化物質(zhì)。
[0052]實施例2、
[0053]將新鮮玫瑰葉曬干后(其含水量為6%)，粉碎過20目篩得到玫瑰葉顆粒。稱取50g玫瑰葉顆粒加入三角瓶后，加入1000g乙醇體積百分含量50%的乙醇水溶液，在70°C下提取2次，每次提取60min，合并得到1.2。Brix的提取液。將該提取液在4500r/min離心15min后得到上清液，再于55°C下減壓濃縮，得到6° Brix的濃縮液。將該濃縮液以1:3體積比依次加入乙醚、乙酸乙酯和水飽和正丁醇溶液，萃取I次依次得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液。將各萃取液分別在45°C下減壓濃縮至干，得到乙醚萃取物(Fa) 2.12g，乙酸乙酯萃取物(Fb) 3.89g，正丁醇萃取物(Fe) 3.57g，和水萃取物(Fd)
2.84g，用甲醇溶液分別溶解定容至200mL，分別過0.45 μ m膜，經(jīng)高效液相色譜分離，分離條件為:Agilent Zorbax AQ 柱(250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m);流動相 A 相為水(含濃度 2%甲酸)，流動相B相為乙腈；梯度洗脫程序:0~15min，0%~10% B ;15~20min，10% B ；20 ~30min, 10%~15% B ；30 ~40min, 15% B ；40 ~50min, 15%~20% B ；50 ~60min,20% B ；60 ~65min，20%~30% B。進樣量 10 μ L ;流速為 0.8ml/min ;柱溫 25°C ;檢測波長270nm，356nm。經(jīng)檢測器檢測，得到四種萃取物的液相色譜圖，記作成分圖譜，并收集分離得到的各組分。
[0054]將配制好的ABTS自由基溶液以0.7mL/min流速泵入柱后反應系統(tǒng)，控溫器溫度為35°C,ABTS溶液流經(jīng)反應系統(tǒng)后進入檢測器，在747nm處吸光度值平衡后，基線調(diào)零。按上述條件將四種萃取物溶液分別進樣，液相色譜分離得到的各組分與ABTS自由基溶液在柱后反應系統(tǒng)反應后進入檢測器，記錄270nm、356nm和747nm下的保留時間，分別得到相應的圖譜，記作反應后圖譜；對比·反應后圖譜中270nm、350nm和747nm條件下的吸收峰，在相同的保留時間下，若270nm和350nm條件下的吸收峰在747nm條件下為負吸收峰時，則該保留時間對應的組分即為抗氧化活性物質(zhì)，收集該保留時間下的組分即得到抗氧化活性物質(zhì)。
[0055]對各萃取物中篩選出的抗氧化活性物質(zhì)采用液質(zhì)聯(lián)用技術進行定性分析。
[0056]結合各抗氧化物質(zhì)的標準圖譜，可以得知，乙醚萃取物中總共檢測出槲皮素、槲皮素3-β -D-葡萄糖甙、牡荊苷等10種抗氧化物質(zhì)；乙酸乙酯萃取物中檢測出兒茶素、蘆丁等14種抗氧化物質(zhì)；正丁醇萃取物中檢測出綠原酸等15種抗氧化物質(zhì)；水萃取物中檢測出中奎寧酸等11種抗氧化物質(zhì)。
【權利要求】
1.一種玫瑰葉中抗氧化活性物質(zhì)的提取方法，包括如下步驟: (1)新鮮的玫瑰葉經(jīng)曬干后經(jīng)粉碎過篩得到玫瑰葉顆粒； (2)用提取溶劑提取所述玫瑰葉顆粒，得到提取液；所述提取溶劑為水或乙醇水溶液； (3)所述提取液經(jīng)離心得到上清液；所述上清液經(jīng)濃縮得到濃縮液； (4)將所述濃縮液依次用乙醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇溶液進行萃取，分別得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和水萃取液，再分別經(jīng)濃縮得到乙醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，分別標記為Fa、Fb、Fe和Fd，即提取得到了玫瑰葉中的抗氧化活性物質(zhì)。
2.根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述方法還包括對所述Fa、Fb、Fc和Fd中的抗氧化物質(zhì)進行提取的步驟: 將所述Fa、Fb、Fe和Fd分別進行液相色譜分離，依次在檢測波長為270nm和350nm的條件下得到萃取物的液相色譜圖1 ;經(jīng)分離后的各組分與自由基溶液進行反應，然后進入檢測器進行檢測，在檢測波長為270nm、350nm和747nm的條件下得到各萃取物與所述自由基溶液反應后的化學成分圖譜II ;對比所述化學成分圖譜II中270nm、350nm和747nm條件下的吸收峰，在相同的保留時間下，若270nm和350nm條件下的吸收峰在747nm條件下為負吸收峰時，則該保留時間對應的組分即為抗氧化活性物質(zhì)，收集該保留時間下的組分即為抗氧化活性物質(zhì)。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，經(jīng)所述曬干后的玫瑰葉的含水率為4%~8% ； 所述玫瑰葉顆粒的粒度為20~80目。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述乙醇水溶液中乙醇的體積含量為10%~90% ；` 所述提取的溫度為40~80°C，所述提取的時間為60~80min ； 所述提取溶劑與所述玫瑰葉顆粒的質(zhì)量比為5~30:1 ; 所述提取的次數(shù)為I~3次。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述離心的轉速為3000~4800r/min,所述離心的時間為5~30min ； 所述濃縮的溫度為40~80°C ; 所述濃縮液的濃度為5~8。Brix0
6.根據(jù)權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于:步驟(4)中，所述濃縮液與所述乙醚的體積比為1:2~3; 乙醚萃余液與所述乙酸乙酯的體積比為1:2~3 ; 乙酸乙酯萃余液與所述水飽和正丁醇的體積比為1:2~3 ; 所述提取的次數(shù)為I~2次； 所述濃縮的溫度為40~70V。
7.根據(jù)權利要求2-6中任一項所述的方法，其特征在于:所述自由基溶液為2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽的水溶液； 所述自由基溶液在747nm處的吸光度值為0.65~0.75。
8.根據(jù)權利要求2-7中任一項所述的方法，其特征在于:所述反應的溫度為25~35。。。
9.根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于:通過液質(zhì)聯(lián)用鑒定篩選出的所述抗氧化活性物質(zhì)。`
【文檔編號】A61P39/06GK103655802SQ201310646234
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權日:2013年12月4日
【發(fā)明者】高彥祥, 王媛莉, 袁芳 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學