雙神經(jīng)因子連接的聚吡咯?聚乳酸平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜及其制備
【專利摘要】本發(fā)明涉及兩種神經(jīng)因子NGF和NT?3連接在聚吡咯?聚乳酸平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜及其制備方法。首先把直徑為50~2000 nm平行多孔聚乳酸絲膜置于含有十二烷基磺酸鈉、聚谷氨酸、FeCl3和吡咯的混合水溶液中，隨后采用在位聚合法充分反應(yīng)2~24小時(shí)，在平行絲膜表面均勻包覆上聚吡咯納米顆粒，洗滌干燥后得到直徑為60~2500 nm的導(dǎo)電聚吡咯包裹的聚乳酸纖維膜；然后采用碳二亞胺技術(shù)在這種平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜上先后連接NGF和NT?3兩種神經(jīng)因子蛋白，從而制得在電場(chǎng)刺激下能釋放神經(jīng)因子并促進(jìn)神經(jīng)軸突延伸及外周神經(jīng)修復(fù)的導(dǎo)電復(fù)合絲膜。本發(fā)明具有簡(jiǎn)單易行、神經(jīng)因子連接效率高、材料導(dǎo)電性好、神經(jīng)修復(fù)時(shí)間短的特點(diǎn)。
【專利說明】
雙神經(jīng)因子連接的聚吡咯-聚乳酸平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜及其制備
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種雙神經(jīng)因子連接的聚吡咯-聚乳酸平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜及其制備。
【背景技術(shù)】
[0002]與普通納米纖維制備技術(shù)相比，靜電紡絲技術(shù)的誕生為納米纖維的制備提供了新的思路，它能制備出直徑更小、纖維更長(zhǎng)的納米線，并提高其生物可降解性，因而被應(yīng)用到很多領(lǐng)域。相比于無(wú)規(guī)的電紡纖維，平行的纖維由于具有各項(xiàng)異性而備受關(guān)注，如其縱向的拉伸強(qiáng)度高，其良好的平行結(jié)構(gòu)還能引導(dǎo)細(xì)胞和組織生長(zhǎng)。導(dǎo)電聚合物中聚吡咯的生物相容性好、導(dǎo)電率高及組織的力學(xué)匹配性好，是良好的生物電刺激給電介質(zhì)。但是聚吡咯的脆性、難降解性和不易加工性限制了其在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用。雖然可以通過聚吡咯納米顆粒包覆在可降解的乳酸纖維絲上，以提高其加工性、體內(nèi)分散性而排出體外;但聚吡咯的疏水性也不利于其神經(jīng)細(xì)胞的粘附、分化和軸突的生長(zhǎng)。對(duì)聚乳酸-聚吡咯復(fù)合絲膜而言，摻雜有十二烷基磺酸(DBS)和聚谷氨酸(PGlu)的導(dǎo)電聚吡咯顆粒，可以均勻包覆在聚乳酸纖維表面而形成導(dǎo)電殼層，在長(zhǎng)時(shí)間的生物體內(nèi)作用下可分散在血液中而被排出生物體外。張等人(Acta 8丨011^七6431丨3，2016，32，？46-56)報(bào)道，通過外層聚吡咯向神經(jīng)模型細(xì)胞?(:12施加100?200 mV/cm的電刺激，能有效地提高細(xì)胞的活性，更易向特定功能分化，并促進(jìn)其長(zhǎng)出的軸突沿著導(dǎo)電復(fù)合纖維方向延伸。
[0003]通過連接上各種特異性生物物質(zhì)，可以提高材料的表面親水性、生物相容性和細(xì)胞粘附性，常見的方法有物理吸附、涂抹包被、電化學(xué)沉積以及化學(xué)活化接枝改性等方法。然而，普通物理吸附包被連接的生物物質(zhì)往往因?yàn)檫B接的不牢而易脫落，化學(xué)沉積或電沉積方法雖然能夠牢牢地將生物物質(zhì)包被在材料上，但其操作難度大、技術(shù)要求高、且易使蛋白失活變性?；瘜W(xué)活化法連接包被蛋白或者特異性因子可以定向完成需要的生物物質(zhì)結(jié)合，具有目標(biāo)明確、方法簡(jiǎn)單易操作、可重復(fù)操作等特點(diǎn)，已得到重視。使用碳二亞胺(EDC)法可以連接上神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在聚吡咯材料上，從而使NGF-PPy復(fù)合材料能誘導(dǎo)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)。李曉光等人(8丨0111&丨64&18，2010，31，？2184-2192)報(bào)道，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(見'-3)連接的可降解生物材料能促進(jìn)神經(jīng)損傷的再生修復(fù)。我們前期的研究(Electrochimi ca八(^&，2015，185，？172-177)表明，在電沉積制備的？?7薄膜上同時(shí)連接抓?和階-3兩種神經(jīng)因子，能較好地促進(jìn)材料表面粘附細(xì)胞的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。但在這種電沉積薄膜上，神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出的軸突是各個(gè)方向發(fā)散性生長(zhǎng)的，并且其軸突仍然比較短。因此目前還沒有在平行導(dǎo)電聚合物絲膜化學(xué)活化法連接NGF和NT-3兩種神經(jīng)因子，以獲得更長(zhǎng)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的報(bào)道。本發(fā)明充分利用了聚谷氨酸摻雜聚吡咯包覆聚乳酸絲膜的平行多孔結(jié)構(gòu)，并在酸性條件下活化，使其平行絲的表面最大效率地連接神經(jīng)因子蛋白。相比單純的平行結(jié)構(gòu)絲膜誘導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)，由于同時(shí)引入NGF和NT-3兩種因子后，這種導(dǎo)電多孔產(chǎn)品不但具有良好的神經(jīng)細(xì)胞粘附性，而且還能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化，并在電刺激條件下促進(jìn)軸突延伸的更長(zhǎng)。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明提供了一種雙神經(jīng)因子連接的平行導(dǎo)電多孔聚吡咯-聚乳酸復(fù)合絲膜及其制備方法。
[0006]本發(fā)明注意到，在合成包覆層聚吡咯時(shí)利用合適的摻雜劑，既可以使聚吡咯-聚乳酸平行多孔絲膜具有優(yōu)良的導(dǎo)電性，還能提高材料的親水性和細(xì)胞粘附性，并為導(dǎo)電纖維上連接多種神經(jīng)因子提供活性基團(tuán)。由此在本發(fā)明中提出一種新的制備特異性神經(jīng)粘附及促進(jìn)神經(jīng)軸突引導(dǎo)延伸生長(zhǎng)的技術(shù)方案。其中，利用化學(xué)氧化法在位聚合沉積聚谷氨酸及十二烷基磺酸共摻雜的導(dǎo)電聚吡咯納米顆粒包覆在平行多孔聚乳酸絲表面，獲得平行導(dǎo)電多孔絲膜，并通過H)C法先后連接NGF及NT-3兩種神經(jīng)因子，該方法包括以下步驟:a)將聚乳酸溶于N，N-二甲基甲酰胺與二氯甲烷(DMF與DCM)的混合溶劑中，配成電紡絲液，再將紡絲液噴射于高壓電場(chǎng)，并由高速旋轉(zhuǎn)鼓收集而獲得平行多孔聚乳酸絲膜，b)用化學(xué)氧化在位聚合沉積法包覆聚吡咯殼層，并同時(shí)進(jìn)行共摻雜DBS和聚谷氨酸;c)將導(dǎo)電復(fù)合絲膜浸泡在EDC活化液中，然后將材料置于NGF溶液中避光反應(yīng)連接;d)將連接NGF的膜再進(jìn)行活化，然后進(jìn)行NT-3反應(yīng)連接;e)重復(fù)上述兩種神經(jīng)因子的連接，以提高其連接量。
[0007]在本發(fā)明的方法中，所述聚乳酸濃度可以是0.5?2.0mg/mL，優(yōu)選為0.65?1.5mg/mL。所述DMF = DCM比例是為0.01?0.3/1，優(yōu)選比例為0.05?0.2/1;所述聚谷氨酸和DBS的濃度可以分別為3.5?42 mM和3.5?56 mM，優(yōu)選濃度分別為7?28 mM和7?42mM。這兩者的摻雜比例不能過高也不能太低，不然就會(huì)影響聚吡咯層的導(dǎo)電性、親水性和細(xì)胞粘附性及接枝基團(tuán)數(shù)量。
[0008]在本發(fā)明的方法中，所述I3BS緩沖液的pH可以為4.0?6.0，優(yōu)選為4.5?5.5。活化液中包含的碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺(EDC和NHS)濃度可以分別為0.1?0.3 M和
0.02?0.15 M，優(yōu)選濃度分別為0.15 -0.25 M和0.035 -0.1 M。可以采用超聲振蕩方法讓活化液以及反應(yīng)液充分浸潤(rùn)絲膜，以達(dá)到每根絲膜表面上的所有位點(diǎn)都被活化并連接上NGF或NT-3，其連接反應(yīng)的時(shí)間為0.3?2小時(shí)。
[0009]在本發(fā)明的方法中，可以在室溫條件下將步驟a)所得的平行絲膜需要在室溫環(huán)境下自然干燥0.5~2天，使紡絲溶劑充分揮發(fā)。吡咯沉積液需要充分?jǐn)嚢璺稚?，也可借助超聲分?-30 min等方式讓沉積液完全浸潤(rùn)在絲膜表面。
[0010]在本發(fā)明的方法中，為得到接枝量最大的神經(jīng)因子復(fù)合產(chǎn)物，在步驟e)中需對(duì)已經(jīng)接枝過的導(dǎo)電絲膜進(jìn)行洗滌、活化和再連接操作。用pH=7.2?7.4的PBS輕輕地將絲膜清洗兩遍，此過程是為了將部分未連接上NGF或NT-3的羧基充分暴露出來，然后用EDC和NHS進(jìn)行振蕩活化處理0.2?1.0小時(shí)，再將活化好的平行導(dǎo)電多孔絲膜置于前一次連接的剩余神經(jīng)因子溶液中，繼續(xù)振蕩反應(yīng)0.2?2小時(shí)。連續(xù)幾次連接，再經(jīng)PBS液清洗后得到神經(jīng)因子連接量大的平行導(dǎo)電絲膜。
[0011]依據(jù)本發(fā)明方法可以在室溫下制備得到NGF和NT-3連接的平行導(dǎo)電多孔聚吡咯-聚乳酸納米絲膜。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單易行，神經(jīng)因子的連接量大，產(chǎn)物環(huán)境友好且具有良好導(dǎo)電性和細(xì)胞粘附性等優(yōu)點(diǎn)。由于納米導(dǎo)電絲表面修飾連接有神經(jīng)生長(zhǎng)因子，因此不但大大提高了其生物相容性和神經(jīng)修復(fù)性，還能賦予導(dǎo)電聚吡咯-聚乳酸納米纖維獨(dú)特的誘導(dǎo)性能。
【附圖說明】
[0012]結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中
圖1是聚乳酸-聚吡咯平行導(dǎo)電多孔納米纖維絲膜的掃描電鏡圖。
[0013]圖2顯示出聚吡咯-聚乳酸納米纖維同時(shí)連接NGF和NT-3的熒光顯微鏡照片，為便于觀察神經(jīng)因子的連接，NGF和NT-3分別被綠色熒光素FITC和紅色羅丹明RITC標(biāo)記。
[0014]圖3為在外加電場(chǎng)與絲軸一致、200mV/cm的電刺激下PC12細(xì)胞培養(yǎng)2天的顯微鏡照片，箭頭指示為外加電場(chǎng)的方向。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，這些實(shí)施例只是為了更好地理解本發(fā)明，并且在任何情況下都不應(yīng)該將其解釋為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附的權(quán)利要求書所限定。
[0016]本發(fā)明中平行導(dǎo)電聚吡咯-聚乳酸納米纖維的制備及其NGF和NT-3的連接是通過高壓靜電紡絲、化學(xué)氧化聚合和m)C-NHS法實(shí)現(xiàn)的。圖1是聚乳酸-聚吡咯平行多孔絲膜的掃描電鏡圖，可見本發(fā)明制備的絲膜具有平行度好、聚吡咯包覆層連續(xù)性好等優(yōu)點(diǎn)。圖2是聚吡咯-聚乳酸平行絲膜連接NGF和NT-3后的熒光顯微鏡照片。由該圖可知熒光素標(biāo)記的NGF或NT-3都很均勻的連接在了納米纖維絲的表面，其接枝總量也很高。
[0017]本發(fā)明提供的平行導(dǎo)電聚吡咯-聚乳酸納米纖維的制備及其NGF和NT-3的連接由于對(duì)設(shè)備、條件、試劑等無(wú)特殊要求，因此易于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)且產(chǎn)量高。以下是本發(fā)明的示例性的具體實(shí)施方案，通過這些實(shí)施方案可以更充分地理解本發(fā)明的上述及其它優(yōu)點(diǎn)。
[0018]實(shí)施例1
將0.3g粘度為?2.3dL的聚乳酸溶于3.6 mL二氯甲烷，再將0.4 mL的N，N二甲基甲酰胺加入已溶解的聚乳酸溶液中，超聲15分鐘再繼續(xù)磁力攪拌12小時(shí)使其充分混溶。把溶解好的聚乳酸溶液裝入注射栗，設(shè)置栗的推進(jìn)速率為0.5?2.0 mL/h，紡絲電壓為10?15 kV，紡絲距離控制在8?25 cm，收集轉(zhuǎn)鼓直徑為12 cm，轉(zhuǎn)鼓速度為400?2000 r/min，電紡時(shí)間3小時(shí)可得平行多孔聚乳酸納米絲膜。配制含有DBS和聚谷氨酸濃度分別為14 mM和14 mM的混合溶液，再于磁力攪拌下加入100 mL的吡咯單體，持續(xù)攪拌、超聲形成懸濁液，將絲膜浸入已于4 °C預(yù)冷0.5小時(shí)的吡咯溶液中，然后在4 °C下緩慢滴加已于4 °C預(yù)冷0.5小時(shí)的38 mM氯化鐵溶液并反應(yīng)12小時(shí)，得到平行導(dǎo)電多孔聚吡咯-聚乳酸復(fù)合絲膜纖維。配制好pH為5.0、濃度分別為0.2 M和0.05 M的EDC-NHS混合溶液，然后將導(dǎo)電平行多孔絲膜放入并浸泡活化0.5小時(shí)，再將其置于配制好的濃度為500 ng/mL的NGF或NT-3的I3BS溶液中避光反應(yīng)連接I小時(shí)，重復(fù)活化和連接蛋白兩到三次，連接完成后用PBS溶液清洗復(fù)合絲膜兩遍后并避光低溫保存。
[0019]實(shí)施例2
將3.6 mL二氯甲烷和0.4 mL N，N二甲基甲酰胺混合均勻，再將0.3 g粘度為?2.3dL的聚乳酸溶解于混合液中，超聲半小時(shí)再攪拌12小時(shí)，然后將溶液加入注射栗，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)為:栗的推進(jìn)速率為0.5?2.0 mL/h，電壓為10?15kV，紡絲距離控制在8?25 cm，收集轉(zhuǎn)鼓直徑為12 cm，轉(zhuǎn)鼓速度為400?2000 r/min，電紡3小時(shí)。絲膜在含有DBS、聚谷氨酸和吡咯單體濃度分別為14 mM、28 mM和100 mL的溶液中浸潤(rùn)0.5小時(shí)，在預(yù)冷使混合微乳液和氯化鐵溶液都保持在4 °C時(shí)，將氯化鐵溶液滴加到微乳液中并振蕩反應(yīng)12小時(shí)。用pH為5.0、EDC和NHS濃度分別為0.2 M和0.05 M的混合溶液活化導(dǎo)電絲膜0.5小時(shí)，再將其置于1000ng/mL的NGF或NT-3熒光標(biāo)記溶液避光振蕩I小時(shí)，重復(fù)活化及再連接過程兩到三次，然后用PBS溶液清洗絲膜兩遍，最后避光低溫保存并進(jìn)行熒光觀察。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種雙神經(jīng)因子連接的聚吡咯-聚乳酸平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜的制備方法，該方法包括以下步驟:a)將聚乳酸溶于N，N-二甲基甲酰胺與二氯甲烷(DMF與DCM)的混合溶劑中，形成濃度為0.5-2.0 mg/mL的紡絲液，其中DMF:DCM為0.01-0.3/1，并用轉(zhuǎn)鼓收集的電紡絲技術(shù)制得平行多孔聚乳酸絲膜;b)將步驟a)所制的平行多孔絲膜浸泡在含有十二烷基苯磺酸鈉(DBS)、聚谷氨酸(PGlu)和吡咯的混合水溶液中，然后將其置于冷凍搖床中，并緩慢滴加氯化鐵溶液，然后在該溫度下繼續(xù)進(jìn)行化學(xué)氧化聚合反應(yīng)，制得PGlu摻雜的聚吡咯納米顆粒包覆聚乳酸的平行多孔復(fù)合絲膜;c)將步驟b)中獲得的平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜進(jìn)行滅菌處理;d)用pH值為4.0?6.0的PBS緩沖液配置濃度分別為0.1?0.3 M和0.02?0.15 M的碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺(EDC與NHS)的混合活化液，將這種平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜放入混合活化液中進(jìn)行活化，隨后再將其浸入神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF的PBS溶液中，于室溫下振蕩連接NGF蛋白后用PBS緩沖液沖洗三次;e)將連接有NGF的平行多孔復(fù)合膜再次放在濃度分別為0.1-0.3 M和0.02-0.15 M的EDC和NHS混合液中進(jìn)行活化，隨后再將其浸入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3的I3BS溶液中，于室溫下振蕩連接NT-3蛋白后用I3BS緩沖液沖洗三次;f)重復(fù)步驟d)和e)的操作以提高兩種神經(jīng)因子在平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜上的連接量，最后用PBS緩沖液低溫沖洗三次，制得連有NGF和NT-3兩種神經(jīng)因子的聚吡咯-聚乳酸平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟b)中，化學(xué)氧化聚合反應(yīng)液為包含吡咯單體、DBS、PGlu和FeCl3的水溶液，其中吡咯單體的濃度為6?70 mM、DBS的濃度為6?56 mM、PGlu的濃度為6?56 mM、FeCl3的濃度為17?190 mM，緩慢滴完氯化鐵溶液的時(shí)間為10?50分鐘，聚合反應(yīng)溫度為O?20 °C，聚合反應(yīng)時(shí)間為2.0?24 h。3.根據(jù)權(quán)利要求1、2任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于化學(xué)氧化在位聚合所獲得聚吡咯-聚乳酸平行復(fù)合絲膜中，聚吡咯殼層厚度為20?120 nm，復(fù)合絲膜的導(dǎo)電性可達(dá)0.02?10 S/cm。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟c)中滅菌方法選擇醫(yī)用酒精浸泡和紫外燈照射兩步法，其滅菌時(shí)間分別是I?60 min和4?48 h，紫外燈的功率為5?60 W，照射距離為1?50 cm。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟d)中配制的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在I3BS溶液中的濃度為0.05-5.0 #g/mL，平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜在EDC與NHS混合液中活化浸泡的時(shí)間為0.3-1.5小時(shí)，隨后在NGF溶液中的浸泡連接時(shí)間為0.3?2小時(shí)。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟e)中配制的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3的PBS溶液的濃度為0.05?5.0 #g/mL，連接有NGF的平行導(dǎo)電多孔復(fù)合絲膜在EDC與NHS混合液中活化浸泡的時(shí)間為0.3-1.5小時(shí)，在NT-3溶液中的浸泡連接時(shí)間為0.5?2小時(shí)。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，經(jīng)過步驟d~f)后，這種平行導(dǎo)電復(fù)合絲膜上所連接的NGF量為I?40視/cm2，所連接的NT-3量為0.2?30 #g/cm2。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于，連有兩種神經(jīng)因子的平行導(dǎo)電多孔絲膜可促進(jìn)神經(jīng)樣細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞分化長(zhǎng)出軸突，還能促進(jìn)神經(jīng)軸突的快速延伸生長(zhǎng);在電場(chǎng)方向與絲軸一致、100?800mV/cm強(qiáng)度的電刺激條件下，可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞長(zhǎng)出I?2倍長(zhǎng)度的神經(jīng)軸突，并增加神經(jīng)軸突沿絲軸(即電場(chǎng))方向取向分布的比率。
【文檔編號(hào)】A61L27/54GK106075571SQ201610511592
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月4日
【發(fā)明人】黃忠兵, 周星星, 尹光福, 廖曉明, 蒲曦鳴
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)