两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

自聚體多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法

文檔序號:3573550閱讀:714來源:國知局

專利名稱::自聚體多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及一種自聚體多肽及其形成的多肽凝膠纖維在止血和促進創(chuàng)面愈合方面的應(yīng)用,屬于生物技術(shù)多肽及醫(yī)學材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)
:任何外科操作無一例外地涉及到出血與止血。手術(shù)搡作或創(chuàng)傷,特別是大的創(chuàng)面出血、滲血,有時很難控制,不但會導致失血量增大,而且還會增加手術(shù)難度,甚至危及生命,而良好的止血是手術(shù)安全進行的前提和保障。止血藥可通過收縮小動脈及毛細血管,或增強血小板功能,或加速、加強血液凝固過程,或抑制血塊溶解過程而產(chǎn)生止血作用。止血技術(shù)已由過去單純的器械止血措施發(fā)展為現(xiàn)代外科條件下的紛繁復雜的技術(shù)體系。目前,外科手術(shù)中常用到的止血方法包括以下幾各方面1、手術(shù)操作性止血措施即在手術(shù)過程中采取的止血措施,如結(jié)扎、縫合、電凝、填壓等方法,這些措施要求手術(shù)實施者對局部流血控制的范圍、時間、結(jié)局等有深刻的理解,處理不當則會誘發(fā)感染、繼發(fā)性出血的等問題。2、介入性止血措施介入性止血治療是指在內(nèi)鏡、超聲、CT或X線監(jiān)視下將治療用的導管、注射針、氣囊或其他相關(guān)器械導入臟器內(nèi),并給以局部噴灑或注射止血藥物、生物膠、化學膠等進行栓塞治療,或?qū)敫哳l電流、激光、微波等理化因素,達到治療出血灶的目的。其操作簡單、創(chuàng)傷小、恢復快。3、理化止血措施如通過電凝、激光、微波、熱量達到止血。4、外用止血藥多為局部止血用途。機理多為止血劑在傷口處形成一層薄膜,膠粘創(chuàng)面而止血。如纖維蛋白凝膠、微絲纖維膠原止血劑、氧化纖維素和氧化再生纖維素、膠原可吸收性止血劑、化學膠、明膠海綿、凝血酶、施必止、外用中草藥制劑等。5、控制性降壓應(yīng)用麻醉學方法降低患者血壓,以減少術(shù)中及術(shù)后出血。目前國內(nèi)臨床常用的止血藥約有20多種,根據(jù)其凝血機制的不同環(huán)節(jié),分為四大類。一是促凝血因子活性藥通過影響某些凝血因子,促進或恢復凝血過程而止血。代表藥物有血凝酶、去氨加壓素、維生素K1、維生素K3、維生素K4、甘氨酸乙二胺等。二是降低毛細血管通透性藥能增強毛細血管對損傷的抵抗力,降低毛細血管的通透性,促進受損毛細血管端收縮而止血。代表藥物有卡巴克絡(luò)、卡絡(luò)磺鈉。三是纖維蛋白原與抗纖維蛋白溶解藥通過抑制纖維蛋白酶原的激活因子,使纖維蛋白溶酶原不能被激活,從而抑制纖維蛋白的溶解。代表藥物有氨基己酸、氨甲苯酸、氨甲環(huán)酸、抑肽酶等。四是外用止血藥有可吸收創(chuàng)面的止血封固劑、明膠海綿、氧化纖維素、醛基纖維素、小蘗胺、云南白藥、止血粉8號、止血消炎貼等。這些止血方法及藥物等要求較高的搡作技術(shù),止血時間較長,不同程度的存在不良的反應(yīng)或者并發(fā)癥,如一些粉末制劑藥物,不能夠流到傷口部位發(fā)揮其止血功能;某些液態(tài)的藥物,如氰基丙烯酸鹽粘合劑,在干燥的環(huán)境下才能發(fā)揮藥效;一些藥物可以引起免疫反應(yīng),造成鄰近的細胞死亡,對肌體造成額外的壓力,延長或阻礙康復;某些藥物的保存期短,而且需要特殊的保存方法;許多現(xiàn)用止血劑很難作用于人力不可控制的體內(nèi)環(huán)境。傳統(tǒng)人工壓迫止血法,止血所需時間及臥床制動時間較長,同時易出現(xiàn)滲血、血腫及迷走神經(jīng)反射等并發(fā)癥。此外,如果治療使用潤脹劑,就必須釆用額外的護理,確保傷口處的血液供給,避免其他組織的損傷或死亡。在使用膨脹泡沬時這一點尤為重要。由于保存時間短,許多止血劑必須在使用前就準備好。外科器械,如燒灼器、鉗子和夾子,必須由專業(yè)人員在可控的情況下使用,上述很多藥物成分復雜,或者含有難降解的高分子材料,生物相容性差,具有毒性等。科學家發(fā)現(xiàn)部分多肽具有自組裝現(xiàn)象,可以形成納米級纖維的片層結(jié)構(gòu),如2005年2月17號公布的國際專利WO2005/014615A2,公布該自組裝多肽的創(chuàng)面愈合功能;專利CN200710048975.1公布了RADA16-1肽的燒傷治療作用。在長期的研究過程中,發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)了一種適于規(guī)?;瘧?yīng)用的單一成分多肽自組裝化合物,利用其可以形成納米纖維的性能可提高或改良止血或傷口護理。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一類新型的多肽,該類多肽具有在離子環(huán)境下可以自組裝成為納米級纖維片層,以達到快速止血的目的。本發(fā)明另一目的是提供上述合成多肽在止血藥物及傷口護理方面的應(yīng)用。本
發(fā)明內(nèi)容如下一種合成多肽,其氨基酸序列滿足如下通式(I):Ac-Xo-(X廠X2-X3誦X4)n國NH2(I)其中,Ac為乙酰化N末端;Xo為L-氨基酸,氨基酸類型為:Ala、Val或Gly;Xt、X2、X3和X4全為L型氨基酸或D型氨基酸,其中,X,為帶正電荷氨基酸Arg、Lys或His,X3為帶負電荷氨基酸Asp或Glu,乂2和乂4為不帶電荷氨基酸Ala、Val或Gly;X「X2-X3-X4為重復序列,n為氨基酸的排列在序列中的重復次數(shù),n=2~4。結(jié)合計算機自由能模擬和^-片層的多肽分子設(shè)計替換數(shù)據(jù),發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了要達到止血的目的,自組裝成為納米級纖維屏障的多肽序列具有如下特點如圖1所示,氨基酸之間排列由親水-疏水氨基酸重復序列組成,排列模式為_+-+-+-+,多肽分子之間通過親水端和疏水端的交互作用,形成"-片層,堆疊在一起,重復序列按2-5次,可以形成穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu),親水和疏水氨基酸之間為不帶電荷的氨基酸間隔,滿足此結(jié)構(gòu)序列的多肽溶液在體內(nèi)濕潤的離子環(huán)境中可以形成孔徑為50-200nm網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(納米纖維屏障),從而達到止血的目的。本發(fā)明合成多肽可采用固相多肽合成方式合成和生產(chǎn),包括但不限于Fmoc-SPPS方式,BOC-SPPS方式,片段縮合連接方式。釆用Fmoc-保護或BOC-保護的的固相多肽合成技術(shù)(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)合成上述通式的多肽,樹脂釆用Fmoc-Rink-MBHA-resin,用20。/。的六氫吡P定/二甲基甲酰胺溶液脫除FMOC保護基后,采用多肽合成儀或者手工多肽合成方式,由N端向C端分步偶聯(lián)發(fā)明通式所述的所有序列多肽,依次連接氨基酸Fmoc-氨基酸,催化劑(HBTU,HOBT)對樹脂摩爾比采用1.5-4倍,Kaise測試每步連接是否完全,進行監(jiān)測,直至序列完成,在最后一個氨基酸Fmoc-脫除保護后,加入乙酸酐/DCM的溶液進行乙?;忾],成為多肽樹脂,用標準TFA切割混合物95%三氟乙酸(TFA):0.4%苯甲硫醚(thioanisole):0.4%1,2-二巰基乙醇(EDT):0.2%水切割2-3小時,切割液過濾,導入冰乙醚中沉析出來,離心3-4次,成為粗品多肽,利用制備級液相色譜,純化后凍干成為98%以上純度級別的多肽粉末。稱取多肽粉末,用雙蒸水或去離子水配成質(zhì)量體積比為0.5%-10%多肽溶液,用于止血或傷口護理,也可以直接用多肽粉末用于止血或傷口護理。多肽粉末或多肽水溶液在遇到血液或在粒子環(huán)境下,自己很快組裝成為凝膠纖維(纖維屏障),外觀形成透明凝膠,如同致密紗布一樣,發(fā)揮止血功和傷口護理功能。本發(fā)明的多肽其有益的效果是具有自組裝形成納米級纖維屏障的特點,可以在體外或體內(nèi)粒子環(huán)境下,形成多肽組成的凝膠狀纖維屏障,用于止血或者傷口護理。本發(fā)明的多肽也可以和其他藥物及藥物組合物,輔料,賦形劑等組合成為不同的藥物形式,用于止血及傷口護理的廣泛用途,其本身屬于多肽物質(zhì),很容易被降解,止血機理與以往藥物不同,應(yīng)用前景廣闊。說明書附圖圖l為本發(fā)明合成多肽形成纖維凝膠的示意圖;圖2自組裝多肽合成MS圖譜;圖3自組裝多肽純化HPLC圖譜;圖4多肽P/。溶液自組裝形成凝膠AFM圖片;圖5納米纖維形成原理圖。具體實施例方式7可以形成自組裝的多肽通式可替換氨基酸如下表:通式Ac-X0-(X1-X2-X3-X4)n-NH:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以下通過實施例對發(fā)明做更進一步闡述,實施例是對本發(fā)明的更進一步的解釋,并不限于該實施例,其他未列出的符合氨基酸替換規(guī)則的序列化合物,制備和應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例X0為Val,Xl為Arg,X2為Val,X3為Asp,X4為Val,序列重復2次(11=2)時,序列如下Ac畫Val-Arg畫Val畫Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2自組裝多肽合成稱取Fmoc-Rink-MBHA-resin樹脂10g(替代度d=0.87),用20%的六氫吡^^/二甲基甲酰胺溶液200ml脫除FMOC保護基后,釆用多肽合成儀或者手工多肽合成方式,由N端向C端分步偶聯(lián)發(fā)明通式所述的序列多肽,連接氨基酸,F(xiàn)moc-氨基酸,催化劑(HBTU,HOBT)對樹脂摩爾比釆用2倍量,用DIEA做催化,在DMF中活化5分鐘,加入多肽反應(yīng)器進行氨基酸偶聯(lián),Kaise測試每步連接是否完全,進行監(jiān)測,不斷重復以上步驟,直至序列合成完成,在最后一個氨基酸Fmoc-脫除保護后,加入乙酸酐/DCM的溶液進行乙?;忾]30分鐘,成為多肽樹脂,用標準TFA切割混合物100ml95。/。三氟乙酸(TFA):0.4%苯甲硫醚(thioanisole):0.4%1,2-二巰基乙醇(EDT):0.2%水切割2.5小時,切割液過濾,濾液倒入冰乙醚中沉析出來,離心3-4次,成為粗品多肽,利用制備級液相色譜,純化條件為A相0.1%TFA+H2O,B相0.1。/oTFA+乙腈,用C18制備柱4Ox250mm,采用B相10-60%線型洗脫,收集主峰后,濃縮后凍干成為98%以上純度級別的多肽粉末4.2g。(質(zhì)譜檢測1097.52,理論值MS為1097.5)圖2為自組裝多肽合成MS圖譜;圖3為自組裝多肽純化HPLC圖譜;圖4多肽1。/。溶液自組裝形成凝膠AFM圖片;圖5納米纖維形成原理圖??梢钥闯觯铣傻玫降亩嚯臑锳c-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2。顯然,通過上述相同程序可以合成以下序列多肽XO為Val,XI為Arg,X2為Val,X3為Asp,X4為Val,序列重復2次(n=2)時,序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO為Val,XI為Arg,X2為Val,X3為Asp,X4為Val,序列重復3次(n=3)時,序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val誦Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO為Val,XI為Arg,X2為Val,X3為Asp,X4為Val,序列重復4次(n=4)時,序列如下Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2XO為Ala,XI為Lys,X2為Ala,X3為Glu,X4為Ala,序列重復3次(n=3)時,序列如下Ac-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-NH2本行業(yè)的技術(shù)人員也可以很容易合成新的符合本發(fā)明的序列,符合替換列表的氨基酸替換產(chǎn)生的所有序列,都在本發(fā)明保護范圍。多肽合成實驗材料及縮寫表示Fmoc-SPPS:利用FMOC-保護性氨基酸組裝合成的固相多肽合成(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)方法BOC-SPPS:利用BOC-保護性氨基酸組裝合成的固相多肽合成(Solidphagepeptidesynthesis,SPPS)方法Fmoc-:9-芴甲氧羰基BOC-:叔丁氧羰基Fmoc-Rink-MBHA-resin:氨基肽合成樹脂,購自西安創(chuàng)景生物科技公司DCM:二氯甲烷DMF:二甲基甲酰胺TFA:三氟乙酸Thioanisole:苯甲硫醚EDT:1,2-二巰基乙醇HBTU:O-(Benzotriazol-1-yl)畫N,N,N,,N,-tetramethyluroniumhexafluorophosphateHOBT:l-羥基苯駢三唑DIEA:N,N-二異丙基二乙胺Fmoc-氨基酸(純度98.5%以上,購自成都凱泰公司)如下Fmoc-Ala-OH(Fmoc-丙氨酸)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Fmoc-精氨酸)Fmoc-Asp(OtBu)-OH(Fmoc-天冬氨酸)Fmoc-Glu(OtBu)-OH(Fmoc-谷氨酸)Fmoc-Gly-OH(Fmoc-甘氨酸)Fmoc-His(Trt)-OH(Fmoc-組氨酸)Fmoc-Lys(Boc)-OH(Fmoc-賴氨酸)Fmoc-Val-OH(Fmoc-纈氨酸)止血實驗稱取多肽粉末200mg(序列為Ac-Val-Arg-Val-Asp-Val-Arg-Val-Asp-Val-NH2),或用去離子水配成質(zhì)量體積(wt/V)比為1%-3%多肽溶液,用于止血或傷口護理實驗。多肽粉末大鼠尾部切斷止血實驗實驗釆用大鼠,體重270士30g,購自西安交大實驗動物中心。用大鼠戊巴比妥鈉50mg/kgip麻醉,仰臥固定,將大鼠尾部用消毒液消毒,在尾部尖端5cm處用鋒利的刀片將尾部切斷,立即把殘留的尾部斷面下邊墊一預先稱重的紗布,并將定量的上述合成多肽凍干粉末迅速灑在尾部斷面上,同時記錄出血時間(完全止住血時間),用稱重法稱量紗布的重量,計算失血量。實驗方法詳見參考文獻KathyL.Ryan,etal.EfficacyofFDA-approvedhemostaticdrugstoimprovesurvivalandreducebleedinginratmodelsofuncontrolledhemorrhage.Resuscitation2006,70:133-M4(FDA批準的大鼠止血藥物恢復存活模型);StephenW.Rothwelletal.Additionofapropylgallate-basedprocoagulanttoafibrinbandageimproveshemostaticperformanceinaseinearterialbleedingmodel.ThromvosisResearch2003,108:335-340(靜脈止血模型)。表l多肽粉末對大鼠尾部切斷出血的止血作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表1可見,多肽止血粉末與普通紗布和止血明膠對照組相比,產(chǎn)生的止血作用起效快、止血效果確切,能顯著減少尾部失血量,明顯縮短出血時間。臨床上可用于微小血管出血的止血,以及某些外傷性出血的止血和傷口護理。多肽1%水凝膠對兔耳皮膚切口止血實驗實驗動物選大白兔,體重2.7土0.3kg,購自西安交大實驗動物中心。用戊巴比妥鈉45mg/kgip麻醉,仰臥固定,氣管插管,將兔右耳剃毛,用碘酒消毒,用手術(shù)刀在兔耳切一條1.5CM的切口,使其出血。立即將配置好的1%的多肽水凝膠涂敷在切口上,并以預先稱重的紗布覆蓋,記錄止血時間和完全止住血液的時間,用稱重法稱量兔耳切口出血的失血量。表2多肽1%水凝膠對兔耳皮膚切口的止血作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果表明(見表2),多肽1%水凝膠與對照組普通紗布,云南白藥等相比,止血作用起效更快、止血效果確切,能顯著減少兔耳皮膚切口出血的失血量,明顯縮短出血時間。臨床上可用于皮膚表面創(chuàng)傷出血的止血,尤其是各種皮膚外傷出血的快速止血。止血多肽對兔股靜脈血管出血的止血實驗實驗選用大白兔,體重2.7士0.3kg,購自西安交大實驗動物中心。用戊巴比妥鈉45mg/kgip麻醉,仰臥固定,氣管插管,將兔右側(cè)腹股溝剃毛,用碘酒消毒,剪開皮膚,分離皮下組織,暴露股靜脈,將靜脈完全剪斷,使其流血,立即把定量的殼聚糖多孔微球撒在創(chuàng)面上,并以預先稱重的紗布覆蓋,下方放置一50g砝碼的天平,記錄止血時間,用稱重法稱量兔股靜脈血管出血的失血量。實驗方法詳見參考文獻同上。表3止血多肽對兔股靜脈血管出血的止血實驗止血材料失血量(g)止血時間(秒)普通紗布35.21±4.01620±50殼聚糖紗布32.35±5.10550±432%多肽凝膠6.35±3.3625±3實驗結(jié)果表明(見表3),2%自組裝多肽凝膠與對照組(普通紗布和殼聚糖紗布)相比產(chǎn)生的止血作用起效快、止血效果確切,能顯著減少對兔股靜脈血管出血失血量,明顯縮短出血時間。臨床上可用于靜脈血管出血的止血。止血多肽對兔股動脈血管流血的止血13實驗選用大白兔,體重2.7±03kg,購自西安交大實驗動物中心。用戊巴比妥鈉45mg/kgip麻醉,仰臥固定,氣管插管,將兔右側(cè)腹股溝剃毛,用碘酒消毒,剪開皮膚,分離皮下組織,分離一段動脈,長度約3.4cm,兩端分別用動脈夾夾住,用眼科虹膜剪細心在股動脈上剪一個2x3mm的橢圓形孔,取出雙側(cè)動脈夾,使其流血。立即配好的3%多肽凝膠涂敷在創(chuàng)面上,并以預先稱重的紗布覆蓋,且放置一個100g砝碼,記錄止血時間,用稱重法稱量兔股動脈血管出血的失血量。表4止血多肽對兔股動脈血管流血的止血作用止血材料失血量(g)出血時間(min)普通紗布55.45±7.7633.12士8.56含殼聚糖紗布46.64±7.4328,26±5.233%多肽凝膠4.21±2.240.50±0.25實驗結(jié)果表明(見表4),3%多肽凝膠與對照組相比產(chǎn)生的止血作用起效快、止血效果確切,能顯著減少兔股動脈血管流血的失血量,明顯縮短出血時間。臨床上可用于大血管出血的止血,尤其是戰(zhàn)傷、各種緊急外傷引起的大出血的快速止血。1權(quán)利要求1、一種合成多肽,其氨基酸序列滿足如下通式(I)Ac-X0-(X1-X2-X3-X4)n-NH2(I)其中,Ac為乙?;疦末端;X0為L-氨基酸,氨基酸類型為Ala、Val或Gly;X1、X2、X3和X4全為L型氨基酸或D型氨基酸,其中,X1為帶正電荷氨基酸Arg、Lys或His,X3為帶負電荷氨基酸Asp或Glu,X2和X4為不帶電荷氨基酸Ala、Val或Gly;X1-X2-X3-X4為重復序列,n為氨基酸的排列在序列中的重復次數(shù),n=2~4。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述合成多肽,其特征在于X。為Ala或Val。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述合成多肽,其特征在于X,,X2,X3,X4為L型氨基酸。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述合成多肽,其特征在于X,為Arg或Lys。5、根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述合成多肽,其特征在于n為2或3。6、根據(jù)權(quán)利要求1至3任意之一所述合成多肽,其特征在于Xo與X4為相同氨基酸。7、權(quán)利要求1所述合成多肽在止血及傷口護理方面的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種合成多肽,其氨基酸序列滿足如下通式Ac-X<sub>0</sub>-(X<sub>1</sub>-X<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>-X<sub>4</sub>)<sub>n</sub>-NH<sub>2</sub>,其中,Ac為乙酰化N末端;X<sub>0</sub>為L-氨基酸,氨基酸類型為Ala、Val或Gly;X<sub>1</sub>、X<sub>2</sub>、X<sub>3</sub>和X<sub>4</sub>全為L型氨基酸或D型氨基酸,X<sub>1</sub>為帶正電荷氨基酸Arg、Lys或His,X<sub>3</sub>為帶負電荷氨基酸Asp或Glu,X<sub>2</sub>和X<sub>4</sub>為不帶電荷氨基酸Ala、Val或Gly;X<sub>1</sub>-X<sub>2</sub>-X<sub>3</sub>-X<sub>4</sub>為重復序列,n為氨基酸的排列在序列中的重復次數(shù),n=2~4。本發(fā)明的多肽具有自組裝形成納米級纖維屏障的特點,可以在體外或體內(nèi)粒子環(huán)境下,形成多肽組成的凝膠狀纖維屏障,用于止血或者傷口護理。文檔編號C07K1/04GK101514225SQ200810231709公開日2009年8月26日申請日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者王亞宏申請人:西安藍晶生物科技有限公司
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
久久久久国内视频| 国产亚洲欧美精品永久| 窝窝影院91人妻| 九色亚洲精品在线播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 91成年电影在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲专区字幕在线| 免费看a级黄色片| 国产黄a三级三级三级人| 老鸭窝网址在线观看| 国产97色在线日韩免费| 99久久99久久久精品蜜桃| 一边摸一边做爽爽视频免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 视频区欧美日本亚洲| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 大型av网站在线播放| 免费在线观看黄色视频的| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 麻豆av在线久日| 狂野欧美激情性xxxx| 9191精品国产免费久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品,欧美在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲第一电影网av| 国产精品免费视频内射| 1024香蕉在线观看| 成年人黄色毛片网站| 国产精品一区二区在线不卡| 岛国在线观看网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 美女高潮到喷水免费观看| 国产av又大| 黄色视频不卡| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久人人精品亚洲av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 性色av乱码一区二区三区2| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 窝窝影院91人妻| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲中文av在线| 麻豆国产av国片精品| 国产精品一区二区免费欧美| 老汉色∧v一级毛片| 精品乱码久久久久久99久播| 国产色视频综合| 午夜成年电影在线免费观看| 一级黄色大片毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| 黄频高清免费视频| 午夜福利成人在线免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 在线永久观看黄色视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久午夜亚洲精品久久| 欧美最黄视频在线播放免费| 18禁观看日本| 亚洲人成77777在线视频| 操出白浆在线播放| 精品卡一卡二卡四卡免费| 999久久久国产精品视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 无人区码免费观看不卡| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 精品电影一区二区在线| 90打野战视频偷拍视频| 欧美黄色淫秽网站| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲熟女毛片儿| 久久天堂一区二区三区四区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 搞女人的毛片| 波多野结衣av一区二区av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 99久久国产精品久久久| 欧美乱色亚洲激情| 午夜福利欧美成人| 99riav亚洲国产免费| 最新美女视频免费是黄的| 一二三四在线观看免费中文在| 两个人免费观看高清视频| cao死你这个sao货| 九色国产91popny在线| 久久香蕉精品热| 免费在线观看完整版高清| 桃红色精品国产亚洲av| 国产1区2区3区精品| 精品人妻偷拍中文字幕| 一个人免费在线观看电影| 欧美中文日本在线观看视频| 免费av不卡在线播放| www.色视频.com| 性色avwww在线观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品不卡国产一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品一区www在线观看 | 99riav亚洲国产免费| av在线老鸭窝| 亚洲精品在线观看二区| 色播亚洲综合网| 亚洲久久久久久中文字幕| 黄色日韩在线| 变态另类丝袜制服| 国产亚洲欧美98| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久精品国产清高在天天线| 乱系列少妇在线播放| 成人精品一区二区免费| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 免费在线观看日本一区| 亚洲自拍偷在线| 一区二区三区四区激情视频 | 久久人妻av系列| 亚洲一区二区三区色噜噜| 99在线人妻在线中文字幕| 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚州av有码| 午夜精品久久久久久毛片777| 在线国产一区二区在线| 国产 一区精品| 成人午夜高清在线视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久久久久九九精品二区国产| 日韩强制内射视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久热精品热| 久久久久久久精品吃奶| 免费观看精品视频网站| 婷婷色综合大香蕉| 99在线视频只有这里精品首页| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产av在哪里看| 日日干狠狠操夜夜爽| 别揉我奶头 嗯啊视频| 一区二区三区激情视频| 乱人视频在线观看| 国产精品永久免费网站| 嫩草影视91久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中出人妻视频一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 综合色av麻豆| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产一级毛片七仙女欲春2| 麻豆国产97在线/欧美| 国产视频内射| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久午夜亚洲精品久久| 少妇的逼水好多| 亚洲真实伦在线观看| 两个人视频免费观看高清| 中文在线观看免费www的网站| 悠悠久久av| av在线天堂中文字幕| 亚洲人成网站在线播| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久久午夜电影| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 露出奶头的视频| 精品日产1卡2卡| 九九在线视频观看精品| 欧美性感艳星| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av国产免费在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲最大成人手机在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲18禁久久av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 国产精品人妻久久久影院| aaaaa片日本免费| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品人妻久久久影院| 色视频www国产| 又紧又爽又黄一区二区| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲人成网站在线播| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 在线观看一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 久久香蕉精品热| 九九热线精品视视频播放| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲成人久久性| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲不卡免费看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 最近最新免费中文字幕在线| 国产成人一区二区在线| 床上黄色一级片| 91麻豆av在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 尾随美女入室| 国产成人福利小说| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 欧美bdsm另类| 免费在线观看成人毛片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产av麻豆久久久久久久| 午夜福利欧美成人| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产在线男女| 国产成年人精品一区二区| 久久99热6这里只有精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 婷婷六月久久综合丁香| 成年免费大片在线观看| 22中文网久久字幕| 日本欧美国产在线视频| 亚洲av二区三区四区| 欧美性猛交黑人性爽| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩精品青青久久久久久| 中国美女看黄片| netflix在线观看网站| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99热6这里只有精品| 国产精品1区2区在线观看.| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲图色成人| 欧美日韩精品成人综合77777| 成年人黄色毛片网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 听说在线观看完整版免费高清| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲精品成人久久久久久| 国产精品一区www在线观看 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产黄片美女视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 91久久精品电影网| 日本欧美国产在线视频| 久久香蕉精品热| 一夜夜www| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 一级a爱片免费观看的视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 午夜福利18| 国产亚洲精品久久久com| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 我的女老师完整版在线观看| 国产久久久一区二区三区| 精品人妻1区二区| 毛片女人毛片| 白带黄色成豆腐渣| 超碰av人人做人人爽久久| 中文字幕久久专区| 黄色女人牲交| 亚洲av不卡在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利视频1000在线观看| 在线观看66精品国产| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩大尺度精品在线看网址| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 美女高潮的动态| 两个人的视频大全免费| 亚洲av免费高清在线观看| 精品福利观看| 欧美成人性av电影在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美性感艳星| 韩国av一区二区三区四区| 欧美精品国产亚洲| 国产综合懂色| 亚洲av.av天堂| 91麻豆av在线| 一级a爱片免费观看的视频| 国产中年淑女户外野战色| 色哟哟哟哟哟哟| 成人无遮挡网站| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美性猛交黑人性爽| 中文字幕久久专区| 亚洲av成人av| 久久久久精品国产欧美久久久| 五月伊人婷婷丁香| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲精品一区av在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 国产老妇女一区| 久久6这里有精品| 国产伦在线观看视频一区| 国国产精品蜜臀av免费| av专区在线播放| 久久久成人免费电影| 人妻久久中文字幕网| av在线观看视频网站免费| 国产精品一区www在线观看 | 人妻久久中文字幕网| 久久人人精品亚洲av| 午夜激情福利司机影院| 久久热精品热| 热99re8久久精品国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品嫩草影院av在线观看 | 日本爱情动作片www.在线观看 | av中文乱码字幕在线| 国产精品一区www在线观看 | 精品日产1卡2卡| 国产精品无大码| x7x7x7水蜜桃| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产美女午夜福利| 97碰自拍视频| 久久久久性生活片| 久久人人精品亚洲av| 久久精品国产亚洲网站| 免费看a级黄色片| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产伦精品一区二区三区四那| 国产成年人精品一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产伦精品一区二区三区视频9| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 日本在线视频免费播放| 国产免费av片在线观看野外av| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲成人中文字幕在线播放| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品人妻1区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久久久久九九精品二区国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 黄色日韩在线| 日韩强制内射视频| 久久久久久久久中文| 国产精品久久久久久精品电影| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日日啪夜夜撸| 给我免费播放毛片高清在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 成年女人永久免费观看视频| 欧美潮喷喷水| 久久99热这里只有精品18| 午夜激情福利司机影院| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲成a人片在线一区二区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 午夜爱爱视频在线播放| 成人国产一区最新在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 国产精品无大码| 性欧美人与动物交配| 精品久久久久久,| 女人被狂操c到高潮| 国产精品无大码| 欧美中文日本在线观看视频| www日本黄色视频网| 国产单亲对白刺激| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 精品乱码久久久久久99久播| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲性夜色夜夜综合| 亚洲无线观看免费| 搡老妇女老女人老熟妇| 看十八女毛片水多多多| 高清毛片免费观看视频网站| 日本黄大片高清| 在线免费十八禁| 日韩人妻高清精品专区| 久久99热6这里只有精品| 午夜福利18| 久久草成人影院| 国产一区二区在线观看日韩| 国产av一区在线观看免费| 我的女老师完整版在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 免费人成在线观看视频色| 麻豆国产97在线/欧美| 国产在线男女| 欧美日韩乱码在线| 亚洲色图av天堂| 中亚洲国语对白在线视频| 国产老妇女一区| 亚洲最大成人手机在线| 久久精品人妻少妇| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 高清在线国产一区| 欧美精品国产亚洲| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品精品国产色婷婷| 成人永久免费在线观看视频| 日韩av在线大香蕉| 小说图片视频综合网站| 麻豆国产av国片精品| 日韩人妻高清精品专区| 性欧美人与动物交配| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产综合懂色| 色哟哟·www| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日本视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国产乱人伦免费视频| 最后的刺客免费高清国语| 不卡一级毛片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品伦人一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 男女那种视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久久久久久中文| 免费观看人在逋| 婷婷亚洲欧美| 免费观看的影片在线观看| ponron亚洲| xxxwww97欧美| 热99在线观看视频| 最近在线观看免费完整版| 久久精品国产亚洲网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线看三级毛片| 精品人妻视频免费看| 亚洲图色成人| 少妇的逼好多水| 在线观看舔阴道视频| 69人妻影院| av福利片在线观看| 简卡轻食公司| 日本色播在线视频| 观看免费一级毛片| 亚洲无线在线观看| 黄色配什么色好看| 春色校园在线视频观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 极品教师在线视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人一区二区视频在线观看| 观看美女的网站| 国产黄片美女视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 偷拍熟女少妇极品色| 网址你懂的国产日韩在线| 久久国内精品自在自线图片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲美女视频黄频| 成人欧美大片| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产精品一及| 亚洲中文日韩欧美视频| 免费搜索国产男女视频| 两个人的视频大全免费| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产91精品成人一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 嫩草影院新地址| 精品不卡国产一区二区三区| 无人区码免费观看不卡| 精品国产三级普通话版| 日日夜夜操网爽| 欧美日韩乱码在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 又爽又黄a免费视频| 男女边吃奶边做爰视频| 国产毛片a区久久久久| 午夜精品在线福利| av在线观看视频网站免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲av中文av极速乱 | 天堂√8在线中文| 伦精品一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 长腿黑丝高跟| 国产免费男女视频| 久久九九热精品免费| 一区二区三区高清视频在线| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩欧美三级三区| 中文资源天堂在线| a在线观看视频网站| 男人舔奶头视频| 免费黄网站久久成人精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 男插女下体视频免费在线播放| 国产av在哪里看| 国产在视频线在精品| 国产一区二区三区在线臀色熟女| h日本视频在线播放| 简卡轻食公司| 男女下面进入的视频免费午夜| 99热精品在线国产| 69av精品久久久久久| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产单亲对白刺激| 国产精品一区二区三区四区久久| 内射极品少妇av片p| 久久九九热精品免费| 精品人妻视频免费看| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产伦人伦偷精品视频| 精品一区二区三区人妻视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲综合色惰| 在线观看舔阴道视频| 午夜免费激情av| 最好的美女福利视频网| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品爽爽va在线观看网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 热99re8久久精品国产| 黄色女人牲交| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 性色avwww在线观看| 午夜影院日韩av| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产黄色小视频在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产高清视频在线观看网站| 黄色配什么色好看| 国产美女午夜福利| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 一本久久中文字幕| 无遮挡黄片免费观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产爱豆传媒在线观看| 日韩欧美在线二视频| 久久久精品欧美日韩精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产男人的电影天堂91| 欧美不卡视频在线免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 精品一区二区免费观看| 国产午夜精品论理片| 日韩亚洲欧美综合| 久久精品国产自在天天线| 中文字幕久久专区| 天天躁日日操中文字幕| 波多野结衣高清无吗| 九色国产91popny在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 中文字幕av成人在线电影| 日韩欧美国产在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| ponron亚洲| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产高清有码在线观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| av黄色大香蕉| 一夜夜www| 日本-黄色视频高清免费观看| 无人区码免费观看不卡| 99热只有精品国产| 亚洲国产精品合色在线| 一级黄片播放器| 亚洲av美国av| 亚洲最大成人中文| 国产成人av教育| 国产私拍福利视频在线观看| 免费看光身美女| 午夜激情欧美在线| 亚洲av免费在线观看| 婷婷亚洲欧美| 色视频www国产|