一種中國家蠅抗菌肽1及其分離純化方法

專利名稱：一種中國家蠅抗菌肽1及其分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物抗菌肽領域，尤其涉及一種中國家蠅抗菌肽1及其分離純化方法。
背景技術：
抗生素的廣泛應用，耐藥菌株和多重耐藥菌株日益增加，臨床抗感染治療已面臨 嚴峻挑戰(zhàn)，尋找廣譜高效的抗細菌、抗病毒藥物，仍然是一個十分艱巨的任務。蠅主要生長 在腐物、糞便和垃圾等含有大量細菌的惡劣環(huán)境中，其體表帶有許多病原菌，能傳播多種疾 病。但其自身卻不會因為感染病原菌而引起死亡，這說明蠅應該對病原微生物有強大的免 疫力，并能產(chǎn)生強效抗菌物質(zhì)。生物抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對G+、C'細菌及真菌都有抗菌活性，特別是對多重 耐藥菌也有抗菌活性。另外還具有抗腫瘤細胞的作用，與傳統(tǒng)抗生素相比，還有促進傷口愈 合和免疫調(diào)節(jié)等作用，是一類具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕帯Ｔ擃I域目前國際上研究較為活躍，找到并能純化出抗菌譜寬、抗菌活性強的抗菌 肽將會有廣闊的開發(fā)應用前景。不同抗菌肽分子大小，生物學特征有一定差別，目前肽類的純化技術較復雜，要分 離純化單一肽類技術難度較大。在抗菌肽的研究中，抗菌肽分離純化方法的建立是個技術 難點，要建立一個結(jié)果穩(wěn)定可靠、操作簡單的方法，需要大量工作，反復試驗。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種中國家蠅抗菌肽1，該抗菌肽具 有廣譜、高效的抗菌活性。本發(fā)明的第二目的在于提供一種從中國家蠅體內(nèi)分離純化中國家蠅抗菌肽1的 方法。為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種中國家蠅抗菌肽1，包括5個肽段，所述5個肽段的氨基酸序列分別如SEQID NO :1 至 SEQ ID NO 5 所示。一種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法，包括以下步驟1)對家蠅進行免疫誘導，使家蠅產(chǎn)生抗菌肽；2)將免疫誘導后的家蠅進行組織勻漿，取含有抗菌肽的樣品溶液；3)將含有抗菌肽的樣品溶液進行透析濃縮，得到濃縮的樣品；4)將濃縮的樣品進行3TGC00超濾柱進行超速離心過濾，得到半純品抗菌肽；5)將半純品抗菌肽進行HPLC分離純化，得到色譜純中國家蠅抗菌肽1。所述步驟1)具體為先使家蠅麻醉，然后帶有細菌懸液的不銹鋼針刺透體壁，再 使其復蘇，刺傷后在溫度28 30°C飼養(yǎng)24h，通過損傷感染免疫誘導，使家蠅產(chǎn)生抗菌肽。所述細菌懸液為大腸埃希氏菌懸液、銅綠假單胞菌懸液或金黃色葡萄球菌懸液。
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所述步驟3)具體為首先將含有抗菌肽的樣品溶液4°C下60000g離心60min，除 去沉淀和上層漂浮的脂肪層；再取上清液裝入分子量截留值為1500U的透析袋內(nèi)，包埋于 聚乙二醇中，在4°C下透析過液。所述步驟4)具體為透析濃縮的樣品60000g離心30min，取上清用UFC3TGC00超 濾柱，以60000g離心超濾。所述步驟5)具體為樣品超濾液采用RT-HPLC半制備柱純化，半制備柱上樣量為 1. Oml 2. 0ml，流速為1. Oml/min，在214nm檢測波長下，當開始出峰時，進行樣品的部分收 集。保留時間為18. OOSmin時的收集品為色譜純中國家蠅抗菌肽1用上述方法制備的中國家蠅抗菌肽1。本發(fā)明所述中國家蠅抗菌肽1是最新發(fā)現(xiàn)的一種小分子肽，抗菌肽的活性較強， 能非特異性地抗細菌，是一類具有發(fā)展?jié)摿Φ?，對多重耐藥菌有抵抗作用的新型抗菌藥。本發(fā)明所述中國家蠅抗菌肽1分離純化方法，具有簡便易行，穩(wěn)定性、重復性好等 優(yōu)點，不同批次純化的抗菌活性用Lowry法測定多肽含量，其蛋白質(zhì)濃度范圍為0. 20g 0. 25g/L，是一種有實用價值的全新的抗菌肽分離純化技術。說明書附1是3TGC00超濾柱進行超速離心過濾，得到半純品的中國家蠅抗菌活性組分的 RP-HPLC色譜圖；圖2是純化中國家蠅抗菌肽1的RP-HPLC分析柱分析色譜圖；圖3是Si^phadex G50層析收集的中國家蠅抗菌肽1對銅綠假單胞菌的抗菌活性 試驗結(jié)果圖，15(80min 85min)、16(85min 90min)、17(90min 95min)為不同保留時間 收集的樣本，加樣量20yg蛋白質(zhì)/紙片；圖4是中國家蠅抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段1的質(zhì)譜圖；圖5是中國家蠅抗菌肽1胰蛋白酶水解的肽段2的質(zhì)譜圖；圖6是中國家蠅抗菌肽ITricine SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果圖。
具體實施例方式實施例1 一種中國家蠅抗菌肽1中國家蠅抗菌肽1經(jīng)胰蛋白酶水解后得到5個酶解片段，酶解片段用 Nano-ESI-MS/MS技術進行質(zhì)譜分析，測定出的質(zhì)譜信息借助Micromass的專用軟件MasSeq 進行序列分析，得到5個肽段的氨基酸序列分別如SEQ ID NO 1-5所示(1)YDNVNLDELLNSDR(T0F MSMS 840. 47ES+, Query 4)Tyr-Asp-Asn-Val-Asn-Leu-Asp-Glu-Leu-Leu-Asn-Ser-Asp-Arg(2)YDLLNVDEEVRFR(T0F MSMS 826. 95ES+, Query 5)Tyr-Asp-Leu-Leu-Asn-Val-Asp-Glu-Leu-Val-Arg-Phe-Arg(3)QPNLYYNK(T0F MSMS 520. 30ES+, Query 2)Gln-Pro-Asn-Leu-Tyr-Tyr-Asn-Lys(4)PNNVYYTK(T0F MSMS 499. 76ES+, Query 1)Pro-Asn-Asn-Val-Tyr-Tyr-Thr-Lys(5)DYPNNVYYTK(T0F MSMS 639. 34ES+, Query 3)
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Asp-Tyr-Pro-Asn-Asn-Val-Tyr-Tyr-Thr-Lys質(zhì)譜圖經(jīng)Micromass的專用軟件MaxEnt3處理后，借助Micromass的專用軟件 MasSeq直接推導出肽段序列。用Spectrum List通過Mascot查詢NCBInr數(shù)據(jù)庫，經(jīng)檢索 未發(fā)現(xiàn)有與之序列相匹配的蛋白質(zhì)，可以證明本發(fā)明分離純化到的家蠅抗菌肽是一個新的 抗菌肽，命名為家蜆抗菌肽 1 (Musca domestica antibacterial peptide l,MdAPl)。肽段 1的質(zhì)譜圖見圖4，肽段2的質(zhì)譜圖見圖5。實施例2 —種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法包括以下步驟1.免疫誘導把家蠅分為試驗組和對照組，對照組不進行損傷誘導處理。試驗組把盛有乙醚的 培養(yǎng)皿放在蠅籠內(nèi)，使蠅麻醉，然后用沾有細菌懸液的不銹鋼針刺透體壁，立即放入另一籠 內(nèi)使其復蘇。刺傷后在溫度28 30°C飼養(yǎng)24h。通過損傷感染免疫誘導，使家蠅產(chǎn)生抗菌 肽。細菌為大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌，2.組織勻漿家蠅1. Og加液氮7g的比例混合，迅速用研缽研磨，或幼蟲放-80°C冷凍過夜， 取出放研缽內(nèi)在冰浴下研磨成細沫狀，加少量4°C buffer A(含尿素2. 0mol/L,0. 2mol/L pH6. 8Tris-HCl)繼續(xù)研磨成糊狀，以Ig組織加IOml bufferA的比例混勻，4°C下60000g離 心60min，取上清液_80°C保存?zhèn)溆谩?.透析濃縮將_80°C貯存的樣品溶液取出，室溫下融化，4°C下60000g離心60min，除去沉淀和 上層漂浮的脂肪層，取上清液裝入分子量截留值為1500U的透析袋內(nèi)，包埋于聚乙二醇中， 在4 °C下透析過液。4.透析濃縮的樣品60000g離心30min，再用UFC 3TGC00超濾柱，以60000g離心超濾。5. HPLC分離純化5. 1色譜柱裝上預柱，接入1100系列高效液相色譜儀的管道系統(tǒng)，在連接時主機 應在開啟狀態(tài)，流動相流速設置為0. 3ml/min,以免空氣進入柱內(nèi)，兩端管道應連接緊密以 防漏液。5. 2色譜柱平衡，色譜柱以100%甲醇為保養(yǎng)液，用時100%甲醇為流動相沖洗， 214nm波長下監(jiān)測至基線呈平穩(wěn)狀態(tài)，同時甲醇濃度由100 %逐步降低至0 %，雙蒸水沖 洗至基線平穩(wěn)時，PROTEIN PAR 300 色譜柱改用 buffer B(0. 2mol/L pH6. 8PBS, PMSF 0. 2mmol/L, EDTA 0. 05mol/L)作流動相，Lichrospher C-18 色譜柱用 buffer C(0. 2mol/L pH6. 8PBS)作流動相，濃度從30%逐漸遞增至100%，至基線平穩(wěn)時上樣。5. 3上樣及洗脫，將S印hadex G50層析收集的半純品抗菌活性組分用半制備柱進 一步分離純化。收集的純化抗菌活性組分再用分析柱分析。根據(jù)色譜柱型號不同決定上樣 量和流速，分析柱一般為 ομ 1 100 μ 1，流速為0. 5ml/min ；半制備柱為1. Oml 2. Oml, 流速為1. Oml/min，檢測波長為214nm。5. 4樣品收集，根據(jù)色譜曲線中的色譜峰，分步收集各峰的樣品，并記錄時間。5. 5樣品濃縮將分步收集的樣品進行真空冷凍干燥，以冷凍干燥前樣品體積的
51/10的比例加雙蒸水溶解，用Lowry法進行蛋白定量后，供抗菌活性測定用。6.樣品濃縮干燥將收集到的樣品真空冷凍干燥，濃縮后加雙蒸水溶解，使體積為原體積的1/10 1/20，做抗菌活性檢測，相同濃縮倍數(shù)的流動相作試劑對照。家蠅組織提取液經(jīng)超濾，所得到的抗菌活性成份，經(jīng)RT-HPLC半制備柱純化，各個 成分分離效果良好。對各峰收集品進行抗菌活性試驗，結(jié)果保留時間為18. OOSmin時的收 集品有明顯的抗菌活性(

圖1)。該組分再用RT-HPLC分析柱分析，色譜圖中只有一個吸收 峰，保留時間為36. 140min，達到了色譜純(圖2)。將經(jīng)過上述純化方法得到的中國家蠅抗菌肽1冷凍干燥后按體積比100 1重 溶，取15 μ 1進行Tricine SDS-PAGE電泳，該抗菌肽分子量為9. OkU，結(jié)果見圖6。實施例3中國家蠅抗菌肽1分子結(jié)構(gòu)測定(一 )將中國家蠅抗菌肽1進行Tricine SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)體系，分離膠濃度18%，夾層膠濃度8%，濃縮膠濃度4%，電壓1. 5伏 /cm,電泳80min后，改變電壓為10伏/cm再電泳120min。用0. 2%的R-250考馬斯亮藍 的甲醇_乙醇混合液(50%甲醇+10%乙醇)染色，脫色液為甲醇-乙醇混合液(50%甲醇 +10%乙醇)。( 二 )氨基酸測序抗菌肽的PAGE膠塊脫色后置于真空干燥器中干燥20min，然后加入5 1010mg/L 的胰蛋白酶液，4°C冰箱中放置40min后，加10 μ 1 25mmol/L碳酸氫銨緩沖液，于37°C溫育 過夜。用5%三氟乙酸(TFA)于40°C提取酶切肽段；再用同體積的丙烯腈(ACN)-TFA溶液 于30°C提??；最后用ACN超聲提取一次；合并3次提取液，真空干燥器干燥。干燥后的樣品 用TFA溶液溶解。用配備有毛細管液相色譜和納升噴霧源的納升電噴霧-四極桿-飛行時 間串聯(lián)質(zhì)譜(Nano-ESI-Q-T0F2-MS/MS)技術測定肽段的質(zhì)譜圖，確定家蠅抗菌肽的氨基酸 序列。(三)檢索數(shù)據(jù)庫所測定得的質(zhì)譜圖用Micromass的專用軟件MasSeq直接推導出肽段序列，根據(jù)肽 段的氨基酸序列用Spectrum List通過Mascot查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，確立其一級結(jié)構(gòu)。實驗例1中國家蠅抗菌肽1抗菌活性測定采用平板法，參照全國臨床檢驗操作規(guī)程，采用LB培養(yǎng)基，將菌株接種于LB培養(yǎng) 基，35°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用無菌生理鹽水稀釋至相當于0.5麥氏標準單位(Mc Farland standard unit，相當于1. 5X 108CFU/ml)，S印halexG50色譜法和高效液相色譜法(HPLC) 分離的各成分用紙片瓊脂擴散法即K-B法(Kirby-Bauer method)檢測有抗菌活性的成 分，再用微量稀釋法(microdilution test)測定最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)，氨芐青霉素作對照。通過測定抑菌圈直徑定性檢測抑菌活力。實驗結(jié)果顯示，分離到的家蠅抗菌肽具有明顯的廣譜抗菌活性，對革蘭陰性桿菌、 革蘭陽性球菌和真菌均有抑制作用。該中國家蠅抗菌肽1對11種臨床分離菌株的最小抑菌 濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)在 2· 22 μ mol/L ~ 13. 33 μ mol/L (20 μ g/ ml 120 μ g/ml)之間。家蠅抗菌肽對大腸桿菌的抗菌活性相對較強，而對陽性球菌和其他 腸桿菌的抗菌活性相對較弱，對白假絲酵母菌的抗菌活性最弱。
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在氨芐青霉素對照組，氨芐青霉素對10種臨床分離菌株的MIC在21. 54 μ mol/ L >86.16ymol/L(8yg/ml >32yg/ml)之間。臨床分離菌株傷寒沙門氏菌、福氏痢 疾桿菌敏感，大腸埃希氏菌、異形枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌中敏，銅綠假單胞菌、普通變形桿 菌、肺炎克雷伯氏菌、表皮葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)耐藥?？咕? 的抗菌活性結(jié)果見圖3，抗菌譜結(jié)果見表1。表1家蠅抗菌肽對臨床分離菌株的MIC

權利要求
一種中國家蠅抗菌肽1，其特征在于，包括5個肽段，所述5個肽段的氨基酸序列分別如SEQ ID NO1至SEQ ID NO5所示。
2.一種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法，包括以下步驟1)對家蠅進行免疫誘導，使家蠅產(chǎn)生抗菌肽；2)將免疫誘導后的家蠅進行組織勻漿，取含有抗菌肽的樣品溶液；3)將含有抗菌肽的樣品溶液進行透析濃縮，得到濃縮的樣品；4)將濃縮的樣品進行UFC3TGC00超濾柱超速離心過濾，得到半純品抗菌肽；5)將半純品抗菌肽進行HPLC分離純化，得到色譜純中國家蠅抗菌肽1。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法，其特征在于，所述步 驟1)具體為先使家蠅麻醉，然后帶有細菌懸液的不銹鋼針刺透體壁，再使其復蘇，刺傷后 在溫度28 30°C飼養(yǎng)24h，通過損傷感染免疫誘導，使家蠅產(chǎn)生抗菌肽。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法，其特征在于，所述細 菌懸液為大腸埃希氏菌懸液、銅綠假單胞菌懸液或金黃色葡萄球菌懸液。
5.根據(jù)權利要求2所述的一種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法，其特征在于，所述 步驟3)具體為首先將含有抗菌肽的樣品溶液4°C下60000g離心60min，除去沉淀和上層 漂浮的脂肪層；再取上清液裝入分子量截留值為1500U的透析袋內(nèi)，包埋于聚乙二醇中，在 4 °C下透析過液。
6.根據(jù)權利要求2所述的一種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法，其特征在于，所述步 驟4)具體為采用UFC 3TGC00超濾柱進行超速離心過濾，在214nm檢測波長下，當開始出 峰時，進行樣品的部分收集。
7.根據(jù)權利要求2所述的一種中國家蠅抗菌肽1的分離純化方法，其特征在于，所述 步驟5)具體為采用RT-HPLC半制備柱純化，半制備柱加樣量為1. Oml 2. 0ml，流速為 1. Oml/min，檢測波長為214nm，保留時間為18. OOSmin時的收集品為色譜純中國家蠅抗菌 肽1。
8.用權利要求2-7任意一項所述方法制備的中國家蠅抗菌肽1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中國家蠅抗菌肽1及其分離純化方法。所述中國家蠅抗菌肽1，包括5個肽段。其分離純化方法，包括以下步驟1)對家蠅進行免疫誘導；2)將免疫誘導后的家蠅進行組織勻漿，取含有抗菌肽的樣品溶液；3)將樣品溶液進行透析濃縮，得到濃縮樣品；4)將濃縮樣品進行超速離心過濾，得到半純品抗菌肽；5)將半純品抗菌肽進行HPLC分離純化，得到色譜純中國家蠅抗菌肽1。本發(fā)明所述中國家蠅抗菌肽1是最新發(fā)現(xiàn)的一種小分子肽，抗菌肽的活性較強，是一類具有發(fā)展?jié)摿Φ?，對多重耐藥菌有抵抗作用的新型抗菌藥?br> 文檔編號C07K1/34GK101935344SQ20101024488
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權日2010年8月4日
發(fā)明者周義文, 姬尚義, 尹一兵, 涂植光, 申萍 申請人:周義文