專利名稱：一種奈西利肽粗品的固相制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥多肽類原料藥的化學(xué)合成，尤其涉及一種奈西利肽粗品的固相制備方法。
背景技術(shù)：
奈西利肽((nesiritide/Natrecor)是一類新的血管擴(kuò)張劑，由32個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，10-26位置通過(guò)S-S鍵相連。在急性心力衰竭的治療中一種重組人腦鈉肽或B型利鈉肽(BNP)，與內(nèi)生荷爾蒙完全相同，主要用于急性失代償性充血性心力衰竭時(shí)呼吸困難的治療。奈西利肽有靜脈、動(dòng)脈和冠狀血管舒張作用以減輕前后負(fù)荷并在無(wú)直接正性肌力作用的情況下增加心輸出量。在慢性心力衰竭的患者中靜注奈西利肽可通過(guò)促進(jìn)鈉外排和抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)而產(chǎn)生有益的血液動(dòng)力學(xué)作用。奈西利 肽與靜脈注射硝酸甘油比較可更有效地改善血液動(dòng)力學(xué)并具有較少不良反應(yīng)。目前奈西利肽的合成方法有固相法、基因重組等方法，如申請(qǐng)?zhí)?00910104860所述的制備方法以HMPB-AM樹(shù)脂為起始原料，在縮合劑、接肽試劑的作用下，通過(guò)固相合成法依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，得到側(cè)鏈全保護(hù)線性奈西利肽HMPB-AM樹(shù)脂。CN200410083873. X報(bào)道了一種固相制備奈西利肽的方法。然而現(xiàn)有技術(shù)中提供的這些方法HMPB-AM樹(shù)脂不是常規(guī)樹(shù)脂，較難在市場(chǎng)上獲得。HMPB-AM樹(shù)脂在連接Fmoc-His (Trt) -OH時(shí)容易引起消旋，雜質(zhì)較多。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種有效、簡(jiǎn)便的固相合成奈西利肽粗品的制備方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種固相合成奈西利肽粗品的制備方法。本發(fā)明提供了一種奈西利肽粗品的固相制備方法，所述方法包括步驟以固相合成樹(shù)脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的三十二肽樹(shù)脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用TBTU/HOBt(即TBTU和 HOBt，)、HBTU/H0Bt (即 HBTU 和 H0Bt)、B0P/H0Bt (即 BOP 和 H0Bt)、TBTU/H0At (即 TBTU和 HOAt)、HBTU/HOAt (即 HBTU 和 HOAt)、DIC/HOBt (即 DIC 和 HOBt)或 B0P/H0At (即 BOP和HOAt)中的任何一對(duì)為縮合劑，進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的三十二肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得奈西利肽粗品，所述步驟有下述特點(diǎn)—是所述固相合成樹(shù)脂是溴化王樹(shù)脂；及一是采用DMF/DCM混合溶劑為活化溶劑，預(yù)先溶解具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸和縮合劑，反應(yīng)體系外進(jìn)行活化，再加入到反應(yīng)體系中。本發(fā)明提供的奈西利肽粗品的固相制備方法中，依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸包括如下步驟 (a)將王樹(shù)脂、PBr3, Fmoc-His (Trt) -OH和DIPEA混合，反應(yīng)得到溴化王樹(shù)脂；(b)在溴化王樹(shù)脂中，加入脫保護(hù)劑進(jìn)行處理，然后樹(shù)脂用DMF洗漆，加入用DMF/DCM混合溶劑溶解的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑的混合物，接肽反應(yīng)后再加入脫保護(hù)劑處理，再加入用DMF/DCM混合溶劑溶解的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，如此重復(fù)，獲得 Fmoc-Serl-Pro2-Lys3-Met4-Val5-Gln6-Gly7-Ser8-Gly9-Cysli3-Phell-Gly12-Arg13-Lysi4-Met15-Asp16-Arg17-I Iel8-Seri9-Ser2o-Ser2i-Ser22-Gly23-Leu24-Gly25-Cys26-Lys27-Val28-Leu29-Arg3Q-Arg31-HiS32-樹(shù)脂；所說(shuō)的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，依次為(I) Fmoc-His (Trt) -OH 或 Fmoc-His-OH、 (2) Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、(3) Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、(4) Fmoc-Leu-OH、(5) Fmoc-Val—OH、(6) Fmoc-Lys (Boc) —OH、(7) Fmoc-Cys (Trt) -OH 或 Fmoc-Cys (Acm) -OH、(8) Fmoc-Gly-OH、(9) Fmoc-Leu-OH、(10) Fmoc-Gly-OH、(11) Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、(12)Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、、(13)Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、、(14)Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、、(15) Fmoc-I I e_0H、(16) Fmoc-Arg (Pbf) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -OH、、(17) Fmoc-Asp (OtBu) -OH、(18) Fmoc-Met-OH、(19) Fmoc-Lys (Boc) -OH、(20) Fmoc-Arg (Pbf) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -OH、(21) Fmoc-Gly-OH、(22) Fmoc-Phe-OH、(23) Fmoc-Cys (Trt) -OH 或 Fmoc-Cys (Acm) -OH、(24) Fmoc-Gly-OH、(25) Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH、(26) Fmoc-Gly-OH、(27) Fmoc-Gln (Trt) -OH、(28) Fmoc-Val-OH^(29) Fmoc-Met-OH、(30) Fmoc-Lys (Boc) -OH、(31) Fmoc-Pro-OH、(32) Fmoc-Ser(tBu)-OH 或 Fmoc-Ser-OH。在上述方法中，依次連接22至18位殘基的Fmoc-氨基酸時(shí)，所述縮合劑為DIC/HOBt、或DIC/Cl-HOBt和選自下述的一種或一種以上的混合TBTU/H0Bt、HBTU/HOBt和HATU/HOAto在上述方法中，依次連接22至18位殘基的Fmoc-氨基酸時(shí)，縮合反應(yīng)溫度為0-5。。。在上述方法中，依次連接22至18位殘基的Fmoc-氨基酸時(shí)，I. 0-3. O倍量的HOBt或Cl-HOBt，I. 0-3. O倍量的DIC試劑，溶解在5ml_10ml/g樹(shù)脂的DMF和DCM溶劑中的混合溶液，反應(yīng)30-60分鐘后加入I. 0-3. O倍量的DIC試劑。在另一優(yōu)選例中，以DMF和DCM的混合溶液的總體積計(jì)，其中DMF的百分含量為40-60%ο在上述方法中，依次連接17、13、8位殘基的Fmoc-Arg (Pbf)-OH時(shí)，將五氟苯酚作為活化試劑。在上述方法中，依次連接12、9、7、5位殘基的Fmoc氨基酸時(shí)，2. 0-5. O倍量的Fmoc保護(hù)氨基酸，2. 0-5. O倍量的H0Bt/Cl-H0Bt，2. 0-5. O倍量的DIPEA試劑，溶解在5ml_10ml/g固相合成樹(shù)脂的DMF和DCM溶劑中的混合溶液，在0-5°C加入2. 0-5. O倍量的HBTU/HATU或 TBTU。在上述方法中，依次連接10、6、4至I位殘基的Fmoc氨基酸時(shí)，I. 0-3. O倍量的Fmoc保護(hù)氨基酸，2. 0-6. O倍量的H0Bt/Cl_H0Bt，I. 0-3. O倍量的DIC試劑，溶解在5ml-10ml/g固相合成樹(shù)脂的DMF和DCM溶劑中的混合溶液，反應(yīng)30-60分鐘后繼續(xù)加入1.0-3. O倍量的DIC試劑。據(jù)此，本發(fā)明提供了一種有效、簡(jiǎn)便的固相合成奈西利肽粗品的制備方法。
圖I是實(shí)施例I所獲得的奈西利肽粗品I的GC-MS譜圖和HPLC檢測(cè)圖譜；其中A是LC-MS譜圖，B是HPLC檢測(cè)圖譜。圖2是實(shí)施例2所獲得的奈西利肽粗品2的GC-MS譜圖和HPLC檢測(cè)圖譜；其中A是LC-MS譜圖，B是HPLC檢測(cè)圖譜。圖3是實(shí)施例3所獲得的奈西利肽粗品3的GC-MS譜圖和HPLC檢測(cè)圖譜；其中A是LC-MS譜圖，B是HPLC檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)如果就不同的氨基酸殘基采用特定的合成方法，減少單一合成方法的不良影響，采用經(jīng)典固相合成方法也可以簡(jiǎn)便、有效地獲得奈西利肽的粗品，純化后得到的產(chǎn)品純度高(> 98%)。本發(fā)明利用固相合成技術(shù)將肽鏈的羧末端保護(hù)氨基酸His(Dnp)的羧基同一個(gè)不溶的高分子樹(shù)脂Pam Resin相連，再以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組分同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng)接長(zhǎng)肽鏈逐步向氨基端延伸，提供了一種新的肽合成方法。具體地采用溴化王樹(shù)脂合成第一個(gè)氨基酸His，有效防止His消旋，減少消旋雜質(zhì)。采用DMF/DCM混合溶劑，預(yù)先溶解氨基酸和活化試劑,反應(yīng)體系外進(jìn)行活化,再加入到反應(yīng)體系中。有效控制長(zhǎng)鏈肽的溶脹和反應(yīng)過(guò)程中空間位阻影響。對(duì)不同殘基米用不同合成方法如22-18#殘基，采用DIC/HOBt為縮合試劑，控制反應(yīng)0_5C，中控監(jiān)測(cè)不完全時(shí)，則繼續(xù)采用HBTU/H ATU/TBTU活化方法繼續(xù)反應(yīng)。對(duì)于17#，13#, 8# Arg殘基，則采用五氟苯酚為活化試劑。而對(duì)于12#，9#，7#和5#分子較小的氨基酸，采用增大投料量的辦法，快速完成反應(yīng)，減小因時(shí)間延長(zhǎng)而引起的副反應(yīng)。對(duì)于10#，6#,4#-1#氨基酸,采用增加活化試劑的量,促使反應(yīng)快速完成。本發(fā)明中所使用的縮寫(xiě)或英文全稱的含義列于下表
權(quán)利要求
1.一種奈西利肽粗品的固相制備方法，所述方法包括步驟 以固相合成樹(shù)脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的三十二肽樹(shù)脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用TBTU/HOBt (即TBTU和HOBt，)、HBTU/H0Bt (即 HBTU 和 H0Bt)、B0P/H0Bt (即 BOP 和 H0Bt)、TBTU/H0At (即 TBTU 和HOAt)、HBTU/HOAt (即 HBTU 和 HOAt)、DIC/HOBt (即 DIC 和 HOBt)或 BOP/HOAt (即 BOP 和HOAt)中的任何一對(duì)為縮合劑，進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的三十二肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得奈西利肽粗品，其特征在于，所述步驟有下述特點(diǎn) 一是所述固相合成樹(shù)脂是溴化王樹(shù)脂；及 一是采用DMF/DCM混合溶劑為活化溶劑，預(yù)先溶解具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸和縮合齊U，反應(yīng)體系外進(jìn)行活化，再加入到反應(yīng)體系中。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸包括如下步驟 (a)將王樹(shù)脂、PBr3>Fmoc-His (Trt) -OH和DIPEA混合，反應(yīng)得到溴化王樹(shù)脂； (b)在溴化王樹(shù)脂中，加入脫保護(hù)劑進(jìn)行處理，然后樹(shù)脂用DMF洗滌，加入用DMF/DCM混合溶劑溶解的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸、縮合劑的混合物，接肽反應(yīng)后再加入脫保護(hù)劑處理，再加入用DMF/DCM混合溶劑溶解的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，如此重復(fù)，獲得FmoC-Serl-Pro2-Lys3-Met4-Val5-Gln6-Gly7-Ser8-Gly9-Cysi0-Phell-Glyi2-Arg13-Lysi4-Meti5-Asp16-Arg17-I Iel8-Seri9-Ser2o-Ser2i-Ser22-Gly23-Leu24-Gly25-Cys26-Lys27-Val28-Leu29-Arg3o-Arg31-His32-樹(shù)脂； 所說(shuō)的具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，依次為(1)Fmoc-His(Trt)-OH 或 Fmoc-His-OH、 (2)Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、 (3)Fmoc-Arg (Pbf ) -OH 或 Fmoc-Arg (HCl) -0H、(4)Fmoc-Leu-OH^(5)Fmoc-Val-OH.(6)Fmoc-Lys(Boc)-0H、(7)Fmoc-Cys(Trt)-OH或 Fmoc-Cys(Acm)-0H、(8)Fmoc-Gly-OH.(9)Fmoc-Leu-OH^(10)Fmoc-Gly-OH.(11)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、(12)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、、(13)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、、(14)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、、(15)Fmoc-Ile-0H、(16)Fmoc-Arg(Pbf)-OH或 Fmoc-Arg(HCl) -OH、、(17)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、(18)Fmoc-Met-OH、(19)Fmoc-Lys(Boc)-OH、(20)Fmoc-Arg(Pbf)-OH或 Fmoc-Arg(HCl)-OH、(21)Fmoc-Gly-0H、(22)Fmoc-Phe-OH、(23)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH、(24)Fmoc-Gly-0H、(25)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH、(26)Fmoc-Gly-0H、(27)Fmoc-Gln(Trt)-OH、(28)Fmoc-Val-0H、(29)Fmoc-Met-OH、(30)Fmoc-Lys(Boc)-OH、(31)Fmoc-Pro-OH、(32)Fmoc-Ser(tBu)-OH或 Fmoc-Ser-OH。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，依次連接22至18位殘基的Fmoc-氨基酸時(shí)，所述縮合劑為DIC/HOBt、或DIC/Cl-HOBt和選自下述的一種或一種以上的混合TBTU/HOBt、HBTU/HOBt 和 HATU/HOAt。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，依次連接22至18位殘基的Fmoc-氨基酸時(shí)，縮合反應(yīng)溫度為0-5°C。
5.如權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，依次連接22至18位殘基的Fmoc-氨基酸時(shí)，I. 0-3. 0倍量的HOBt或Cl-HOBt, I. 0-3. 0倍量的DIC試劑，溶解在5ml-10ml/g樹(shù)脂的DMF和DCM溶劑中的混合溶液，反應(yīng)30-60分鐘后加入I. 0-3. 0倍量的DIC試劑。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，以DMF和DCM的混合溶液的總體積計(jì)，其中DMF的百分含量為40-60%。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，依次連接17、13、8位殘基的Fmoc-Arg(Pbf)-OH時(shí)，將五氟苯酚作為活化試劑。
8.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，依次連接12、9、7、5位殘基的Fmoc氨基酸時(shí)，2. 0-5. 0倍量的Fmoc保護(hù)氨基酸，2. 0-5. 0倍量的H0Bt/Cl_H0Bt，2. 0-5. 0倍量的DIPEA試劑，溶解在5ml-10ml/g固相合成樹(shù)脂的DMF和DCM溶劑中的混合溶液，在0_5°C加A 2. 0-5. 0 倍量的 HBTU/HATU 或 TBTU。
9.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，依次連接10、6、4至I位殘基的Fmoc氨基酸時(shí)，I. 0-3. 0倍量的Fmoc保護(hù)氨基酸，2. 0-6. 0倍量的H0Bt/Cl_H0Bt，I. 0-3. 0倍量的DIC試劑，溶解在5ml-10ml/g固相合成樹(shù)脂的DMF和DCM溶劑中的混合溶液，反應(yīng)30-60分鐘后繼續(xù)加入I. 0-3. 0倍量的DIC試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奈西利肽粗品的固相制備方法。所述方法包括步驟以固相合成樹(shù)脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)的三十二肽樹(shù)脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用TBTU/HOBt、HBTU/HOBt、BOP/HOBt、TBTU/HOAt、HBTU/HOAt、DIC/HOBt或BOP/HOAt中的任何一種為縮合劑，進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的三十二肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得奈西利肽粗品，所述步驟有下述特點(diǎn)一是所述固相合成樹(shù)脂是溴化王樹(shù)脂；及一是采用DMF/DCM混合溶劑為活化溶劑，預(yù)先溶解具有Fmoc保護(hù)基團(tuán)的氨基酸和縮合劑，反應(yīng)體系外進(jìn)行活化，再加入到反應(yīng)體系中。
文檔編號(hào)C07K14/575GK102702342SQ20121023440
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者張國(guó)慶, 張若平, 方路, 白俊才 申請(qǐng)人:上海昂博生物技術(shù)有限公司