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一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):3592372閱讀:575來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
與簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)分子或是由微生物產(chǎn)生的抗生素類不同,抗菌肽是由基因編碼的,因而高等生物可以根據(jù)其表面的微生物對(duì)這些肽類抗生素的敏感性的變化來(lái)靈活調(diào)節(jié)其自身的分子結(jié)構(gòu),有廣譜、高效的殺菌活性。目前抗菌肽的潛在應(yīng)用價(jià)值受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。迄今發(fā)現(xiàn)的抗菌肽中,主要是小分子抗微生物肽(一般小于100個(gè)氨基酸),這些內(nèi)源性的短肽分子能夠破壞微生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)或功能。在過(guò)去的20年里,在植物以及軟體動(dòng)物和人等一系列多細(xì)胞動(dòng)物的細(xì)胞和體液中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)這類抗微生物肽。大體上,可以粗略地將這些短肽分類為Cecropin樣抗菌肽、富含脯氨酸殘基的抗菌肽、含甘氨酸殘基的抗菌肽和富含半胱氨酸殘基的抗菌肽,其中富含半胱氨酸殘基的堿性抗菌肽被命名為防御素(defensin)。防御素具有廣譜及強(qiáng)力的抗微生物(細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等)特性,是人粘膜、皮膚以及上皮細(xì)胞的重要免疫作用分子。人防御素包括α、β和Θ三個(gè)家族,分子大小為29-45個(gè)氨基酸,含有六個(gè)半胱氨酸殘基,從而形成三對(duì)二硫鍵。其中,防御素家族在人基因組上約有40個(gè)成員,人β-防御素I (hBD-Ι)于1995年被發(fā)現(xiàn),隨后在2000年左右hBD-2、hBD-3和hBD-4也相繼被發(fā)現(xiàn)。防御素具有廣譜的抗微生物活性。在體外,防御素在毫摩爾濃度下對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰 性菌均具有殺滅作用。其中,微克級(jí)水平的hBD-3對(duì)金黃色葡萄球菌和釀膿鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性致病菌,綠膿桿菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌,以及酵母,都具有強(qiáng)烈的殺傷作用,并且對(duì)多重抗藥性的金黃色葡萄球菌和抗萬(wàn)古霉素的糞腸球菌也可在較低濃度下發(fā)揮殺傷作用。hBD-4可以抑制革蘭氏陽(yáng)性菌(如葡萄球菌)和革蘭陰性菌(如大腸埃希菌)的生長(zhǎng),同時(shí)抗綠膿桿菌的活性也很強(qiáng)。此外,β -防御素對(duì)病毒、真菌(如酵母等)等微生物也有抑制作用。β -防御素的直接殺菌作用是由于β -防御素分子呈陽(yáng)性、帶正電荷,能夠與帶負(fù)電荷、呈陰性的細(xì)菌表面結(jié)合,結(jié)合后其分子中的疏水區(qū)可插入到細(xì)菌的胞膜,而其帶電區(qū)(帶正點(diǎn)荷)則與細(xì)菌胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部和水分子相互作用。在細(xì)胞膜上多個(gè)β -防御素分子聚集形成孔隙或通道,使得正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內(nèi),而胞內(nèi)重要的鹽類、大分子等則泄漏到胞外,最終導(dǎo)致不可逆性的菌體死亡。β -防御素在細(xì)胞膜上的通道形成過(guò)程與膜的磷脂組成成分和所處的溫度環(huán)境等因素有關(guān)。然而,一旦β -防御素在膜上形成了通道,上述因素便不會(huì)對(duì)其通道的活動(dòng)構(gòu)成本質(zhì)的影響。防御素的表達(dá)水平和活力受作用環(huán)境的鹽濃度和離子種類的影響。過(guò)高的鹽濃度(如IOOmM以上PBS緩沖液)會(huì)導(dǎo)致防御素活性水平急劇下降。一價(jià)離子對(duì)防御素活性影響較小,二價(jià)離子(如鈣、鎂離子)則可顯著降低防御素的活性。分析認(rèn)為較高的鹽濃度(>50mM)可能會(huì)影響防御素的帶電量,進(jìn)而降低其抗菌效果,而人體生理環(huán)境鹽濃度約為150mM,一定程度限制了防御素的臨床應(yīng)用。因此,提升防御素的活性和耐鹽能力可推動(dòng)防御素的實(shí)際應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽,如序列表的序列I所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本發(fā)明還保護(hù)具有所述多肽的蛋白質(zhì)(包括將所述多肽進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白質(zhì),也包括將所述多肽與其他標(biāo)簽蛋白或功能蛋白進(jìn)行融合得到的融合蛋白)、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本發(fā)明還保護(hù)所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物在制備抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物的產(chǎn)品,其活性成分為所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物。本發(fā)明提供的產(chǎn)品,除了所述有效成分外,可以添加藥學(xué)上允許的稀釋劑、賦形齊 、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑、增效劑、添加劑等。本發(fā)明提供的產(chǎn)品,可為片劑、散劑、顆粒劑、液劑、乳劑或懸濁劑等,亦可為粉劑、
水劑、油劑、軟膏、硬膏、噴霧劑等。
本發(fā)明還保護(hù)所述多肽、所述蛋白質(zhì)、所述衍生物或所述組合物在抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物中的應(yīng)用。以上任一所述的微生物可為細(xì)菌,具體可為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌,更具體可為大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌或表皮葡萄球菌。本發(fā)明通過(guò)改變現(xiàn)有防御素的氨基酸組成和部分序列,設(shè)計(jì)新的抗菌肽,通過(guò)影響多肽或其部分區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)、帶電荷量、疏水性等特性,從而保持或提高其抗微生物活性,并具有更好的耐鹽能力。本發(fā)明對(duì)于微生物,特別是有害微生物的防治,微生物流行病的防治具有重大價(jià)值。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明,但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn),均設(shè)置三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值。PBS緩沖液的制備方法:將8mmol Na2HPO4和2moI NaH2PO4溶于水并用水定容至IL0LB培養(yǎng)基的制備方法:取胰化蛋白胨(0X0ID,批號(hào)804054) 10g、酵母提取物(0X0ID,批號(hào)1173143)5g、NaCl (西隴化工股份有限公司,批號(hào)1207032) 10g,用蒸餾水定容至 1L,pH7.4。
MH培養(yǎng)基(水解酪蛋白培養(yǎng)基):青島海博生物技術(shù)有限公司,批號(hào)20121105。實(shí)施例1、抗菌肽的設(shè)計(jì)已報(bào)道的β -防御素3 (hBD-3)和β -防御素4 (hBD-4)的序列如下:β防御素3、4的氨基酸序列為:hBD-3:GI INTLQKYYCRVRGGRCAVLSC !LPKHHQI(;k| CSTRGRKCCRRKKhBD-4:EFELDRICGYGTARCRKKC jRSQEYR IGR CPNTYACCLRKffDESLLNRTKP根據(jù)已報(bào)道的β -防御素3和β -防御素4,設(shè)計(jì)新的抗菌肽如下:Η4 (序列表的序列 2):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSC bSQR¥Rlfiw| CSTRGRKCCRRKK。H4中,用hBD-4中的方框部分取代了 hBD_3中的方框部分。3N4I (序列表的序列 I):QKYYCRVRGGRCAVLSCRSQEYRIGRCSTRGRKCCRRKK。3N4I中,刪除了 H4中的下劃線部分。MIX-M (序列表 的序列 3):GIIAVLAKWCRVRKKRCAVLSCPRRAKRIGKCSTRGRKCCRRKK。MIX-M中,對(duì)H4中的若干氨基酸殘基進(jìn)行了突變,見(jiàn)粗體字母。HBD3-M (序列表的序列 4):GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEESISKCSTRGRKCCRRKK。HBD3-M中,對(duì)H4中的若干氨基酸殘基進(jìn)行了突變,見(jiàn)粗體字母。實(shí)施例2、抗菌肽的合成委托上海波泰生物技術(shù)有限公司,采用9-芴甲氧羰基法(Fmoc固相合成法)分別合成 hBD-3、hBD-4、H4、3N41、MIX-M 和 HBD3-M。合成工藝簡(jiǎn)述如下:1、NovaSyn TGA樹(shù)脂(0.25mmol/g)作為固相載體;將10份的首個(gè)氨基酸以N,N- 二異丙基碳二亞胺(DIC) /4- 二甲氨基吡啶(DMAP)法加入到樹(shù)脂中(10份的Fmoc-氨基酸,5份的DIC,0.1份的DMAP);后續(xù)的氨基酸,以四倍于固相載體的量,同時(shí)加入 I 份的 Fmoc-氨基酸,I 份的 2- (lH-benzotriazole-1-yl) I, I, 3, 3-tetramethyluronium tetrafluoroborate,I 份的 N-hydroxybenzotriazole,以及 2 份的N, N-diisopropylethylamine。2、Fmoc基團(tuán)用30%的哌唳/NMP洗脫,合成后的多肽用含5%thioanisole,3%ethandithiol及2%anisole的三氟乙酸(TFA)去保護(hù)并從樹(shù)脂上分離;洗脫下的多肽用冰冷的乙醚沉淀,過(guò)濾后溶于水中,凍干,并用DTT還原。3、合成的多肽用反向高效液相層析(RP-HPLC)進(jìn)行純化,樣品注入PhenomenexC18層析柱(25cm,內(nèi)徑5mm),用含0.1%TFA的蒸餾水(A液)和0.1%TFA的乙腈(B液)洗脫,收集下的組分凍干干燥并進(jìn)行RP-HPLC分析。實(shí)施例3、抗菌肽的對(duì)微生物的抑制活性實(shí)驗(yàn)菌株如下:大腸桿菌(Escherichiacoli):ATCC 編號(hào)為 25922 ;肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia):ATCC 編號(hào)為 700603 ;銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosa):ATCC 編號(hào)為 1δ442 ;福氏志賀菌(ShigellafIexneri):CICC 編號(hào)為 21534 ;宋氏志賀菌(Shigellasonnei):CICC 編號(hào)為 21535 ;
鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium):CICC 編號(hào)為 21484 ;金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus):ATCC 編號(hào)為 29213 ;幾腸球菌(Enterococcusfaecalis):ATCC 編號(hào)為 29212 ;屎腸球菌(Enterococcusfaecium):ATCC 編號(hào)為 6057 ;表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis):ATCC 編號(hào)為 12228。CICC即中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,網(wǎng)址為:http://www.china-cicc.0rg/οATCC即美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù),網(wǎng)址為:http://www.atcc.0rg/0實(shí)驗(yàn)方法:(I)用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)待測(cè)菌株至OD6tltol約為0.6,然后用PBS緩沖液稀釋,得到濃度為106CFU/ml的菌液;(2)在步驟(I)得到的菌液中加入待測(cè)多肽(即實(shí)施例2制備得到的hBD-3、hBD-4、H4、3N41、MIX-M或HBD3-M ;H4即序列表的序列2所示的多肽,3N4I即序列表的序列I所示的多肽,MIX-M即序列表的序列3所示的多肽,HBD3-M即序列表的序列4所示的多肽),37°C孵育3h ;(3)將步驟(2)得到的混合液用PBS緩沖液稀釋至1000倍體積后取100 μ I均勻涂布在固體培養(yǎng)基平板上,37°C培養(yǎng)12小時(shí),觀察細(xì)菌生長(zhǎng)與存活狀況,對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù),采用Logit回歸模型計(jì)算LD90數(shù)值(即90%細(xì)菌死亡時(shí)對(duì)應(yīng)的多肽濃度)。采用LB培養(yǎng)基(包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基)的實(shí)驗(yàn)菌株為:大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、宋氏志賀菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌。采用MH培養(yǎng)基(包括液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基)的實(shí)驗(yàn)菌株為:金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌和表皮葡萄球菌。各個(gè)多肽對(duì)各個(gè)細(xì)菌的LD90數(shù)值見(jiàn)表I。表I各個(gè)多肽對(duì)各個(gè)細(xì)菌的LD90數(shù)值(μ g/ml)
權(quán)利要求
1.多肽,如序列表的序列I所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。
2.具有權(quán)利要求1所述多肽的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求1所述多肽的衍生物或含有權(quán)利要求1所述多肽的組合物。
3.權(quán)利要求1所述多肽、權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2所述衍生物或權(quán)利要求2所述組合物,在制備抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于:所述微生物為細(xì)菌。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于:所述細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。
6.一種抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物的產(chǎn)品,其活性成分為權(quán)利要求1所述多肽、權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2所述衍生物或權(quán)利要求2所述組合物。
7.如權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品,其特征在于:所述微生物為細(xì)菌。
8.如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品,其特征在于:所述細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。
9.權(quán)利要求1所述多肽、權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2所述衍生物或權(quán)利要求2所述組合物,在抑制微生物生長(zhǎng)和/或殺滅微生物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的 應(yīng)用,其特征在于:所述微生物為細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蛋白質(zhì)及其在制備抗微生物產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的多肽,如序列表的序列1所示、序列表的序列2所示、序列表的序列3所示或序列表的序列4所示。本發(fā)明還保護(hù)具有所述多肽的蛋白質(zhì)、所述多肽的衍生物或含有所述多肽的組合物。本發(fā)明對(duì)于微生物,特別是有害微生物的防治,微生物流行病的防治具有重大價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/47GK103193877SQ201310135178
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月18日
發(fā)明者王慧, 李濤, 劉雄, 郭峰, 郭通 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所
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