一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體，屬于酶工程領(lǐng)域。編碼所述肌酸水解酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。所得肌酸水解酶突變體的半衰期相比野生型分別提高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍，更適合工業(yè)應(yīng)用。
【專利說明】
一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體，屬于酶工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌酸水解酶(Creatinase，EC 3.5.3.3，簡稱CRE)是酶促檢測法中檢測肌酐的一種 必不可少的酶，主要來源于微生物。在一些研究中發(fā)現(xiàn)一些屬的菌株能夠通過誘導(dǎo)產(chǎn)生肌 酸水解酶并在細(xì)胞中積累。這些細(xì)菌有假單胞菌屬、梭菌、黃桿菌屬、芽孢菌屬、產(chǎn)堿菌屬等 等。但由于原始菌的肌酸水解酶產(chǎn)量很低，且誘導(dǎo)劑的價格較高，不適合進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模 生產(chǎn)。同時，對肌酸水解酶的性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)其具有底物親和力低、熱穩(wěn)定性差等特點(diǎn)。而在 實(shí)際應(yīng)用中需要有大量的酶，不利于工業(yè)生產(chǎn)。
[0003] 目前對肌酸水解酶性質(zhì)分析比較深入的菌株主要是惡臭假單胞菌、節(jié)桿菌和產(chǎn)堿 桿菌。綜合分析不同來源的肌酸水解酶學(xué)性質(zhì)，多數(shù)肌酸水解酶的最適反應(yīng)pH范圍為7.0~ 8.0，在中性、弱堿和弱酸條件下保持穩(wěn)定。已報道的肌酸水解酶的最適反應(yīng)溫30~40°C，而 熱穩(wěn)定性不是很理想，在45°C以下相對穩(wěn)定，溫度一旦高于45°C，酶活會迅速下降。因此，對 肌酸水解酶的熱穩(wěn)定性研究很有必要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明所要解決的問題是提供一種熱穩(wěn)定性提高的肌酸水解酶突變體。
[0005] 編碼所述肌酸水解酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQIDN0.4SSEQIDN0.5K*。
[0006] 本發(fā)明還提供一種獲得上述肌酸水解酶突變體的方法，包括以下步驟:PCR獲得編 碼突變體的核苷酸序列，連接表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E. coli BL21，以TB培養(yǎng)基培養(yǎng)重組菌，使之表 達(dá)突變體。
[0007] 本發(fā)明還提供表達(dá)上述肌酸水解酶突變體的基因工程菌，是以pET_20b為載體構(gòu) 建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主BL21 (DE3)。
[0008] 本發(fā)明還提供一種肌酐檢測試劑盒，含有所述的肌酸水解酶突變體。
[0009] 本發(fā)明的有益效果在于：提高肌酸水解酶的熱穩(wěn)定性，所得肌酸水解酶突變體的 半衰期相比野生型分別提高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍，更適合工業(yè)應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0010] LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L。
[0011] TB 培養(yǎng)基：蛋白胨 12g/L、酵母粉 24g/L、甘油 10g/L、KH2P042.32g/L、K2HP〇4l6.43g/ L〇
[0012] 采用分光光度法測定肌酸水解酶酶活。單位酶活定義：lmin內(nèi)將肌酸水解產(chǎn)生1μ mol尿素所需要的酶量。酶活測定條件為：在試管中加入900yL肌酸溶液，在室溫中平衡 5min。后加入100yL待測酶液，在37 °C反應(yīng)10min，然后向反應(yīng)體系中加入2mL對-二甲胺基苯 甲醛溶液終止反應(yīng)，并置于25°C溫育20min，在435nm處測定吸光度值，以水調(diào)零?？瞻坠苁?在肌酸溶液中先加入對-二甲氨基苯甲醛，后加入待測酶液，其它步驟與測定管一致。
[0013]實(shí)施例1高熱穩(wěn)定性突變菌株的獲得
[0014] 利用定點(diǎn)突變試劑盒(TaKaRa)，設(shè)計多對引物，以載體PET20J(煙草節(jié)桿菌肌酸酶 的高效異源表達(dá)與應(yīng)用分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報)為模板對第368位和第195位兩個位 點(diǎn)進(jìn)行飽和突變。編碼野生肌酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015] PCR 反應(yīng)條件為 981€31^11，34個循環(huán)（981€311^11、581€305、72。(：111^11305)、72 1€ lOmiruPCR擴(kuò)增體系:模板ΙμL、上下游引物各ΙμL，2x PrimeStar 24μ1、滅菌的雙蒸水24μ1。 PCR結(jié)束后，加入5μ1 的FD Buffer、lyU9DpnHf^^lh。
[0016] 將含有編碼突變體的基因的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli BL21，挑選轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培 養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)化至TB培養(yǎng)基，接種量為3 %。菌體長到OD600為3時，加入IPTG，使其 終濃度為〇. 6mmol/L，并將培養(yǎng)溫度降到30 °C，培養(yǎng)8h。收集發(fā)酵后的菌體，超聲破碎后測定 相同溫度下保溫不同時間的酶活。篩選到Pet20J-V368L、Pet20J-K195C、Pet20J-K195L、 Pet20J-K195V、Pet20J-K195T五個正向突變株，分別對應(yīng)肌酸水解酶突變體V368L、肌酸水 解酶突變體K195C、肌酸水解酶突變體K195L、肌酸水解酶突變體K195V、肌酸水解酶突變體 K195T。
[0017] 實(shí)施例2肌酸水解酶的純化
[0018] 破碎大腸桿菌后進(jìn)行硫酸銨沉淀，選擇55 % -75 %硫酸銨飽和度的沉淀，用少量 磷酸鹽緩沖液(PH 7.0)溶解蛋白沉淀，透析24h除去酶液中的硫酸銨。根據(jù)肌酸水解酶的等 電點(diǎn)性質(zhì)，選擇QFF柱進(jìn)行離子交換純化。QFF柱以磷酸鹽緩沖液平衡30min，將粗酶液注入 純化柱中，用含有1M NaCl的磷酸緩沖液洗脫目的蛋白。
[0019 ]實(shí)施例3突變體的純酶液的性質(zhì)測定
[0020] 將純化后的各肌酸水解酶突變體稀釋，測定突變體在50°C下保溫不同時間的酶活 并計算其半衰期（ti/2，min)，發(fā)現(xiàn)五個突變體￥3681^、1(195￥、1(1951'、1(195(：、1(1951^較訂分別提 高6.9、3.7、3.4、1.6、1.2倍(如表1所示）。除此之外，1(195(：的1^值較町下降了72.4%，1(195￥ 和1(195(：的比酶活較訂分別提高了41.9%、47.9%。
[0021] 表1酶學(xué)性質(zhì)
[0022]
[UUM」 雖然不友明已以敉住頭施例公開卯上，但兵開非用以限疋不友明，仕例熟戀此扠 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種肌酸水解酶，其特征在于，編碼所述肌酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. I、 SEQIDN0.2、SEQIDN0.3、SEQIDN0.4SSEQIDN0.5m*。2. 編碼權(quán)利要求1所述肌酸水解酶的核苷酸序列。3. 含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的載體或細(xì)胞。4. 一種獲得權(quán)利要求1所述肌酸水解酶的方法，其特征在于，包括以下步驟:PCR獲得編 碼突變體的核苷酸序列，連接表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E. coli BL21，以TB培養(yǎng)基培養(yǎng)重組菌，使之表 達(dá)突變體。5. -種表達(dá)權(quán)利要求1所述肌酸水解酶的基因工程菌，其特征在于，是以pET-20b為載 體構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主BL21(DE3)。6. 權(quán)利要求1所述肌酸水解酶在檢測肌酐中的應(yīng)用。7. -種肌酐檢測試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的肌酸水解酶。8. 權(quán)利要求7所述的肌酐檢測試劑盒在肌酐檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK105907739SQ201610294244
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月4日
【發(fā)明人】劉松, 李江華, 阮潔, 陳堅, 堵國成
【申請人】江南大學(xué)