專利名稱：前列腺特異性抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床血液免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于人體血清前列腺特異性抗原(PSA)定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，利用該試劑盒檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著人口結(jié)構(gòu)老齡化、飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)前列腺疾病的發(fā)病率迅速增長(zhǎng)，其中前列腺癌占男性發(fā)病率的第二位、死亡率的第三位，而前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)是能否根治的關(guān)鍵所在。前列腺特異性抗原(PSA)是前列腺癌特異性最強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，PSA的檢測(cè)有助于前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、監(jiān)視病情進(jìn)展、治療效果監(jiān)測(cè)，同時(shí)PSA在原發(fā)性前列腺癌和繼發(fā)性前列腺癌的鑒別診斷中起著決定性作用。目前在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)PSA的方法，仍多是自60年代發(fā)展起來(lái)的放射免疫分析方法和80年代興起的酶聯(lián)免疫分析法。但由于放射免疫分析方法必須使用放射性標(biāo)記物，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜，必需用專門的放射性探測(cè)器對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，對(duì)操作人員也存在有放射性污染與傷害，特別是如常用的碘-125、碘-131和磷-32等半衰期短的核素，其保存時(shí)期不長(zhǎng)，也給臨床使用帶來(lái)了不便。而酶免法雖然避免了放免法的污染、繁瑣、保存期短等問題，但由于其檢測(cè)范圍窄、靈敏度低等缺點(diǎn)仍不能滿足臨床的需求。
20世紀(jì)70年代中期Arakawe首次報(bào)道用發(fā)光信號(hào)進(jìn)行分析檢測(cè)，即利用發(fā)光的化學(xué)反應(yīng)(chemiluminescence，CL)和生物反應(yīng)(bioluminescence，BL)分析超微量物質(zhì)，特別是用于臨床免疫分析中檢驗(yàn)超微量活性物質(zhì)?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)以其靈敏度高(attomole即10-18mol)、快速(幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，有的情況下信號(hào)可持續(xù)幾小時(shí))、簡(jiǎn)便、測(cè)試中不使用有害的試劑，因此成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。化學(xué)發(fā)光免疫分析法因標(biāo)記方法的不同而分為直接標(biāo)記法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法兩種，直接標(biāo)記法多采用的是吖啶酯直接標(biāo)記在抗原或抗體上用于檢測(cè)。由于其發(fā)光往往是閃爍光，不宜捕獲，往往只適應(yīng)全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于人體血清前列腺特異性抗原(PSA)定量檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析試劑盒，利用該試劑盒進(jìn)行分析檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高。
為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案前列腺特異性抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，主要由包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板、前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記前列腺特異性抗原抗體、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液組成，發(fā)光底物A液由高效發(fā)光劑、復(fù)合增強(qiáng)劑、氨基酸配成，發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶和穩(wěn)定劑配成。
包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板為包被有抗前列腺特異性抗原單克隆或多克隆抗體的不透明聚苯乙烯板；前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品以分析緩沖液為基質(zhì)，加入前列腺特異性抗原純品配制而成；酶標(biāo)記前列腺特異性抗原抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的前列腺特異性抗原的抗體；發(fā)光底物A、B為HRP-魯米諾發(fā)光體系。
辣根過氧化物酶標(biāo)記前列腺特異性抗原抗體的工作濃度為1∶5000-9000；包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被。
發(fā)光底物A液由下列成分組成luminol 0.15mM、羥基香豆素0.59mM、沒食子酸0.35mM、Tris-Hcl緩沖液0.2M；發(fā)光底物B液由下列成分組成氨基酸氧化酶0.85mM、吐溫-20 0.8％，V/V、DTPA 0.5mM、維生素C 0.12mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M。
本發(fā)明試劑盒中，分析緩沖液由0.05M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉、0.01M的氯化鈉和1％牛血清白蛋白(BSA)組成，Ph7.2；所用抗體采用常規(guī)的細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備得到的PSA單克隆抗體，采用辛酸-硫酸銨鹽析法對(duì)制備的抗體進(jìn)行純化后，再進(jìn)行篩選鑒定，選出配對(duì)較好的一對(duì)單抗用于檢測(cè)，于-20℃保存?zhèn)溆?；不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被單克隆抗體，包被液為0.05M pH9.6的碳酸鹽緩沖液，包被濃度為2-5ug/ml，包被量100ul/孔，0℃-4℃孵育過夜；棄去孔內(nèi)液體，用PBS-Tween洗液洗板孔兩次；用pH7.4PBS-1％BSA，150ul/孔封閉，室溫孵育3小時(shí)；棄去孔內(nèi)液體，用pH7.4PBS-2.5％蔗糖，150ul/孔保護(hù)；棄去孔內(nèi)液體，經(jīng)干燥后裝入隔潮的鋁箔袋中密封保存。
本發(fā)明試劑盒中所用的PSA系列標(biāo)準(zhǔn)品，以分析緩沖液為基質(zhì)，采用濃縮精漿以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為準(zhǔn)稀釋而成，為系列凍干品，使用前用蒸餾水復(fù)溶；所用的酶標(biāo)記前列腺特異性抗原的抗體，采用改良的過碘酸鈉法進(jìn)行標(biāo)記。其原理為辣根過氧化物酶是一種糖蛋白，含約18％的糖，是與酶活性無(wú)關(guān)的。與酶活性無(wú)關(guān)的糖基被過碘酸鈉(NaIO4)氧化為醛基，再與抗體蛋白的氨基與醛基形成Schiff’s堿。為了防止酶蛋白的氨基與醛基反應(yīng)發(fā)生自身偶聯(lián)，在標(biāo)記前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封閉酶蛋白中殘存的α-和ε-氨基。酶與抗體的結(jié)合反應(yīng)后，再加入硼氫化鈉(NaHB4)還原成穩(wěn)定的結(jié)合物。在標(biāo)記好的抗體溶液中等比加入甘油于-20℃包存?zhèn)溆?。試?yàn)表明，所用的酶標(biāo)抗體使用的工作濃度為1∶8000最好。所用發(fā)光底物系統(tǒng)采用高效穩(wěn)定酶促化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)，A液為luminol 0.15mM、羥基香豆素0.59mM、沒食子酸0.35mM、Tris-Hcl緩沖液0.2M、pH 9.4；B液為氨基酸氧化酶0.85mM、吐溫-20 0.8％(V/V)、DTPA 0.5mM、維生素C 0.12mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M，pH 6.5。
本發(fā)明針對(duì)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室提供了一種既可手工操作，又可適用于某些標(biāo)準(zhǔn)全自動(dòng)檢測(cè)儀器的檢測(cè)手段，建立了檢測(cè)人血清PSA的定量檢測(cè)方法。其采用標(biāo)準(zhǔn)96孔微孔板為固相載體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，催化發(fā)光底物發(fā)光作為示蹤信號(hào)用以檢測(cè)。利用辣根過氧化物酶催化發(fā)光底物，發(fā)光底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并釋放出大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)中間體。這種激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)其回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，可同時(shí)發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器即可測(cè)量光量子產(chǎn)額，該光量子產(chǎn)額與樣品中的待測(cè)物質(zhì)的量成正比。由此可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量。
利用本發(fā)明進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)便、無(wú)放射性污染；試劑盒生產(chǎn)成本低，大大減輕了醫(yī)患雙方負(fù)擔(dān)。因此本發(fā)明更適合我國(guó)臨床試驗(yàn)室的使用。
本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的使用操作程序如下(一)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1、將所有檢測(cè)試劑及血清標(biāo)本恢復(fù)至室溫18-25℃(約需30分鐘)；2、將恒溫箱或水浴鍋調(diào)至反應(yīng)溫度；3、將發(fā)光底物A、B液等比例混合至本次試驗(yàn)所需體積(每孔需100μl，可按照每條包被板(8孔)需混合后的發(fā)光底物1ml混合，依此類推)。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)微孔板已將PSA抗體固定在板孔，可直接使用，不必使用前現(xiàn)場(chǎng)包被，非常方便。
(二)實(shí)驗(yàn)操作步驟1、將所需用量的已包被板條放置在支架上；2、在包被孔中分別加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品、血清樣品；3、每孔再分別加入酶標(biāo)記抗體溶液100μl。微量振蕩器上振蕩30秒使其混合均勻；4、置37℃溫育60分鐘；5、甩去孔內(nèi)混合物，用蒸餾水注滿各孔，甩去，重復(fù)5次，最后在吸水紙上拍干；6、每孔加入混合后的發(fā)光底物100μl，室溫(18-25℃)反應(yīng)5分鐘；7、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度值；8、以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo)(X軸)，以標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)(Y軸)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算測(cè)定結(jié)果。
以本發(fā)明上述檢測(cè)試劑盒按上述程序進(jìn)行測(cè)定所用時(shí)間較短，一批測(cè)定一般僅需一個(gè)多小時(shí)即可完成，方便快速。
經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明上述檢測(cè)試劑在用于前列腺特異性抗原含量測(cè)定時(shí)的方法學(xué)鑒定數(shù)據(jù)可達(dá)到如下指標(biāo)
靈敏度-最小檢出量為0.3ng/ml；標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0-100ng/ml；精密度-分析內(nèi)精密度平均4.5％(n＝10)，分析間精密度平均為9.6％(n＝10)，遠(yuǎn)高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，說明本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中具有很好的重復(fù)性；準(zhǔn)確性——向血清中添加已知PSA標(biāo)準(zhǔn)品后的回收率為98％-109％。
實(shí)驗(yàn)表明，應(yīng)用本發(fā)明對(duì)人血清中的前列腺特異性抗原進(jìn)行測(cè)定，只需取少量樣品即可進(jìn)行，對(duì)被檢測(cè)者沒有任何傷害。同時(shí)由于本發(fā)明采用了化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測(cè)方法，在上述指標(biāo)中都優(yōu)于目前廣泛使用的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，同時(shí)也不存在放射免疫法的放射性污染、有效期短、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，本發(fā)明為臨床提供了一種檢測(cè)前列腺特異性抗原的更準(zhǔn)確、方便、快捷的方法，能夠更好地滿足臨床的需要。
具體實(shí)施例方式
前列腺特異性抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，由(1)包被有抗前列腺特異性抗原單克隆抗體的96孔不透明聚苯乙烯板，(2)以分析緩沖液為基質(zhì)，加入前列腺特異性抗原純品配制而成的前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品，(3)辣根過氧化物酶標(biāo)記的前列腺特異性抗原的抗體，其工作濃度為1∶8000，(4)發(fā)光底物A液，(5)發(fā)光底物B液組成。發(fā)光底物A液由高效發(fā)光劑、復(fù)合增強(qiáng)劑、氨基酸配成，發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶和穩(wěn)定劑配成。
包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附法包被。
發(fā)光底物A液由下列成分組成luminol 0.15mM、羥基香豆素0.59mM、沒食子酸0.35mM、Tris-Hcl緩沖液0.2M；發(fā)光底物B液由下列成分組成氨基酸氧化酶0.85mM、吐溫-200.8％(V/V)、DTPA 0.5mM、維生素C 0.12mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M。
權(quán)利要求
1.前列腺特異性抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，主要由包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板、前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記前列腺特異性抗原抗體、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液組成，發(fā)光底物A液由高效發(fā)光劑、復(fù)合增強(qiáng)劑、氨基酸配成，發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶和穩(wěn)定劑配成。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板為包被有抗前列腺特異性抗原單克隆或多克隆抗體的不透明聚苯乙烯板；前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品以分析緩沖液為基質(zhì)，加入前列腺特異性抗原純品配制而成；酶標(biāo)記前列腺特異性抗原抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的前列腺特異性抗原的抗體；發(fā)光底物A、B為HRP-魯米諾發(fā)光體系。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，辣根過氧化物酶標(biāo)記前列腺特異性抗原抗體的工作濃度為1∶5000-9000；包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板采用直接物理吸附包被法包被抗前列腺特異性抗原單克隆或多克隆抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，發(fā)光底物A液由下列成分組成luminol 0.15mM、羥基香豆素0.59mM、沒食子酸0.35mM、Tris-Hcl緩沖液0.2M；發(fā)光底物B液由下列成分組成氨基酸氧化酶0.85mM、吐溫-20 0.8％(V/V)、DTPA 0.5mM、維生素C 0.12mM、乙酸-乙酸鹽緩沖液0.2M。
全文摘要
前列腺特異性抗原化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒，屬于臨床血液檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域。主要由包被有抗前列腺特異性抗原抗體的不透明聚苯乙烯板、前列腺特異性抗原系列標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記前列腺特異性抗原抗體、發(fā)光底物A液和發(fā)光底物B液組成，發(fā)光底物A液由高效發(fā)光劑、復(fù)合增強(qiáng)劑、氨基酸配成，發(fā)光底物B液由氨基酸氧化酶和穩(wěn)定劑配成。發(fā)光底物A、B為HRP－魯米諾發(fā)光體系。可用于臨床檢測(cè)人血清PSA含量的檢測(cè)方法，對(duì)前列腺疾病的早期發(fā)現(xiàn)、病情進(jìn)展監(jiān)測(cè)、治療效果監(jiān)測(cè)與評(píng)估等提供良好的技術(shù)支持。
文檔編號(hào)G01N33/52GK1924581SQ20051001794
公開日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者付光宇, 李曉霞, 王睿, 許遠(yuǎn)航, 李彬, 馬建軍 申請(qǐng)人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司