專利名稱：呋喃它酮殘留物無標(biāo)記阻抗型免疫傳感器及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物殘留檢測領(lǐng)域；具體涉及呋喃它酮殘留物無標(biāo)記阻抗型免疫傳感 器及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
硝基呋喃類藥物是人工合成的廣譜抗生素，它有非常好的抗菌作用和藥理動力學(xué) 特性，除了作為一種抗生素被應(yīng)用于獸醫(yī)醫(yī)療中外，它還曾作為豬、禽與水產(chǎn)品促生長的添 加劑被廣泛應(yīng)用。但在長時間的實驗室研究過程中發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物 均可以使實驗動物發(fā)生癌變和基因突變，鑒于此，歐盟分別于1993年(歐盟法令2901/93) 與1995年(歐盟法令1442/95)立法禁止在動物源性食品生產(chǎn)加工過程中使用呋喃它酮 (.Fural tadone )、呋喃西林 OVi trofurazone)、呋喃咀啶、Ni trofuran to in)與呋喃唑酮 (Furazolidone)等四種藥物。其后，美國、加拿大、澳新與日本等國均全面禁止使用硝基呋 喃類藥物。2002年3月我國也將硝基呋喃類藥物列為禁用獸藥。研究證明，硝基呋喃類藥物 在動物體內(nèi)若干小時就會迅速分解成硝基呋喃與各種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物與組織內(nèi)蛋 白質(zhì)形成較為穩(wěn)定的化合物，該化合物可以在組織中存留較長時間，所以分析此類藥物殘 留時應(yīng)該對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析，歐盟等國就是以檢測代謝產(chǎn)物為手段達(dá)到檢測硝基 呋喃殘留的目的。四種硝基呋喃類藥物的代謝產(chǎn)物分別對應(yīng)為呋喃它酮一3-氨基-5-嗎 啉基-2-氧唑酮(AMm ；呋喃西林一氨基脲iSEM、；呋喃咀啶一 1-氨基咀啶(AHD)；呋喃唑 酮一 3-氨基-2-氧唑酮(Jfl )。隨著我國加入世貿(mào)組織以來，歐美日等發(fā)達(dá)國家利用自身技術(shù)優(yōu)勢對我國出口食 品及農(nóng)副產(chǎn)品不斷設(shè)置新的技術(shù)壁壘措施，以達(dá)到限制我國食品與農(nóng)副產(chǎn)品的出口，有關(guān) 這方面的貿(mào)易糾紛接踵而來，歐盟早在2000年初就開始了一項長達(dá)42個月的FoodBRAND 計劃(QLK1-1999-00142)，其主要目的是要求歐盟各認(rèn)可實驗室對食品中硝基呋喃類殘留 檢測方法(包括ELISA與LC-MS-MS方法)進(jìn)行攻關(guān)研究，以為其設(shè)置技術(shù)壁壘提供技術(shù)支 持。目前，歐盟規(guī)定不得在食品中檢測出硝基呋喃類藥物四種代謝產(chǎn)物殘留，鑒于此，歐盟 等國家已研制出液質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測分析方法，同時也有酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備和使 用，我國相關(guān)科研人員也研制成功上述檢測方法。但目前已有的針對上述殘留物的快速檢 測方法(ELISA與LC-MS-MS方法)由于均需對殘留物進(jìn)行衍生化處理，檢測工作量大，需耗 費至少24小時，所需時間較長，達(dá)不到快速檢測的要求。本發(fā)明旨在通過免疫傳感器的制備，建立一種呋喃它酮殘留快速檢測方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為人們提供一種呋喃它酮殘留物無標(biāo)記阻抗型免疫傳感器及其 制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所說的呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器，是將納米金通過自組
4裝方法固定于金電極表面，用來固定呋喃它酮殘留物的單克隆抗體而構(gòu)建得到。上述呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器具體是通過以下步驟制得
(1)金膠的制備制備金納米粒子溶液；
(2)金電極的預(yù)處理金電極先用0.3,0. 05 μ m的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光，然 后依次用二次水和無水乙醇超聲清洗；再將拋光處理好的金電極置于0. 5M H2S04溶液中， 在-0. 5到+1. 4V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描25圈，掃速為0. IV s-Ι ；然后將電極在氮氛下 干燥；
(3)1，4_苯二硫醇修飾金電極將預(yù)處理好的金電極浸入含15mM的1，4_苯二硫醇的 無水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用無水乙醇沖洗表面，再在氮氛下干燥；
(4)單層納米金膠的自組裝將自組裝了1，4_苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放 在暗處置于室溫下5h后，取出后用二次水沖洗表面；
(5)抗體的固定將納米金修飾電極浸入含0.030mg/mL AMOZ抗體的磷酸緩沖溶液 (PH7.0)中，于4° C下放置12 h;然后將其取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白溶液 中，置于37. 5oC水浴中1小時，以封閉非特異性位點；最后將取出后的電極用二次水沖洗以 除去表面多余的牛血清蛋白；即制得呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器。本發(fā)明還公開了使用上述呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器檢測呋喃 它酮殘留物的方法，具體是
(1)建立阻抗的相對變化率％ Δ Rct與AMOZ濃度的關(guān)系測定阻 抗型免疫傳感器的起始阻抗值R。t(BSA)，以及阻抗型免疫傳感器分別與 不同濃度的AMOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行免疫反應(yīng)后阻抗值R。t(AM.Ab)，按公式
= 腿;計算出阻抗的相對變化率％ Δ Rct ;阻抗的相對變化 jtSs(皿}
率％厶1^與41 )2濃度對數(shù)在1.0到1.0 ？ 106rig/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為1. 0 ng/mL ；其中所說的免疫反應(yīng)條件是在pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行，37. 5° C溫育3h ； (2 )按照步驟(1)的方法和條件將阻抗型免疫傳感器與待測物溶液進(jìn)行免疫反應(yīng)，測定 阻抗值，計算得到抗體與AMOZ反應(yīng)后引起阻抗的相對變化率％ Δ Rct ；
(3)根據(jù)步驟(1)確定的阻抗的相對變化率％ Δ R。t與AMOZ濃度的關(guān)系，確定出待測物 溶液中AMIOZ殘留物含量。本發(fā)明利用電化學(xué)阻抗技術(shù)，通過直接測定抗原-抗體發(fā)生免疫反應(yīng)前后對阻抗 測試溶液鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀在傳感器表面發(fā)生氧化還原時電子傳遞阻抗的改變，制備 針對呋喃它酮代謝產(chǎn)物呋喃它酮-3-氨基-5-嗎啉基-2-氧唑酮(AMOZ)特異的快速檢測無 標(biāo)記型免疫傳感器，尋求AMOZ濃度與免疫反應(yīng)前后阻抗變化率之間的關(guān)系，實現(xiàn)對AMOZ的 快速檢測。與液質(zhì)聯(lián)用色譜分析法相比，該方法對樣品的前處理要求較低，分析過程簡單， 檢測時間由原來的24小時縮短到3小時，而且檢測靈敏度也較高，為我國畜禽產(chǎn)品進(jìn)出口 貿(mào)易中呋喃它酮殘留檢測提供一種高效、簡便的途徑。
圖1是抗體濃度對抗體固定后電極阻抗的影響。圖2是配制抗體溶液的磷酸鹽緩沖溶液pH對抗體固定后電極阻抗的影響。
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圖3是免疫反應(yīng)時間對阻抗相對變化率的影響。圖4是免疫反應(yīng)溶液的pH對阻抗相對變化率的影響。圖5是免疫反應(yīng)溫度對阻抗相對變化率的影響。
具體實施例方式實施例一傳感器的制備 (1)金膠的制備
金膠的制備可按現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。所有制備納米金膠的玻璃器皿都需用1:3 (ν/ν) HNO3-HCl溶液浸泡一段時間，使用前用二次蒸餾水沖洗干凈。本實施例中金納米粒子的制 備方法如下將100 mL 0. 01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，在劇烈攪拌的條件下加入2. 50 mL 1. 0%的檸檬酸鈉溶液，溶液顏色先由無色變成墨色再變成墨綠色，最后為酒紅色并呈透 明狀即可。經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，制備的金納米粒子粒徑約為25 nm。另外，根據(jù)納米金 膠溶液的紫外一可見吸收光譜曲線，在520 nm左右出現(xiàn)了納米金膠的吸收峰，這與文獻(xiàn)報 道結(jié)果相一致。所得金納米粒子溶液置于棕色瓶中在4° C下保存?zhèn)溆谩?2)金電極的預(yù)處理
金電極首先分別用0. 3,0. 05 μ m的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光，然后依次用二 次水和無水乙醇超聲清洗。然再將拋光處理好的金電極置于0. 5MH2S04溶液中，在-0. 5到 +1.4V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描25圈，掃速為0. IV s—1。然后將電極在氮氛下干燥。(3) 1,4-苯二硫醇修飾金電極
將預(yù)處理好的金電極浸入15 mM的1，4_苯二硫醇的無水乙醇溶液中，4oC下放置 10 min，然后用無水乙醇沖洗表面，然后在氮氛下干燥。(4)單層納米金膠的自組裝
將自組裝了 1，4-苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放在暗處置于室溫下5h后，取出 后用二次水沖洗表面。(5)抗體的固定
將納米金修飾電極浸入含0.2 mL 0.030 mg/mL抗AMOZ單克隆抗體的磷酸鹽緩沖溶 液(PH7.0)中，于4° C下放置12 h。電極取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置 于37. 5°C水浴中1小時，以封閉非特異性位點。最后將取出的電極用二次水沖洗以除去表 面多余的牛血清蛋白。將制備好的修飾有抗體的電極浸入磷酸緩沖溶液(PH=7. 0)中，置于 4°C保存?zhèn)溆?。本實施例中使用的抗AMOZ單克隆抗體，是由雜交瘤細(xì)胞株AM0Z-D4E10分泌的，該 細(xì)胞株公開于中國專利申請第20061012 7111. 4號，揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點 實驗室制備和保存，自申請日起向公眾提供20年；公眾也可從中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心獲得，該細(xì)胞株保藏號為CGMCC No: 1792。但本領(lǐng)域的技術(shù)人員可發(fā) 理解，本發(fā)明中不限于使用該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，其他抗AMOZ抗體也同樣能用來制 作本發(fā)明的傳感器。實施例二檢測方法的建立 (1)抗體固定條件的優(yōu)化 ①抗體濃度的影響傳感器對AMOZ抗原的響應(yīng)與AMOZ抗體的在電極表面的固定量有關(guān)，電極表面單 位面積固定的抗體量越多，則可結(jié)合抗原的位點就越多，越有利于與抗原分子的結(jié)合。在傳 感器的制備中，當(dāng)改變AMOZ抗體用量時，所得傳感器的性能呈現(xiàn)明顯差異。由圖1可見， 當(dāng)抗體濃度小于0. 025 mg/mL時，阻抗隨著抗體濃度的增加而增大；當(dāng)抗體濃度大于0. 025 mg/mL，阻抗的響應(yīng)基本不變。所以實驗過程中選擇將抗體濃度為0.030 mg/mL。②pH對抗體固定的影響
研究了配制抗體用的磷酸鹽溶液在pH在6. 0到8. 5范圍內(nèi)對抗體固定的影響(圖2)。 結(jié)果表明當(dāng)溶液PH為7. 0時阻抗達(dá)到最大，說明在此條件下抗體在納米金表面的固定量達(dá) 到最大。故固定用抗體溶液的PH選用7. 0的磷酸鹽緩沖液來控制。(2)抗體-抗原免疫反應(yīng)條件優(yōu)化 ①溫育時間的影響
在免疫反應(yīng)中，溫育時間是衡量免疫反應(yīng)檢測的一個重要因素。本實驗中，為了選擇 免疫反應(yīng)最佳反應(yīng)時間，將固定了抗體的電極在濃度為1. OX IO3ngAiL磷酸鹽緩沖溶液 (PH7.4)中溫育，檢測阻抗相對變化值。從圖3可以看出，溫育時間小于3小時，阻抗的相對 變化隨著溫育時間的延長而增加。當(dāng)溫育時間達(dá)到3小時后，阻抗的相對變化基本不變，表 明抗原的吸附量達(dá)到最大。因此，選取3小時作為免疫反應(yīng)的溫育時間。②抗體-抗原反應(yīng)的pH值的影響
將固定了抗體的電極分別浸入到PH為6. 0，6. 5，7. 0，7. 4，8. 0和8. 5的濃度同為 1.0X103 ng/mLAMOZ的磷酸鹽緩沖溶液中溫育3h，測量其阻抗的相對變化。結(jié)果表明，pH 值從6. 0到7. 4，阻抗的相對變化值逐漸增大，pH值從7. 4到8. 5，阻抗的相對變化值逐漸 減小(圖4)。因此，選取pH7. 4的磷酸鹽緩沖液作為抗體-抗原反應(yīng)的最佳緩沖液。③抗體-抗原反應(yīng)的溫育溫度的影響
溫育溫度對電極表面發(fā)生的免疫反應(yīng)有一定的影響。將修飾了抗體的電極浸入濃度為 1.0X IO3 ng/mL AMOZ的磷酸鹽緩沖溶液(pH7. 4)中溫育3h，當(dāng)溫育溫度從20增加到50° C 時，阻抗的相對變化值在37. 5° C時達(dá)到最大值(圖5)。因此選取37. 5° C作為免疫反應(yīng) 最佳溫育溫度。(3)干擾試驗
為了探討該免疫傳感器的特異性，使用硝基呋喃類代謝的其他三種產(chǎn)物作為干擾物 測定對象。在濃度為1.0 ng/mLAMOZ溶液中分別加入不同濃度的干擾物質(zhì)，將固定了抗體 的電極浸入其中進(jìn)行反應(yīng)，測定其阻抗值(結(jié)果見表1)。從表1可以看出，加入干擾物質(zhì) 后，阻抗只有輕微的變化，其RSD小于3%。由此可見，該免疫傳感器具有良好的的特異性。
實施例三AMOZ檢測
配制不同濃度的3-氨基-5-嗎啉基-2-氧唑酮(AMOZ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，將含固定好抗體的 修飾電極在上述優(yōu)化得到的最佳條件下與不同濃度的AMOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行免疫反應(yīng)。然后 將修飾電極、飽和甘汞電極和鉬電極三電極體系浸入含1.0 mM Fe(CN)63_M_&0. IM KNO3的 磷酸鹽緩沖溶液(PH7. 4)的阻抗測試溶液中，利用Autolab電化學(xué)工作站在開路電位和正 弦波電位振幅為10 mV的條件下，于10—1 Hz到IO6Hz頻率范圍測定其交流阻抗圖譜，再通 過等效電路擬合求得Fe (CN) 63-7 4在修飾電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)時電子傳遞的阻抗值， 并按公式(1)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理
權(quán)利要求
一種呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器，其特征在于是通過以下方法制備得到(1)金膠的制備制備金納米粒子溶液；(2)金電極的預(yù)處理金電極先分別用0.3，0.05μm的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光，然后依次用二次水和無水乙醇超聲清洗；再將拋光處理好的金電極置于0.5M H2SO4溶液中，在 0.5到+1.4V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描25圈，掃速為0.1V s 1；然后將電極在氮氛下干燥；(3)1，4 苯二硫醇修飾金電極將預(yù)處理好的金電極浸入15 mM的1，4 苯二硫醇的無水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用無水乙醇沖洗表面，然后在氮氛下干燥；(4)單層納米金膠的自組裝將自組裝了1，4 苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放在暗處置于室溫下5h后，取出后用二次水沖洗表面；(5)抗體的固定將納米金修飾電極浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗體的磷酸緩沖溶液(pH7.0)中，于4°C下放置12 h；電極取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于37.5oC水浴中1小時，以封閉非特異性位點；最后再將電極取出后用二次水沖洗以除去表面多余的牛血清蛋白；即制得呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器。
2.一種制備呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器的方法，其特征在于，包括以 下步驟(1)金膠的制備制備金納米粒子溶液；(2)金電極的預(yù)處理金電極先分別用0.3,0. 05 μ m的三氧化二鋁粉末在絲綢上拋光， 然后依次用二次水和無水乙醇超聲清洗；再將拋光處理好的金電極置于0. 5M H2S04溶液 中，在-0. 5到+1. 4V范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描25圈，掃速為0. IV s-Ι ；然后將電極在氮氛 下干燥；(3)1，4-苯二硫醇修飾金電極將預(yù)處理好的金電極浸入15mM的1，4_苯二硫醇的無 水乙醇溶液中，4oC下放置10 min，然后用無水乙醇沖洗表面，然后在氮氛下干燥；(4)單層納米金膠的自組裝將自組裝了1，4_苯二硫醇的金電極浸入金膠溶液中，放 在暗處置于室溫下5h后，取出后用二次水沖洗表面；(5)抗體的固定將納米金修飾電極浸入含0.030 mg/mL AMOZ抗體的磷酸緩沖溶液 (PH7.0)中，于4° C下放置12 h;電極取出后再放入10.0 mg/mL的牛血清蛋白中，置于 37. 5°C水浴中1小時，以封閉非特異性位點；最后再將電極取出后用二次水沖洗以除去表 面多余的牛血清蛋白；即制得呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器。
3.用權(quán)利要求1所述阻抗型免疫傳感器檢測呋喃它酮殘留物的方法，包括以下步驟(1)建立阻抗的相對變化率％ Δ Rct與AMOZ濃度的關(guān)系測定阻抗型免疫傳感器的起始阻抗值R。t(BSA)，以及阻抗型免疫傳感器分別與 不同濃度的AMOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行免疫反應(yīng)后阻抗值R。t(AM.Ab)，按公式
全文摘要
本發(fā)明涉及呋喃它酮殘留物無標(biāo)記的阻抗型免疫傳感器，及其制備方法和應(yīng)用，所說的該傳感器通過金膠制備、金電極的預(yù)處理、1，4-苯二硫醇修飾金電極、單層納米金膠的自組裝和抗體的固定5個步驟而制得。其特征在于是將納米金通過自組裝方法固定于金電極表面，用來固定呋喃它酮殘留物的單克隆抗體而構(gòu)建得到。使用時，先建立阻抗的相對變化率%△Rct與AMOZ濃度的關(guān)系，再根據(jù)待測樣品的阻抗相對變化率%△Rct就可確定其AMOZ濃度。采用本發(fā)明的傳感器和檢測方法具有快速簡便的特點，解決當(dāng)前呋喃它酮殘留檢測操作費時的缺陷。
文檔編號G01N27/30GK101957375SQ201010295008
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月15日
發(fā)明者余兵, 吳麗萍, 李東明, 楊功俊, 王倩倩, 秦愛建, 蔡寶亮, 邵紅霞, 金文杰, 錢琨 申請人:揚州大學(xué)