專利名稱：用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白芯片，具體涉及用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，以及相應(yīng)的蛋白芯片檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
鐵是人體內(nèi)必需的微量元素。鐵缺乏會導(dǎo)致成年人生理活力減低，兒童大腦發(fā)育受損。人體嚴(yán)重鐵缺乏會導(dǎo)致缺鐵性貧血。目前，全球約有20億人群貧血，鐵缺乏人群比例更高。評估機(jī)體鐵狀況，判別是否存在鐵缺乏具 有重要的臨床意義，同時(shí)也是亟待解決的技術(shù)問題。選擇具有特異、靈敏的早期鐵缺乏的監(jiān)測指標(biāo)，將有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)并治療缺鐵人群和潛在貧血患者，同時(shí)也有助于人群營養(yǎng)調(diào)查，為制訂控制預(yù)防鐵缺乏及缺鐵性貧血的公共衛(wèi)生政策提供科學(xué)依據(jù)。目前，對鐵營養(yǎng)狀況進(jìn)行監(jiān)測的指標(biāo)主要包括血清鐵蛋白(serum ferritin,簡稱 SF),可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(soluble transferrin receptor,簡稱sTfR), C-反應(yīng)蛋白(C reactive protein,簡稱 CRP),血清鐵(serum iron，簡稱 SI)，轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(transferrin saturation,簡稱TS)、血紅蛋白(haemoglobin,簡稱Hb)和血液鋅原卩卜啉(zinc protoporphyrin,簡稱ZPP)(葛可佑.中國營養(yǎng)科學(xué)全書(上、下冊)[M].第一版.北京人民衛(wèi)生出版社，2004 :129.);后四種指標(biāo)曾經(jīng)一度與血清鐵蛋白一同做為評價(jià)鐵儲量耗損與貧血發(fā)展之間關(guān)系的綜合指標(biāo)，但由于血清鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的生理學(xué)變異較大，且正常人和缺鐵人群這兩個(gè)指標(biāo)的范圍有重疊，故轉(zhuǎn)鐵蛋白不是判定缺鐵與否的有效指標(biāo)(Κ0ΝΙΙΝ AM等.BrJ Haem, 1977, 37 :7-16.);血紅蛋白主要用于功能性鐵缺乏的判斷，其在判斷機(jī)體缺鐵方面不具有特異性，在使用時(shí)也需要聯(lián)合其他指標(biāo)對貧血原因進(jìn)行分析才能得出相應(yīng)結(jié)果，其并不是早期發(fā)現(xiàn)鐵缺乏的靈敏指標(biāo)(Brugnara C等.J AMA,1998，281 =2225-2230);鋅原卟啉雖是識別成人鐵缺乏的靈敏指標(biāo)，但由于鉛中毒、慢性病貧血、慢性感染及炎癥等原因也會引起鋅原卟啉的升高，所以鋅原卟啉也不是特異性判斷鐵缺乏的指標(biāo)，而且正常人群ZPP與缺鐵人群的ZPP有很大范圍的重疊、不同試驗(yàn)ZPP分析方法不統(tǒng)一，結(jié)果表示方法也不一致，這些原因都限制了鋅原卟啉作為檢測指標(biāo)的應(yīng)用(LABBE R F等.Clin Biochem, 2004，37 :165-174)。因此，目前主要以血清鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體作為判斷鐵營養(yǎng)儲量的標(biāo)志物。以C-反應(yīng)蛋白做為質(zhì)量控制，用以判斷是否確實(shí)存在鐵缺乏(Iron Deficiency, ID)或缺鐵性貧血(iron-deficiency anemia, IDA)。目前，對血清鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和C-反應(yīng)蛋白的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法與比濁法。但這兩種方法對血清的需要量大，且不能實(shí)現(xiàn)對兩種標(biāo)志物的同時(shí)快速檢測，存在檢測成本高、檢測效率低等問題(殷繼永等.衛(wèi)生研究.2011，40 (2)，266-269)。另外的方法是利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)進(jìn)行檢測，如利用蛋白芯片技術(shù)對可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(殷繼永等.衛(wèi)生研究，2011,40(1) 91-94.)和血清鐵蛋白(殷繼永等.營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，33(2)，182-187.)進(jìn)行檢測。此種方法具有檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高、且檢測所需的樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，但是由于每次僅能進(jìn)行單一指標(biāo)檢測，多指標(biāo)需要進(jìn)行多次檢測，仍然存在著需要多次取樣，不僅影響結(jié)果的判斷，還會因多次取樣造成受檢者痛苦，其次，還存在檢測成本高，檢測效率低、檢測速度慢等問題。如果能將三種檢測指標(biāo)置于同一個(gè)蛋白芯片上，從而實(shí)現(xiàn)對它們同時(shí)進(jìn)行檢測，則可克服上述缺點(diǎn)。經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)用多指標(biāo)檢測人體鐵儲量的蛋白芯片的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片。利用該蛋白芯片可同時(shí)檢測三種與人體鐵儲量有關(guān)的指標(biāo)，通過一次檢測就可以準(zhǔn)確判定人體鐵儲量的存在狀況，具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、檢測速度快，檢測效率高，成本低、受檢者痛苦少等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明另一目的在于提供上述蛋白芯片的制備方法。本發(fā)明第三目的在于提供含有上述用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片試劑盒。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，包括固相載體和陣列式分布于同相載體上的抗血清鐵蛋白單克隆抗體、抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體和抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體；其中所述的單克隆抗體以共價(jià)鍵固定在固相載體的表面；所述的固相載體經(jīng)醛基化修飾。所述的固相載體是指經(jīng)過醛基化修飾的載玻片。所述的抗血清鐵蛋白單克隆抗體可以是小鼠抗血清鐵蛋白單克隆抗體(Anti-Ferritin, mitochondrial antibody)。 所述的抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體可以是小鼠抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(Anti-Transferrin Receptor antibody)。所述的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體可以是小鼠抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體(Anti-CReactive Protein Antibody)。所述的單克隆抗體皆可于市場上公開購買得到；如小鼠抗血清鐵蛋白單克隆抗體和小鼠抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體可于abeam公司購買，小鼠抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體可于Novus公司購買。上述用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，還包括陽性對照、陰性對照、空白對照；所述的陽性對照、陰性對照分別通過共價(jià)鍵固定于經(jīng)過醛基化修飾的固相載體表面。所述的陽性對照是指兔IgG(兔多克隆抗體)。所述的陰性對照是指小牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)。所述的空白對照是指磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7. 4)。所述的陽性對照、陰性對照皆可于市場上公開購買；如兔IgG(兔多克隆抗體)、小牛血清白蛋白、磷酸鹽緩沖液均可自北京中杉金橋公司購買。上述用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片的制備方法，包括選擇醛基化微陣列固相載體，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；配制點(diǎn)樣液，然后用點(diǎn)樣針按點(diǎn)陣的排列方式將抗血清鐵蛋白單克隆抗體、抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體、抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體與陰性對照、陽性對照及空白對照分別以接觸式點(diǎn)樣方式直接點(diǎn)印于固相載體上；37°C過夜；以5%小牛血清白蛋白溶液封閉I小時(shí)，然后用含有1%。吐溫20的磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer saline Tween 20,PBST,pH7. 4)洗漆3次,室溫晾干,然后抽真空包裝，4°C保存。
一種用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片試劑盒，包括上述用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片。上述用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片試劑盒，還包括樣本稀釋液、濃縮洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)品混合液、空白對照液、抗體檢測液、Cy3熒光標(biāo)記羊抗兔IgG工作液。所述的樣本稀釋液是指3%小牛血清白蛋白溶液(BSA)。所述的濃縮洗滌液是指含有I %吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST，pH7. 4)。所述的標(biāo)準(zhǔn)品混合液是指以3%小牛血清白蛋白溶液(BSA)做樣本稀釋液溶解配制的血清鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和C-反應(yīng)蛋白的混合液。其中混合液中三種蛋白的濃度分別為血清鐵蛋白(SF)為512. 5ng/ml，可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)625ng/ml，C-反應(yīng)蛋白(CRP)為200ng/ml。血清鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和C-反應(yīng)蛋白皆可于市場上購買。所述的空白對照液是指3%小牛血清白蛋白溶液(BSA)。所述的抗體檢測液是指以3%小牛血清白蛋白溶液(BSA)做樣本稀釋液溶解配制的兔抗血清鐵蛋白多克隆抗體、兔抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體多克隆抗體和兔抗C-反應(yīng)蛋白多克隆抗體的混合液；其中混合液中三種多克隆抗體的質(zhì)量體積濃度(yg/ml)分別為兔抗血清鐵蛋白多克隆抗體5 μ g/ml、兔抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體多克隆抗體O. 36 μ g/ml,兔抗C-反應(yīng)蛋白多克隆抗體為O. 5 μ g/ml。所述的Cy3熒光標(biāo)記羊抗兔IgG工作液是指Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG與3%小牛血清白蛋白溶液按I : 1000稀釋成的二抗工作液。所述的樣本稀釋液、濃縮洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)品混合液、空白對照液、抗體檢測液、Cy3熒光標(biāo)記羊抗兔IgG工作液中的各種溶質(zhì)成份均可公開購買。如小牛血清白蛋白可自中杉金橋購買，吐溫20可自北京市慶盛達(dá)化工技術(shù)有限公司購買，血清鐵蛋白可自Fitzgerald公司購買，C-反應(yīng)蛋白可自R&D公司購買，可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體可自ARP-I公司購買，兔抗血清鐵蛋白多克隆抗體可自abeam公司購買，兔抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體多克隆抗體可自Nuvos公司購買,兔抗C-反應(yīng)蛋白多克隆抗體可自Nuvos公司購買，Cy3突光標(biāo)記的羊抗兔IgG 可自 GE-Amersham Biosciences UK L imited 公司購買。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果(I)、本發(fā)明可對檢測鐵儲量的三項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行檢測，與單一指標(biāo)檢測相比，結(jié)果準(zhǔn)確性大大提高。(2)本發(fā)明特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測速度快，檢測結(jié)果穩(wěn)定；(3)本發(fā)明可采用多樣品微陣列技術(shù)，可同時(shí)對多人樣品同時(shí)進(jìn)行檢測，適于對大規(guī)模人群的篩查檢測；(4)與現(xiàn)有檢測方法相比，本發(fā)明檢測方法簡單、操作安全、檢測效率高，樣品需要量小，且檢測一次完成，對受檢人群傷害小，已有的檢測方法對三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測時(shí)需要將一份樣本分三次檢測才能完成，使得檢測所需血樣量較大，檢 測耗時(shí)較長，檢測效率較低，且影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；(5)本發(fā)明蛋白芯片生產(chǎn)成本低、檢測成本低。
圖I.蛋白芯片陣列設(shè)計(jì)示意圖。芯片為12陣列芯片，其中陽性對照兔多克隆抗體(兔IgG)檢測點(diǎn)位；陰性對照小牛血清白蛋白(BSA)檢測點(diǎn)位；空白對照磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4 PBS)檢測點(diǎn)位；SF :血清鐵蛋白檢測點(diǎn)位；sTfR :可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體檢測點(diǎn)位；CRP C-反應(yīng)蛋白檢測點(diǎn)位。圖2.蛋白芯片點(diǎn)樣后掃描圖。圖3 血清鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4.可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅用于對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。如無特別說明，實(shí)施例中所用的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)方法，所涉及的藥品及濃度也是本領(lǐng)域常用試劑和濃度。實(shí)施例I用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片的制備按照如下方法進(jìn)行(I)固相載體的選擇選用醛基化的12點(diǎn)陣形式的三維基片(晶芯高分子三維基片，購自博奧生物有限公司)，確定點(diǎn)陣的排列方式為3X6陣列。(2)配制點(diǎn)樣液a.用含有游離Cy3的50%甘油點(diǎn)樣緩沖液(購自博奧生物有限公司)與pH7. 4的PBS緩沖液按點(diǎn)樣緩沖液PBS :單克隆抗體之間I : I : 2體積比分別配制小鼠抗血清鐵蛋白單克隆抗體(Anti-Ferritin,mitochondrial antibody [F23], abeam 公司)點(diǎn)樣液、小鼠抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體(Anti-Transferrin Receptor antibody [2B6],abeam公司)點(diǎn)樣液和小鼠抗C反應(yīng)蛋白單克隆抗體(Anti_C Reactive ProteinAntibody [C6]，Novus 公司)點(diǎn)樣液。b.陰性對照點(diǎn)樣液將50%甘油點(diǎn)樣緩沖液、pH7. 4的PBS溶液和12%小牛血清白蛋白溶液之間按I:I:2的體積比配制。c.陽性對照點(diǎn)樣液將含有游離Cy3的含50%甘油點(diǎn)樣緩沖液、pH7. 4的PBS溶液和兔多克隆抗體(兔IgG,濃度為lmg/ml)(購自中杉金橋公司)按照1:1:2的體積比配制。d.空白對照pH7. 4的PBS溶液。(3)利用蛋白芯片點(diǎn)樣儀(PersonalArrayer 16 Microarray Spotter,博奧生物有限公司)將⑵中配制的各點(diǎn)樣液小鼠抗血清鐵蛋白單克隆抗體點(diǎn)樣液、小鼠抗可溶性鐵蛋白受體單克隆抗體點(diǎn)樣液、小鼠抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體點(diǎn)樣液、陽性對照點(diǎn)樣液、陰性對照點(diǎn)樣液、空白對照點(diǎn)樣液分別點(diǎn)樣于步驟(I)中的醛基化的三維基片上。(4)固定、封閉、洗滌在37°C恒溫箱中固定反應(yīng)16小時(shí)；然后以5%小牛血清白蛋白溶液(購自北京中杉金橋公司)封閉I小時(shí)，再用含有1%。吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST) (pH 7. 4)洗滌芯片3次，室溫晾干，得到本發(fā)明用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片(見圖I)。對固定好的芯片抽真空，4°C保存。對所制備的蛋白芯片進(jìn)行檢測用芯片掃描儀(LuxScan 10K MicroarrayScanner，博奧生物有限公司)掃描上述制備的蛋白芯片，直接觀察點(diǎn)樣結(jié)果。結(jié)果(見圖2)除了陰性對照點(diǎn)因不含游離Cy3而沒有熒光信號外，其余各點(diǎn)位因含有游離的Cy3均呈清晰圓潤信號結(jié)果，說明所制備的蛋白芯片質(zhì)量好。實(shí)施例2用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片檢測人體鐵儲量的對比試驗(yàn)
試驗(yàn)樣品為2010年采自河南省南陽地區(qū)成年育齡婦女自愿受試者(20 60歲)的血清，隨機(jī)選取六例(編號為I、II、III、IV、V、VI)，每例血清樣品分為兩份，一份為200μ I/份，用比濁法分別檢測血清鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和C-反應(yīng)蛋白含量；另一份為20μ I/份，用于本發(fā)明實(shí)施例I制備的蛋白芯片同時(shí)檢測血清鐵蛋白與可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和C-反應(yīng)蛋白含量。(一 )比濁法檢測每例取血清200 μ I用比濁法進(jìn)行檢測。比濁法檢測按常規(guī)方法(Dubois S 等· GIT Labor-Medizin, 1988 ；9 :468-471)進(jìn)行。結(jié)果見表 I。( 二)蛋白芯片檢測按照如下方法進(jìn)行 (I)雜交反應(yīng)將實(shí)施例I制備的蛋白芯片取出，恢復(fù)至室溫后破真空，對芯片中的I 6陣列依次滴加入將標(biāo)準(zhǔn)品混合液(以3%小牛血清白蛋白溶液(BSA)做樣本稀釋液溶解配制的血清鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和C-反應(yīng)蛋白的混合液；其中混合液中各種蛋白的質(zhì)量濃度分別為血清鐵蛋白(SF)為512. 5ng/ml，可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(sTfR)為625ng/ml, CRP為200ng/ml ;從高至低按I : 2倍比稀釋所得的5個(gè)梯度的混合液，第六陣列加入空白對照液(30 μ I/陣)；第7 12陣列分別依次加入6份稀釋的血清樣品(30 μ I/陣)(用3%小牛血清白蛋白溶液(BSA)按I : 8稀釋各份血清后配成稀釋的血清樣品)；37°C溫育I小時(shí)；(2)將濃縮洗滌液按I : 10稀釋得1%。PBST洗滌液，然后用1%。PBST洗滌液洗滌芯片3次，5分鐘/次，室溫晾干。(3)向各陣列中加入抗體檢測液(用3%小牛血清白蛋白溶液(BSA)稀釋配制的兔抗血清鐵蛋白多克隆抗體(購自abeam公司)、兔抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體多克隆抗體(購自Nuvos公司)和兔抗C-反應(yīng)蛋白多克隆抗體(購自Novus公司)的混合液。其中混合液中各種兔多克隆抗體的質(zhì)量體積濃度(μ g/ml)分別為兔抗血清鐵蛋白多克隆抗體5 μ g/ml、兔抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體多克隆抗體O. 36 μ g/ml、兔抗C-反應(yīng)蛋白多克隆抗體
O.5 μ g/ml, 30 μ I/陣，37°C溫育I小時(shí)；用I %。PBST洗滌液洗滌芯片3次，每次5分鐘，室溫晾干。(4)向各陣列中加入Cy3突光標(biāo)記羊抗兔IgG (購買自GE-Amersham
Biosciences UK L imited公司)與3%小牛血清白蛋白按I : 1000稀釋的Cy3突光標(biāo)記羊抗兔IgG工作液，30 μ I/陣，37°C溫育I小時(shí)；用1%0 PBST洗滌液洗滌芯片3次，每次5
分鐘，室溫晾干。(5)利用芯片掃描分析儀(LuxScan IOK Microarray Scanner,博奧生物有限公司)進(jìn)行結(jié)果的判讀與數(shù)據(jù)分析。對芯片中1-6陣列檢測信號值與濃度值做六個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3和圖4)并擬合標(biāo)準(zhǔn)回歸方程(公式I、公式2)。血清鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y = -6. 49+0. 014x (公式 I)其中X為檢測信號值，y為樣本血清鐵蛋白濃度值(ng/ml)。可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體標(biāo)準(zhǔn)回歸方程y = 13. 94-0. 005x+4. 38E_007x2 (公式 2)其中X為檢測信號值，y為樣本血清鐵蛋白濃度值(ng/ml)。將7-12陣列中血清樣品檢測信號值代入標(biāo)準(zhǔn)方程后，定量的計(jì)算出各例血清中檢測濃度，并按公式3計(jì)算各血清鐵儲量。BTSi /K ) -— 1°g(^r)~ 2'8229 (公式 3)
S (mg/Kg) -0.1207其中BIS表示鐵儲量，SF表示血清鐵蛋白含量，sTfR表示可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量。根據(jù)此公式，當(dāng)結(jié)果為正值時(shí)，表示機(jī)體儲存鐵的實(shí)際含量；當(dāng)結(jié)果為負(fù)值時(shí)，表示機(jī)體缺鐵的量。表I比濁法檢測人體鐵儲量結(jié)果
1Λ……血清樣品編號 fe 測 日標(biāo)
___I II III IV V VI
血清鐵蛋白(ng/ml) 94.8 69.4 97.3 124. 3 47.5 36.8 可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體
2.52 1.91 3. 29 1.84 2.02 2. 32
_( Ug/ml)________
C-反應(yīng)蛋白(μ g/ml) 2.26 O. 57 O. 28 0. 26 4.97 3.67鐵儲量 BIS (mg/Kg) 丨 11. 59 丨 11. 46 I 10. 72 13. 69 9.89 8.48表2.用本發(fā)明蛋白芯片檢測人體鐵儲量結(jié)果
仏、、咖士匕士一—血清樣品編號
檢測 日標(biāo) ~\__I II III IV V VI
血清鐵蛋白(ng/ml) 89. 7 72.2 111.3 128.6 73.4 32
可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體—~
2.22 2. 17 2.82 1.91 I. 55 2. 25_( U g/ml)_______
_C-反應(yīng)蛋白(μ g/ml) 2. 23 O. 49 O. 25 O. 27 4.88 3. 45
鐵儲量 BIS (mg/Kg)11. 84 11. 14 IL 78 13. 68 12. 41 8. 09C-反應(yīng)蛋白(CRP)是反映人體有無炎癥和其他可能疾病的指標(biāo)，如果CRP >
5μ g/ml，則說明人體處于炎癥和疾病狀況。而炎癥和疾病會導(dǎo)致鐵蛋白不正常上升，從而使鐵儲量計(jì)算結(jié)果不能真實(shí)反映機(jī)體鐵狀況。因此通過檢驗(yàn)CRP來確定血清鐵蛋白值和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的值是否可用于鐵儲量的計(jì)算。從表I和表2可以看出，本次樣品CRP檢測值均小于5 μ g/ml，說明受檢人機(jī)體無炎癥和疾病，用所測的血清鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的值計(jì)算的人體鐵儲量可以反映人體實(shí)際鐵儲量。從表I與表2數(shù)據(jù)可以看出，兩種方法檢測血清鐵蛋白和可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體含量的結(jié)果之間無顯著差異，其六例血清樣品的實(shí)際鐵儲量計(jì)算結(jié)果也無顯著差異(鐵儲量公式COOK J D等.Blood, 2003,101 :3359-3367)，說明用本發(fā)明蛋白芯片檢測鐵儲量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。但是，利用本發(fā)明蛋白芯片經(jīng)一次加樣即可同時(shí)檢測三個(gè)蛋白指標(biāo)，從而縮短了 三個(gè)指標(biāo)間的檢測時(shí)間，使得檢測結(jié)果更能反應(yīng)出三個(gè)檢測指標(biāo)的真實(shí)性，并進(jìn)而更能準(zhǔn)確的反應(yīng)出受檢者鐵儲量的真實(shí)值；其次，用本發(fā)明蛋白芯片檢測耗時(shí)少，本發(fā)明方法僅用五小時(shí)即可完成對42份血樣各3項(xiàng)檢測指標(biāo)3次重復(fù)的檢測操作，而比濁法則至少需要用時(shí)9-10小時(shí)；此外，本發(fā)明方法檢測用血量低，本方法對每份血樣各3項(xiàng)指標(biāo)完成3次重復(fù)僅需血樣20 Ul/份，而比濁法為至少需血樣200 Ul/份，本發(fā)明減少了受檢人的痛苦。因而利用本發(fā)明蛋白芯片檢測人體鐵儲量方法是一種高通量、檢測速度快、所需樣品少的檢測方法。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，包括固相載體和陣列式分布于固相載體上的抗血清鐵蛋白單克隆抗體、抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體和抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體；其中所述的單克隆抗體以共價(jià)鍵固定在固相載體的表面；所述的固相載體經(jīng)醛基化修飾。
2.按照權(quán)利要求I所述的用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，其特征在于所述的固相載體是指經(jīng)過醛基化修飾的載玻片。
3.按照權(quán)利要求I所述的用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，其特征在于所述的抗血清鐵蛋白單克隆抗體是小鼠抗血清鐵蛋白單克隆抗體；所述的抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體是指小鼠抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體；所述的抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體是小鼠抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體。
4.按照權(quán)利要求I所述的用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，其特征在于還包括陽性對照、陰性對照、空白對照；所述的陽性對照、陰性對照分別通過共價(jià)鍵固定于經(jīng)過醛基化修飾的固相載體表面。
5.按照權(quán)利要求4所述的用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片，其特征在于所述的陽性對照是指兔IgG ;所述的陰性對照是指小牛血清白蛋白；所述的空白對照是指磷酸鹽緩沖液。
6.權(quán)利要求I 5任一所述的用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片的制備方法，其特征在于包括選擇醛基化微陣列固相載體，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；配制點(diǎn)樣液，然后用點(diǎn)樣針按點(diǎn)陣的排列方式將抗血清鐵蛋白單克隆抗體、抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體、抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體與陰性對照、陽性對照及空白對照分別以接觸式點(diǎn)樣方式直接點(diǎn)印于固相載體上；37°C過夜；以5%小牛血清白蛋白溶液封閉I小時(shí)，然后用含有1%。吐溫20的磷酸緩沖液洗滌3次，室溫晾干，然后抽真空包裝，4°C保存。
7.一種用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求I 5任一所述的用于檢測人體鐵儲量的蛋白芯片。
8.按照權(quán)利要求7所述的蛋白芯片試劑盒，其特征在于還包括樣本稀釋液、濃縮洗滌液、標(biāo)準(zhǔn)品混合液、空白對照液、抗體檢測液和Cy3熒光標(biāo)記羊抗兔IgG工作液。
9.按照權(quán)利要求8所述的蛋白芯片試劑盒，其特征在于所述的樣本稀釋液是指3%小牛血清白蛋白溶液；所述的濃縮洗滌液是指含有1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液；所述的空白對照液是指3%小牛血清白蛋白溶液；所述的標(biāo)準(zhǔn)品混合液是指以3%小牛血清白蛋白溶液做樣本稀釋液溶解配制的血清鐵蛋白、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和C-反應(yīng)蛋白的混合液。
10.按照權(quán)利要求8或9所述的蛋白芯片試劑盒，其特征在于所述的抗體檢測液是指以3 %小牛血清白蛋白溶液做樣本稀釋液溶解配制的兔抗血清鐵蛋白多克隆抗體、兔抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體多克隆抗體和兔抗C-反應(yīng)蛋白多克隆抗體的混合液；所述的Cy3熒光標(biāo)記羊抗兔IgG工作液是指Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG與3%小牛血清白蛋白溶液按I : 1000稀釋成的二抗工作液。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于人體鐵營養(yǎng)檢測領(lǐng)域的用于人體鐵儲量檢測的蛋白芯片，包括固相載體和陣列式分布于固相載體上的抗血清鐵蛋白單克隆抗體、抗可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體和抗C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體；其中所述的單克隆抗體以共價(jià)鍵固定在固相載體的表面；所述的固相載體經(jīng)醛基化修飾。本發(fā)明還公開了基于所述蛋白芯片的檢測試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，利用本發(fā)明蛋白芯片可實(shí)現(xiàn)對評價(jià)人體鐵儲量的三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行同時(shí)檢測，結(jié)果準(zhǔn)確可靠；其次，利用本發(fā)明蛋白芯片檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測速度快，檢測結(jié)果穩(wěn)定；此外，本發(fā)明采用多樣品微陣列技術(shù)，適于對大規(guī)模人群的篩查檢測；本發(fā)明方法需采血樣量小，對受檢人群傷害小，檢測且成本低。
文檔編號G01N33/68GK102621330SQ20121009717
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月5日
發(fā)明者孫靜, 李文仙, 殷繼永, 霍軍生, 黃建 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所