專利名稱：除草劑2,4-d-殺蟲(chóng)劑chi二聯(lián)檢測(cè)卡及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境激素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種除草劑2，4-D-殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)檢測(cè)卡及其制備方法。
背景技術(shù)：
近些年來(lái)，科學(xué)家們接連發(fā)現(xiàn)一些存在于生物機(jī)體之外，具有與人和生物內(nèi)分泌激素作用類似的物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠模擬內(nèi)分泌激素功能從而引起生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊舌L就將之稱為環(huán)境激素或環(huán)境荷爾蒙。環(huán)境激素已成為繼臭氧層、地球氣候變暖之后全球的第三大環(huán)境問(wèn)題，成為環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域中的熱門(mén)課題。環(huán)境激素是指外因性干擾生物體內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)。由于人類活動(dòng)而釋放到環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)，在動(dòng)物和人體內(nèi)發(fā)揮類似雌激素的作用。它能通過(guò)與激素受體結(jié)合，干擾生物體正常的生理代謝、內(nèi)分泌和生殖機(jī)能，引起種種負(fù)面的生物學(xué)效應(yīng)。環(huán)境激素通過(guò)環(huán)境介質(zhì)和食物鏈進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)，干擾其內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖功能系統(tǒng)，甚至有引發(fā)惡性腫瘤與生物絕種的危害?，F(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)在不斷滿足人類的生活需要的同時(shí)也給環(huán)境帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，并且已經(jīng)威脅到人類的生殖健康，甚至物種的繁衍。我國(guó)是世界上的農(nóng)藥生產(chǎn)與使用大國(guó)，資料顯示2011年我國(guó)農(nóng)藥原藥產(chǎn)量為264. 87萬(wàn)噸，其中殺蟲(chóng)劑原藥產(chǎn)量為70. 9萬(wàn)噸，占總產(chǎn)量的44. 35% ;除草劑產(chǎn)量為117. 5萬(wàn)噸，占總產(chǎn)量的26. 77% ;殺菌劑原藥產(chǎn)量為15萬(wàn)噸，占總產(chǎn)量的5.67%。此類農(nóng)藥除部分出口外，大部分在國(guó)內(nèi)銷售和使用。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)估算我國(guó)每年約有5(Γ60萬(wàn)噸有機(jī)氯農(nóng)藥直接排放至環(huán)境中，如除草劑2，4-滴(2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid, 2, 4-D)、殺蟲(chóng)劑毒死蝶(Chlorpyrifos, CHI)及真菌劑五氯苯酹(Pentachlorophenol,PCP)。而多數(shù)有機(jī)氯農(nóng)藥具有較強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾作用。此類農(nóng)藥一旦進(jìn)入環(huán)境就會(huì)通 過(guò)多種暴露途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，富集于生物體的脂肪組織內(nèi)進(jìn)而危害人和動(dòng)物的生殖健康。目前，環(huán)境激素污染物的分析方法主要分為以GC-MS、HPLC與LC-MS技術(shù)為代表的儀器分析方法以及基于抗原抗體反應(yīng)的免疫分析方法，這些常規(guī)的殘留分析方法通常操作程序復(fù)雜，效率較低，分析成本較高，不利于推廣使用，難以適應(yīng)大量樣本和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求?；诃h(huán)境激素污染物的危害性、代表性及目前的研究熱點(diǎn)，本發(fā)明涉及一種除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)檢測(cè)卡及其制備方法。本發(fā)明的檢測(cè)卡具有簡(jiǎn)便快捷、易于操作、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，并且能同時(shí)檢測(cè)水樣中這兩種環(huán)境激素污染物質(zhì)，產(chǎn)生了良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能同時(shí)檢測(cè)水樣中除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHI的檢測(cè)卡，適合進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)且選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、簡(jiǎn)單方便、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)膠體金檢測(cè)卡，由包被了 2，4_D單克隆抗體、CHI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物的膠體金結(jié)合墊、包被了 2，4-D蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、CHI蛋白質(zhì)偶聯(lián)物和兔抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、樣品墊、吸水墊、PVC背襯及塑料模具等組成，在PVC背襯的一端依次粘附樣品墊、結(jié)合墊，中間黏貼硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。本發(fā)明的除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)膠體金檢測(cè)卡的制備方法，是由以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個(gè),加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br>
(2)抗體的預(yù)處理將要標(biāo)記的2，4-D或CHI單克隆抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS將要標(biāo)記的2，4-D或CHI單克隆抗體稀釋成I mg/mL,過(guò)O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標(biāo)記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg 2，4_D或CHI單克隆抗體的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ；金標(biāo)抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體或CHI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物依次用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金膜；
(5)包被膜制備將兔抗鼠Ig G抗體稀釋成Img/mL、2, 4-D抗原稀釋成O. 3 mg/mL和CHI抗原稀釋成O. 5 mg/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37 °C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測(cè)卡的組裝PVC背襯自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度長(zhǎng)條，再將試紙條安裝在長(zhǎng)條扁平殼狀的檢測(cè)卡外殼中。所述步驟(3)中的金標(biāo)抗體稀釋液由5 g小牛血清蛋白(BSA) ,10 g鹿糖,加100mL 0.01 mol/L PBS溶液溶解配制而成，過(guò)O. 22 濾膜，現(xiàn)配現(xiàn)用；金標(biāo)抗體洗滌緩沖液是由 10 g 小牛血清蛋白(BSA)和 I g PEG-20000，用 0.01 mol/L PBS ρΗ7· 4 定容至 100 mL所得；
所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白(BSA)和0. 8 g氯化鈉(NaCl),用含有 0. 5%TRIT0N-100 的 0. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL ；
本發(fā)明可有效用于同時(shí)測(cè)定水樣中除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHI 二種環(huán)境激素污染物質(zhì)，方法簡(jiǎn)單，方便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。
圖1為本發(fā)明除草劑2，4-D-殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)檢測(cè)卡的結(jié)構(gòu)圖圖中1.加樣孔2.2，4-D檢測(cè)線3. CHI檢測(cè)線4.質(zhì)控線5.檢測(cè)孔6.試紙條；
圖2為本發(fā)明除草劑2，4-D-殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)檢測(cè)卡的試紙條的剖視結(jié)構(gòu)圖，圖中7.檢測(cè)卡外殼8.樣品墊9.膠體金結(jié)合墊10. PVC背襯11.硝酸纖維素膜。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
圖1為本發(fā)明除草劑2，4-D-殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)檢測(cè)卡的結(jié)構(gòu)圖、圖2為本發(fā)明除草劑2，4-D-殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)檢測(cè)卡的試紙條的剖視結(jié)構(gòu)圖，圖中10為PVC背襯；8為樣品墊；9為膠體金結(jié)合墊，該膠體金結(jié)合墊上包被了 2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體膠體金標(biāo)記物；11為包被膜，即硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜上包被了 2，4-D蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、CHI蛋白質(zhì)偶聯(lián)物和兔抗鼠IgG。在PVC背襯10的一端上(樣品加樣端)粘附樣品墊8、膠體金結(jié)合墊9，樣品墊8搭接在膠體金結(jié)合墊9上。在PVC背襯10的中間粘附硝酸纖維素膜11。在硝酸纖維素膜11上設(shè)置有2，4_D蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測(cè)線2、CHI蛋白質(zhì)偶聯(lián)物檢測(cè)線3和兔抗鼠IgG質(zhì)控線4。在PVC背襯10的另一端粘附吸水墊12。硝酸纖維素膜11的一端與膠體金結(jié)合墊9略交叉，另一端與吸水墊12略交叉。該試紙條6可裝入有塑料模具制成的檢測(cè)卡外殼7中，在檢測(cè)卡外殼7的上蓋上設(shè)有加樣孔I和檢測(cè)孔5，樣品墊8正對(duì)加樣孔I，硝酸纖維素膜11正對(duì)檢測(cè)孔5。實(shí)施例2
除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHI 二聯(lián)膠體金檢測(cè)卡制備，是由以下步驟具體實(shí)現(xiàn)
(1)膠體金溶液制備取IL三角燒瓶I個(gè),加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl4 · 3H20) 5 mL，配制成500 mL O. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7 · 2H20)溶液5_7 mL,繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?br>
(2)抗體的預(yù)處理將要標(biāo)記的2，4-D或CHI單克隆抗體在1000r/min, 4°C條件下，離心20 min,取上清,用O. 01 mol/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用O. 01 mol/L PBS將要標(biāo)記的2，4-D或CHI單克隆抗體稀釋成I mg/mL,過(guò)O. 22 Mm濾膜；
(3)膠體金標(biāo)記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40mL，用0.25 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌,逐滴加入4 mL含O. 3 mg 2，4_D或CHI單克隆抗體的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ；金標(biāo)抗體溶液常溫低速(1500 r/min)離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體或CHI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物；
(4)膠體金膜的制備將步驟(3)2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物依次用劃膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金膜；
(5)包被膜制備將兔抗鼠IgG抗體稀釋成Img/mL、2, 4-D抗原稀釋成O. 3 mg/mL和CHI抗原稀釋成O. 5 mg/mL，用劃膜儀依次以I PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37 °C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干；
(6)樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干；
(7)檢測(cè)卡的組裝PVC背襯自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度長(zhǎng)條，再將試紙條安裝在長(zhǎng)條扁平殼狀的檢測(cè)卡外殼中。實(shí)施例3 最低檢出限量試驗(yàn)。分別配制標(biāo)準(zhǔn)的除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHI標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度是0、5 ng/mLUOng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL ;滴加2滴樣品到檢測(cè)卡加樣孔上,5 min后觀察檢測(cè)線T和質(zhì)控線C的顯色結(jié)果。經(jīng)多次檢驗(yàn)，2，4-D和CHI的檢出率達(dá)99%以上，最低檢出限量少于15ng/mLο
權(quán)利要求
1.除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHIニ聯(lián)膠體金檢測(cè)卡，其特征在于按照下述步驟制備得到 膠體金溶液制備取I L三角燒瓶I個(gè)，加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸HAuCl4 3H20 5 mL，配制成500 mL 0. 01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉Na3C6H5O7 2H20溶液5_7 mL,繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯淖霞t色時(shí)，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫? 抗體的預(yù)處理將要標(biāo)記的2，4-D或CHI單克隆抗體在1000 r/min, 4°C條件下,離心20 min，取上清，用0. 01 mo I/L PBS稀釋成I mg/mL ;或者用0. 01 mo I/L PBS將要標(biāo)記的2，4-D或CHI單克隆抗體稀釋成I mg/mL，過(guò)0. 22 Mm濾膜； 膠體金標(biāo)記物的制備取步驟(I)中的膠體金溶液40 mL，用0. 25 mo I/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液PH至8. 5，電磁攪拌器250 r/min攪拌，逐滴加入4 mL含0. 3 mg 2，4-D或CHI單克隆抗體的蛋白溶液，反應(yīng)10 min ;逐滴加入4 mL 10% BSA,繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min ;金標(biāo)抗體溶液常溫1500 r/min離心20 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C, 12000 r/min離心20 min,棄上清,收集沉淀,將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至I mL,制備成2，4-D單克隆抗體或CHI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物； 膠體金膜的制備將步驟(3) 2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物依次用劃膜儀以5 ML/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3h，制成含2，4-D單克隆抗體和CHI單克隆抗體的膠體金膜； 包被膜制備將兔抗鼠IgG抗體稀釋成I mg/mL、2，4-D抗原稀釋成0. 3 mg/mL和CHI抗原稀釋成0.5 mg/mL，用劃膜儀依次以I ML/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干或者37°C烘干； 樣品墊前處理將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的條件下，室溫自然晾干； 檢測(cè)卡的組裝PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水墊，組裝成試紙條，切割成一定寬度長(zhǎng)條，再將試紙條安裝在長(zhǎng)條扁平殼狀的檢測(cè)卡外殼中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的除草劑2，4-D和殺蟲(chóng)劑CHIニ聯(lián)膠體金檢測(cè)卡，其特征在于所述步驟(3)中的金標(biāo)抗體稀釋液由5 g小牛血清蛋白，10 g鹿糖,加100 mL 0. 01 mol/LPBS溶液溶解配制而成，過(guò)0.22 Mffl濾膜，現(xiàn)配現(xiàn)用；金標(biāo)抗體洗滌緩沖液是由10 g小牛血清蛋白和 I g PEG-20000,M 0. 01 mol/L PBS pH7. 4 定容至 100 mL 所得； 所述步驟(6)中的樣品墊處理液是由I g小牛血清蛋白和0.8 g氯化鈉，用含有·0.5%TRIT0N-100 的 0. 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
全文摘要
本發(fā)明除草劑2,4-D-殺蟲(chóng)劑CHI二聯(lián)檢測(cè)卡及其制備方法，涉及環(huán)境激素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的檢測(cè)卡外殼中有試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含2,4-D單克隆抗體、CHI單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設(shè)有二條檢測(cè)線T線和一條質(zhì)控線C線，檢測(cè)線T線依次包被有2,4-D蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、CHI蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，質(zhì)控線C線包被有兔抗鼠IgG抗體。本發(fā)明可同時(shí)檢測(cè)出水樣中除草劑2,4-D和殺蟲(chóng)劑CHI，方法簡(jiǎn)單、方便、快捷，結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N33/577GK103048455SQ20121036676
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者杜道林, 洪霞, 張禎, 薛永來(lái) 申請(qǐng)人:江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司