專利名稱：使用來自分化細(xì)胞的供體細(xì)胞或細(xì)胞核克隆豬以及多能豬的生成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括將由分化豬細(xì)胞衍生的細(xì)胞核移植到去核豬卵母細(xì)胞或卵裂球中的克隆操作。細(xì)胞核被重新編程以指導(dǎo)克隆胚胎的發(fā)育，然后可將其移植到受體雌畜中以生成胎兒和子代，或者用于生成多能培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(CICM)?？寺∨咛ミ€可聯(lián)合受精胚胎以生成嵌合胚胎、胎兒、和/或子代。
背景技術(shù)：
將有蹄類內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)細(xì)胞用于核移植的應(yīng)用也已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)。例如，Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994，公開了將經(jīng)裂解供體細(xì)胞顯微注射到去核成熟卵母細(xì)胞中進(jìn)行牛ICM核移植。Collas等人公開了將胚胎在體外培養(yǎng)7天以生成15個(gè)胚泡，在將其移植到牛受體中后導(dǎo)致4次懷孕和2次出生。同樣，Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994，公開了將牛ICM細(xì)胞在核移植操作中作為供體細(xì)胞核用于生成胚泡，在將其移植到牛受體中后生成7個(gè)活的子代。此外，Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906143-6147，1993，公開了將細(xì)胞核由短期體外培養(yǎng)的牛ICM細(xì)胞移植到去核成熟卵母細(xì)胞中從而生成小牛。
還已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在將細(xì)胞核移植到培養(yǎng)胚盤細(xì)胞中后生成活的小羊(Campbell等人，Nature，38064-68，1996)。還有，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了牛多能胚胎細(xì)胞在核移植和生成嵌合胎兒中的應(yīng)用(Stice等人，Biol.Reprod.，54100-110，1996；Collas等人，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994)。Collas等人證明了顆粒細(xì)胞(成熟細(xì)胞)可用于?？寺〔僮鞫膳咛?。然而，沒有證明發(fā)育經(jīng)過早期胚胎階段(胚泡階段)。同樣，顆粒細(xì)胞不容易培養(yǎng)，而且只能由雌畜獲得。Collas等人沒有嘗試在培養(yǎng)中增殖顆粒細(xì)胞或者遺傳修飾那些細(xì)胞。Wilmut等人，Nature，365810-813，1997，生成了由胎兒成纖維細(xì)胞衍生的核移植綿羊子代，并由衍生自成年綿羊的一個(gè)細(xì)胞生成了一個(gè)子代。
與其它物種的細(xì)胞相比，豬細(xì)胞的克隆更困難。下表例示了這種現(xiàn)象
生成轉(zhuǎn)基因豬的領(lǐng)域也存在問題。通過目前的方法，將異源DNA導(dǎo)入早期胚胎或在胎兒中分化成各種細(xì)胞類型的胚胎細(xì)胞系，并最終發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然而，生成一只轉(zhuǎn)基因動(dòng)物需要許多早期胚胎，因此這種操作是非常低效的。同樣，在經(jīng)歷將胚胎置于代孕雌畜中的時(shí)間和費(fèi)用之前，沒有簡單且有效的方法用于選擇轉(zhuǎn)基因胚胎。另外，就早期胚胎轉(zhuǎn)基因操作而言，不容易實(shí)現(xiàn)基因打靶技術(shù)。
小鼠胚胎干細(xì)胞使得研究人員能夠選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并進(jìn)行基因打靶。這能夠比其它轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)更多的遺傳工程。然而，必須將胚胎干細(xì)胞系和其它胚胎細(xì)胞系維持在未分化狀態(tài)，這需要飼養(yǎng)層和/或在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子。即使遵循這些防范措施，這些細(xì)胞也常常經(jīng)歷自發(fā)分化，從而不能通過目前可利用的方法用于生成轉(zhuǎn)基因子代。同樣，有些胚胎細(xì)胞系必須在不利于基因打靶操作的方式中進(jìn)行增殖。
用于在體外由早期植入前小鼠胚胎衍生胚胎干(ES)細(xì)胞系的方法是眾所周知的(參閱如Evans等人，Nature，29154-156，1981；Martin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，787634-7638，1981)。倘若存在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(Evans等人，Id.)或分化抑制源(Smith等人，Dev.Biol.，1211-9，1987)，ES細(xì)胞可以未分化狀態(tài)進(jìn)行傳代。
先前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了ES細(xì)胞具有許多應(yīng)用。例如，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了ES細(xì)胞可作為體外分化模型，尤其是用于研究涉及早期發(fā)育調(diào)控的基因。在導(dǎo)入植入前小鼠胚胎后，小鼠ES細(xì)胞可生成種系嵌合體，由此證明了它們的多能性(Bradley等人，Nature，309255-256，1984)。
考慮到它們將基因組轉(zhuǎn)移給下一代的能力，通過使用含或不含期望遺傳修飾的ES細(xì)胞，ES細(xì)胞在家畜動(dòng)物種系操作中具有潛在效用。此外，在家畜動(dòng)物(如有蹄類)的情況中，來自像植入前家畜胚胎的細(xì)胞核支持去核卵母細(xì)胞發(fā)育至分娩期(Smith等人，Biol.Reprod.，401027-1035，1989；Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994)。這與來自超過8細(xì)胞階段的小鼠胚胎的細(xì)胞核相反，據(jù)報(bào)導(dǎo)它在移植后不支持去核卵母細(xì)胞的發(fā)育(Cheong等人，Biol.Reprod.，48958，1993)。因此，來自家畜動(dòng)物的ES細(xì)胞非常有價(jià)值，因?yàn)樗鼈兛梢詾楹艘浦膊僮魈峁┤芄w細(xì)胞核的潛在來源(經(jīng)過或未經(jīng)遺傳修飾或其它)。
有些研究小組已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了據(jù)說多能的胚胎細(xì)胞系的分離。例如，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，43255-260，1991，報(bào)導(dǎo)了由豬和綿羊胚泡建立據(jù)說穩(wěn)定且多能的細(xì)胞系，它們展示的一些形態(tài)學(xué)和生長特征與通過免疫手術(shù)由綿羊胚泡分離的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的原代培養(yǎng)細(xì)胞相似。同樣，Notarianni等人，J.Reprod.Fert.Suppl.，4151-56，1990，公開了來自豬胚泡的推定多能的胚胎細(xì)胞系在培養(yǎng)中的維持和分化。Gerfen等人，Anim.Biotech.，6(1)1-14，1995，公開了由豬胚泡分離胚胎細(xì)胞系。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層中可以穩(wěn)定維持這些細(xì)胞而不使用條件培養(yǎng)基，而且據(jù)報(bào)導(dǎo)在培養(yǎng)過程中分化成幾種不同的細(xì)胞類型。
此外，Saito等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，201134-141，1992，報(bào)導(dǎo)了存活3代但在第4代后喪失的培養(yǎng)牛胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞系。Handyside等人，Roux’s Arch.Dev.Biol.，196185-190，1987，公開了將通過免疫手術(shù)分離的綿羊胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在能夠分離由小鼠ICM衍生的小鼠ES細(xì)胞系的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。Handyside等人報(bào)導(dǎo)了在這種條件下，綿羊ICM貼壁、擴(kuò)展、并發(fā)展ES細(xì)胞樣細(xì)胞和內(nèi)胚層樣細(xì)胞區(qū)域，但是在延長培養(yǎng)后只有內(nèi)胚層樣細(xì)胞是明顯的。
最近，Cherny等人，Theriogenology，41175，1994，報(bào)導(dǎo)了在長期培養(yǎng)中維持的據(jù)說多能的牛原始生殖細(xì)胞衍生細(xì)胞系。這些細(xì)胞在培養(yǎng)大約7天后生成ES樣集落，堿性磷酸酶(AP)染色陽性，展示形成胚狀體的能力，并自發(fā)分化成至少兩種不同的細(xì)胞類型。據(jù)報(bào)導(dǎo)這些細(xì)胞還表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子OCT4、OCT6、和HES1的mRNA，這是認(rèn)為唯獨(dú)由ES細(xì)胞表達(dá)的同源異型框基因模式。
同樣在最近，Campbell等人，Nature，38064-68，1996，報(bào)導(dǎo)了在對培養(yǎng)胚盤(ED)細(xì)胞(來自在促進(jìn)在小鼠中分離ES細(xì)胞系的條件下培養(yǎng)9天的綿羊胚胎)進(jìn)行核移植之后生成了活的小羊。作者得出結(jié)論，來自第9天的綿羊胚胎的ED細(xì)胞在核移植中是全能的，而且全能性在培養(yǎng)中得到維持。
Van Stekelenburg-Hamers等人，Mol.Reprod.Dev.，40444-454，1995，報(bào)導(dǎo)了自牛胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞分離和鑒定據(jù)說永久的細(xì)胞系。作者在不同條件下由第8或9天的牛胚泡分離并培養(yǎng)ICM，以確定哪種飼養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)培養(yǎng)基對支持牛ICM細(xì)胞的貼壁和擴(kuò)展最有效。他們得出結(jié)論，培養(yǎng)ICM細(xì)胞的貼壁和擴(kuò)展通過STO(小鼠成纖維細(xì)胞)飼養(yǎng)細(xì)胞(代替牛子宮上皮細(xì)胞)的使用和通過在培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加經(jīng)木炭吸收過的血清(而非普通血清)而得到增強(qiáng)。然而，VanStekelenburg等人報(bào)導(dǎo)了他們的細(xì)胞系更像上皮細(xì)胞而非多能ICM細(xì)胞。
Smith等人，WO 94/24274，發(fā)表于1994年10月27日；Evans等人，WO 90/03432，發(fā)表于1990年4月5日；和Wheeler等人，WO 94/26889，發(fā)表于1994年11月24日，報(bào)導(dǎo)了據(jù)說可用于獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的動(dòng)物干細(xì)胞的分離、選擇、和增殖。Evans等人還報(bào)導(dǎo)了由豬和牛物種衍生據(jù)說多能的胚胎干細(xì)胞，據(jù)說可用于生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。另外，Wheeler等人，WO 94/26884，發(fā)表于1994年11月24日，公開了據(jù)說可用于生成嵌合和轉(zhuǎn)基因有蹄類的胚胎干細(xì)胞。
因而，根據(jù)上文，由于ES細(xì)胞系在例如生成克隆或轉(zhuǎn)基因胚胎和核移植中的潛在應(yīng)用，顯然許多小組已經(jīng)試圖生成ES細(xì)胞系。
因此，不管文獻(xiàn)中先前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了什么，仍然需要使用培養(yǎng)分化細(xì)胞作為供體細(xì)胞核來克隆豬的改進(jìn)方法。
發(fā)明目的和概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供使用分化細(xì)胞或由其衍生的細(xì)胞核作為供體細(xì)胞或細(xì)胞核通過核移植來生成克隆豬的新的且改進(jìn)的方法。優(yōu)選的是，這些分化細(xì)胞將包括處于G1、G2、或M期的活潑分裂中即非休眠(增殖中)的細(xì)胞，其任選可經(jīng)過遺傳修飾。
本發(fā)明的一個(gè)更具體目的是提供用于克隆豬的新方法，包括將分化豬細(xì)胞或其細(xì)胞核移植到去核豬卵母細(xì)胞或卵裂球中。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于增殖具有經(jīng)證明的遺傳優(yōu)勢或其它期望性狀的成年豬的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供用于生成遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬(即NT單位、胎兒、子代)的改進(jìn)方法。本發(fā)明還提供了遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬，包括由這種方法生成的那些豬。
本發(fā)明的一個(gè)更具體目的是，提供通過在將分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核用于形成NT單位之前在該分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去、或修飾期望的DNA來生成遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的方法。本發(fā)明還提供了由這種方法生成的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于生成豬CICM細(xì)胞的新方法，包括將分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核移植到去核豬卵母細(xì)胞或卵裂球中，然后使用產(chǎn)生的NT單位生成多能CICM細(xì)胞。本發(fā)明還提供了由這種方法生成的多能豬CICM細(xì)胞和細(xì)胞系。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將這種豬CICM細(xì)胞用于治療或診斷。
本發(fā)明的一個(gè)具體目的是將這種豬CICM細(xì)胞用于治療或診斷在治療上或在診斷上將受益于細(xì)胞、組織、或器官移植的任何疾病。CICM細(xì)胞可用于相同物種或交叉物種，如用于人類治療。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將由豬NT單位、胎兒、或子代衍生的細(xì)胞或組織用于治療或診斷在治療上或在診斷上將受益于細(xì)胞、組織、或器官移植的任何疾病。這類疾病和損傷包括帕金森氏病、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉營養(yǎng)不良癥、糖尿病、肝病、心臟病、軟骨代換、燒傷、血管疾病、泌尿道疾病，以及用于治療免疫缺陷、骨髓移植、癌癥、其它疾病。可使用相同物種或交叉物種的組織。
本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是將由依照本發(fā)明生成的豬NT單位、胎兒、或子代衍生的細(xì)胞或組織或者豬CICM細(xì)胞用于生成分化細(xì)胞、組織、或器官。
本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是將由依照本發(fā)明生成的豬NT單位、胎兒、或子代衍生的細(xì)胞或組織或者豬CICM細(xì)胞在體外用于例如細(xì)胞分化研究和化驗(yàn)用途(如用于藥物研究)。例如，可將豬CICM導(dǎo)入SCID小鼠。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將得自由豬NT單位、胎兒、或子代衍生的組織產(chǎn)生的細(xì)胞、組織、或器官或者豬CICM細(xì)胞用于提供移植療法的改進(jìn)方法。這種療法包括例如治療下列疾病和損傷帕金森氏病、亨廷頓氏病、阿爾茨海默氏病、ALS、脊髓損傷、多發(fā)性硬化癥、肌肉營養(yǎng)不良癥、糖尿病、肝病、心臟病、軟骨代換、燒傷、血管疾病、泌尿道疾病，以及用于治療免疫缺陷、骨髓移植、癌癥、其它疾病。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由通過在將分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核用于形成NT單位之前在該分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去、或修飾期望的DNA序列而生成的豬NT單位、胎兒、或子代衍生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因組織或者豬CICM細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將由依照本發(fā)明生成的豬NT單位、胎兒、或子代衍生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因組織或者豬CICM細(xì)胞用于基因療法，特別是用于治療和/或預(yù)防上文確定的疾病和損傷。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將由依照本發(fā)明生成的豬NT單位、胎兒、或子代衍生的組織或者豬CICM細(xì)胞，或者由依照本發(fā)明生成的豬NT單位、胎兒、或子代衍生的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因組織或者豬CICM細(xì)胞作為細(xì)胞核供體用于核移植。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是將依照本發(fā)明生成的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬子代用于生產(chǎn)制藥學(xué)上重要的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明在一個(gè)方面提供了用于克隆豬(如胚胎、胎兒、子代)的方法，包括a)在適合于形成核移植(NT)單位的條件下，將期望的分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核嵌入任選去核的豬卵母細(xì)胞或卵裂球中；b)若受體豬卵母細(xì)胞或卵裂球先前未去核，則由所述豬卵母細(xì)胞或卵裂球除去內(nèi)源細(xì)胞核；c)激活產(chǎn)生的NT單位；并d)將所述培養(yǎng)NT單位移植到宿主豬中，使之發(fā)育成胎兒。
任選地，培養(yǎng)激活的核移植單位直至超過2細(xì)胞的發(fā)育階段。培養(yǎng)培養(yǎng)基將包含促進(jìn)NT胚胎發(fā)育的已知成分，如激素、鹽類，還可任選在抑制凋亡的化合物存在下進(jìn)行培養(yǎng)，如caspase抑制劑。然而，這不是必需的，因?yàn)槭聦?shí)上可以在NT激活后立即移植一個(gè)細(xì)胞的NT胚胎而完成胎兒發(fā)育。
此外，宿主豬將任選包含“輔助胚胎”，如普通豬胚胎、單性胚胎、或四倍體胚胎，以促進(jìn)克隆胚胎的發(fā)育。優(yōu)選的是，輔助胚胎的數(shù)目是2-大約100個(gè)，優(yōu)選2-50個(gè)，更優(yōu)選2-10個(gè)。
胎兒的細(xì)胞、組織、和/或器官將可有利的用于細(xì)胞、組織、和/或器官移植領(lǐng)域，或者用于生成期望的基因型。
本發(fā)明還包括用于克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的方法，由此在將分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核嵌入任選去核的卵母細(xì)胞或卵裂球中之前在分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去、或修飾期望的DNA序列。通過這種方法生成的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬將有利的用于細(xì)胞、組織、和/或器官移植領(lǐng)域，用于生成期望的基因型，和用于生產(chǎn)藥用蛋白質(zhì)。
若將克隆的胚胎、胎兒、或子代用于生成用于移植的細(xì)胞、組織、或器官，則還希望導(dǎo)入一種或多種遺傳修飾以抑制排斥的風(fēng)險(xiǎn)。例如，已知特定的碳水化合物表位涉及排斥應(yīng)答，即血管內(nèi)皮上的Galα1-Gal。因此，可能有利的是敲除編碼這些表位的基因，或者用人類蛋白質(zhì)中存在的其它碳水化合物表位(“競爭性糖基化”)取代這些表位(如掩蔽)。具體而言，一種選擇是導(dǎo)入人類組織學(xué)血液O(H)抗原(90％的人不引發(fā)針對它的抗體)以刪除90％的αGal表達(dá)?；蛘?，可通過導(dǎo)入α半乳糖苷酶的cDNA，并優(yōu)選在可調(diào)控或組成性強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，從而在體內(nèi)酶促消除αGal表位。還有另一個(gè)選擇是消除半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，如通過同源重組。同樣，由于這將導(dǎo)入新的碳水化合物表位，因此可能希望同樣通過敲除或酶促消除這些表位。
同樣，由于已知主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I型抗原引發(fā)免疫應(yīng)答，因此可能希望消除涉及這種表達(dá)的基因的表達(dá)，如β2-微球蛋白(形成I型分子中裝配和表達(dá)必需部分的肽)、蛋白酶體亞基LMP-2和LMP-7、和/或肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAP-1和/或TAP-2(TAP-1和TAP-2在肽片段開始它們細(xì)胞表面之旅時(shí)跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)這些肽片段)。
還有，上文所述的供體組織中抑制性細(xì)胞因子(諸如IL-4、可溶性CTLA-4、CTLA4-Ig、抗CD40、抗CD40-L(CD154)、受體-配體對的其它抑制劑、或Fas配體)局部表達(dá)的生理性下調(diào)可抑制排斥，例如通過誘導(dǎo)對異種移植物的耐受性。同樣，通過增強(qiáng)保護(hù)性基因的表達(dá)以抑制與內(nèi)皮細(xì)胞激活有關(guān)的促炎藥療法和保護(hù)供體細(xì)胞、組織、或器官免于凋亡，由此預(yù)防或抑制排斥。例如，應(yīng)激反應(yīng)基因血紅素加氧酶(HO-1)的表達(dá)可加強(qiáng)異種移植物的存活。同樣，可過度表達(dá)抗凋亡基因(如抑制轉(zhuǎn)錄激活的基因)以增強(qiáng)異種移植物的存活。已經(jīng)克隆了抑制凋亡的許多基因并測序。
還有，可消除內(nèi)源豬逆轉(zhuǎn)錄病毒以預(yù)防這些序列插入宿主基因組的風(fēng)險(xiǎn)。
同樣，由于補(bǔ)體激活是超急性排斥的關(guān)鍵媒介，因此可通過遺傳修飾來抑制這種途徑。具體而言，已知補(bǔ)體級聯(lián)受到一組內(nèi)皮蛋白質(zhì)的緊密調(diào)控，包括衰變加速因子(DAF，CD55)、膜輔助因子蛋白(MCP，CD46)、和CD59，它們通常在補(bǔ)體級聯(lián)的多個(gè)點(diǎn)擔(dān)當(dāng)抑制劑。這些蛋白質(zhì)具有限制性活性，即它們只作用于同源(相同物種)靶分子。因此，可能有利的是在豬組織的血管內(nèi)皮上導(dǎo)入編碼人類補(bǔ)體抑制蛋白質(zhì)(如DAF、MCP)的基因。同樣，可能有利的是聯(lián)合這些遺傳方法以獲得最佳結(jié)果，即生成引發(fā)排斥應(yīng)答能力很低的細(xì)胞、組織、或器官。
還有，可以在移植到受體中之前在體外在存在供體細(xì)胞和其它試劑(如CTLA4-Ig、免疫毒素、抗CD40-L)的情況中培養(yǎng)細(xì)胞、組織、或器官，從而在移植前誘導(dǎo)耐受性。
當(dāng)然，可能仍然必需在移植后施用抗排斥試劑，包括例如環(huán)孢菌素、糖皮質(zhì)激素、FK-506、雷帕霉素、硫唑嘌呤、及其衍生物。
本發(fā)明還提供了依照上述方法獲得的豬及其子代。
本發(fā)明在另一方面提供了用于生成豬CICM(多能)細(xì)胞的方法，包括a)在適合于形成核移植(NT)單位的條件下，將期望的分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核嵌入任選去核的豬卵母細(xì)胞或卵裂球中；b)若先前未去核，則任選由卵母細(xì)胞或卵裂球除去內(nèi)源細(xì)胞核；c)激活產(chǎn)生的NT單位；并d)培養(yǎng)得自所述培養(yǎng)NT單位的細(xì)胞以獲得豬CICM細(xì)胞。
任選的是，培養(yǎng)激活的核移植單位直至超過2細(xì)胞的發(fā)育階段。產(chǎn)生的豬CICM細(xì)胞可有利的用于細(xì)胞、組織、和器官移植領(lǐng)域。
隨著本發(fā)明的上述和其它目的、優(yōu)勢、和特征將在下文中變得清晰，通過參考下文本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述和所附權(quán)利要求，可以更清除的理解本發(fā)明的本質(zhì)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過核移植來克隆豬的改進(jìn)操作。在本申請中，核移植或NT可互換使用。
依照本發(fā)明，將由分化豬細(xì)胞衍生的細(xì)胞核移植到去核豬卵母細(xì)胞或卵裂球中。細(xì)胞核被重新編程以指導(dǎo)克隆胚胎的發(fā)育，然后可將其移植到受體雌畜中以生成胎兒和子代，或者用于生成CICM細(xì)胞?？寺∨咛ミ€可聯(lián)合受精胚胎使用，以生成嵌合胚胎、胎兒、和/或子代。
本領(lǐng)域現(xiàn)有方法已經(jīng)在克隆操作中使用了胚胎細(xì)胞類型。這包括Campbell等人(Nature，38064-68，1996)和Stice等人(Biol.Reprod.，54100-110，1996)的工作。在這兩項(xiàng)研究中，胚胎細(xì)胞系是由懷孕少于10天的胚胎衍生的。在這兩項(xiàng)研究中，在飼養(yǎng)層上維持細(xì)胞以防止將要用于克隆操作的供體細(xì)胞的明顯分化。本發(fā)明使用分化細(xì)胞。
據(jù)說，來自綿羊的成熟細(xì)胞和胎兒成纖維細(xì)胞已經(jīng)用于生成綿羊子代(Wilmut等人，1997)。然而，研究顯示，豬的克隆比綿羊克隆更難。事實(shí)上，在研究的哺乳動(dòng)物物種中，綿羊的克隆顯得最容易，而豬的克隆顯得最困難。因此，依照本發(fā)明使用分化細(xì)胞類型(優(yōu)選活潑分裂中的非休眠細(xì)胞，即處于G1、G2、或M期細(xì)胞)實(shí)現(xiàn)的豬的成功克隆是意料外的成果。
因此，依照本發(fā)明，對豬的優(yōu)越基因型進(jìn)行增殖是可能的。這將能夠增殖具有經(jīng)證明的遺傳優(yōu)越性或其它期望性狀的成年豬。豬的遺傳進(jìn)步將得到加速。通過本發(fā)明，潛在的可收獲數(shù)以十億計(jì)的胎兒或成年豬細(xì)胞，并用于克隆操作。這將在短期內(nèi)生成許多相同子代。
本發(fā)明還能夠通過使用可克隆增殖的細(xì)胞來源來簡化轉(zhuǎn)基因操作。這不需要將細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)。因此，更容易實(shí)現(xiàn)遺傳修飾，包括隨機(jī)整合和基因打靶。同樣，通過使核移植聯(lián)合在體外修飾并選擇這些細(xì)胞的能力，該操作比先前的轉(zhuǎn)基因胚胎技術(shù)更有效。依照本發(fā)明，這些細(xì)胞可克隆增殖而無需細(xì)胞因子、條件培養(yǎng)基、和/或飼養(yǎng)層，這進(jìn)一步簡化和便于轉(zhuǎn)基因操作。在依照本發(fā)明將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于克隆操作時(shí)，能生成可發(fā)育成胎兒和子代的轉(zhuǎn)基因豬胚胎。同樣，這些轉(zhuǎn)基因克隆胚胎可用于生成CICM細(xì)胞系或其它胚胎細(xì)胞系。因此，本發(fā)明不需要在體外衍生和維持有益于遺傳工程技術(shù)的未分化細(xì)胞系。
在特別適用于復(fù)雜遺傳修飾的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將遺傳修飾期望的分化細(xì)胞，優(yōu)選組織培養(yǎng)中的細(xì)胞，將這些遺傳修飾細(xì)胞用于生成克隆胎兒或動(dòng)物，然后由克隆胎兒或動(dòng)物衍生分化細(xì)胞，進(jìn)行另外的遺傳修飾，并將產(chǎn)生的二次遺傳修飾細(xì)胞在克隆中用作細(xì)胞或細(xì)胞核供體。這個(gè)過程(發(fā)明人稱為“再克隆”)可用于生成需要大量時(shí)間的復(fù)雜遺傳修飾。本質(zhì)上，通過在不同步驟進(jìn)行這種遺傳修飾及隨后的克隆，有可能生成期望遺傳修飾而沒有在進(jìn)行所有期望遺傳修飾前細(xì)胞潛在老化的問題。理論上，可根據(jù)需要數(shù)次重復(fù)這個(gè)過程。
可在體外無限維持依照本發(fā)明生成的轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞，由此可為稍后生成期望的分化細(xì)胞類型提供未分化多能細(xì)胞的無限供應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將依照共同轉(zhuǎn)讓的美國專利號5,905,042(完整收入本文作為參考)中公開的方法，將這些CICM維持于未分化狀態(tài)。
本發(fā)明還可用于生成克隆豬胎兒、子代、或CICM細(xì)胞，它們可用于例如細(xì)胞、組織、和器官移植。通過由豬采集胎兒或成熟細(xì)胞，并將其用于克隆操作，可以在它們發(fā)育經(jīng)過器官形成時(shí)由克隆胎兒獲得多種細(xì)胞、組織、可能還有器官。也可以由克隆子代分離細(xì)胞、組織和器官。這種方法可以為許多醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)治療(包括細(xì)胞和基因療法)提供“材料”來源。若將細(xì)胞移植回動(dòng)物(該細(xì)胞是由該動(dòng)物衍生的)，則避免了免疫排斥。同樣，因?yàn)榭梢杂蛇@些克隆分離許多細(xì)胞類型，所以可使用其它方法學(xué)(諸如造血嵌合狀態(tài))在相同物種以及物種間的動(dòng)物中避免免疫排斥。
因此，本發(fā)明在一個(gè)方面提供了用于克隆豬的方法。一般而言，將通過包括下列步驟的核移植方法生成豬a)獲得期望的分化豬細(xì)胞作為供體細(xì)胞核或供體細(xì)胞的來源；b)獲得豬卵母細(xì)胞或卵裂球；c)任選將所述卵母細(xì)胞或卵裂球去核；d)例如通過融合或注射，將期望的分化細(xì)胞或細(xì)胞核移植到任選去核的卵母細(xì)胞或卵裂球中，以形成NT單位；e)將NT單位去核以除去內(nèi)源卵母細(xì)胞或卵裂球的細(xì)胞核(若先前未去核)；f)激活產(chǎn)生的NT單位；并g)將所述培養(yǎng)NT單位移植到宿主豬體內(nèi)，使之發(fā)育成胎兒。
任選的是，培養(yǎng)激活的核移植單位直至超過2細(xì)胞的發(fā)育階段。同樣，任選宿主豬將包含一個(gè)或多個(gè)“輔助”胚胎，如普通豬胚胎、四倍體胚胎、或單性豬胚胎，以促進(jìn)克隆胚胎的發(fā)育。
本發(fā)明還包括用于克隆遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬的方法，由此在將分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核嵌入任選去核的卵母細(xì)胞或卵裂球中之前在分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去、或修飾期望的DNA序列(可以在嵌入供體細(xì)胞或細(xì)胞核之后進(jìn)行去核)。
本發(fā)明還提供了依照上述方法獲得的克隆豬及其子代。與先前的轉(zhuǎn)基因和配種豬相反，這些克隆將包含與先前存在的用作核移植供體的分化細(xì)胞或細(xì)胞核相同的基因型。
除了上述用途以外，本發(fā)明的遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬可用于生產(chǎn)期望蛋白質(zhì)，諸如制藥學(xué)重要的蛋白質(zhì)。然后可以由轉(zhuǎn)基因豬的乳汁或其它流體或者組織分離所述期望蛋白質(zhì)?；蛘?，外源DNA序列可賦予轉(zhuǎn)基因豬以農(nóng)業(yè)有用性狀，諸如疾病抵抗力、體脂肪減少、瘦肉產(chǎn)量增加、飼料轉(zhuǎn)化改進(jìn)、或后代性別比例改變。同樣，外源DNA可編碼一種或多種抑制異源宿主(如人)排斥這些細(xì)胞的DNA。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，豬將表達(dá)一種或多種人基因，如那些編碼結(jié)構(gòu)蛋白(諸如膠原)、免疫蛋白、激素、酶、凝結(jié)因子的基因，優(yōu)選插入在豬對應(yīng)物中。這將有助于稍后的人蛋白質(zhì)回收，因?yàn)檫@將不需除去同源豬蛋白質(zhì)(如若在其中表達(dá)人因子VIII，則是豬因子VIII)。
本發(fā)明還提供了NT胎兒以及NT和嵌合子代在細(xì)胞、組織、和器官移植領(lǐng)域中的用途。
本發(fā)明在另一方面提供了用于生成豬CICM細(xì)胞的方法，包括a)在適合于形成核移植(NT)單位的條件下，將期望的分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核嵌入任選去核的豬卵母細(xì)胞或卵裂球中；b)除去內(nèi)源卵母細(xì)胞或卵裂球細(xì)胞核(若先前未去核)；c)激活產(chǎn)生的NT單位；并d)培養(yǎng)得自所述培養(yǎng)NT單位的細(xì)胞以獲得豬CICM細(xì)胞。
如上所述，優(yōu)選培養(yǎng)操作公開于美國專利號5,905,042(完整收入本文作為參考)。任選培養(yǎng)激活的核移植單位直至超過2細(xì)胞的發(fā)育階段。
豬CICM細(xì)胞可有利的用于細(xì)胞、組織、和器官移植領(lǐng)域，或者用于生成胎兒或子代，包括轉(zhuǎn)基因胎兒或子代。
在用于本文時(shí)，胎兒指在胎生動(dòng)物的子宮中已成形的未出生幼仔。在豬中，胎兒階段指妊娠后30天直至出生。哺乳動(dòng)物指由出生至死亡的成體。
任選的是，培養(yǎng)NT單位至大小為至少2-400個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選4-128個(gè)細(xì)胞，最優(yōu)選大小為至少大約50個(gè)細(xì)胞。
核移植技術(shù)在文獻(xiàn)中是已知的，且描述于發(fā)明背景中引用的許多參考文獻(xiàn)中。特別是參閱Campbell等人，Theriogenology，43181，1995；Collas等人，Mol.Repord.Dev.，38264-267，1994；Keefer等人，Biol.Reprod.，50935-939，1994；Sims等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906143-6147，1993；WO 94/26884；WO 94/24274；和WO 90/03432(完整收入本文作為參考)。同樣，美國專利號4,944,384和5,057,420描述了用于牛核移植的操作。
分化指細(xì)胞具有與周圍結(jié)構(gòu)或起源細(xì)胞不同的特征或功能。分化豬細(xì)胞指那些晚于胚胎早期的細(xì)胞。更具體的說，分化細(xì)胞是那些來自至少晚于胚盤期(牛胚胎形成第10天)的細(xì)胞。分化細(xì)胞可衍生自外胚層、中胚層、或內(nèi)胚層。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分化細(xì)胞將是活潑增殖中(非休眠)細(xì)胞，即處于G1、G2、或M期。這些細(xì)胞可由成年或胎兒豬直接獲得，或者可由體外培養(yǎng)物分離。還有，這些分化中細(xì)胞可衍生自非豬動(dòng)物，如移植了豬免疫細(xì)胞的SCID小鼠?？勺鳛楣w細(xì)胞或細(xì)胞核使用的合適分化細(xì)胞包括體細(xì)胞和生殖細(xì)胞，以及由其衍生的細(xì)胞核。
可通過眾所周知的方法來獲得豬細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明的豬細(xì)胞包括例如上皮細(xì)胞、卵丘細(xì)胞(cumulus cells)、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(B和T淋巴細(xì)胞)、紅細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核的細(xì)胞、和其它免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、和其它肌細(xì)胞等等。此外，用于核移植的豬細(xì)胞可得自不同器官，如皮膚、肺、胰、肝、胃、腸、心、生殖器官、膀胱、腎、尿道、和其它泌尿器官等等。同樣，特定分化細(xì)胞類型的干細(xì)胞可能是有用的供體細(xì)胞，如造血干細(xì)胞。這些只是合適供體細(xì)胞的范例。合適供體細(xì)胞，即可用于本發(fā)明的細(xì)胞，可得自機(jī)體的任何細(xì)胞或器官。如上所述，供體細(xì)胞意欲包括體細(xì)胞和生殖細(xì)胞二者。
例如，在生殖細(xì)胞的情況中，這將特別包括原始生殖細(xì)胞。
成纖維細(xì)胞是理想的細(xì)胞類型，因?yàn)樗鼈兛捎砂l(fā)育中胎兒和成年豬大量獲得。成纖維細(xì)胞稍有分化，因而先前認(rèn)為它是用于克隆操作的較差細(xì)胞類型。重要的是，這些細(xì)胞易于在體外增殖，倍增時(shí)間短，而且可克隆增殖，以用于基因打靶操作。再次指出，本發(fā)明是新的，因?yàn)槭褂昧朔只?xì)胞類型。本發(fā)明比較有利，因?yàn)檫@些細(xì)胞易于在體外增殖、遺傳修飾、和選擇。
用于分離卵母細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。本質(zhì)上，這將包括由豬的卵巢或生殖道分離卵母細(xì)胞。容易獲得的豬卵母細(xì)胞來源是屠宰場材料。
為了諸如遺傳工程、核移植、和克隆等技術(shù)的成功應(yīng)用，在將這些細(xì)胞作為受體細(xì)胞用于核移植之前，可以使卵母細(xì)胞在體外成熟。該過程通常需要由豬卵巢(如在屠宰場得到的豬卵巢)收集未成熟(前期I)卵母細(xì)胞，并在授精或去核之前使卵母細(xì)胞在成熟培養(yǎng)基中成熟直至卵母細(xì)胞達(dá)到中期II，在豬卵母細(xì)胞的情況中，這通常發(fā)生于抽吸后大約35-45小時(shí)。為了本發(fā)明的目的，將這段時(shí)間稱為“成熟期”。在用于本文計(jì)算時(shí)長時(shí)，“抽吸”指由卵巢濾泡抽吸未成熟卵母細(xì)胞。目前優(yōu)選的豬卵巢濾泡抽吸方案公開于下文實(shí)施例。
另外，已在體內(nèi)成熟的中期II卵母細(xì)胞已經(jīng)成功的用于核移植技術(shù)。例如，在動(dòng)情期開始或者注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)或類似激素35-48小時(shí)后，通過手術(shù)由未超排卵或超排卵的母?；蛐∧概Ｊ占墒熘衅贗I卵母細(xì)胞。類似操作也可用于豬。合適操作描述于下文實(shí)施例。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，去核和核移植時(shí)卵母細(xì)胞的成熟階段對NT方法的成功是重要的(參閱如Prather等人，Differentiation，481-8，1991)。然而，預(yù)計(jì)未成熟卵母細(xì)胞也可與分化細(xì)胞或細(xì)胞核融合并用于生成核移植胚胎。例如，可在融合后在體外使卵母細(xì)胞成熟。然而，一般而言，成功的哺乳動(dòng)物胚胎克隆實(shí)踐使用中期II卵母細(xì)胞作為受體卵母細(xì)胞，因?yàn)檎J(rèn)為在這個(gè)階段卵母細(xì)胞可以是或者是充分“激活的”，從而像對授精精子一樣對待導(dǎo)入的細(xì)胞核。在家畜中，卵母細(xì)胞激活期的范圍通常為抽吸后大約16-52個(gè)小時(shí)，優(yōu)選大約35-45個(gè)小時(shí)。
例如，可在體外在合適成熟培養(yǎng)基中使未成熟卵母細(xì)胞成熟。優(yōu)選而非必需的是，在體外使豬卵母細(xì)胞成熟，如通過將這些卵母細(xì)胞置于添加pFF、β-巰基乙醇、半胱氨酸、EGF(表皮生長因子)、HCG/PMSG、和cAMP的NCSU37培養(yǎng)基(成份見下文)中大約22小時(shí)，然后用HECM/HEPES和蔗糖清洗，優(yōu)選3次，再然后置于不含激素的相同NCSU37培養(yǎng)基中達(dá)大約20小時(shí)。這優(yōu)選在4孔Nunc板中進(jìn)行。
還優(yōu)選在去核前處理成熟卵母細(xì)胞，其中成熟可在體外(如上所述)或體內(nèi)進(jìn)行。這是為了除去卵丘細(xì)胞而進(jìn)行的。這可優(yōu)選通過透明質(zhì)酸酶處理及隨后的旋渦震蕩來進(jìn)行。
如上所述，可在體內(nèi)使卵母細(xì)胞成熟隨后旋渦震蕩，通過誘導(dǎo)卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的形成并收集這些成熟卵母細(xì)胞。例如，可給母豬注射PG600，并收集成熟卵母細(xì)胞，通常在大約5-6天后，即動(dòng)情期后24-36小時(shí)。這可如下進(jìn)行，由送到屠宰場的動(dòng)物切下生殖道，由此解剖輸卵管，優(yōu)選用合適培養(yǎng)基沖洗，然后由卵丘細(xì)胞剝離卵母細(xì)胞。這可通過用于體外成熟卵母細(xì)胞的相同方法進(jìn)行，如通過透明質(zhì)酸酶處理及隨后旋渦震蕩。
成熟后(若在體外進(jìn)行，通常需要大約30-50小時(shí)，優(yōu)選大約40小時(shí))，優(yōu)選將卵母細(xì)胞去核。然而，這不是必需的，因?yàn)槿ズ艘部稍谝浦补w細(xì)胞或細(xì)胞核后進(jìn)行。優(yōu)選對通過上述或其它操作獲得的剝離卵母細(xì)胞篩選極體，并優(yōu)選將選擇的中期II卵母細(xì)胞(通過極體的存在來確定)用于核移植。去核可在導(dǎo)入供體分化細(xì)胞或細(xì)胞核之前或之后進(jìn)行。去核可通過已知方法進(jìn)行，諸如描述于美國專利號4,994,384，收入本文作為參考。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞將暴露于NCSU23培養(yǎng)基(含0.2567mg/10ml蔗糖)和HXT達(dá)20分鐘或更長。然后優(yōu)選在添加松胞菌素B的HECM/HEPES和蔗糖(0.2567mg/10ml)培養(yǎng)基中進(jìn)行去核。去核后，將卵母細(xì)胞置于合適培養(yǎng)基中，如含蔗糖(0.2567mg/10ml)的NCSU23?；蛘?，對于立即去核，可將中期II卵母細(xì)胞置于HECM中，任選含7.5μg/ml松胞菌素B(CB)和0.15M蔗糖。任選地，可在合適培養(yǎng)基中(例如胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)基諸如NCSU23，見實(shí)施例中的表)于39℃和5％CO2維持這些卵母細(xì)胞，稍后去核，優(yōu)選不超過稍后24小時(shí)。
可通過顯微手術(shù)使用微量移液管除去極體及附近細(xì)胞質(zhì)來進(jìn)行去核。篩選卵母細(xì)胞以鑒定那些已經(jīng)成功去核的卵母細(xì)胞。該篩選優(yōu)選通過在合適培養(yǎng)基(如NCSU23)中用合適染料(如1μg/ml 33342Hoechst染料)給卵母細(xì)胞染色達(dá)20分鐘，然后目測是否實(shí)現(xiàn)去核(如在少于10秒鐘的紫外線照射下觀察)來進(jìn)行。然后可將已經(jīng)成功去核的卵母細(xì)胞置于合適培養(yǎng)基中，如NCSU23和蔗糖(0.2567mg/10ml)、HECM和0.15M蔗糖。
在本發(fā)明中，受體卵母細(xì)胞將優(yōu)選在成熟開始后大約30小時(shí)-大約50小時(shí)的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行去核，更優(yōu)選成熟開始后大約38小時(shí)-大約46小時(shí)，最優(yōu)選成熟開始后大約42小時(shí)進(jìn)行去核。
然后將單個(gè)豬分化細(xì)胞，如體細(xì)胞或生殖細(xì)胞，豬細(xì)胞或細(xì)胞核移植到用于生成NT單位的優(yōu)選去核的卵母細(xì)胞或卵裂球的卵周隙中。然而，如上所述，如果需要，可在融合后進(jìn)行去核。依照本領(lǐng)域已知方法，將豬細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞用于生成NT單位。例如，可通過電融合來融合細(xì)胞。電融合是通過提供足以引起細(xì)胞質(zhì)膜瞬時(shí)降解的電脈沖來進(jìn)行的。這種細(xì)胞質(zhì)膜降解的時(shí)間非常短，因?yàn)槟た焖僦貥?gòu)。因此，若兩片鄰近膜被誘導(dǎo)降解并在重構(gòu)脂雙層時(shí)混合，則在這兩個(gè)細(xì)胞之間將打開小通道。由于這些小開口的熱力學(xué)不穩(wěn)定性，它將擴(kuò)大直至這兩個(gè)細(xì)胞成為一個(gè)細(xì)胞。該過程的進(jìn)一步討論參考Prather等人的美國專利號4,997,384(完整收入本文作為參考)?？墒褂枚喾N電融合培養(yǎng)基，包括如蔗糖、甘露醇、山梨醇、和磷酸鹽緩沖液。還可使用Sendai病毒作為融合劑來進(jìn)行融合(Graham，Wister Inot.Symp.Monogr.，919，1969)。用于下文實(shí)施例的優(yōu)選融合培養(yǎng)基包括0.28M甘露醇、10μM CaCl2、100μM MgSO4、和10mM組氨酸，pH7.0。
在有些情況中(如小型供體細(xì)胞核)，可能優(yōu)選直接將細(xì)胞核注射到卵母細(xì)胞中而非使用電穿孔融合。這些技術(shù)公開于Collas和Barnes，Mol.Reprod.Dev.，38264-267，1994，完整收入本文作為參考。
或者，在導(dǎo)入融合槽前，通過在以2∶1、1∶2、和0∶1的比例含HECM的融合培養(yǎng)基中3次保溫，可將NT單位逐步暴露于融合培養(yǎng)基?？赏ㄟ^多種方法使豬細(xì)胞和卵母細(xì)胞電融合，如在卵母細(xì)胞開始成熟后大約44小時(shí)，在500μm槽中應(yīng)用90-120V、大約30μsec的電脈沖。融合后，將產(chǎn)生的融合NT單位在融合培養(yǎng)基中維持5分鐘，然后置于HECM中10分鐘，再然后是置于NCSU23+7.5mg/ml CB中直至激活。通常稍后進(jìn)行激活，通常稍后24小時(shí)以內(nèi)，優(yōu)選稍后大約1-9小時(shí)，最優(yōu)選稍后大約2小時(shí)。
目前，優(yōu)選方案是移植任選去核的經(jīng)鏈霉蛋白酶處理(優(yōu)選大約400μl/孔)的卵母細(xì)胞，在合適培養(yǎng)基(如HECM/HEPES)中稀釋，離心(優(yōu)選大約6000rpm達(dá)4分鐘)，并重懸于合適培養(yǎng)基(如HECM/HEPES)?；蛘撸褂门c上文相同的解離條件用TE處理卵母細(xì)胞。
在目前優(yōu)選的方案中，供體細(xì)胞核或細(xì)胞的移植是在合適培養(yǎng)基中進(jìn)行的，如HECM/HEPES+蔗糖(0.2567mg/10ml)。進(jìn)行移植后，將產(chǎn)生的NT胚胎轉(zhuǎn)移到合適培養(yǎng)基中，如含蔗糖(0.2567mg/10ml)的NCSU23。然后融合NT胚胎，優(yōu)選通過在合適融合培養(yǎng)基中應(yīng)用110V、大約30μsec的電流。如上所述，目前優(yōu)選的融合培養(yǎng)基包含500mlSigma水、0.28M甘露醇(25.51g)、100μM MgSO4(0.0123g)、和100mM組氨酸(0.776g)。然而，也可用其它已知融合培養(yǎng)基替代。優(yōu)選的是，然后將融合NT單位置于合適培養(yǎng)基(如HECM/HEPES)中，然后置于NCSU23和松胞菌素B(3μl/2ml)中在激活前進(jìn)行大約2小時(shí)。
任選在成熟、操作(剝離卵丘細(xì)胞)、和/或激活過程中可使用一種或多種caspase抑制劑，以增強(qiáng)胚泡發(fā)育和活的子代的生成。它們的范例包括caspase3、caspase8、和caspase9。
可通過已知方法激活NT單位?？梢栽谌诤现?、同時(shí)、或之后進(jìn)行激活。這些方法包括如在亞生理溫度培養(yǎng)NT單位，本質(zhì)上是通過對NT單位應(yīng)用冷的或?qū)嶋H上涼的溫度休克。最便利的是于室溫培養(yǎng)NT單位，這相對于胚胎通常暴露的生理溫度條件而言屬于較冷。
合適激活方案包括1.離子霉素和DMAP的激活1-將卵母細(xì)胞置于5μM離子霉素和2mM DMAP中達(dá)4分鐘；2-將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含2mM DMAP的培養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)4小時(shí)；3-漂洗4次并進(jìn)行培養(yǎng)。
2.離子霉素DMAP和Roscovitin的激活1-將卵母細(xì)胞置于5μM離子霉素和2mM DMAP中達(dá)4分鐘；
2-將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含2mM DMAP和200μM Roscovitin的培養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)3小時(shí)；3-漂洗4次并進(jìn)行培養(yǎng)。
3.暴露于離子霉素隨后是松胞菌素和環(huán)己酰亞胺的激活1-將卵母細(xì)胞置于5μM離子霉素中達(dá)4分鐘；2-將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含5μg/ml松胞菌素B和5μg/ml環(huán)己酰亞胺的培養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)5小時(shí)；3-漂洗4次并進(jìn)行培養(yǎng)。
4.電脈沖的激活1-將卵細(xì)胞置于含100μM CaCl2的甘露醇培養(yǎng)基中；2-進(jìn)行3次1.0kVcm-1、20μsec的脈沖，各隔22秒鐘；3-將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含5μg/ml松胞菌素B的培養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)3小時(shí)。
5.暴露于乙醇隨后是松胞菌素和環(huán)己酰亞胺的激活1-將卵母細(xì)胞置于7％乙醇中達(dá)1分鐘；2-將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含5μg/ml松胞菌素B和5μg/ml環(huán)己酰亞胺的培養(yǎng)培養(yǎng)基中達(dá)5小時(shí)；3-漂洗4次并進(jìn)行培養(yǎng)。
6.顯微注射adenophostin的激活1-給卵母細(xì)胞注射10-12pl含10μM adenophostin的溶液；2-將卵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
7.顯微注射精子因子的激活1-給卵母細(xì)胞注射10-12pl由靈長類、豬、牛、綿羊、山羊、馬、小鼠、大鼠、兔、或倉鼠分離的精子因子；2-將卵細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
8.顯微注射重組精子因子的激活9.其它DMAP/離子霉素方案通常在成熟后大約22-28小時(shí)，將卵母細(xì)胞或NT單位置于大約2mMDMAP中大約1小時(shí)，隨后在5μg/ml松胞菌素B和20μg/ml環(huán)己酰亞胺中保溫大約2-12小時(shí)，優(yōu)選大約8小時(shí)。
目前優(yōu)選的激活方法是在含1mg/ml BSA的HECM/HEPES(H/H)培養(yǎng)基中進(jìn)行的3步激活方案。第一步，將所述NT融合體置于還含10μM離子霉素(4μl/2ml)的所述H/H BSA培養(yǎng)基中達(dá)大約4分鐘，隨后用所述H/H培養(yǎng)基漂洗，并將NT融合體置于含DMAP(1μl/ml)的NCSU23培養(yǎng)基中達(dá)大約30分鐘。第二步，再次將NT融合體置于含1mg/ml BSA且還含5μM離子霉素的H/H培養(yǎng)基中達(dá)大約4分鐘，隨后用H/H漂洗，并將經(jīng)漂洗的卵母細(xì)胞置于NCSU23和DMAP(1μl/ml)中達(dá)大約30分鐘。第三步，再次將NT融合體置于含1mg/ml BSA且還含5μM離子霉素和DMAP(1μl/ml)的H/H中達(dá)大約2小時(shí)。在這種激活方案之后，優(yōu)選將激活的NT單位轉(zhuǎn)移到合適培養(yǎng)基中，如NCSU23培養(yǎng)基。根據(jù)需要，通常在大約第3天，更換這種培養(yǎng)基或其它合適培養(yǎng)基。第5天，優(yōu)選加入大約5％FBS，并將NT單位培養(yǎng)使形成胚泡。然而，如上所述，可在生成后幾乎立即移植NT胚胎，即在第1天(處于單細(xì)胞階段)移植可能會(huì)成功。
或者，可以如下在500μm槽中激活豬NT單位在包含0.28M甘露醇、100μM CaCl2、100μM MgSO4、和10mM組氨酸(pH7.0)的激活培養(yǎng)基中應(yīng)用30V、30μsec的電脈沖；1小時(shí)后，應(yīng)用15V、30μsec的第二次電脈沖。在兩次脈沖之間，將NT單位維持于含CB的NCSU23中，39℃，5％CO2。
或者，還可以通過應(yīng)用已知激活劑來進(jìn)行激活。例如，受精過程中精細(xì)胞對卵母細(xì)胞的侵入或精細(xì)胞所含激活因子可激活NT單位。同樣，諸如電學(xué)或化學(xué)休克、鈣離子載體、蛋白激酶抑制劑等處理可在融合后用于激活NT胚胎。
還有，可在融合后大約1-2小時(shí)，將NT單位置于含5μM離子霉素的HECM/HEPES中達(dá)4分鐘，隨后用HECM/HEPES清洗3次，然后置于HECM/HEPES+松胞菌素B和離子霉素中達(dá)大約4分鐘，用HECM/HEPES清洗3次，并置于含2mM DMAP(6-二甲基氨基嘌呤)的NCSU23中達(dá)大約3小時(shí)，由此進(jìn)行化學(xué)激活。然后，優(yōu)選用HECM/HEPES將NT單位清洗大約3-4次，并在胚胎移植前置于NCSC23中。
還有，激活后可將NT單位在NCSU23+CB中培養(yǎng)3-4小時(shí)，然后在不含CB的NCSU23中培養(yǎng)。如上所述，可在激活后任何時(shí)間將NT單位移植到受體雌畜中。
或者，此后可以在合適體外培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)激活的NT單位，以生成CICM細(xì)胞和細(xì)胞集落。適用于培養(yǎng)和維持胚胎的培養(yǎng)培養(yǎng)基在本領(lǐng)域是眾所周知的。已知培養(yǎng)基的范例包括Ham’S F-10+10％胎牛血清(FCS)、組織培養(yǎng)培養(yǎng)基-199(TCM-199)+10％胎牛血清、Tyrodes-清蛋白-乳酸-丙酮酸(TALP)、Dulbecco氏磷酸鹽緩沖液(PBS)、Eagle氏和Whitten氏培養(yǎng)基。用于收集卵母細(xì)胞和使之成熟的最常用培養(yǎng)基之一是添加1-20％血清的TCM-199，包括胎牛血清、新生血清、動(dòng)情期母牛血清、小羊、豬、或閹牛血清。優(yōu)選的維持培養(yǎng)基包括含Earl鹽、10％胎牛血清、0.2mM丙酮酸鈉、和50μg/ml硫酸慶大霉素的TCM-199。更優(yōu)選的是，所用培養(yǎng)基是NCSU23，而且激活后2-5天，在新鮮NCSU23+5-10％胎牛血清中培養(yǎng)NT單位。任何上述方法還包括與多種細(xì)胞類型的共培養(yǎng)，諸如顆粒細(xì)胞、輸卵管細(xì)胞、BRL細(xì)胞、子宮細(xì)胞、和STO細(xì)胞。
另一種維持培養(yǎng)基描述于Jr.Rosenkrans等人的美國專利號5,096,822，收入本文作為參考。這種稱為CR1的胚胎培養(yǎng)基包含支持胚胎所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。
可以在NCSU23+5-10％FCS中培養(yǎng)NT單位，直至NT單位達(dá)到期望的大小，然后將它們移植到受體雌畜中，或者用于生成CICM細(xì)胞或細(xì)胞集落。例如，可培養(yǎng)這些NT單位，直至至少大約2-400個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選大約4-128個(gè)細(xì)胞，最優(yōu)選至少大約50個(gè)細(xì)胞?；蛘?，可將單細(xì)胞NT胚胎(即激活后第1天生成的胚胎)導(dǎo)入受體雌畜。在合適條件下進(jìn)行培養(yǎng)，即大約38.5℃，5％CO2，通常大約每2-5天、優(yōu)選大約每3天更換培養(yǎng)培養(yǎng)基以優(yōu)化生長。
可使用胚胎移植工業(yè)中使用的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行本發(fā)明中用于胚胎移植和受體動(dòng)物管理的方法。比較希望是同步移植，即NT胚胎的階段與受體雌畜的動(dòng)情周期同步。這種優(yōu)勢和如何維持受體描述于Wall等人，“離心后能夠呈現(xiàn)前核和細(xì)胞核的豬卵子的發(fā)育”(Development ofporcine ova that were centrifuged to permit visualization ofpronuclei and nuclei)，Biol.Reprod.，32645-651，1985，將它的內(nèi)容收入本文作為參考。
如上所述，比較希望受體雌畜還包含“輔助”胚胎，但并非必需如此。這些輔助胚胎包括普通豬胚胎(如通過天然或人工方法生成的胚胎)、單性胚胎(不會(huì)生成活的子代的已激活、未受精的胚胎)、和四倍體胚胎。已發(fā)現(xiàn)這可增強(qiáng)克隆豬的發(fā)育和維持。
這些輔助胚胎的數(shù)目可顯著變化，即由大約1-2個(gè)至多達(dá)100個(gè)。猜測這些輔助胚胎可生成增強(qiáng)胚胎發(fā)育和/或克隆胚胎移植的物質(zhì)，如激素和生長因子。單性輔助胚胎或四倍體輔助胚胎的優(yōu)勢是會(huì)發(fā)育成活子代的唯一子代是克隆胚胎。然而，可通過遺傳分析來確認(rèn)克隆子代的生成，如通過PCR或通過檢測克隆DNA序列的表達(dá)或存在(如通過原位雜交)，或者通過檢測克隆DNA的表達(dá)(如通過使用放射性標(biāo)記抗體或其它探針)。
如上所述，本發(fā)明特別可用于生成遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的克隆豬。本發(fā)明的優(yōu)勢在于通過使用可克隆增殖的分化細(xì)胞來源可簡化轉(zhuǎn)基因操作。具體而言，用作供體細(xì)胞核的分化細(xì)胞已經(jīng)插入、除去、或修飾了期望DNA序列。然后將那些遺傳改變的分化細(xì)胞與去核卵母細(xì)胞一起用于核移植。
用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中插入、除去、或修飾期望DNA序列的任何已知方法可用于改變將用作細(xì)胞核供體的分化細(xì)胞。這些操作可除去所有或部分DNA序列，而且DNA序列可以是異源的。所包括的有能夠在細(xì)胞基因組中特定位點(diǎn)插入、刪除、或修飾DNA序列的同源重組技術(shù)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將“敲除”內(nèi)源豬基因，并“敲入”人同源物，如編碼免疫學(xué)蛋白質(zhì)、激素、結(jié)構(gòu)蛋白、凝結(jié)因子、酶、受體、或其它克隆基因的DNA。
本發(fā)明因而可用于提供具有期望基因型的成年豬。具有經(jīng)證明的遺傳優(yōu)越性或其它期望性狀的成年豬的增殖特別有用，包括轉(zhuǎn)基因或遺傳工程動(dòng)物和嵌合動(dòng)物。因此，本發(fā)明將能夠生成一種性別的子代，而且能夠生成具有改進(jìn)的肉產(chǎn)量、生殖性狀、和疾病抵抗力的豬。此外，來自NT胎兒(包括轉(zhuǎn)基因和/或嵌合胎兒)的細(xì)胞和組織可以用于細(xì)胞、組織、和器官移植，治療下文就CICM細(xì)胞的用途所述的許多疾病。因此，轉(zhuǎn)基因豬的用途包括疾病模型、細(xì)胞和器官的異種移植、和藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
如上所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將用人結(jié)構(gòu)基因(如膠原)取代內(nèi)源基因如膠原基因。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將用人血清清蛋白(HSA)基因取代豬血清清蛋白基因。
為了生成CICM細(xì)胞和細(xì)胞系，在獲得期望大小的NT單位后，機(jī)械的由該區(qū)域取出細(xì)胞并使用。優(yōu)選如下進(jìn)行取出包含NT單位(通常包含至少大約50個(gè)細(xì)胞)的細(xì)胞塊，清洗這些細(xì)胞，并將細(xì)胞置于飼養(yǎng)層(如經(jīng)照射成纖維細(xì)胞)上。通常，用于獲得干細(xì)胞或細(xì)胞集落的細(xì)胞將得自培養(yǎng)NT單位(大小優(yōu)選至少50個(gè)細(xì)胞)的最內(nèi)層部分。然而，細(xì)胞數(shù)目較少或較多的NT單位以及來自NT單位其它部分的細(xì)胞也可用于獲得ES細(xì)胞和細(xì)胞集落。將細(xì)胞在飼養(yǎng)層中在合適生長培養(yǎng)基中維持，如添加10％FCS和0.1mM β-巰基乙醇(Sigma)和L-谷氨酰胺的αMEM。根據(jù)優(yōu)化生長所需頻繁更換生長培養(yǎng)基，如大約每2-3天。
這種培養(yǎng)過程導(dǎo)致CICM細(xì)胞或細(xì)胞系的形成。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可根據(jù)需要改變培養(yǎng)條件，以優(yōu)化特定CICM細(xì)胞的生長。同樣，依照本發(fā)明可生成遺傳工程或轉(zhuǎn)基因豬CICM細(xì)胞。即，上文所述的方法可用于生成導(dǎo)入期望DNA序列或者除去或修飾所有或部分內(nèi)源DNA序列的NT單位。然后，那些遺傳工程或轉(zhuǎn)基因NT單位可用于生成遺傳工程或轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞。如先前所述，美國專利號5,905,042(收入本文作為參考)中討論了用于在培養(yǎng)中將這些CICM維持于未分化狀態(tài)的優(yōu)選方法。
產(chǎn)生的CICM細(xì)胞和細(xì)胞系具有許多治療性和診斷性應(yīng)用。最特別的是，這些CICM細(xì)胞可用于細(xì)胞移植療法。
在這點(diǎn)上，已知小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞能夠分化成幾乎任何細(xì)胞類型，如造血干細(xì)胞。因此，依照本發(fā)明生成的豬CICM細(xì)胞應(yīng)當(dāng)具有相似的分化能力。可以依照已知方法誘導(dǎo)本發(fā)明的CICM細(xì)胞分化，以獲得期望細(xì)胞類型。例如，通過在分化培養(yǎng)基中在提供細(xì)胞分化的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞，可誘導(dǎo)本發(fā)明的豬CICM細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、尿道細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。本領(lǐng)域知道導(dǎo)致CICM細(xì)胞分化的培養(yǎng)基和方法以及合適的培養(yǎng)條件。
例如，Palacios等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927530-7537，1995，講授了通過對干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)操作來由胚胎細(xì)胞系生成造血干細(xì)胞，包括首先在不含視黃酸的懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細(xì)胞的聚集體，然后在含視黃酸的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再然后將細(xì)胞聚集體轉(zhuǎn)移到提供細(xì)胞貼壁的基底上。
此外，Pedersen，J.Reprod.Fertil.Dev.，6543-552，1994，在這篇回顧性論文參考的許多論文中，公開了使胚胎干細(xì)胞體外分化以生成多種分化細(xì)胞類型的方法，包括造血細(xì)胞、肌肉、心肌、神經(jīng)細(xì)胞、及其它。
此外，Bain等人，Dev.Biol.，163342-357，1995，講授了胚胎干細(xì)胞體外分化成具有神經(jīng)元特性的神經(jīng)細(xì)胞。這些參考文獻(xiàn)例示了用于由胚胎或干細(xì)胞獲得分化細(xì)胞的方法。將這些參考文獻(xiàn)完整收入本文作為參考，特別是其中涉及胚胎干細(xì)胞分化方法的公開內(nèi)容。
因此，使用已知方法和培養(yǎng)培養(yǎng)基，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可培養(yǎng)本發(fā)明CICM細(xì)胞，包括遺傳工程或轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞，以獲得期望分化細(xì)胞類型，如神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、等。嵌合動(dòng)物(豬和牛)的成功生成已經(jīng)證明，美國專利號5,905,042中公開的培養(yǎng)方法能夠生成多能CICM細(xì)胞。
本發(fā)明CICM細(xì)胞可用于獲得任何期望的分化細(xì)胞類型。這些分化細(xì)胞的治療性用法是前所未有的。例如，造血干細(xì)胞可用于需要骨髓移植的醫(yī)學(xué)治療。這些操作可用于治療許多疾病，如癌癥晚期(諸如卵巢癌和白血病)以及危害免疫系統(tǒng)的疾病(諸如AIDS)。可如下獲得造血干細(xì)胞，例如融合癌癥或AIDS患者的成熟體細(xì)胞(如上皮細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)與去核卵母細(xì)胞，如上所述獲得CICM細(xì)胞，并在有助于分化的條件下培養(yǎng)這些細(xì)胞直至獲得造血干細(xì)胞。這些造血細(xì)胞可用于疾病治療，包括癌癥和AIDS。
本發(fā)明可用于取代缺陷型基因，如缺陷型免疫系統(tǒng)基因，或者用于導(dǎo)入可引起治療有益蛋白質(zhì)表達(dá)的基因，諸如生長因子、淋巴因子、細(xì)胞因子、凝結(jié)因子、受體、酶、等。
可導(dǎo)入本發(fā)明CICM細(xì)胞的DNA序列包括例如編碼表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)性生長因子、胰島素樣生長因子(I和II)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-4/5、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、AFT-1、細(xì)胞因子(白介素、干擾素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子α和β、等)、治療性酶等的那些基因。
本發(fā)明包括豬細(xì)胞在治療人疾病中的用途。因此，豬CICM細(xì)胞、NT胎兒、以及NT和嵌合子代(轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因)可用于治療批準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)胞、組織、或器官移植的人疾病狀況。一般而言，本發(fā)明的CICM細(xì)胞、胎兒、和子代可用于相同物種(自體、同基因、或同種異體移植)或不同物種(異種移植)。例如，來自豬NT胎兒的腦細(xì)胞可用于治療帕金森氏病。
同樣，本發(fā)明的CICM細(xì)胞可用作體外分化模型，特別是用于研究涉及早期發(fā)育調(diào)控的基因。同樣，使用本發(fā)明CICM細(xì)胞的分化細(xì)胞、組織、和器官可用于藥物研究。
另外，本發(fā)明CICM細(xì)胞可作為細(xì)胞核供體用于生成其它CICM細(xì)胞和細(xì)胞集落。
為了更清晰的描述本發(fā)明而提供下列實(shí)施例。
實(shí)施例用于豬克隆的材料和方法修改后的NCSU37培養(yǎng)基(mNCSU37)
使用18mΩ、RO、DI水。pH應(yīng)當(dāng)是7.4，檢查滲透摩爾濃度并記錄。通過真空過濾(0.22μm)除菌，并在瓶子上注明日期和編號。保存于4℃并在10天內(nèi)使用。修改后的TL-HEPES-PVA培養(yǎng)基(Hepes-PVA)
**60％糖漿*最后慢慢加入CaCl2·2H2O以防止沉淀使用18mΩ、RO、DI水。pH調(diào)至7.4，檢查滲透摩爾濃度并記錄。通過真空過濾(0.22μm)除菌，并在瓶子上注明日期和編號。保存于4℃并在10天內(nèi)使用。NCSU23培養(yǎng)基
使用18mΩ、RO、DI水。pH應(yīng)當(dāng)是7.4，檢查滲透摩爾濃度并記錄。使用紅色Nalgene濾器通過真空過濾(0.22μm)除菌，并在瓶子上注明日期和編號。保存于4℃并在10天內(nèi)使用。注意BSA類型是重要的。優(yōu)選使用Sigma公司的BSA，目錄#A-7906。還有，青霉素G/鏈霉素是任選的。成熟培養(yǎng)基(MAT)18.0ml mNCSU372.0ml豬濾泡液(pFF)7.0μl稀釋的β-巰基乙醇(將10μl β-巰基乙醇在990μlmNCSU37中稀釋；終濃度50μM)0.002g半胱氨酸(終濃度0.6mM)20μl EGF原液(來自10ng/μl EGF原液的表皮生長因子)用于抽吸豬卵巢濾泡的方案通過目測對濾泡的大小評級。認(rèn)為3mm×3mm至7mm×7mm的濾泡是抽吸的好候選者。相反，更大的濾泡，尤其是超過1cm×1cm的濾泡，是抽吸的差候選者。
優(yōu)選使用配備18號針頭的10cc注射器吸取1ml肝素(濃度為100IU/ml)，保持直立，并將肝素溶液抽到10cc線，以包被注射器內(nèi)腔。由注射器推出肝素。一只手握著卵巢，另一只手握著注射器。
將針頭斜插到濾泡中，并輕輕拉起注射器，直至濾泡塌陷，即隨同卵泡一起吸取所有濾泡液。發(fā)現(xiàn)在抽吸過程中在濾泡內(nèi)輕輕前后擺動(dòng)可促進(jìn)濾泡的塌陷和所有濾泡內(nèi)含物的吸取。
繼續(xù)抽吸以獲得盡可能多的卵泡，直至達(dá)到10cc標(biāo)志。由注射器除去針頭，并將濾泡液存放于收集管中。
在將濾泡液存放于管中時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意除去針頭，以避免剝離卵丘細(xì)胞和損傷卵母細(xì)胞。同樣，希望在每一個(gè)卵巢中吸取盡可能多的大小合適的卵泡。為了獲得最佳結(jié)果，比較理想的是對每一批生殖道更換包被肝素的注射器。豬濾泡液的制備由青春期前小母豬收集豬濾泡液(pFF)，通常是大約3-6mm的濾泡。通過例如靜置大約5-10分鐘，卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞能夠由此沉淀。然后吸取pFF并轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中。將錐形管在Sorvall上于4℃以3000rpm離心30分鐘。取出錐形管，由沉淀以上收集pFF，合并，并先后用0.8μm和0.45μm濾器(Sterivex)過濾。將過濾后的材料分裝到1.5ml無菌微量離心管中，并凍存于-20℃直至使用。表皮生長因子原液(EGF)及制備100μg EGF10ml含0.1％BSA的mNCSU37混勻。分裝成25μl，并凍存于-20℃。用于MAT(PMSG/hCG)的馬絨毛膜促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素原液及制備ECG(PMSG 6000；Intervet公司，Millsboro；DE 19966)加入3ml dH2O將這種材料由6000IU稀釋至2000IU/ml。hCG(Chorulon；Intervet公司)加入5ml dH2O將這種材料由10000IU稀釋至2000IU/ml。
然后，混合1ml稀釋的PMSG和1ml稀釋的hCG，使得每種激素達(dá)到1000IU/ml。分裝成50μl并凍存于-20℃。剩余PMSG和hCG原液也凍存。db-cAMP 100mM原液及制備25mg db-cAMP(保存于-20℃干燥器中)0.509ml dH2O將上述材料混勻，分裝成50μl，并凍存于-20℃。激活培養(yǎng)基除了包含1mg/ml BSA以外，其余與HECM/HEPES相同。抗生素/抗霉菌劑(Ab/Am)100U/l青霉素、100μg/l鏈霉素、和0.25μg/l兩性霉素B(Gibco#15240-062)每升鹽水中加入上述材料的10ml分裝液。每毫升加入10μl這種混合液。卵母細(xì)胞-卵丘復(fù)合物(OCC)的收集于25℃將卵巢運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，并立即用含抗生素/抗霉菌劑(10ml/L；Gibco #600-5240g)的0.9％鹽水清洗。使用連接真空系統(tǒng)(GEML牛系統(tǒng))的18號針頭和50ml Falcon管抽吸3-6mm的濾泡。裝滿一個(gè)管后，使OCC沉淀5-10分鐘。抽吸濾泡液(pFF)，并保存用于培養(yǎng)系統(tǒng)(如果需要)(參閱下文pFF制備方案)。用于核移植豬胚胎的體內(nèi)卵母細(xì)胞回收和轉(zhuǎn)移的優(yōu)選方案給225-275磅的Landrance x York或Landrance x Hampshire小母豬注射PG600，并在5-6天后(動(dòng)情期開始后24-36小時(shí))將動(dòng)物送去屠宰。回收生殖道并置于隔熱容器中，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。
由子宮解離輸卵管，并用緩沖培養(yǎng)基沖洗。然后，如上所述由卵丘細(xì)胞剝離卵母細(xì)胞，用于制備體外成熟的卵母細(xì)胞。
激活后，將卵細(xì)胞裝到5英寸的Tom Cat導(dǎo)管中(Sovereign，目錄#8890-703021)，并通過手術(shù)移植到同步受體小母豬(相同品種且200-300磅)的輸卵管中。將胚胎總數(shù)的一半移植到每個(gè)輸卵管中，通常每只動(dòng)物移植不超過100個(gè)NT。在有些情況中，與NT一起移植10-20個(gè)天然生成的2-4細(xì)胞胚胎作為“輔助”胚胎。緩沖液中可任選包含caspase抑制劑以增強(qiáng)胚胎發(fā)育和維持。每50磅使用1ml混合物(250mg賽拉嗪(Xylazine)、250mg氯胺酮(Ketamine)、和500mg Telazol重溶成5ml溶液)麻醉小母豬。灌輸后，優(yōu)選將受體小母豬轉(zhuǎn)移至新的隔離設(shè)備。
優(yōu)選在手術(shù)后30天進(jìn)行懷孕檢查，通常通過超聲波。那時(shí)可通過C-切開術(shù)回收胎兒，并通過PCR和Southern印跡進(jìn)行分析，以鑒定它們中哪一個(gè)是通過核移植而生成的?；蛘?，可使克隆胎兒發(fā)育至足月分娩期，并通過天然方法或C-切開術(shù)來出生。OCC清洗將OCC重懸于20ml HEPES-PVA并進(jìn)行沉淀；重復(fù)2次。最后一次清洗后，將OCC轉(zhuǎn)移至柵盤并選擇用于培養(yǎng)。將選擇的OCC在60mm盤中用HEPES-PVA清洗2次。所有抽吸和卵母細(xì)胞回收都在室溫進(jìn)行(大約25℃)。體外成熟(IVM)將清洗后的OCC(大約50個(gè))置于每個(gè)孔裝有0.5ml成熟培養(yǎng)基(如上所述)的4孔Nunc板中大約22小時(shí)。然后，將卵母細(xì)胞置于不含激素的相同培養(yǎng)基中大約20小時(shí)。豬胚胎和成熟成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)物的分離由受精后30-114天(優(yōu)選35天)的豬胎兒獲得豬成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物。無菌除去頭、肝、心、和消化道，將胎兒切碎，并在預(yù)熱的胰蛋白酶EDTA溶液中(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)于37℃保溫30分鐘。將成纖維細(xì)胞置于組織培養(yǎng)板中，并在成纖維細(xì)胞生長培養(yǎng)基(FGM)(含添加10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100IU/ml)、和鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD))中培養(yǎng)。在含5％CO2的潮濕空氣中于37℃培養(yǎng)并維持成纖維細(xì)胞。
由豬的肺和皮膚分離成熟成纖維細(xì)胞。將切碎的肺組織在胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中于10℃保溫過夜。次日，將組織和解離細(xì)胞在預(yù)熱的胰蛋白酶EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶/0.02％EDTA；GIBCO，Grand Island，NY)中于37℃保溫1小時(shí)，并進(jìn)行3次連續(xù)清洗和胰蛋白酶保溫(1小時(shí))。將成纖維細(xì)胞置于組織培養(yǎng)板中，并在添加10％胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logen，UT)、青霉素(100IU/ml)、和鏈霉素(50μl/ml)的α-MEM培養(yǎng)基(BioWhittaker，Walkersville，MD)中培養(yǎng)。事實(shí)上可在發(fā)育的任何時(shí)間分離成纖維細(xì)胞，大致從胚盤階段后至動(dòng)物的整個(gè)成年期(豬是由受精后9-10天至5歲或更長)。用于核移植的成纖維細(xì)胞的制備可作為供體細(xì)胞核的胎兒成纖維細(xì)胞的范例是1.不在任何單細(xì)胞階段或血清饑餓或靜止中同步化的增殖中成纖維細(xì)胞都可作為細(xì)胞核供體。用胰蛋白酶EDTA處理來自上述培養(yǎng)物的細(xì)胞達(dá)10分鐘，并用100％胎牛血清清洗3次。然后將成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞置于HbT培養(yǎng)基(Bavister等人，1983)的顯微操作液滴中。這是在將成纖維細(xì)胞移植到去核豬卵母細(xì)胞中之前10-30分鐘進(jìn)行的。優(yōu)選的是，將具有CMV啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白基因的增殖中轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞(第9代)用于生成NT單位。
2.第二種方法是，使成纖維細(xì)胞同步在細(xì)胞周期的G1或G0。將成纖維細(xì)胞生長至匯合。然后，連續(xù)4天將FCM中的胎牛血清濃度降低一半(第0天＝10％，第1天＝5％，第2天＝2.5％，第3天＝1.25％，第4天＝0.625％)。第5天用胰蛋白酶EDTA處理細(xì)胞達(dá)10分鐘，并用100％胎牛血清清洗3次。然后將成纖維細(xì)胞的單細(xì)胞置于HbT培養(yǎng)基的顯微操作液滴中。這是在將成纖維細(xì)胞移植到去核豬卵母細(xì)胞中之前15分鐘內(nèi)進(jìn)行的。
或者，供體細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞)可直接得自活的動(dòng)物(如成年豬)、組織、或流體來源。除去卵丘細(xì)胞成熟期(范圍為大約30-50小時(shí)，優(yōu)選大約42小時(shí))后，可優(yōu)選將卵母細(xì)胞去核。優(yōu)選在去核前，使細(xì)胞接觸含0.68mg/ml透明質(zhì)酸酶的H/H培養(yǎng)基，隨后旋渦震蕩大約3分鐘，由此除去卵丘細(xì)胞?；蛘撸谌ズ饲?，可以在除去卵丘細(xì)胞前取出卵母細(xì)胞，并置于含1mg/ml透明質(zhì)酸酶的HECM(Seshagiri和Bavister，1989)中。這可以通過用孔很細(xì)的移液管反復(fù)吸取或者通過簡短旋渦震蕩(大約3分鐘)來實(shí)現(xiàn)。然后對剝離的卵母細(xì)胞篩選極體，并將選擇的中期II卵母細(xì)胞(通過極體的存在來確定)用于核移植。去核當(dāng)前優(yōu)選的操作包括將卵母細(xì)胞暴露于NCSU23+蔗糖+HXT達(dá)至少20分鐘，隨后在含蔗糖和松胞菌素B的H/H培養(yǎng)基中進(jìn)行去核。去核后，優(yōu)選在移植前將卵母細(xì)胞置于含蔗糖的NCSU23中。移植優(yōu)選用鏈霉蛋白酶或TE處理用于移植的細(xì)胞。在鏈霉蛋白酶的情況中，每個(gè)孔用400μl處理細(xì)胞，保溫，在H/H中稀釋，以6000rpm離心4分鐘，并重懸于H/H供使用。
在TE的情況中，使用相同方案。然后優(yōu)選在含蔗糖的H/H中進(jìn)行移植，并在完成后將細(xì)胞置于含蔗糖的NCSU23中供融合。融合培養(yǎng)基配方500mlSigma水0.28M甘露醇 25.51g100μM MgSO40.0123g10mM組氨酸 0.776g融合優(yōu)選使核移植單位通過H/H與甘露醇的梯度1∶2、1∶1、和0∶2，然后在600μm槽中融合，并注滿甘露醇。
將細(xì)胞置于大約100V下達(dá)30微秒，對細(xì)胞進(jìn)行電融合。融合后，將NT單位置于純H/H中，然后置于NCSU23+松胞菌素B(3μl/2ml)中，優(yōu)選在激活前進(jìn)行達(dá)2小時(shí)。激活可使用的激活方法的范例包括本申請先前鑒定的如下操作，通常在成熟后大約47-49小時(shí)進(jìn)行。正如所述，可以在融合之前、接近、或之后進(jìn)行激活。
1.離子霉素/DMAP操作將NT單位置于含1mg/ml BSA+10μM離子霉素(4μl/2ml)的H/H培養(yǎng)基中達(dá)4分鐘，用H/H漂洗，然后置于NCSU23+DMAP(1μl/ml)中達(dá)30分鐘。然后，將NT單位置于含1μl/ml BSA和5μM離子霉素的相同H/H培養(yǎng)基中并處理30分鐘。
然后，將NT單位置于含1mg/mlBSA+2.5μM離子霉素和DMAP的相同H/H培養(yǎng)基中再過2小時(shí)。
然后漂洗NT單位以除去DMAP，并在NCSU23中培養(yǎng)。在第3天更換培養(yǎng)基，并在第5天加入5％FBS，培養(yǎng)NT單位直至形成胚泡。
2.一次激活脈沖由NCSU23+CB中取出NT單位，并用激活培養(yǎng)基清洗3次。平衡后，將NT單位置于注滿融合操作中所述激活培養(yǎng)基的融合槽(500μm缺口)中。應(yīng)用30V、30μsec的脈沖。然后立即用HECM HEPES清洗NT單位3次，并在NCSU23中繼續(xù)培養(yǎng)(39℃，5％CO2)2小時(shí)，直至胚胎移植或體外培養(yǎng)(39℃，5％CO2，在NCSU23中)。如果進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第2天將NT單位置于新鮮NCSU23+5％胎牛血清中。表1中的結(jié)果指出，可使用該操作激活卵母細(xì)胞，而且它們具有發(fā)育能力。
3.兩次激活脈沖由NCSU23+CB中取出NT單位，并用激活培養(yǎng)基清洗3次。平衡后，將NT單位置于注滿融合操作中所述激活培養(yǎng)基的融合槽(500μm缺口)中。應(yīng)用30V、30μsec的脈沖。然后立即用HECM HEPES清洗NT單位3次，放回NCSU23+CB中，并在此培養(yǎng)基中于39℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)，直至下一次脈沖(1小時(shí)后)。1小時(shí)后，這次重復(fù)激活培養(yǎng)基平衡步驟，并應(yīng)用15V、30μsec的脈沖。然后立即用HECM HEPES清洗NT單位3次，放回NCSU23+CB中，并在此培養(yǎng)基中于39℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)2-6小時(shí)。然后使用上文1中所述操作培養(yǎng)NT單位。表1中的結(jié)果指出，可使用該操作激活卵母細(xì)胞，而且它們具有發(fā)育能力。核移植胚胎也是一樣。兩次脈沖激活操作產(chǎn)生了4個(gè)胚泡期NT單位。
4.精子因子最初由Stice和Robl(Mol.Reprod.Dev.，25272-280，1990)(本文收入它的內(nèi)容作為參考)描述于哺乳動(dòng)物精子，該因子引起卵母細(xì)胞的激活。由豬精細(xì)胞分離精子因子和顯微注射的方法描述于Fissore等人，Mol.Reprod.Dev.，46176-189，1997(本文收入它的內(nèi)容作為參考)。由NCSU23+CB取出NT單位，并置于上文所述的顯微操作板中用于去核和成纖維細(xì)胞移植。使用吸滿精子因子的顯微注射針頭(1μm開口)，將因子投遞到NT單位的細(xì)胞質(zhì)中后，卵母細(xì)胞發(fā)生激活。顯微注射后，用HECM HEPES清洗NT胚胎，并置于NCSU23+CB中達(dá)2-6小時(shí)，然后保存在NCSU23中，直至胚胎移植。表1使用不同激活操作激活的卵母細(xì)胞和NT單位的發(fā)育
胚胎移植在豬中進(jìn)行單細(xì)胞胚胎移植的方法是眾所周知的(參閱例如Pinkert等人，1993，本文收入它的內(nèi)容作為參考)。通常將20-30個(gè)NT(可多達(dá)100個(gè)NT)同步移植到已配種或未配種小母豬的輸卵管中。懷孕29天后，可以由受體小母豬回收核移植胎兒(轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因)?；蛘?，允許胎兒發(fā)育至分娩期(懷孕114天)并生成克隆豬子代。正如所述這些小母豬也將優(yōu)選包含“輔助”胚胎，如普通豬胚胎、單性豬胚胎、或四倍體胚胎。輔助胚胎的數(shù)目可在1-大約50個(gè)的范圍內(nèi)變化，通常是2-4個(gè)。caspase抑制劑在體外成熟、卵母細(xì)胞剝離、或激活過程中的使用如上所述，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，加入caspase抑制劑(如caspase3、8、或9)可增強(qiáng)由NT操作生成的胚泡的數(shù)目。下表提供了支持這種發(fā)現(xiàn)的一些數(shù)據(jù)。
同樣，為了方便讀者，下文概述了發(fā)明人正在使用的當(dāng)前優(yōu)選的豬卵母細(xì)胞移植方案。優(yōu)選克隆方法和材料的概述豬卵母細(xì)胞的核移植方案體外成熟在運(yùn)送途中在NCSU23+pFF+β-巰基乙醇+半胱氨酸+EGF+1000IUHCG/PMSG&cAMP中放置22小時(shí)，用H/H漂洗3次。
在4孔Nunc板中在不含激素的上述培養(yǎng)基中放置20小時(shí)。對豬卵母細(xì)胞的處理用0.68mg/ml透明質(zhì)酸酶(Hyal)進(jìn)行剝離，并旋渦震蕩3次，每次3分鐘。所需培養(yǎng)基HECM/HEPES+蔗糖(0.2567mg/10ml)NCSU23+蔗糖(0.2567mg/10ml)NSCU23融合培養(yǎng)基10μM甘露醇配方500ml Sigma水0.28甘露醇25.51g100μM MgSO40.0123g10mM組氨酸0.776g融合使核移植單位通過H/H與甘露醇的梯度1∶2、1∶1、和0∶2，然后在600μm槽中融合，并注滿甘露醇。
通過應(yīng)用100V、30μsec電脈沖進(jìn)行融合。立即將融合體置于純H/H中，然后置于NCSU23+Cyto B(3μl/2ml)中，在激活前進(jìn)行2小時(shí)。去核將卵母細(xì)胞暴露于NCSU23+蔗糖+HXT達(dá)至少20分鐘。
在H/H+蔗糖+Cyto B中進(jìn)行去核。
然后在移植前將卵母細(xì)胞置于NCSU23+蔗糖中。移植用鏈霉蛋白酶或TE制備細(xì)胞。
鏈霉蛋白酶--每個(gè)孔400μl，擱置，在H/H中稀釋，以6000rpm離心4分鐘，并重懸于H/H供使用。
TE--用于細(xì)胞解離的相同方案。
在H/H+蔗糖中進(jìn)行移植，并在完成后放回NCSU23+蔗糖中供融合。激活培養(yǎng)基H/H Z1(與H/H相同，但含1mg/ml BSA)。
3次處理間隔30分鐘。
1.置于H/H Z1+10μM離子霉素(4μl/2ml)中達(dá)4分鐘，用H/H漂洗，然后置于NCSU23+DMAP(1μl/ml)中達(dá)30分鐘。
2.再置于H/H Z1+5 1+2.5μM離子霉素然后是DMAP中達(dá)2小時(shí)。
漂洗激活后的NT單位以除去DMAP，然后在NCSU23中培養(yǎng)。
第3天更換培養(yǎng)基，第5天加入5％FBS，并培養(yǎng)直至形成胚泡。
雖然已經(jīng)通過某些具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可由此進(jìn)行許多修改和變化，而不違背本發(fā)明的精神。因此，所附權(quán)利要求意欲覆蓋屬于本發(fā)明真實(shí)精神和范圍之內(nèi)的所有修改和變化。
權(quán)利要求
1.克隆豬胎兒或活的子代的方法，包括a)在適合于形成核移植(NT)單位的條件下，將期望的分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核嵌入任選去核的豬卵母細(xì)胞或卵裂球中；b)若先前未除去，則由所述卵母細(xì)胞或卵裂球除去內(nèi)源細(xì)胞核；c)激活產(chǎn)生的NT單位；d)任選培養(yǎng)所述NT單位；并e)將所述任選培養(yǎng)的NT單位移植到宿主哺乳動(dòng)物中，使之發(fā)育成豬胎兒或動(dòng)物。
2.權(quán)利要求1的方法，其產(chǎn)生活的子代。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在所述分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去、或修飾期望的DNA，由此生成遺傳改變的NT單位。
4.權(quán)利要求3的方法，還包括將胎兒發(fā)育成子代。
5.權(quán)利要求1的方法，其包括培養(yǎng)所述激活的核移植單位直至超過2細(xì)胞發(fā)育階段。
6.權(quán)利要求1的方法，其中移植的NT單位是單細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的方法，其中移植是在激活的同一天進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在導(dǎo)入所述分化細(xì)胞或細(xì)胞核后將卵母細(xì)胞去核。
9.權(quán)利要求1的方法，其中分化細(xì)胞或細(xì)胞核是增殖中(非休眠)細(xì)胞的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述分化細(xì)胞處于G1、G2、或M期。
11.權(quán)利要求1的方法，其中豬卵母細(xì)胞在體外成熟。
12.權(quán)利要求1的方法，其中豬卵母細(xì)胞在體內(nèi)成熟。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核得自體細(xì)胞。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核得自生殖細(xì)胞。
15.權(quán)利要求1的方法，其中宿主動(dòng)物包含一個(gè)或多個(gè)輔助胚胎。
16.權(quán)利要求1的方法，其中分化細(xì)胞包含一處或多處當(dāng)在人體內(nèi)移植所述克隆胎兒或動(dòng)物的細(xì)胞、組織、或器官時(shí)可抑制排斥的遺傳修飾。
17.權(quán)利要求1的方法，其中分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核得自中胚層。
18.權(quán)利要求1的方法，其中分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核得自外胚層。
19.權(quán)利要求1的方法，其中分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核得自內(nèi)胚層。
20.權(quán)利要求1的方法，其中分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核是成纖維細(xì)胞或細(xì)胞核。
21.權(quán)利要求1的方法，其中分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核是成熟的分化細(xì)胞或由其衍生的細(xì)胞核。
22.權(quán)利要求1的方法，其中分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核是胚胎或胎兒細(xì)胞或者細(xì)胞核。
23.權(quán)利要求1的方法，其中分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核是直接得自豬的增殖中細(xì)胞。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述分化細(xì)胞或細(xì)胞核得自己在組織培養(yǎng)中擴(kuò)增的增殖中細(xì)胞。
25.權(quán)利要求1的方法，其中在核移植前將所述分化細(xì)胞或細(xì)胞核在體內(nèi)增殖。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述增殖豬細(xì)胞得自己注射豬細(xì)胞的SCID小鼠。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述增殖細(xì)胞經(jīng)過遺傳修飾。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述遺傳修飾是使用重組病毒、病毒載體、裸露的DNA、或質(zhì)粒載體進(jìn)行的。
29.權(quán)利要求1的方法，其中使去核卵母細(xì)胞在去核前成熟。
30.權(quán)利要求1的方法，其中融合的核移植單位通過暴露于一次或多次電脈沖而得到激活。
31.權(quán)利要求1的方法，其中融合的核移植單位通過暴露于離子霉素和DMAP而得到激活。
32.權(quán)利要求1的方法，其中融合的核移植單位通過暴露于至少一種衍生自精細(xì)胞的激活因子而得到激活。
33.權(quán)利要求3的方法，其中將顯微注射用于嵌入所述異源DNA。
34.權(quán)利要求3的方法，其中將電穿孔用于嵌入異源DNA。
35.依照權(quán)利要求1的方法獲得的克隆的、任選轉(zhuǎn)基因的豬胎兒或動(dòng)物，其中所述胎兒或動(dòng)物具有與先前存在的非胚性分化豬細(xì)胞相同的基因型，所述分化豬細(xì)胞任選已被遺傳修飾。
36.權(quán)利要求1的方法，還包括將克隆的NT單位與受精胚胎聯(lián)合使用以生成嵌合胚胎。
37.權(quán)利要求36的方法，其中包括將嵌合胚胎發(fā)育成子代。
38.依照權(quán)利要求36的方法得到的嵌合胎兒。
39.依照權(quán)利要求37的方法得到的嵌合子代。
40.權(quán)利要求39的嵌合子代的后代。
41.生成豬CICM(多能)細(xì)胞系的方法，包括a)在適合于形成核移植(NT)單位的條件下，將期望的分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核嵌入任選去核的豬卵母細(xì)胞中；b)若先前未進(jìn)行，則除去內(nèi)源卵母細(xì)胞細(xì)胞核；c)激活產(chǎn)生的NT單位；d)培養(yǎng)得自所述培養(yǎng)NT單位的細(xì)胞以獲得豬CICM細(xì)胞系，它是多能的且可在組織培養(yǎng)中無限期維持。
42.權(quán)利要求41的方法，其中包括培養(yǎng)所述激活的核移植單位直至獲得可辨別的滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。
43.依照權(quán)利要求41的方法獲得的CICM細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系是多能的且具有與先前存在的非胚性分化細(xì)胞相同的基因型。
44.權(quán)利要求41的方法，其中在所述分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核中插入、除去、或修飾期望的DNA，由此產(chǎn)生遺傳改變的NT單位。
45.依照權(quán)利要求44的方法獲得的轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系具有與先前存在的經(jīng)過遺傳修飾的豬分化細(xì)胞相同的基因型。
46.權(quán)利要求41的方法，其中對產(chǎn)生的CICM細(xì)胞系進(jìn)行誘導(dǎo)而分化。
47.權(quán)利要求44的方法，其中使CICM細(xì)胞發(fā)生分化。
48.依照權(quán)利要求46的方法獲得的分化細(xì)胞。
49.克隆豬胎兒或活的子代的方法，包括a)激活任選去核的豬卵母細(xì)胞；b)在所述激活步驟a之后或接近同時(shí)，將期望的分化豬細(xì)胞或細(xì)胞核移植到所述豬卵母細(xì)胞中以生成NT單位；c)若卵母細(xì)胞先前未去核，則除去內(nèi)源卵母細(xì)胞細(xì)胞核；并任選經(jīng)培養(yǎng)步驟，然后將所述NT單位移植到雌豬中以生成豬胎兒或動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于核移植的改進(jìn)方法,包括將供體分化豬細(xì)胞核移植到去核豬卵母細(xì)胞中。產(chǎn)生的核移植單位可用于通過生成胎兒和子代來增殖基因型和轉(zhuǎn)基因基因型。本發(fā)明有助于生成遺傳工程或轉(zhuǎn)基因的豬胚胎、胎兒、和子代,因?yàn)榭蛇z傳修飾并克隆增殖供體細(xì)胞核的分化細(xì)胞來源。
文檔編號C12N15/09GK1377225SQ00813714
公開日2002年10月30日 申請日期2000年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月13日
發(fā)明者S·L·斯蒂斯, J·賽貝利, J·羅貝爾, P·格魯克 申請人:馬薩諸塞大學(xué)