專利名稱：重組仙臺病毒載體的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及重組病毒載體的純化方法，更具體是應(yīng)用于重
組仙臺病毒純化。
背景技術(shù)：
基因治療是當(dāng)今最具發(fā)展前景和發(fā)展最快的前沿生物技術(shù)之一。研究結(jié)果表明很 多疾病都是由于直接或間接原因基因自身出現(xiàn)異常及功能障礙導(dǎo)致的。隨著人類基因組的 解析，有關(guān)疾病與基因關(guān)系的信息越來越多?；蛑委熅褪前雅c疾病有關(guān)的基因制成藥劑 導(dǎo)入患者體內(nèi)，達(dá)到治療疾病的目的。這是一種尖端信息快速轉(zhuǎn)為實(shí)用化的最新醫(yī)療技術(shù)。
—般的基因治療載體，進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)作為DNA來表達(dá)目的基因所編碼的蛋白。 在細(xì)胞核內(nèi)有整合到靶細(xì)胞的染色體上，或者與染色體DNA發(fā)生基因重組的危險(xiǎn)。有報(bào)告 表明，雖然發(fā)生頻率極低，但逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有誘發(fā)白血病的可能。另外，已知腺相關(guān)病毒 載體在被整合的染色體附近，可引起局部的不可逆性的染色體結(jié)構(gòu)變化。因此，在使用這些 載體時(shí)必須慎重考慮利弊問題。仙臺病毒載體是細(xì)胞質(zhì)型RNA載體，對各種動物細(xì)胞有較 高的感染效率；它本身不進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行基因表達(dá)，在理論上不存在改變細(xì) 胞核內(nèi)染色體的危險(xiǎn)性，與其他載體相比具有更高的安全性。從根本上解決以往載體存在 的生物安全隱患的不足之處。 在臨床前研究中，重組仙臺病毒載體在重度下肢缺血基因治療制劑、阿耳茨海默 病(早老性癡呆癥)疫苗、艾滋病疫苗都表現(xiàn)出了極好的治療效果。由于仙臺病毒載體的 基因表達(dá)水平很高，可望獲得以往載體所不能實(shí)現(xiàn)的更好的治療效果。此外，該載體即使是 較少劑量也可發(fā)揮相應(yīng)的治療效果，相比其他載體需要幾十分鐘以上的細(xì)胞接觸才能獲得 較滿意的基因?qū)胄Ч?，重組仙臺病毒載體僅在幾分鐘之內(nèi)便可完成，在臨床上可以減輕
患者及醫(yī)生的負(fù)擔(dān)，是一種非?？旖輰?shí)用的載體。因此仙臺病毒載體有比較廣闊的應(yīng)用前
旦 豕。 重組病毒在對于所有應(yīng)用之前，都要在宿主細(xì)胞中增殖之后從宿主細(xì)胞中進(jìn)行純 化這一過程。 一般的方法包括細(xì)胞培養(yǎng)、感染宿主細(xì)胞、收獲裂解宿主細(xì)胞、濃縮粗制裂解 物、核酶消化處理、以及進(jìn)一步層析純化。大多數(shù)改良的方法都集中在選用不同性質(zhì)的層析 介質(zhì)和超速離心。本發(fā)明是利用了仙臺病毒蛋白的特點(diǎn)創(chuàng)造性的提出了新的純化途徑，其 過程是將收集的病毒初始液與來源于動物的紅細(xì)胞在低溫下混合一定的時(shí)間，然后在低溫 條件下低速離心，收集沉淀；沉淀再用洗液洗滌，洗滌后的沉淀在37t:溫浴一定的時(shí)間，然 后在室溫條件下低速離心，收集上清液即為病毒純品。收集的病毒純品也可以選用相應(yīng)的 層析介質(zhì)做進(jìn)一步的精純化。 為更好的說明本發(fā)明的內(nèi)容，對仙臺病毒的結(jié)構(gòu)做簡單的介紹。
仙臺病毒(Sendai virus, SeV)屬于副粘病毒科副粘病毒亞科、呼吸道病毒屬病 毒，為單股負(fù)鏈RNA病毒。RNA分子量4. 76X 106D，病毒粒子多是呈圓形，直徑130 250nm。 病毒內(nèi)部由直徑約18nm的螺旋狀對稱結(jié)構(gòu)的核蛋白組成，外包有脂蛋白囊膜，其上有放射狀排列的纖突，纖突長8 15nm，寬2 4nm。 仙臺病毒的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)野生型SeV為嗜肺的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組 全長15384個(gè)核苷酸，編碼核蛋(皿cleoprotein， NP)、磷蛋白(phosphoprotein， P)、 基質(zhì)蛋白(matrix protein, M)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝素神經(jīng)氨酸酶 (hemagglutinin—neuraminidase, HN)禾口大分子蛋白(large protein, L) 6禾中結(jié)構(gòu)蛋白禾口 C、 V、W等一些非結(jié)構(gòu)蛋白?；蚺帕写涡?yàn)? '-leader-NP-P/C-M-F-HN-L-leader-5'。其中HN、 F蛋白為跨膜糖蛋白，位于 病毒表面，形成剌突，又稱為剌突蛋白(spiker protein). M蛋白排列在包膜內(nèi)表面.NP 蛋白與病毒基因組RNA結(jié)合，形成螺旋狀的核衣殼，再結(jié)合P蛋白、L蛋白形成核蛋白 (ribo皿cleo-protein， RNP)復(fù)合體，構(gòu)成病毒的核心結(jié)構(gòu).P/C基因區(qū)還包含一個(gè)病毒特 有的非結(jié)構(gòu)蛋白C的編碼區(qū)，除非結(jié)構(gòu)蛋白C外，每個(gè)基因上、下游各有一個(gè)非編碼序列R1、 R2，對基因表達(dá)有特殊的調(diào)控功能。SeV RNA3 '端和5'端各有1個(gè)51nt和54nt的前導(dǎo) (leader)序列，它們與病毒在宿主內(nèi)復(fù)制及致病有關(guān).
SeV編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 HN蛋白HN蛋白為同源四聚體的II型跨膜糖蛋白，其基因在進(jìn)化中高度保守，編碼 區(qū)有1728bp，可編碼575個(gè)氨基酸殘基，其中1 35aa殘基位于包膜內(nèi)，36 60aa為疏水 氨基酸組成的跨膜區(qū)，61 575aa殘基位于包膜外.HN蛋白有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分 別位于N77、N499禾P N511 ，成熟的HN蛋白只有N77、N499和N511被糖基化。N499禾P N511糖 基化對于細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和促進(jìn)融合至關(guān)重要。254 259aa殘基組成的六肽鏈N-R-K-S-C-S, 是神經(jīng)氨酸酶的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)，與病毒吸附穿入有關(guān)。 目前已知HN有3種功能1)吸附宿主細(xì)胞表面受體。病毒借助HN與細(xì)胞表面含 唾液酸的受體結(jié)合，使病毒吸附于宿主細(xì)胞表面。2)具有神經(jīng)氨酸酶活性，可裂解宿主細(xì)胞 膜寡糖鏈末端唾液酸，促進(jìn)子代病毒顆粒從感染的細(xì)胞表面釋放.3)與F蛋白協(xié)同作用促 進(jìn)細(xì)胞融合.HN的這3種功能相對獨(dú)立，定位于HN蛋白的不同區(qū)域，如C端的444個(gè)氨基 酸殘基主要負(fù)責(zé)受體識別和神經(jīng)氨酸酶活性，而與F蛋白相互作用促進(jìn)細(xì)胞融合的功能與 和跨膜區(qū)比鄰的膜外區(qū)82個(gè)氨基酸殘基有密切關(guān)系。 研究表明HN膜內(nèi)區(qū)可與其他病毒蛋白特異性的相互作用，在子代病毒組裝中起 重要作用.進(jìn)一步比較各株SeV及I型人副流感病毒HN膜內(nèi)區(qū)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)短肽 S-Y-W-S-T高度保守，暗示它有重要的生物學(xué)作用。 F蛋白病毒包膜與細(xì)胞膜融合是包膜病毒穿入宿主細(xì)胞的主要方式。SeV F蛋白 具有膜融合活性，與病毒致病性有關(guān)。 M蛋白M蛋白是非糖基化的內(nèi)膜蛋白，位于病毒包膜內(nèi)表面，1173個(gè)核苷酸編碼
348個(gè)氨基酸。M蛋白富含堿性氨基酸。即使病毒包膜被去污劑破壞的情況下，也能維持緊
湊的病毒結(jié)構(gòu)。M蛋白含有5個(gè)半胱氨酸殘基，分別位于83、 106、 158、251 、295位，即使在副
粘病毒亞科這些半胱氨酸殘基也是很保守的，說明它們有重要的生物學(xué)功能。 P/C蛋白P/C基因編碼區(qū)1821-3550bp。根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道，由于RNA轉(zhuǎn)錄后加工
和多個(gè)0RF的重疊，P/C基因共可編碼8種蛋白C'、C、Y1、Y2、P、V、W和X蛋白。8種蛋白
中最大的是P蛋白，共568個(gè)氨基酸。P、 V和W蛋白N端317個(gè)氨基酸相同。L蛋白L基因編碼序列為8556 15242nt。編碼2228個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量單位為
4245kd左右，是SeV編碼的最大蛋白。只有L蛋白與P蛋白形成復(fù)合物，才具有RNA多聚酶 的活性，在病毒RNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA5 '帽結(jié)構(gòu)甲基化等發(fā)揮作用。 NP蛋白NP基因編碼區(qū)1575bp，編碼524個(gè)氨基酸。NP蛋白自身相互作用，同時(shí)包 裹病毒RNA形成左手螺旋的核衣殼。 基于以上SeV編碼蛋白的功能，特別是仙臺病毒外膜表面存在的HN蛋白可與紅細(xì) 胞表面唾液酸殘基結(jié)合，同時(shí)兼具唾液酸酶活性，可裂解細(xì)胞表面糖蛋白上的唾液酸殘基， 但在低溫下HN主要表現(xiàn)出的是唾液酸的結(jié)合活性，仙臺病毒可以與紅細(xì)胞結(jié)合；在適當(dāng)?shù)?升高溫度的條件下表現(xiàn)的是神經(jīng)氨酸酶活性，仙臺病毒可以與紅細(xì)胞分開。利用該特點(diǎn)我 們創(chuàng)造性的提出 一種純化仙臺病毒的方法。
實(shí)施例l雞紅細(xì)胞液的制備 1).采雞血用注射器吸取阿氏液約lml，取3日齡 10日齡SPF雞(最少兩只)， 從胸骨尖下方約1. 3cm處將注射器針頭剌入心臟。吸取心血約2ml 4ml 。與阿氏液輕輕 混合，放入裝有10ml阿氏液的離心管中， 2)洗滌雞紅胞將離心管中的血液經(jīng)1500r/min 1800r/min離心8min，棄上清 液，沉淀 物加入阿氏液，輕輕混合后，再經(jīng)1500r/min 1800r/min離心8min，用吸管移去 上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)以上過程后，加入阿氏液20ml，輕輕混合成 紅細(xì)胞懸液，4度保存5天備用。 3)雞紅細(xì)胞懸液取阿氏液保存不超過5天的紅細(xì)胞液，在錐形刻度離心管中離 心1500r/Min-1500r/min離心8min，棄去上清液，加人PBS，用吸管反復(fù)吹吸使PBS與紅細(xì) 胞均勻混合，制成紅細(xì)胞液。
實(shí)施例2重組病毒的純化 1)病毒初始液與實(shí)施例1制備的紅細(xì)胞液在低溫(優(yōu)先4°C 8°C )下混合一定 的時(shí)間，優(yōu)先選擇0. 5小時(shí) 2小時(shí)； 2)然后在低溫(優(yōu)先4°C 8°C )條件下低速(優(yōu)先選擇1000rpm/m 4000rpm/ m)離心，收集沉淀； 3)沉淀再用洗液(PBS，含一定濃度的BSA)洗滌；
4)洗滌后的沉淀在32°C 38t:溫浴5分鐘 30分鐘； 5)然后在室溫條件下低速(優(yōu)先選擇1000rpm/m 3000rpm/m)離心，收集上清液
即為病毒純品。純化的病毒電鏡照片，見附圖1。 實(shí)施例3.重組病毒的純度鑒定(SDS-PAGE電泳) 方法參考分子克隆3，采用10% SDS-PAGE法進(jìn)行，加樣量為4. 0 X 108CIU， SDS-PAGE電泳，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，脫色，照相，與仙臺病毒對照品梯度SDS-PAGE圖譜 比較，判斷是否含仙臺病毒的7條特征帶。見附圖2。
實(shí)施例4 SDS-PAGE電泳純度檢查 采用10%梯度SDS-PAGE法進(jìn)行，加樣量為4. OX 108CIU，電泳，凝膠用考馬斯亮藍(lán) 染色，脫色后用掃描儀掃描，用圖片分析軟件alpha-Image對電泳條帶進(jìn)行分析，計(jì)算仙臺 病毒特征帶蛋白總量占總蛋白量的百分比。參考附圖3
實(shí)施例5 病毒滴度測定
1.將病毒從-80 °C冰箱中取出，立即放于37 °C水浴鍋中搖5秒鐘，待融化后取出，
放于4t:冰箱中待用。 2.取U型底96孔板放在生物安全柜中，向各孔加入PBS，50u1/孔，共16個(gè)孔。
3.取病毒50ul加在第一孔，用加樣器反復(fù)混勻10次，取50ul加到下一孔中，如此 依次稀釋到第15 L在第15孔中取出50ul棄掉；第16孔設(shè)為陰性對照，只加50ul PBS。
4.向各孔中加入新鮮配制的雞紅細(xì)胞，8Xl(fcells/ml，50ul/孔。順序?yàn)橄燃雨?性孔(第16孔)，再依從稀到濃的順序加入雞紅細(xì)胞，蓋上蓋子，輕輕拍打板子側(cè)面，使之混 勻。 5. 4"放置1小時(shí)，觀察結(jié)果，照相，記錄。 6結(jié)果判定血球完全凝集者判為陽性，凝集終點(diǎn)為最后一個(gè)完全凝集的孔(示例
中第11個(gè)孔)，病毒滴度按以下公式計(jì)算 病毒滴度=凝集終點(diǎn)孔的病毒稀釋度 病毒粒子密度=8X107XA A為病毒滴度 示例中的病毒樣品滴度為1 : 2， 048 病毒粒子密度為8 X 107X 2048 = 1. 64X 10"VP/ml 。 實(shí)施例6 —種重組仙臺病毒純化系統(tǒng)，或者一種重組仙臺病毒純化試劑盒，其組 成包括來源于動物的紅細(xì)胞、含BSA的細(xì)胞洗液。


附圖1本發(fā)明方法純化的病毒電鏡照片。 附圖2本發(fā)明方法純化的病毒SDS-PAGE電泳圖譜，判斷是否含仙臺病毒的7條特 征帶。左邊為低分子量Marker,中間為本發(fā)明方法純化的樣品，右邊為次高分子量Marker。
1 :L，2 :P，3 :HN，4 :NP，5 :P'，6 :&，7 :M 附圖3本發(fā)明方法純化的病毒SDS-PAGE電泳圖譜純度鑒定，對7條特征帶的含量 用分析軟件alpha-Imag做出分析。L， P， HN， NP， P， Fn M比例依次為4. 7 % ， 6. 6 % ， 22. 0 % ， 34. 0%，6. 3%，4. 4%，22. 1%。 附圖4 :血球完全凝集者判為陽性，凝集終點(diǎn)為最后一個(gè)完全凝集的孔(示例中第
11個(gè)孔)，病毒滴度按以下公式計(jì)算 病毒滴度=凝集終點(diǎn)孔的病毒稀釋度 病毒粒子密度=8X107XA A為病毒滴度 示例中的病毒樣品滴度為1 : 2， 048 病毒粒子密度為8 X 107X 2048 = 1. 64X 10"VP/ml 。
權(quán)利要求
一種重組仙臺病毒的純化方法，其特征是過程包括以下步驟(1)收集來源于動物的紅細(xì)胞；(2)病毒初始液與紅細(xì)胞在低溫下混合一定的時(shí)間；(3)然后在低溫條件下低速離心，收集沉淀；(4)沉淀再用洗液洗滌；(5)洗滌后的沉淀在37℃溫浴一定的時(shí)間；(6)然后在室溫條件下低速離心，收集上清液即為病毒純品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l，所述的動物紅細(xì)胞優(yōu)先來源于雞紅細(xì)胞。
3 根據(jù)權(quán)利要求l，所述的病毒初始液與紅細(xì)胞混合的條件為2°C 8°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l，所述的病毒初始液與紅細(xì)胞混合的時(shí)間為0. 5 2小時(shí)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l，所述的病毒初始液與紅細(xì)胞低溫低速離心條件為2000rpm/m，時(shí)間 為10 30分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l，所述上清液洗液優(yōu)先為含BSA的PBS。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l，所述病毒純品可以用層析法進(jìn)一步純化。
8. —種重組仙臺病毒純化系統(tǒng)，其組成包括來源于動物的紅細(xì)胞、洗液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組仙臺病毒的純化方法，其過程是將收集的病毒初始液與來源于動物的紅細(xì)胞在低溫下混合一定的時(shí)間，然后在低溫條件下低速離心，收集沉淀；沉淀再用洗液洗滌，洗滌后的沉淀在37℃溫浴一定的時(shí)間，然后在室溫條件下低速離心，收集上清液即為病毒純品。
文檔編號C12N7/02GK101735990SQ200810225790
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者許允立 申請人:本元正陽基因技術(shù)有限公司