專(zhuān)利名稱(chēng)：永生化禽細(xì)胞系的制作方法
永生化禽細(xì)胞系
本發(fā)明涉及永生化禽細(xì)胞系，以及這些細(xì)胞在制備病毒中的用途。本
發(fā)明的細(xì)胞具體可用于制備重組病毒it體，其可用于制備治療動(dòng)物更具體 是人的治療和/或預(yù)防組合物。
真核細(xì)胞系是制備病毒疫苗和許多生物技術(shù)產(chǎn)品的基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)物 中的生物產(chǎn)品包括酶，激素，免疫生物物質(zhì)(單克隆抗體，白介素，淋巴因 子)，和抗癌劑。盡管許多更簡(jiǎn)單的蛋白可利用細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生，更復(fù)雜的糖 基化蛋白質(zhì)目前必須在真核細(xì)胞中制備。
禽細(xì)胞多年來(lái)已經(jīng)用于制備病毒載體。例如，用于制備治療痘癥的預(yù)
防組合物的痘苗病毒在雞胚纖維母細(xì)胞(CEF)上培養(yǎng)。禽細(xì)胞非常有用，這 是由于許多用于藥物組合物中的病毒能在其上復(fù)制。更值得注意的是，多 種病毒僅能在禽細(xì)胞上生長(zhǎng)。例如哺乳動(dòng)物安卡拉病毒(MVA)，其不能在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞上生長(zhǎng)。這種痘病毒通過(guò)將痘苗病毒在CEF上傳代500次獲 得，用于17世紀(jì)早期對(duì)免疫缺陷人群進(jìn)行接種以對(duì)抗痘癥?，F(xiàn)在MVA主 要用作基因治療目的的載體。例如，MVA用作MUC1基因的載體用于接 種病人對(duì)抗表達(dá)該抗原的腫瘤(Scholl et al., 2003， J Biomed Biotechnol., 2003， 3， 194-201)。攜帶編碼HPV抗原的基因的MVA也用作載體用于治療 禽肉瘤。最近，MAV作為可選載體來(lái)制備針對(duì)新出現(xiàn)的疾病或可能的生物 武器諸如西尼羅河病毒和炭疽的預(yù)防性治療。
因此，對(duì)病毒制備的需要不斷增長(zhǎng)。目前，最有用的MVA生產(chǎn)方法 包括在CEF上的病毒復(fù)制步驟。但是CEF的應(yīng)用有很多困難。首先，CEF 的制備包括很多必須人工進(jìn)行的步驟。
此外，該病毒制備方法有賴(lài)于卵的可用性，在繁殖污染的情況下可能 完全破壞。這個(gè)問(wèn)題與禽流感播散越來(lái)越相關(guān)。
此外，許多CEF具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性(RT)。 RT是逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制所需的 酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒見(jiàn)于許多不同物種。RT在人或動(dòng)物中不是感染性的，并且 不導(dǎo)致人中的任何不良健康影響。利用高度敏感的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)的測(cè)定法，在利用雞胚纖維母細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗中檢測(cè)到微量的RT活
6性。該酶的來(lái)源很可能是編碼RT的部分病毒基因組，據(jù)信在數(shù)百甚至數(shù) 千年之前整合到雞細(xì)胞中。產(chǎn)生這種酶的禽逆轉(zhuǎn)錄病毒不影響人。雖然人 免疫缺陷病毒(HIV，導(dǎo)致AIDS的病毒)是逆轉(zhuǎn)錄病毒，疫苗中檢測(cè)的RT 活性絕對(duì)不是源自HIV的。此外，RT的檢測(cè)不能確定逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在。 然而，沒(méi)有內(nèi)源性RT活性的細(xì)胞系是感興趣的。
為了使得病毒制備過(guò)程不受CEF使用的約束，需要允許病毒復(fù)制和產(chǎn) 生的禽細(xì)胞系。永生化細(xì)胞系可在生產(chǎn)位點(diǎn)在不同批次中保持或冷凍，并 總是可用于新的制備過(guò)程。此外，它們還局限在生產(chǎn)工廠，不容易收到外 源污染物的污染。它們的使用允許制備過(guò)程所需的人工操作明顯減少。所 有這些性質(zhì)導(dǎo)致價(jià)格降低、生產(chǎn)持續(xù)時(shí)間縮短以及潛在污染減少。
最后，細(xì)胞系可充分表征并且由此完全符合良好的實(shí)驗(yàn)室操作以及不 同藥劑的要求。
不同禽細(xì)胞系已經(jīng)被描述。例如DF1 (US5,879，924),是自發(fā)永生化雞 細(xì)胞系，其衍生自10日齡East Lansing Line (ELL-0)卵。所述細(xì)胞可用作病 毒增殖，重組蛋白表達(dá)和重組病毒產(chǎn)生的基質(zhì)。然而，該細(xì)胞系容易被多 種病毒感染，所述病毒諸如Meleagrid皰疹病毒1 (火雞皰疹病毒)，雞痘病 毒，呼腸病毒，禽肉瘤白血病病毒和勞斯肉瘤病毒。
永生禽細(xì)胞也可通過(guò)逐步從生長(zhǎng)因子和喂養(yǎng)層分開(kāi)而衍生自胚胎千細(xì) 胞，由此保持生長(zhǎng)特征以及模糊的未分化干細(xì)胞的壽命特征。該方法衍生 的唯一的可得禽細(xì)胞系是Ebx雞細(xì)胞系(W02005007840)，其與鼠源喂養(yǎng)層 接觸，導(dǎo)致另外的調(diào)節(jié)問(wèn)題諸如鼠病毒污染和雞細(xì)胞中內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序 列的存在。此外，該細(xì)胞系在一些條件下不穩(wěn)定并且易于分化。
鴨胚永久細(xì)胞系，不包含內(nèi)源性禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，也被建立。該細(xì)胞系 稱(chēng)為DEC 99 (Ivanov et al. Experimental Pathology And Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences),已經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)超過(guò)140代，并且對(duì)于鳥(niǎo)類(lèi) 而言是非致瘤性的。DEC99細(xì)胞系是研究用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可用于生 物技術(shù)中。該細(xì)胞系是研究細(xì)胞生物學(xué)，病毒需，免疫學(xué)，毒理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn) 模型，并用于制備診斷劑和疫苗。永久鴨胚細(xì)胞系(CL)DEC 99對(duì)胚-適應(yīng) 禽痘病毒(embryo-adapted avian poxvirus) (APV)疫苗株的易感性已經(jīng)被研究 (Ivanov et al. Experimental Pathology. And Parasitology, 4/6 2001 BulgarianAcademy of Sciences)。禽和鵒子來(lái)源的FK和Dessau疫苗株已被使用。病 毒株在原代鴨胚細(xì)胞培養(yǎng)物(CC)上連續(xù)傳代(13代)。適應(yīng)的病毒株在DEC 99細(xì)胞系的CC上進(jìn)一步傳代(12代)，觀察到典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。 感染性病毒粒子的產(chǎn)生通過(guò)接種11-日齡白色來(lái)亨雞胚來(lái)檢査，在絨毛尿 囊膜(CAMs)上形成典型的痘增殖。在DEC99細(xì)胞中，F(xiàn)K株導(dǎo)致早期CPE, 與Dessau株形成對(duì)比，并達(dá)到滴度106,25 CCID50/ml。接種2月齡雛雞后， DEC 99-適應(yīng)的病毒株誘導(dǎo)常見(jiàn)的表皮病變("takes")。因此DEC 99作為標(biāo) 準(zhǔn)CC系統(tǒng)適合抗禽痘疫苗的制備。但是這種具體的細(xì)胞系在第40代之后 生長(zhǎng)緩慢并不能懸浮生長(zhǎng)。 .
人腺病毒5的早期區(qū)域的核酸序列已經(jīng)用于體外轉(zhuǎn)化一些特定的人細(xì) 胞(293和PER. C6細(xì)胞系；Fallaux，F(xiàn). J. etal.， Hum. Gene Ther. 9 : 1909-17 (1998); Graham, F. L. et al.， J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977))。
通常而言，腺病毒基因組由大約36kb的雙鏈線性DNA分子組成，其 中包含編碼超過(guò)30個(gè)蛋白的序列。在每個(gè)末端，根據(jù)血清型不同，存在作 為100-150個(gè)核苷酸的短反向序列的ITR(反向末端重復(fù))。ITR參與腺病毒 基因組復(fù)制。大約300個(gè)核苷酸的衣殼化區(qū)域位于基因組5'末端緊接著 5'ITR之后。
早期基因分布在分散于腺病毒基因中的4個(gè)區(qū)域中，稱(chēng)為El-E4 (E表 示早期)。早期區(qū)域包含至少6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，其具有自己的啟動(dòng)子。早期 基因的表達(dá)是自我調(diào)節(jié)的， 一些基因在其他之前表達(dá)。三個(gè)區(qū)域E1,E2和 E4,對(duì)于病毒復(fù)制必不可少。因此，如果腺病毒的一個(gè)或這些功能有缺陷， 意味著其不能產(chǎn)生至少一種這些區(qū)域之一編碼的蛋白，該蛋白將需要反式 供給該病毒。
El早期區(qū)域位于腺病毒基因組5'末端，含有2個(gè)病毒轉(zhuǎn)錄單元，分別 為E1A和E1B。該區(qū)域編碼非常早地參與病毒循環(huán)并對(duì)于腺病毒的幾乎所 有其他基因的表達(dá)必不可少的蛋白。具體地，E1A轉(zhuǎn)錄單元編碼反式激活 其他病毒基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白，包括自E1B,E2A，E2B和E4區(qū)域的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。
Guilhot et al. (Guilhot, C. et al., Oncogene 8 : 619畫(huà)24(1993))顯示，Ad5的
E1A的12S蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致鵪鶉細(xì)胞的永生。但是，WO2005042728公開(kāi)了不可能在ElA基因通過(guò)裸露DNA的轉(zhuǎn)染取代逆轉(zhuǎn) 錄病毒轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入時(shí)永生化禽細(xì)胞。WO2005042728中還稱(chēng):"經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄 病毒感染的極其有效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生大到足以容納具有自發(fā)基因組改變 的單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞池，所述改變阻斷了在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤失活時(shí)通常誘導(dǎo) 的凋亡."(第10頁(yè))。
逆轉(zhuǎn)錄病毒序列在Guilhot等所得細(xì)胞中的存在阻礙了所述的細(xì)胞在 制備生物產(chǎn)品更具體為治療性化合物中的用途。
發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)禽細(xì)胞具體是番鴨(cm'n'加mosc/iato)細(xì)胞可有效通 過(guò)非病毒載體的E1A轉(zhuǎn)染永生化。
為了解決與CEF使用和/或之前可得細(xì)胞系的使用有關(guān)的不同問(wèn)題，本 發(fā)明提供了包含E1A核酸序列的永生化禽細(xì)胞，所述細(xì)胞通過(guò)包括用非病 毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟的方法獲得，^f述載體包含所述ElA核酸序列，并 且其中所述細(xì)胞不包含E1B核酸序列。
本發(fā)明還涉及永生化禽細(xì)胞的方法，包括用非病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞 的步驟，所述載體包含E1A核酸序列，并且所述方法不包括用E1B核酸序 列轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的步驟。
永生化細(xì)胞，如本發(fā)明所述，指能在培養(yǎng)中生長(zhǎng)超過(guò)35代的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)傳代數(shù)指細(xì)胞群體從培養(yǎng)容器中取出并經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)從而使得細(xì) 胞密度足夠低以刺激進(jìn)一步的生長(zhǎng)的次數(shù)。
本發(fā)明中所用術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"和"一種"指所述的組分或步驟為"至少 一個(gè)"，"至少第一個(gè)"，"一或多個(gè)"或"多個(gè)"，除非另有明確說(shuō)明。 例如，術(shù)語(yǔ)"一種細(xì)胞"包括多個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。
術(shù)語(yǔ)"和/或"在使用時(shí)包括"和"，"或"，以及"所有或任何其他 與該術(shù)語(yǔ)相關(guān)元素的組合"。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"包含"意圖指所述產(chǎn)品，組合物和方法包括參考的組分 或步驟，但不排除其他。"基本上由…。.,組成"用于限定產(chǎn)品，組合物和 方法時(shí)，表示排除任何必不可少的其他組分或步驟。因此基本上由所述組 分組成的組合物不排除微量污染物以及可藥用載體。"由......組成"表示
排除超過(guò)微量的其他組分或步驟。本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"E1A核酸序列"指腺病毒E1A區(qū)域的所有基因產(chǎn)物的核 酸序列，包括編碼兩種主要RNA: qS和12S的核酸序列。
術(shù)語(yǔ)"E1A核酸序列"指下述核酸序列，其包含與SEQIDNO:l具有 至少60%氨基酸序列相同性的核酸序列。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，E1A指 這樣的核酸序列，其包含與SEQIDNO:l具有至少70。/。，優(yōu)選至少80%， 更優(yōu)選至少90%核酸序列相同性的核酸序列。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，E1A 指核酸序列SEQ IDNO:l。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"E1B核酸序列"指腺病毒E1B區(qū)域的所有核酸序列，包 括編碼19 kd和55 kd的三種主要多肽的核酸序列。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"基本相同的核酸序列"指與參比多核苷酸具有足夠相同 性的核酸分子，從而其將在中度嚴(yán)格雜交條件下與參比核苷酸雜交。 一個(gè) 實(shí)施方案中，核酸分子具有與參照核苷酸序列SEQ ID NO:l基本相同核苷 酸序列。
雜交指核酸互補(bǔ)鏈通過(guò)氫鍵相互結(jié)合(即有義反義鏈或探針靶
DNA)，所述的氫鍵類(lèi)似染色體DNA中天然存在的鍵合。雜交給定探針 與耙DNA的嚴(yán)格程度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易確定。
術(shù)語(yǔ)"嚴(yán)格雜交"指使得多聚核酸雜合子穩(wěn)定的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知，雜合子的穩(wěn)定性受雜合子熔解溫度(Tm)的影響。通常，雜合子 穩(wěn)定性是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)。通常，雜合反應(yīng)在低嚴(yán)格條件下進(jìn)行， 然后在可變但較高的嚴(yán)格條件下洗滌。雜合嚴(yán)格度也涉及所述洗滌條件。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"中度嚴(yán)格雜交"指允許革巴-DNA結(jié)合互補(bǔ)核酸的條件，所 述核酸與靶DNA具有大約60%相同性，優(yōu)選大約75%相同性，更優(yōu)選大 約85%相同性，特別優(yōu)選與耙DNA具有大約90。/。相同性。優(yōu)選的高度嚴(yán) 格條件是等同在50%甲酰胺，5*Denhart's溶液，5*SSPE, 0.2% SDS中，在 42° C雜交，然后在0.2*SSPE， 0.2% SDS，在65° C洗滌的條件。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"非病毒載體"指質(zhì)粒來(lái)源的載體，可選所述載體與一或 多種改善轉(zhuǎn)染效率和/或所述載體穩(wěn)定性和/或針對(duì)宿主生物體免疫系統(tǒng)的 對(duì)所述載體的體內(nèi)保護(hù)的物質(zhì)組合。這些物質(zhì)在本領(lǐng)域已知的文獻(xiàn)中廣泛 記載(見(jiàn)例如Feigner et al.， 1987， Proc, West. Pharmacol. Soc。 32， 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al.，1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654)。作為舉例而非限制，它們可以是多聚物，脂質(zhì)，具體是陽(yáng)離子脂質(zhì)，脂質(zhì)體，核蛋白或中性脂質(zhì)。這些物質(zhì)可單獨(dú)使用或組合使用。所述化合物的例子具體見(jiàn)于專(zhuān)利申請(qǐng)WO 98/08489， WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853,EP 890362或WO 99/05183。已知的組合例如質(zhì)粒重組載體與陽(yáng)離子脂質(zhì)(DOGS， DC-CHOL， spermine-chol, spermidine-chol等)和中性脂質(zhì)(DOPE)的組合。
用于本發(fā)明的質(zhì)粒的選擇很廣泛。它們可以是克隆和/或表達(dá)載體。通常，其為本領(lǐng)域已知的并且多數(shù)是可購(gòu)得的，但可構(gòu)建它們或通過(guò)遺傳工程化技術(shù)修飾它們。例如，衍生自pBR322(GibcoBRL),pUC(GibcoBRL),pBluescript (Stratagene)， pREP4， pCEP4 (Invitrogene)或p Poly (Lathe et al"1987, Gene 57， 193-201)的質(zhì)粒。優(yōu)選，本發(fā)明的質(zhì)粒含有保證在制備細(xì)胞和/或宿主細(xì)胞中復(fù)制開(kāi)始的復(fù)制起點(diǎn)(例如，ColEl起點(diǎn)可根據(jù)意圖在大腸桿菌中制備的質(zhì)粒選擇，并且如果需要在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中自主復(fù)制可選擇oriP/EBNAl系統(tǒng)，Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5,2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815)，其可包含額外的改善其在給定細(xì)胞中的保持和/或穩(wěn)定性的元件(cer sequence which promotes themonomelic maintenance of a plasmid(Summers and Sherrat, 1984， Cell 36,1097-1103， sequences for integration into the cell genome)。
術(shù)語(yǔ)"非病毒載體"排除了病毒載體，諸如例如來(lái)自痘病毒(痘苗病毒，具體是MVA，金絲雀痘等)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒、泡沫病毒或腺伴隨病毒的載體。
本發(fā)明還涉及衍生自本發(fā)明細(xì)胞的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"衍生"指從本發(fā)明的細(xì)胞發(fā)展或分化而來(lái)或其祖先為本發(fā)明的細(xì)胞的細(xì)胞。
術(shù)語(yǔ)傳代數(shù)指細(xì)胞群體從培養(yǎng)容器中取出并經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)從而使得細(xì)胞密度足夠低以刺激進(jìn)一步的生長(zhǎng)的次數(shù)。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染的"是指本發(fā)明細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的"指外來(lái)核酸序列導(dǎo)入和整合進(jìn)入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組。術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物"具有穩(wěn)定整合入基因組DNA的外來(lái)DNA的細(xì)胞。
li根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的禽細(xì)胞源自鴨科或雉科的細(xì)胞。
在鴨科中，優(yōu)選番鴨(Cm'W"^或鴨G4"a^。更優(yōu)選，本發(fā)明的細(xì)胞屬于番鴨(CazW"a附asc/wto」或綠頭甲鳥(niǎo)(j"as /7/a(^/jy"c/zay)。
優(yōu)選，本發(fā)明的細(xì)胞取自胚生物體。允許從存活生物體分離細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，使用實(shí)施例2中公開(kāi)的方法。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，原代細(xì)胞分離自鴨科的輝胎，其為1-20日齡，優(yōu)選5-15日齡，更優(yōu)選11-14日齡。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，E1A核酸序列插入本發(fā)明細(xì)胞的靶DNA序列。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)"靶DNA序列"是細(xì)胞基因組內(nèi)預(yù)先確定的區(qū)域，其被靶向以通過(guò)與載體的同源重組進(jìn)行修飾。靶DNA序列包括結(jié)構(gòu)基因(即在真核細(xì)胞的情況下編碼包含內(nèi)含子和外顯子的編碼多肽的DNA序列)，調(diào)節(jié)序列諸如增強(qiáng)子序列，啟動(dòng)子等以及目的基因組中的其他區(qū)域。靶DNA序列也可為在被載體靶向時(shí)對(duì)于宿主基因組功能沒(méi)有影響的序列。
術(shù)語(yǔ)"插入耙DNA序列"廣泛指同源重組過(guò)程，其導(dǎo)致永生化基因的插入被引入靶DNA序列的缺失或斷裂中。
為了產(chǎn)生E1A核酸序列被插入靶DNA序列中的永生化禽細(xì)胞，本發(fā)明過(guò)程中所用載體還可包含兩個(gè)能與耙DNA序列的區(qū)域同源重組的同源序列，其對(duì)于所述細(xì)胞基因組的基因組而言是天然的。
所述同源序列的存在允許本發(fā)明核酸分子通過(guò)同源重組位點(diǎn)特異性插入耙DNA序列中。
術(shù)語(yǔ)"同源重組"指兩個(gè)DNA分子在基本相同的核苷酸序列的位點(diǎn)的DNA片段交換。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，載體內(nèi)包含與靶DNA序列中所含許樂(lè)部分同源的序列。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移載體中的同源序列與靶序列的區(qū)域百分之百同源。然而，可使用較低的序列同源性。因此，可使用低如80%的序列同源性。
轉(zhuǎn)移載體中的同源序列包含至少25bp,優(yōu)選更長(zhǎng)的區(qū)域，至少500 bp，更優(yōu)選至少5000 bp。
根據(jù)本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案，核酸分子被載體中的同源序列包圍。本發(fā)明中"包圍"指同源序列之一位于本發(fā)明核酸分子上游，并且同 源序列之一位于本發(fā)明核酸分子的下游。本發(fā)明中"包圍的"不一定指兩
個(gè)同源序列直接連于永生化基因的3'或5'末端，所述永生化基因和同源序 列可被非限制數(shù)目的核苷酸分離。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇適當(dāng)?shù)耐葱蛄幸詫⑻囟―NA分子定向于待 永生化細(xì)胞的基因組中。例如， 一個(gè)同源序列可與靶向序列的部分同源， 其中另外的同源序列與位于靶序列上游或下游的DNA序列同源。根據(jù)另一 實(shí)例，同源序列之一與靶DNA序列上游的DNA序列同源，其中另外的同 源序列與位于靶DNA下游的DNA序列同源。另一實(shí)例中，兩條同源序列 均與位于耙DNA序列中的序列同源。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，靶DNA序列是HPRT(次黃嘌呤磷酸核 糖轉(zhuǎn)移酶)基因。
包含HPRT啟動(dòng)子和番鴨HPRT基因的基因組序列示于SEQ ID NO:2。 編碼HPRT的序列起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置8695中的ATG 密碼子，該ATG密碼子上游序列是HPRT啟動(dòng)子序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇ElA核酸序列整合入HPRT基因所需的同源序 列。在某一科的各個(gè)成員中，編碼HPRT的基因組序列高度同源，本領(lǐng)域 技術(shù)人員也能涉及將HPRT基因靶向每個(gè)禽細(xì)胞所需的同源序列。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，同源序列經(jīng)定制以將E1A核酸序列插 入細(xì)胞HPRT啟動(dòng)子下游。該具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子可操作 連接于細(xì)胞內(nèi)源HPRT啟動(dòng)子。"可操作連接于"指E1A核酸序列以允許 其在細(xì)胞中表達(dá)的方式連接于所述啟動(dòng)子。
根據(jù)該具體的實(shí)施方案，本發(fā)明核酸分子上游的同源序列優(yōu)選具有這 樣的核酸序列，其與起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置1核苷酸、 終止于位置8694的核酸序列的至少500連續(xù)bp更優(yōu)選至少5000連續(xù)bp 同源，前提是所述同源序列不與起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置 8695核苷酸、終止于位置26916的核酸序列同源。此外，該上游同源序列 優(yōu)選直接連接于EIA核酸序列的起始密碼子。根據(jù)本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施 方案，本發(fā)明核酸分子上游的同源序列由起始于SEQ ID NO:2所示核酸序 列的位置1核苷酸、終止于位置8694核苷酸的核酸序列組成。位于EIA核酸序列下游的同源序列，優(yōu)選具有與起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列 的位置10580核苷酸、終止于位置18009核苷酸的核酸序列的至少500連 續(xù)bp同源、更優(yōu)選至少5000連續(xù)bp同源的核酸序列。更優(yōu)選，所述位于 ElA核酸序列下游的同源序列由起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置 10580核苷酸、終止于位置18009核苷酸的核酸序列組成。
因此，本發(fā)明還涉及包含E1A核酸序列的禽細(xì)胞，所述細(xì)胞通過(guò)包括 用包含所述E1A核酸序列的非病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟的方法獲得，其中 所述細(xì)胞不包含EIB核酸序列并且其中所述EIA核酸序列可操作連接于細(xì) 胞內(nèi)源HPRT啟動(dòng)子。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明方法中所用載體包含第一選擇標(biāo)記，其
中哦咯所述第一選擇標(biāo)記是陽(yáng)性選擇標(biāo)記并且其中所述第一選擇標(biāo)記被包 今沐^沐載汰中的同姬席別句,鬧。沐i玄方而.，屮孤干所沭裁休和所述細(xì)胞
的基因之間的同源重組過(guò)程導(dǎo)致E1A核酸序列和第一選擇標(biāo)記的整合。當(dāng)
轉(zhuǎn)移載體是環(huán)狀時(shí)，"包圍的"意指所述第一選擇標(biāo)記和EIA核酸序列位
于載體的相同部分中，所述部分被同源序列限定。
術(shù)語(yǔ)陽(yáng)性選擇標(biāo)記意指編碼僅能使攜帶所述基因的細(xì)胞存活和/或在 特定條件下生長(zhǎng)的產(chǎn)物的基因。常見(jiàn)選擇標(biāo)記編碼賦予抗生素或其他毒素 例如氨芐西林、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素的抗性，互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺陷 或提供復(fù)合培養(yǎng)基不能提供的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)的蛋白。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中， 第一選擇標(biāo)記編碼賦予抗生素抗性的蛋白。
第一選擇標(biāo)記的整合允許選擇已經(jīng)摻入E1A核酸序列的細(xì)胞。因此， 部分的方法可進(jìn)一步包含這樣的步驟，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)在僅允許包含所 述第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。例如，在包含抗生素的培養(yǎng)基中。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，載體中的第一選擇標(biāo)記被允許其抑制 的序列包圍。所述允許已知第一選擇標(biāo)記的序列不包圍E1A核酸序列。當(dāng) 載體為環(huán)狀是，允許第一選擇標(biāo)記已知的序列，第一選擇標(biāo)記和EIA核酸 序列位于轉(zhuǎn)移載體的相同部分，所述部分通過(guò)同源序列限定。
允許核酸序列片段已知的序列是本領(lǐng)域已知的(Nunes-Duby， S. et al (1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406)。這些序列可被一或多個(gè)特異性酶識(shí)別，其誘導(dǎo)包含在所述序列之間的核酸的抑制，這些酶稱(chēng)為"重組酶"。
例如，三種允許核酸片段抑制的已知S組酶是FLP,ISCEl和Cre重組酶。
常見(jiàn)的位點(diǎn)特異性重組酶是Cre重組酶。Cre是噬菌體Pl的cre (環(huán)化 重組)基因的38-kDa產(chǎn)物，并且是Int家族的位點(diǎn)特異性DNA重組酶。 Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212。 Cre識(shí)別Pl基因組上的 稱(chēng)為loxP的34-bp位點(diǎn)(P1的X-over的基因座)并有效催化loxP位點(diǎn)之間 的相互保守DNA重組。loxP位點(diǎn)由兩個(gè)側(cè)接8-bp非重復(fù)核心區(qū)域的13-bp 倒置重復(fù)組成。兩個(gè)直接重復(fù)loxP位點(diǎn)之間的Cre介導(dǎo)的重組導(dǎo)致它們中 間的DNA作為共價(jià)閉合環(huán)被切除。方向倒置的loxP位點(diǎn)對(duì)之間的Cre-介 導(dǎo)的重組將導(dǎo)致插入DNA的倒轉(zhuǎn)而非切除。DNA的斷裂和連接限制于核 心區(qū)域中的離散位置并且與通過(guò)酶的瞬時(shí)磷酸酪氨酸DNA-蛋白連接每次 同時(shí)發(fā)生而進(jìn)行下去。
另一種位點(diǎn)特異性重組酶是I-SceI。其他內(nèi)含子歸巢內(nèi)切核酸酶，例如 I-Tlil， I-Ceul, I-Crel， I-Ppol和PI-PspI,也可替代本發(fā)明方法中的I-Scel。許 多在Belfort and Roberts ((1997) Nucleic Acids Research 25:3379-3388)中列 出。這些內(nèi)切核酸酶中的許多源自細(xì)胞器基因組，其中密碼子使用與標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞核密碼子使用不同。為使用所述基因從而對(duì)其內(nèi)切核酸酶進(jìn)行細(xì)胞核 表達(dá)，可能需要改變編碼序列來(lái)匹配細(xì)胞核基因的編碼序列。I-Scel是雙鏈 內(nèi)切核酸酶，其在DNA識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行切割。I-Scel產(chǎn)生4 bp交錯(cuò)切割物， 其具有3'OH突出端。
酶I-Scel具有已知的識(shí)別位點(diǎn)。I-Scel的識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱(chēng)序列，長(zhǎng)度 超過(guò)18 bp。
5' TAGGGATAACAGGGTAAT3'
3' ATCCCTATTGTCCCATTA5'
另一位點(diǎn)特異性重組酶是FLP重組酶。Flp重組酶識(shí)別獨(dú)特的34-bp 最小位點(diǎn)，其僅僅耐受其識(shí)別序列的有限簡(jiǎn)并(Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988)。已經(jīng)檢測(cè)了Flp重組酶和FRT序列之間的相互作用(Panigrahi et al.， 1992)。變體FRT序列的實(shí)例見(jiàn)于Jayaram (1985) and Senecoff etal. (1988), 不同基質(zhì)上Flp介導(dǎo)的重組的測(cè)定見(jiàn)于Sna他etal. (1996)。因此，本發(fā)明的方法還可包括抑制來(lái)自所述原代細(xì)胞基因組的第一選 擇標(biāo)記的步驟。為了已知所述第一選擇標(biāo)記，用編碼允許抑制所述第一選 擇標(biāo)記的序列的特異性重組酶的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。能將所述基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)
胞的方法和載體是本領(lǐng)域己知的，例如，本發(fā)明實(shí)施例4中公開(kāi)的方法可 使用。之前描述的載體也可使用。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，用于該方法的載體包含第二選擇標(biāo)記，其不被所 述同源序列包圍，其中所述第二選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記。所述第二選擇 標(biāo)記在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的載體是環(huán)形時(shí)尤其有用。所述第二選擇 標(biāo)記的存在允許破壞細(xì)胞，其中同源重組過(guò)程導(dǎo)致轉(zhuǎn)移載體中不包含E1A 核酸序列的部分的引入。當(dāng)所述載體是環(huán)形時(shí)，第二選擇載體不被所述同 源序列包圍的事實(shí)意味著所述第二選擇載體和E1A核酸序列不位于所述轉(zhuǎn) 移載體的相同部分中，所述部分被所述同源序列所限定。
因此，本發(fā)明的方法還可包含其中將細(xì)胞培養(yǎng)在僅允許不包含所述第 二選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的步驟。所述步驟可與將所述原代細(xì)胞 培養(yǎng)在僅允許包含所述第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的步驟同時(shí)或 分開(kāi)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述載體包含第三選擇標(biāo)記，其中 所述第三選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記并且其中所述第三選擇標(biāo)記位于允許抑 制所述第一選擇標(biāo)記的序列之間。這表明抑制第一選擇標(biāo)記的步驟將也導(dǎo) 致抑制第三選擇標(biāo)記。第三選擇標(biāo)記的存在允許破壞其中存在第一選擇標(biāo) 記的細(xì)胞。當(dāng)載體是環(huán)形時(shí)，第三選擇標(biāo)記位于允許抑制第一選擇標(biāo)記的 序列之間的事實(shí)意味著所述第三選擇標(biāo)記和第一選擇標(biāo)記位于轉(zhuǎn)移載體的 相同部分，所述部分通過(guò)允許抑制第一選擇標(biāo)記的序列限定。
本發(fā)明術(shù)語(yǔ)陰性選擇標(biāo)記意指編碼在一定條件下殺死攜帶該基因的細(xì) 胞的產(chǎn)物的基因。這些基因包含"自殺基因"。這些基因編碼的產(chǎn)物能轉(zhuǎn)
化細(xì)胞毒化合物中的前藥。多種自殺基因/前藥對(duì)是目前已知的。具體如下
-I型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-1 TK)和阿昔洛韋或更昔洛韋(GCV) (Camso et al., 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al.， 1997， Nat. Med. 3, 1354-1361);
16-細(xì)胞色素p450和環(huán)磷酰胺(Wei et al.， 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);
-大腸桿菌(E. coli)嘌呤核苷酸磷酸化酶和6-甲基嘌呤脫氧核糖核苷 (Sorscher et al., 1994， Gene Therapy 1， 233-238);
-大腸桿菌鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和6-硫代黃嘌呤(Mzoz and Moolten， 1993, Human Gene Therapy 4， 589-595)和
-胞嘧啶脫氨酶(CDase)和5-氟胞嘧啶(5FC);
-FCU1和5-氟胞嘧啶(5FC)(W09954481);
-FCU1-8和5-氟胞嘧啶(5FC) (WO2005007857)。
所述第三選擇標(biāo)記允許選擇其中發(fā)生第一選擇標(biāo)記抑制的細(xì)胞。因此， 本發(fā)明的方法還可包含將所述細(xì)胞培養(yǎng)在不允許包含第三選擇標(biāo)記的細(xì)胞 生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中的步驟。例如，不允許包含作為第三選擇標(biāo)記的FCU1的 細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基包含5-氟胞嘧啶。
所述第一、第二和第三選擇標(biāo)記可分開(kāi)使用。例如用于本發(fā)明方法中 的載體可包含所述第一和第三選擇標(biāo)記但不包含第二選擇標(biāo)記，或包含第 二和第三選擇標(biāo)記但不包含第一選擇標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，E1A核酸序列，第一、第二和/或第三選 擇標(biāo)記在它們的表達(dá)在細(xì)胞中永生化所需的元件的控制下。
表達(dá)所需的元件由一組允許核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為RNA以及mRNA翻譯 成多肽的元件組成，具體是在所述細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子序列和/或調(diào)節(jié)序 列，可選允許分泌到所述多肽的靶細(xì)胞表面或在所述表面表達(dá)的序列。這 些元件可調(diào)節(jié)或?yàn)闃?gòu)成型的。當(dāng)然，所述啟動(dòng)子經(jīng)改造適合選定的載體和 宿主細(xì)胞。例如，下述基因的真核啟動(dòng)子PGK(PhosphoGlycerate Kinase), MT (metallothionein; Mclvor et al" 1987， Mol. Cell Biol. 7， 838-848), oc-l抗胰 蛋白酶，CFTR,下述物質(zhì)的啟動(dòng)子編碼肌肉肌酸激酶的基因，肌動(dòng)蛋白肺 表面活性劑，免疫球蛋白或p-肌動(dòng)蛋白(Tabin et al.， 1982， Mol. Cell Biol. 2， 416-436), SRoc (Takebe et al,, 1988, Mol. Cell. 8， 466-472)， SV40病毒(猿猴病 毒)早期啟動(dòng)子，RSV (勞斯肉瘤病毒)LTR， MPSV啟動(dòng)子，TK-HSV-1啟動(dòng) 子，CMV病毒(巨細(xì)胞病毒)早期啟動(dòng)子。巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子尤其 優(yōu)選。
17本發(fā)明更具體涉及，但不限于永生化細(xì)胞的方法，包括以下步驟 - 將載體轉(zhuǎn)移入禽細(xì)胞中，其中所述載體包含
■ 同源序列包圍的ElA核酸序列，
■ 第一選擇標(biāo)記，其中所述第一選擇標(biāo)記是陽(yáng)性選擇標(biāo) 記且其中所述第一選擇標(biāo)記被所述同源序列包圍，
■ 允許抑制所述第一選擇標(biāo)記的序列，
■ 第二選擇標(biāo)記，其不被所述同源序列包圍，其中所述選 擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記， .
■ 第三選擇標(biāo)記，其中所述第三選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo) 記和其中所述第三選擇標(biāo)記位于允許抑制所述第一選擇標(biāo)記的序列之 間，
-在僅允許包含第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，
-在不允許包含第二選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，
-將所述第一選擇標(biāo)記從所述細(xì)胞的基因組去除，
-在不允許包含第三選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞還可包含允許缺陷病毒增殖的一或多個(gè)核酸序列。"缺 陷病毒"指其中一或多個(gè)復(fù)制必須的病毒基因被缺失或被無(wú)功能化的病毒。 術(shù)語(yǔ)"允許缺陷病毒增殖的核酸序列"指反式提供允許缺陷病毒復(fù)制的功 能的核酸序列。換言之，所述核酸序列編碼所述缺陷病毒復(fù)制和衣殼化所 需的蛋白。 '
本發(fā)明的細(xì)胞還可包含編碼目的物質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明中目的物質(zhì) 可包括但不限于藥物活性蛋白，例如生長(zhǎng)因子，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)子，抗體，抗原， 其用于免疫或接種的衍生物等，白介素，胰島氣G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF， M-CSF或其組合，干擾素，例如干擾素-(x,干擾素-卩，干擾素-Y，凝血因子， 例如因子VIII,因子IX,或tPA或其組合。"目的物質(zhì)"也指工業(yè)用酶， 例如用于紙漿和紙，紡織品改性，或乙醇制備。最后"目的物質(zhì)"還指蛋 白補(bǔ)充劑或動(dòng)物飼料的增值(value-added)產(chǎn)品。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的細(xì)胞還包含編碼重組端粒酶逆 轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列，更優(yōu)選，所述重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶描述于EP 06 36 0047。2。 EP 06 36 0047.2描述的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)2具有至少70%， 更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%核酸序歹1|相同性。EP 06 36 0047.2中優(yōu) 選編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列是EP 06 36 0047.2的SEQ ID NO:2。 EP 06 36 0047.2中的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酸序列SEQ ID NO:2對(duì)應(yīng)本發(fā)明的 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酸序列SEQIDNO:3。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方 案，本發(fā)明的細(xì)胞也包含編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列，更優(yōu)選編 碼與SEQ ID NO:3具有至少70%，更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%核酸 序列相同性的重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列。更優(yōu)選，編碼重組端粒酶逆 轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列是SEQ ID NO:3 (dTERT)。
本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞和衍生自所述細(xì)胞的細(xì)胞可 用于病毒復(fù)制。所述病毒可為活、減毒、重組或非重組的病毒。更優(yōu)選， 所述細(xì)胞尤其可用于痘病毒(痘苗病毒，具體是MVA，金絲雀痘病毒等)， 腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，甲病毒，泡沫病毒或腺伴隨病毒的復(fù)制。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染性質(zhì)，在大多數(shù)情況下整合進(jìn)入分裂中的細(xì)胞， 并且在該方面尤其適合用于癌癥相關(guān)用途。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒通常包含LTR 序列，衣殼化區(qū)和本發(fā)明的核苷酸序列，其位于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR或內(nèi)部啟 動(dòng)子諸如下述那些的控制之下。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可包含修飾，具體在 LTR(用真核啟動(dòng)子取代啟動(dòng)子區(qū)域)或衣殼化區(qū)(用異源衣殼化區(qū)域取代， 例如VL30型)中(見(jiàn)法國(guó)申請(qǐng)94 08300和97 05203)。
腺病毒載體可缺乏所有或部分復(fù)制必需的至少一個(gè)區(qū)域，其選自El, E2,E4和L1L5區(qū)。El區(qū)的缺失是優(yōu)選的。然而，其可與其他修飾/缺失組 合，具體是所有或部分E2， E4禾卩/或L1 L5區(qū)。例如，El區(qū)的主要部分和 E4轉(zhuǎn)錄單元的缺失非常有利。為了增加克隆能力，腺病毒載體還可缺失所 有或部分非必需E3區(qū)。根據(jù)另一方案，可使用最小腺病毒載體，其保持衣 殼化必需的序列，即5'和3'ITR(反向末端重復(fù))，和衣殼化區(qū)。各種腺病毒 載體，以及制備它們的方法，是已知的(見(jiàn)例如，Graham and Prevect， 1991， in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109 128; Ed: E. J. Murey， The Human Press Inc)。
痘病毒科包含Chord(Dpoxvirus和昆蟲(chóng)痘病毒亞科的病毒。其中，本發(fā) 明的痘病毒優(yōu)選選自以下病毒組成的組正痘病毒，副痘病毒，雞痘病毒，駱鴕痘病毒(capripoxviruses)，兔痘病毒，豬痘病毒(Suipoxviruses),軟疣 痘病毒(Molluscipoxviruses)，亞塔痘病毒(Yatapoxviruses)。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí) 施方案，本發(fā)明的痘病毒是正痘病毒。
正痘病毒優(yōu)選是痘苗病毒并且優(yōu)選是修飾的痘苗病毒安卡拉株 (MVA)，具體是MVA 575 (ECACC V00120707)和MVA-BN (ECACC V00083008)。
術(shù)語(yǔ)"重組病毒"指其基因組中包含插入的外源序列的病毒。本發(fā)明中， 外源序列指不天然存在親代病毒中的核酸。
一個(gè)實(shí)施方案中，外源序列編碼具有直接或間接細(xì)胞毒性功能的分子。 "直接或間接"細(xì)胞毒性意指外源序列編碼的分子自身可具有毒性(例如 蓖麻蛋白，腫瘤壞死因子，白介素-2,干擾素-gamma,核糖核酸酶，脫氧核 糖核酸酶，假單胞菌外毒素A)或其可被代謝形成毒性產(chǎn)物，或其可作用于 其他物質(zhì)形成毒性產(chǎn)物。蓖麻蛋白cDNA序列公開(kāi)于Lamb et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148,265-270)，包含在內(nèi)作為參考。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，外源序列是自殺基因。自殺基因編碼 能將相對(duì)無(wú)毒的前藥轉(zhuǎn)化為毒性藥物的蛋白。例如，胞嘧啶脫氨酶將5-氟 胞嘧啶(5FC)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5FU)(Mullen et al (1922) PNAS 89， 33);單 純皰疹胸苷激酶使得細(xì)胞對(duì)利用抗病毒劑更昔洛韋(GCV)或阿昔洛韋的治 療敏感(Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608)。任何生物體例如大腸桿菌或釀酒酵母的胞嘧啶脫氨酶可使用。
因此，本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因編碼具有胞嘧啶脫氨酶活 性的蛋白，更優(yōu)選專(zhuān)利申請(qǐng)WO2005007857和W09954481所述的蛋白。
另一實(shí)施方案中，所述外源基因編碼能裂解靶向RNA或DNA的核酶。 待裂解的耙向RNA或DNA可為對(duì)于細(xì)胞功能必不可少的RNA或DNA并 且其裂解導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或待裂解RNA或DNA可為編碼不需要的蛋白的 RNA或DNA，例如癌基因產(chǎn)物，該RNA或DNA的裂解可防止細(xì)胞癌變。
另一實(shí)施方案中，外源基因編碼反義RNA。
"反義RNA"意指這樣的RNA分子，其與與編碼蛋白的mRNA分子 雜交并干擾自所述mRNA分子的表達(dá)，或者其與細(xì)胞內(nèi)的其他RNA分子 諸如前-mRNA或tRNA或rRNA雜交，或與基因雜交并干擾其表達(dá)。
20本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，外源序列取代靶細(xì)胞中缺陷基因的功能。 哺乳動(dòng)物包括人有數(shù)千種遺傳基因病，其由缺陷基因?qū)е?。所述基因疾?br> 的實(shí)例包括囊性纖維化，其已知存在《FTR基因中的突變；Duchenne肌營(yíng) 養(yǎng)不良癥，其已知在肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白基因中存在突變；鐮狀細(xì)胞病，其已知 存在HbA基因中的突變。許多類(lèi)型的癌癥由缺陷基因?qū)е?，具體是原癌基 因，以及經(jīng)歷突變的腫瘤抑制基因。
原癌基因的實(shí)例是ras， src, bcl等；腫瘤抑制基因的實(shí)例是p53和Rb。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，外源序列編碼腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。 TAA 指以在腫瘤細(xì)胞中檢出的頻率或密度高于相同組織類(lèi)型的非腫瘤細(xì)胞中的 情況的分子。TAA的實(shí)例包括但不限于CEA, MART-l, MAGE-1， MAGE-3, GP-100， MUC-l, MUC-2，點(diǎn)突變的ras癌基因，正常或點(diǎn)突變的p53,過(guò)表 達(dá)的p53, CA-125, PSA， C-erb/B2, BRCA I, BRCA II， PSMA，酪氨酸酶， TRP-l, TRP畫(huà)2， NY-ESO-l, TAG72, KSA, HER-2/neu， bcr-abl， pax3-fkhr, ews-fli-l， surviving和LRP。更優(yōu)選的實(shí)施方案中TAA是MUC1 。
重組病毒可包含超過(guò)一個(gè)外源序列，每個(gè)外源序列可編碼超過(guò)一個(gè)分 子。例如，可在相同的重組痘病毒中將編碼TAA的外源序列與編碼細(xì)胞因 子的外源序列相連。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述外源基因編碼抗原。"抗原"在這里指 可與抗體結(jié)合的配體；抗原本身不必是免疫原性的。
優(yōu)選抗原來(lái)自病毒諸如HIV-1，(諸如gp 120或gp 160),貓免疫缺陷病 毒、人或動(dòng)物皰疹病毒中任一種，諸如gD或其衍生物或立即早期蛋白諸如 ICP27,其來(lái)自HSV1或HSV2,巨細(xì)胞病毒(諸如gB或其衍生物)，水痘帶 狀皰疹病毒(諸如gpl, II或III),或來(lái)自肝炎病毒諸如乙型肝炎病毒例如乙 型肝炎表面抗原或其衍生物，甲型肝炎病毒，丙型肝炎病毒(優(yōu)選來(lái)自基 因型lb株ja的非結(jié)構(gòu)蛋白)和戊型肝炎病毒，或來(lái)自其他病毒致病原，諸 如呼吸道合胞病毒，人乳頭瘤病毒(優(yōu)選HPV16株的E6和E7蛋白)或流感 病毒，或來(lái)自細(xì)菌致病原諸如沙門(mén)菌，奈瑟球菌，疏螺旋體(例如OspA或 OspB或其衍生物)，或衣原體，或博德特菌例如P.69,PT和FHA，或來(lái)自寄 生蟲(chóng)諸如瘧原蟲(chóng)或弓形蟲(chóng)。


圖1:包含編碼E1A核酸序列的基因的載體。圖2:E1A核酸序列向HPRT基因中的位點(diǎn)特異性插入的圖示。 圖3:從本發(fā)明方法獲得的永生化細(xì)胞的基因組去除第一和第三選擇 標(biāo)記的圖示。
圖4:包含編碼番鴨端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因和E1A核酸序列的基因的載體。
實(shí)施例
實(shí)施例1:建立包含E1A核酸序列的永生化禽細(xì)胞系
A. 質(zhì)粒構(gòu)建體
A-l.用于隨機(jī)插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A與番鴨基因組無(wú)共同特定同源序列的質(zhì)粒(質(zhì)粒E1A)被用于該目的 (圖1).
A-2.用于靶向插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A構(gòu)建質(zhì)粒，其包含包圍E1A核酸序列(SEQ ID NO:l)的與番鴨 HPRT基因同源的兩個(gè)5kb片段和兩個(gè)選擇標(biāo)記。編碼次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷 酸轉(zhuǎn)移酶的HPRT基因被選擇作為組成型表達(dá)E1A核酸序列的合適位點(diǎn)。
所述兩個(gè)選擇標(biāo)記是CMV啟動(dòng)子(Thomsen et al. P.N.A.S. 1984, 81. 3:659-63)控制下的FCU1基因(Erbs et'al, Cancer Res, 2000. 15. 60, :3813-22) 和SV40啟動(dòng)子控制下的新霉素(或嘌呤霉素)抗性基因。新霉素(或嘌呤霉 素)抗性和FCU-1表達(dá)盒被Scel裂解位點(diǎn)包圍，其允許選擇盒從最終細(xì)胞 系的去除。HPRT基因臂之外插入了編碼RSV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HSVTK的選 擇標(biāo)記(圖2)。
B. 從番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
B.l從12日齡番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
25個(gè)受精SPF卵保溫在37.5°C。卵在根據(jù)已知方案保溫12日后打開(kāi)。
將23個(gè)胚胎切碎，在磷酸緩沖鹽水-Dulbecco(PBS)中洗滌一次，在 TrypLE Select (Invitrogen)中室溫解離5小時(shí)。
低速離心之后，細(xì)胞重懸于基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基(MBE)，其中補(bǔ)充有10% 胎牛血清(FCS)，慶大霉素0.04g/L,在500cm2triple瓶中接種，37。C5Q/oC02 下保溫。 '24h后，匯合細(xì)胞利用TrypLE Select (5mL/triple瓶)從瓶中取出，部分 細(xì)胞再接種于175ci^瓶中二次傳代。余下細(xì)胞在1(^細(xì)胞/mL在適宜培養(yǎng) 基中濃縮(60。/。BME， 30%FCS禾Q 10%DMSO)，在異丙基醇調(diào)節(jié)的容器 (NALGENE. . "Mr. Frosty" 1。C frezing. Container)中在-80。C冷凍，然后轉(zhuǎn) 移到液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，形成初始細(xì)胞庫(kù)(50x1，5.107細(xì)胞/瓶，44x1.107細(xì)胞/ 瓶)。
培養(yǎng)中保存的細(xì)胞常規(guī)傳代到第18代，前3代中非結(jié)合細(xì)胞通過(guò)低速 離心調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基收集，再接種并以相同方式作為初始培養(yǎng)物再傳代。
顯示特征性不同形態(tài)學(xué)特征的亞群在培養(yǎng)基壽命中重復(fù)分離。
B.2.從19日齡番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
得自AFFSSA Ploufragan的29個(gè)受精SPF番鴨卵在潮濕環(huán)境下保溫在 37.5。C。
19日后打開(kāi)卵并無(wú)菌取出胚胎。20個(gè)胚胎經(jīng)去頭、去肢體處理并且肝 用于其他細(xì)胞制備。胚胎軀干部分被切碎，在PBS Dulbecco (Sigma, R6f. D8537, Lot 46K2428)中洗滌一次，在500mL TrypLE Select (Gibco, R6f. 12563, Lots 1319986 and 1339844)中37。C解離2小時(shí)。
5分鐘2000 rpm離心后，細(xì)胞重懸于BME (Basal Medium Eagle, Gibco， R6f。 41010， Lot 8270)，其中補(bǔ)充有10。/。胎牛血清(JRH， Rif. 12003-1OOOM， Lot. 5A0102，CodeTGP4001Q)，慶大霉素0.04 g/L和L-谷氨酰胺4mM。終 體積1.5L (1.9.106細(xì)胞/mL)懸液接種在10個(gè)triple瓶(500cm勺中并在37。C 5%(302保溫。
24h后，匯合細(xì)胞利用TrypLE Select (5mL/triple瓶)從瓶中取出。細(xì)胞 經(jīng)計(jì)數(shù)，在2000 rpm離心4-5分鐘。沉淀物以5.106或107細(xì)胞/mL在適宜 培養(yǎng)基(60。/。BME, 30%FCS和10% DMSO)中濃縮。懸液充滿(mǎn)cryovials (Nunc) 并在-80。C冷凍，同時(shí)在-20。C進(jìn)行2h的步驟，然后轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ) 存，形成CETC19pl初始細(xì)胞庫(kù)(l 10 cryovials, 107細(xì)胞/瓶)(鴨軀干胚細(xì)胞， 19日齡胚胎，第l代)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，從番鴨卵制備CEC批次根據(jù)備選方案B.2. 進(jìn)行(從19日齡番鴨卵)。
C轉(zhuǎn)染方法
23大量轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域已知的，其引入能指導(dǎo)目的核苷酸序列的表達(dá)
的載體。這些方法的非限制性舉例如下CaP04沉淀，電穿孔，lipofectin轉(zhuǎn) 染發(fā)。給出的實(shí)例基于CaP04沉淀法。
細(xì)胞為大約80-50%匯合。培養(yǎng)基在加入CaP04/DNA之前每2小時(shí)更 換。30 |ig DNA重懸于31 pl2M CaCl2 - 161.3 mM Tris pH 7.6。加入H20使 得終體積為0.5 ml。
隨后，2個(gè)供選方案
a) 每次轉(zhuǎn)染，將0.5 ml 2X HEBS分散在15 ml無(wú)菌Falcon管中，將 DNA溶液逐滴加入同時(shí)溫和渦旋或氣泡使得DNA溶液分散開(kāi)。溶液變?yōu)?乳狀?；旌衔镌谑覝乇３?0-30分鐘。在組織培養(yǎng)箱中用無(wú)菌移液管吸取 并放回液體一次從而破壞薄片狀物，逐滴施加于細(xì)胞。細(xì)胞隨后在37。C保 溫6小室到過(guò)夜。細(xì)微的沉淀物會(huì)覆蓋細(xì)胞表面。為了完成轉(zhuǎn)染，將甘油 休克溶液升溫至37。C。培養(yǎng)基被吸出，加入5 mlBME洗滌細(xì)胞層，隨后 吸出培養(yǎng)基，加入l ml甘油休克溶液2分鐘或更短。隨后輕柔加入10ml BME稀釋甘油，完全去除BME-甘油。隨后加入IO ml所需培養(yǎng)基，在適 宜溫度保溫板。
或
b) 每次轉(zhuǎn)染，將0.5 ml 2X HEBS分散在15 ml無(wú)菌Falcon管中，將
DNA溶液逐滴加入同時(shí)溫和渦旋或氣泡使得DNA溶液分散開(kāi)。溶液變?yōu)?乳狀?；旌衔镌谑覝乇３?0-30分鐘。在組織培養(yǎng)箱中用無(wú)菌移液管吸取 并放回液體一次從而破壞薄片狀物，'逐滴施加于細(xì)胞。細(xì)微的沉淀物會(huì)覆 蓋細(xì)胞表面。細(xì)胞隨后在37。C保溫6小室到過(guò)夜。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染(CaP04沉淀)根據(jù)方案b)進(jìn)行。
D。選擇方法
D-L選擇隨機(jī)插入的方法
轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10%禾卩G418 800嗎/mL,優(yōu)選500jig/mL (并任選更昔洛韋25嗎/mL，優(yōu)選10嗎/mL)。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長(zhǎng)的克隆可被分離。 D-2.選擇靶向插入的方法轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10% ，更昔洛韋25pg/mL，優(yōu)選10嗎/mL; 和G418 800嗎/mL，優(yōu)選500pg/mL (或嘌呤霉素0.5|ig/mL)。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長(zhǎng)的克隆可被分離。
細(xì)胞克隆隨后用大范圍核酸酶I-Scel表達(dá)質(zhì)粒根據(jù)下述方法轉(zhuǎn)染。
為了消除選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后施加5-氟胞嘧啶(5-FC)48小時(shí)細(xì)胞用 TrypLE select解離，低速離心并再接種于具有1(T3-1(T7M的5-FC的培養(yǎng)基 中，并保持G418 (或嘌呤霉素)/更昔洛韋選擇(BME with FCS 10%; 5-FC更 昔洛韋25pg/mL,優(yōu)選10pg/mL;和G418 800jig/mL,優(yōu)選500pg/mL (或嘌 呤霉素0.5^g/mL)(圖3)。
實(shí)施例2:建立包含E1A核酸序列和重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酸序列的 永生化禽細(xì)胞系
A. 質(zhì)粒構(gòu)建體.
A-l.用于隨機(jī)插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A與番鴨基因組無(wú)共同特定同源序列的質(zhì)粒被用于該目的 A-2.用于靶向插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A構(gòu)建質(zhì)粒(質(zhì)粒dTERT-ElA)，其包含包圍端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(SEQ ID N0:3)的與番鴨HPRT基因同源的兩個(gè)5kb片段，E1A核酸序列(SEQ ID N0:1)和兩個(gè)選擇標(biāo)記。編碼次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶的HPRT基因被選 擇作為組成型表達(dá)EIA核酸序列的合適位點(diǎn)。
所述兩個(gè)選擇標(biāo)記是CMV啟動(dòng)子(Thomsen et al. P.N.A.S. 1984, 81. 3:659-63)控制下的FCU1基因(Erbs et.al. Cancer Res. 2000. 15. 60, :3813-22) 和SV40啟動(dòng)子控制下的新霉素(或嘌呤霉素)抗性基因。嘌呤霉素抗性和 FCU-1表達(dá)盒被Seel裂解位點(diǎn)包圍，其允許選擇盒從最終細(xì)胞系的去除。 HPRT基因臂之外插入了編碼RSV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HSVTK的選擇標(biāo)記(圖4)。
B. 從19日齡番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
得自AFFSSA Ploufragan的29個(gè)受精SPF番鴨卵在潮濕環(huán)境下保溫在 37.5。C。19日后打開(kāi)卵并無(wú)菌取出胚胎。20個(gè)胚胎經(jīng)去頭、去肢體處理并且肝 用于其他細(xì)胞制備。胚胎軀干部分被切碎，在PBS Dulbecco (Sigma， R6f. D8537， Lot 46K2428)中洗滌一次，在500mL TrypLE Select (Gibco， R6f. 12563， Lots 1319986 and 1339844)中37°C解離2小時(shí)。
5分鐘2000 rpm離心后，細(xì)胞重懸于BME (Basal Medium Eagle, Gibco, Rif. 41010， Lot 8270)，其中補(bǔ)充有10。/。胎牛血清(JRH, R6f. 12003-1000M, Lot. 5A0102，CodeTGP4001Q),慶大霉素0.04 g/L和L-谷氨酰胺4mM。終 體積1.5L (1.9.106細(xì)胞/mL)懸液接種在10個(gè)triple瓶(500cm勺中并在37°C 5%(:02保溫。
24h后，匯合細(xì)胞利用TrypLE Select (5mL/triple瓶)從瓶中取出。細(xì)胞 經(jīng)計(jì)數(shù)，在2000 rpm離心4-5分鐘。沉淀物以5.106或107細(xì)胞/mL在適宜 培養(yǎng)基(60。/。BME, 30%FCS和10% DMSO)中濃縮。懸液充滿(mǎn)cryovials (Nunc) 并在-80。C冷凍，同時(shí)在-20。C進(jìn)行2h的步驟，然后轉(zhuǎn)移到液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ) 存，形成CETC19pl初始細(xì)胞庫(kù)(110'cryovials， 107細(xì)胞/瓶)(鴨軀干胚細(xì)胞， 19日齡胚胎，第l代)。
C. 轉(zhuǎn)染方法
大量轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域已知的，其引入能指導(dǎo)目的核苷酸序列的表達(dá) 的載體。這些方法的非限制性舉例如下CaP04沉淀，電穿孔,lipofectin轉(zhuǎn) 染發(fā)。給出的實(shí)例基于電穿孔。
轉(zhuǎn)染禾U用Amaxa，s Nucleofector裝置禾卩Basic Fibroblast kit (Amaxa， Cat NO VPI-1002)進(jìn)行。細(xì)胞在700rpm (100g)離心10分鐘，重懸于Basic Nucleofector溶液(100(iL per 106cells); 100pL懸液與3-6pg DNA混合并轉(zhuǎn)移 到置于Nucleofector(U-12program)中的樣品池中。電穿孔后，樣品轉(zhuǎn)移到 6cm培養(yǎng)皿，充滿(mǎn)5 mL培養(yǎng)基，在37°C/ 5%C02保溫箱中重平衡。在37°C 5%C02下保溫過(guò)夜后，更新培養(yǎng)基繼續(xù)保溫。
D. 選擇方法
D-l.選擇隨機(jī)插入的方法轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10%;更昔洛韋25pg/mL，優(yōu)選10ng/mL 和G418 800|ig/mL，優(yōu)選500jag/mL。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長(zhǎng)的克，隆可被分離。
D-2.選擇靶向插入的方法
轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10% ，更昔洛韋25pg/mL，優(yōu)選lOpg/mL; 和嘌呤霉素0.5|ig/mL。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長(zhǎng)的克隆可被分離。
細(xì)胞克隆隨后用大范圍核酸酶I-Scel表達(dá)質(zhì)粒根據(jù)下述方法轉(zhuǎn)染。
為了消除選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后施加5-氟胞嘧啶(5-FC)48小時(shí)細(xì)胞用 TrypLE select解離，低速離心并再接種具有1(T3-10—7M的5-FC的培養(yǎng)基中， 并保持嘌呤霉素/更昔洛韋選擇(BME，具有FCS 10%; 5-FC更昔洛韋 25jig/mL,優(yōu)選10嗎/mL;和嘌呤霉素0.5ng/mL)。參考文獻(xiàn)
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Thomsen et al, P.N.A.S. 1984. 81. 3:659-6權(quán)利要求
1.包含E1A核酸序列的永生化禽細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞通過(guò)包含用含有所述E1A核酸序列的非病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的步驟的方法獲得，并且其中所述細(xì)胞不包含E1B核酸序列。
2. 權(quán)利要求1的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列被插入所述禽 細(xì)胞的HPRT基因。
3. 權(quán)利要求2的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列可操作連接于 所述細(xì)胞的內(nèi)源HPRT啟動(dòng)子。
4. 權(quán)利要求1-3之一的永生化細(xì)胞，其中所述細(xì)胞源自屬于鴨科的動(dòng)物。
5. 權(quán)利要求4的永生化細(xì)胞，其中所述動(dòng)物屬于番鴨種。
6. 權(quán)利要求4的永生化細(xì)胞，其中所述動(dòng)物屬于綠頭鴨種。
7. 權(quán)利要求1-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少60%核酸序列相同性。
8. 權(quán)利要求1-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少70%核酸序列相同性。
9. 權(quán)利要求1-8之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少80%核酸序列相同性。
10. 權(quán)利要求1-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少90%核酸序列相同性。
11. 權(quán)利要求l-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列為SEQ ID NO:l。
12. 權(quán)利要求l-ll之一的永生化細(xì)胞，其中其還包含編碼重組端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列。
13. 權(quán)利要求12的永生化細(xì)胞，其中所述編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 的核酸序列與SEQ ID NO:3具有至少70%,更優(yōu)選至少90%,和更優(yōu)選至 少95%核酸序列相同性。
14. 權(quán)利要求12的永生化細(xì)胞，其中所述編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 的核酸序列是SEQ ID NO:3。
15. 權(quán)利要求1-14之一的永生化細(xì)胞，其中其還包含編碼目的物質(zhì)的 核酸序列。
16. 權(quán)利要求1-14之一的永生化細(xì)胞，其中其還包含允許缺陷病毒增 殖的互補(bǔ)盒。
17. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在病毒復(fù)制中的用途。
18. 權(quán)利要求17的用途，其中所述病毒選自下組牛痘病毒，鼠痘病 毒，猴痘病毒，痘苗病毒，天花病毒和MVA。
19. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在制備目的物質(zhì)中的用途。
20. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在制備病毒中的用途。
21. 權(quán)利要求20的用途，其中所述病毒是痘病毒。
22. 權(quán)利要求21的用途，其中所述病毒是痘苗病毒。
23. 權(quán)利要求22的用途，其中所述痘苗病毒是MVA。
24. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在制備重組病毒中的用途。
25. 使禽細(xì)胞永生化的方法，包括用包含E1A核酸序列的非病毒載體 轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的步驟，其中所述方法不包括用E1B核酸序列轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞 的步驟。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述載體包含與所述細(xì)胞基因組中存 在的序列同源的兩個(gè)序列。 ，
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述EiA核酸序列被所述同源序列包圍。
28. 權(quán)利要求26或27的方法，其中所述載體還包含第一選擇標(biāo)記， 其中所述第一選擇標(biāo)記是陽(yáng)性選擇標(biāo)記并且其中所述第一選擇標(biāo)記被所述 同源序列包圍。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述第一選擇標(biāo)記被允許抑制該標(biāo)記 的序列包圍。
30. 權(quán)利要求26-28之一的方法，其中所述載體包含不被所述同源序 列包圍的第二選擇標(biāo)記，其中所述選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記。
31. 權(quán)利要求29或30的方法，其中所述載體包含第三選擇標(biāo)記，其 中所述第三選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記并且其中所述第三選擇標(biāo)記位于允許 抑制所述第一選擇標(biāo)記的序列之間。
32. 權(quán)利要求28-31之一的方法，其特征在于其還包括在僅允許包含 第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟。
33. 權(quán)利要求30-32之一的方法，其特征在于其還包括在不允許包含 第二選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟。
34. 權(quán)利要求31-33之一的方法，其中所述方法還包括將第一選擇標(biāo) 記從所述細(xì)胞基因組去除的步驟。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中在將第一選擇標(biāo)記從所述細(xì)胞基因組 去除的步驟之后獲得的細(xì)胞被培養(yǎng)在不允許包含所述第三選擇標(biāo)記的細(xì)胞 生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。
36. 權(quán)利要求25-35之一的方法，其中所述細(xì)胞得自屬于鴨科的生物體。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述生物體屬于番鴨種。
38. 權(quán)利要求36的方法，其中所述生物體屬于綠頭鴨種。
39. 權(quán)利要求25-38之一的方法，其中所述E1A核酸序列被插入所述 細(xì)胞的耙DNA序列。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述靶DNA序列是HPRT基因。
41. 權(quán)利要求25-40之一的方法，其中所述載體還包含編碼重組端粒 酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及永生化禽細(xì)胞，以及這些細(xì)胞制備病毒的用途。本發(fā)明的細(xì)胞具體用于制備重組病毒載體，所述病毒載體可用于制備治療動(dòng)物更具體是人的治療和/或預(yù)防組合物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101688182SQ200880023138
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者M·卡普弗, N·西爾韋斯特雷, P·埃爾布 申請(qǐng)人:特蘭斯吉恩股份有限公司