專利名稱：霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的三重pcr檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境科學水體病原菌檢測領域，是應用三重聚合酶鏈式反應(全稱Polymerase Chain Reaction,簡稱PCR)技術，將被測病原菌微量的目的基因片段體外擴增，快速檢測水樣中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌，評價并預警海洋環(huán)境這三種致病菌的含量及污染情況。
背景技術：
霍亂弧菌(VibrioCholerae)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和創(chuàng)傷弧菌(Vibrio Vulnificus)是三種常見的革蘭氏陰性弧菌，在海洋環(huán)境中廣泛分布。人們主要通過食用被污染的海產品感染以上三種病原菌，也可能通過傷口接觸污染的海水、礁石等而感染，會在短時間內引起患者腹痛腹瀉、嘔吐，甚至內臟淤血和敗血癥。在美國、丹麥、西班牙、以色列及我國臺灣等一些沿海城市，都有過副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌感染的臨床報告，大多因多器官功能障礙而死亡。歷史上曾有過6次霍亂世界性大流行，無一不禍及中國。三種病原菌都能通過糞口途徑在人群中傳播，威脅人類的生命健康安全。PCR技術是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，三重PCR方法是多重PCR方法的一個分支。與傳統(tǒng)的生物學方法相比，PCR技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時省力等優(yōu)點。近二十幾年來，該技術已經成為最常用、也是最重要的分子生物學技術之一。三重PCR在單一 PCR基礎上，向同一反應體系中加入三對引物，同時擴增出三段DNA片段，這樣更加節(jié)省了時間和成本。建立三重PCR方法用于快速檢測樣品中的病原微生物具有重要的實際意義和應用價值，因而越來越受到人們的關注。

發(fā)明內容

本發(fā)明根據(jù)霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌的保守序列，分別選擇退火溫度相同的引物，并使三種不同細菌的目的基因片段長度不等。提取三種細菌的DNA基因組，在同一體系中同時進行三重PCR擴增反應。擴增結果通過瓊脂糖凝膠電泳觀察，整個檢測時間只需6_8小時。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:1、DNA模板的準備將三種細菌的菌種分別接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩18小時(創(chuàng)傷弧菌于28°C，霍亂弧菌和副溶血弧菌于37°C )，所得的菌液用已過濾的無菌海水稀釋一定的倍數(shù)，用試劑盒提取兩種細菌的基因組DNA。2、用于三重PCR的三對引物核苷酸序列如下:
權利要求
1.霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌三重PCR檢測方法的特征在于將三種病原菌的特異性引物加入到同一反應體系中。本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的: 1)DNA模板的準備 將三種細菌的菌種分別接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩18小時(創(chuàng)傷弧菌于28°C，霍亂弧菌和副溶血弧菌于37°C )，所得的菌液用已過濾的無菌海水稀釋一定的倍數(shù)，用試劑盒提取兩種細菌的基因組DNA。
2)設計三重PCR的三對引物，核苷酸序列如下:
2.權利要求I所述的三重PCR反應方法檢測樣品中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌，可用于檢測海水樣品以及其他水樣中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境科學水體病原菌檢測領域，通過基因片段的體外酶促擴增，快速檢測水樣中的霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌，評價并預警海洋環(huán)境這三種致病菌的含量及污染情況?；魜y弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌是三種常見的革蘭氏陰性弧菌，在海洋環(huán)境中廣泛分布，能感染人類，通過糞口途徑在人群中傳播。PCR技術具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時省力等優(yōu)點。三重PCR在單一PCR基礎上，向同一反應體系中加入三對引物，同時擴增出三段DNA片段，這樣更加節(jié)省了時間和成本。建立三重PCR方法用于快速檢測樣品中的病原微生物具有重要的實際意義和應用價值，因而越來越受到人們的關注。
文檔編號C12Q1/68GK103255202SQ20121003769
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權日2012年2月20日
發(fā)明者王林同, 朱琳, 明紅霞, 王軻 申請人:南開大學