牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病pcr快速診斷試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，它包括紅細(xì)胞裂解液，TBS液，蛋白酶K，裂解液，PCR酶，DL2000Marker，引物，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，TE緩沖液，吸附柱。本發(fā)明研制了用于檢測(cè)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，可從牛全血臨床樣本中直接檢測(cè)到牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病病原核酸，試劑盒的靈敏度約為41.2pg,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程從開(kāi)始到出結(jié)果僅需6小時(shí)。由此可見(jiàn)，該試劑盒具有快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。適用于牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【專(zhuān)利說(shuō)明】牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒。【背景技術(shù)】
[0002]雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)(Babesia bigemina)病是對(duì)牛危害較大的一種血液寄生蟲(chóng)病。蟲(chóng)體經(jīng)微小牛蜱、鐮形煽頭蜱和二棘血蜱等中間宿主傳播給牛體，當(dāng)蜱叮咬牛時(shí),蟲(chóng)體隨蜱的唾液進(jìn)入牛體，隨即由血液進(jìn)入紅細(xì)胞，在紅細(xì)胞內(nèi)以“成對(duì)出芽”方式進(jìn)行繁殖。牛感染上雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病，其臨床癥狀表現(xiàn)為稽留熱(體溫升高至40~41.5°C)，病畜精神沉郁，食欲不振，腹瀉或便秘，消瘦、貧血，黏膜蒼白、黃膽，后期通常出現(xiàn)血紅蛋白尿，急性病例在4~8天內(nèi)死亡。
[0003]牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病的流行歷史悠久，極大地威脅著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。凡是引進(jìn)純種牛、雜交牛和本地?；旌巷曫B(yǎng)放牧的場(chǎng)所，極容易發(fā)生和流行此病，如不及時(shí)治療其發(fā)病死亡率則占發(fā)病數(shù)50%~100%，這將給養(yǎng)牛生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。目前，隨著人們對(duì)乳牛制品的需求日益增長(zhǎng)，草山草坡資源的綜合開(kāi)發(fā)和利用，人工草地飼養(yǎng)與發(fā)展奶牛、改良牛群數(shù)量日漸增加，該病的發(fā)生和流行日趨增加，對(duì)于確診該病，有效地控制和預(yù)防該病的發(fā)生和流行顯得尤為重要。傳統(tǒng)的診斷方法是根據(jù)臨床癥狀和血涂片光學(xué)顯微鏡檢查確診，但由于該蟲(chóng)在顯微鏡下難于與附紅體、牛巴貝斯蟲(chóng)、泰勒焦蟲(chóng)等血液原蟲(chóng)區(qū)分，這為準(zhǔn)確判斷該病造成了影響；有許多血清學(xué)方法可檢測(cè)該病原，如:補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，間接免疫熒光抗體試驗(yàn)，間接血凝試驗(yàn)等，但存在一定的假陽(yáng)性和假陰性，現(xiàn)在市場(chǎng)缺少一種能對(duì)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病臨床樣本進(jìn)行簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是:提供一種牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，它可以從全血臨床樣本中直接檢測(cè)到牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病原核酸，靈敏度約為41.29pg，具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，它包12mL紅細(xì)胞裂解液，6mL TBS 液，1.2mL 蛋白酶 K，5.4mL 裂解液，300μ? PCR 酶，300μ? DL2000Marker, 60μ?引物，60μ?陽(yáng)性對(duì)照，330μ?陰性對(duì)照，6mL TE緩沖液，30個(gè)吸附柱；引物包括上引物及下引物，上引物及下引物的體積均為30μ?，濃度均為20 μ M ;上引物的序列為:5’ -CCCCTATCACCTTCAACC _3’，下引物序列為:5’ -ACTGCGAGCACTCAATCC -3’。
[0006]紅細(xì)胞裂解液組成包括1.5Μ NH4CL, IOOmM KHCO3 及 IOmM Na4EDTA,用 IN HCL 或 INNaOH 調(diào) pH 至 7.2-7.4。
[0007]TBS 液包括 10mmoL/L 的 Tris 含 0.9%NaCL,用 IN HCL 調(diào) pH 至 7.4。
[0008]蛋白酶K用TE溶液配制成20mg/mL。
[0009]裂解液包括IOmM的Tris-HCLUmia^ EDTA、2.5M的NaCL以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液。[0010]TE緩沖液包括:IOmM的Tris-HCL及ImM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7.8。
[0011]PCR 酶的組成包括:10mM 的 Tris-HCL (PH8.3)、50mM 的 KCL、1.5mM 的 MgCL2 以及
0.05U Polymerase/M-L。
[0012]陰性對(duì)照為超純水；陽(yáng)性對(duì)照為牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA模板。
[0013]為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):
牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒的研制 材料與方法
1、參考蟲(chóng)株:牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)蟲(chóng)株DNA模板，由中國(guó)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲(chóng)病室惠贈(zèng)。附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲(chóng)、巴貝斯焦蟲(chóng)DNA模板，均由本所重大疫病檢測(cè)室采集到的病料所提模板而得。
[0014]2、主要試劑
2.1引物(濃度為20 μ M，用TE溶液配制)
根據(jù)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)熱休 克蛋白基因片段設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出一長(zhǎng)度為318bp大小的特異片段，該序列在Genbank上的登錄號(hào)為AF332567.1。引物序列如下:
上引物:5’ -CCC CTA TCA CCT TCA ACC -3，
下引物:5’ -ACT GCG AGC ACT CAA TCC -3’
由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0015]2.2 PCR試劑盒的組成:⑴紅細(xì)胞裂解液；(2)TBS液；(3)蛋白酶K J4)裂解液；(5)PCR酶；(6) DL2000 Marker ;(7)引物；(8)陽(yáng)性對(duì)照；(9)陰性對(duì)照；(10) TE緩沖液；(11)吸附柱。
[0016]2.3樣本的采集
用檸檬酸鈉或EDTA作為抗凝劑無(wú)菌采集牛全血，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0017]3、模板的提取
3.1全血中DNA的提取:取1000PL全血于1.5mL的離心管中，10000r/min，離心2分鐘,去上清；用1000PL生理鹽清洗，10000r/min，離心2分鐘，去上清，采用同樣的方法共清洗3次，收集沉淀。在收集沉淀的離心管中，加入200μ?的生理鹽水和200-400μ?的紅細(xì)胞裂解液，充分搖勻，10000r/min,離心2分鐘，去上清。在離心管中加入20(^LTBS液、40μ?蛋白酶K，搖勻，再加入160μ?裂解液充分混勻，70°C水浴作用15-20分鐘，取出，加入無(wú)水乙醇200μ?，充分搖勻，然后倒入吸附柱里，離心2分鐘，去上清，加入500μ?清洗劑進(jìn)行清洗，10000r/min,離心I分鐘,反復(fù)清洗兩次,然后將倒掉了清洗劑吸附柱10000r/min,再離心2分鐘，取出吸附柱，置室溫5分鐘，將清洗劑完全晾干。再將吸附柱放入另一個(gè)干凈的收集管中，加入60-100μ?ΤΕ緩沖液，室溫放置2_5分鐘，10000r/min，離心2分鐘。為了獲得更多的DNA模板，可將離心過(guò)的溶液再加在吸附柱里，同樣室溫放置2-5分鐘，10000r/min,離心2分鐘。然后將提取得到的DNA模板用加樣槍轉(zhuǎn)入存放DNA模板的離心管里。
[0018]3.2附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲(chóng)、巴貝斯焦蟲(chóng)DNA模板的提取，與上述方法相同。
[0019]4、牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)特異性片段的PCR擴(kuò)增
采用提取的DNA摸板，利用合成的引物在PCR酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系和條件如下:PCR酶為10μ?，雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)蟲(chóng)株DNA模板2μ?，樣本DNA摸板2μ?，上下引物各?μ?，加入ddH20至25μ?，在Tgradient96擴(kuò)增儀下進(jìn)行如下循環(huán):94°C變性3分鐘，94°C 35秒，53.4°C 35秒，72°C 40秒，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物取7μ?進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳檢測(cè)顯示約在318bp處，出現(xiàn)一條PCR目標(biāo)帶，其結(jié)果如圖1所示，與預(yù)計(jì)的結(jié)果非常接近。
[0020] 5、PCR法擴(kuò)增的特異性測(cè)定
分別用附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲(chóng)、巴貝斯焦蟲(chóng)DNA為摸板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)出現(xiàn)擴(kuò)增帶，其它的蟲(chóng)株未見(jiàn)特異性318bp片段擴(kuò)增。結(jié)果如圖2所示。
[0021 ] 6, PCR法擴(kuò)增的敏感性的測(cè)定
采用TU-1800spc紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，取OD值為260nm，將牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA摸板稀釋100倍，進(jìn)行濃度的測(cè)量。根據(jù)摸板濃度(PgZ^L)=A26tlX稀釋倍數(shù)X38/1000的方法進(jìn)行計(jì)算。測(cè)得牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的平均OD26tl值為0.05433nm,根據(jù)模板濃度的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果得實(shí)驗(yàn)提取的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的含量為0.206μδ/KL。在進(jìn)行敏感性試驗(yàn)時(shí)，按對(duì)數(shù)稀釋法對(duì)DNA模板進(jìn)行稀釋后，取2 PL模板進(jìn)行擴(kuò)增，則牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度依次為412ng,41.2ng,4.12ng,412pg,41.2pg,4.12pg,412fg，41.2fg，4.12fg?？蓹z出的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的含量最小是41.2pg，即靈敏度為41.2pg。結(jié)果如圖3所示。
[0022]7、重復(fù)性試驗(yàn)
應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測(cè)3次，檢驗(yàn)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA樣品結(jié)果的可靠性。研制結(jié)果是:應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測(cè)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA樣品3次結(jié)果均一致。
[0023]8、試劑盒的保存期檢測(cè)
將試劑盒在4°C、一 20°C分別保存I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、I年，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，以確定試劑盒的保存時(shí)間。研制結(jié)果是:4°C保存I年條帶較淡，一 20°C保存I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、I年對(duì)條帶亮度無(wú)影響。
[0024]由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明研制了用于檢測(cè)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病的PCR試劑盒，可從牛全血臨床樣本中直接檢測(cè)到牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病原核酸，試劑盒的靈敏度為41.2pg,從開(kāi)始到出結(jié)果整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需6小時(shí)。由此可見(jiàn)，該試劑盒具有快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。適用于牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]附圖1為牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)特異性片段試驗(yàn)圖；
M.Marker DL2000 ；1.標(biāo)準(zhǔn)陰性；2.標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性；3.被檢出的陽(yáng)性樣本；
附圖2為PCR特異性試驗(yàn)圖；
M.Marker DL2000 ；1.牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)；2.附紅體；3.環(huán)形泰勒焦蟲(chóng)；4.巴貝斯焦
蟲(chóng)；
附圖3為PCR敏感性 試驗(yàn)圖；
M.Marker DL2000 ；1.DNA 模板為 412ng ；2.DNA 模板為 41.2ng ；3.DNA 模板為 4.12ng ；4.DNA 模板為 412pg ；5.DNA 模板為 41.2pg ；6.DNA 模板為 4.12pg ；7.DNA 模板為 412fg ；8.DNA 模板為 41.2fg。
【具體實(shí)施方式】[0026]本發(fā)明的實(shí)施例:牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，它包12mL紅細(xì)胞裂解液，6mL TBS 液，L2mL 蛋白酶 K，5.4mL 裂解液，300μ? PCR 酶，300μ? DL2000 Marker,60μ?引物，60μ?陽(yáng)性對(duì)照，330μ?陰性對(duì)照，6mL TE緩沖液，30個(gè)吸附柱；引物包括上引物及下引物，上引物及下引物的體積均為30μ?，濃度均為20μΜ;上引物的序列為:5’-CCCCTATCACCTTCAACC _3’，下引物序列為:5’ -ACTGCGAGCACTCAATCC -3’；紅細(xì)胞裂解液組成包括 1.5Μ NH4CL, IOOmM KHCO3 及 IOmM Na4EDTA,用 IN HCl 或 IN NaOH 調(diào) pH 至
7.2-7.4 ；TBS 液包括 10mmoL/L 的 Tris 含 0.9%NaCL,用 IN HCl 調(diào) pH 至 7.4 ;蛋白酶 K 用TE溶液配制成20mg/mL ;裂解液包括IOmM的Tris-HCL、ImM的EDTA、2.5M的NaCL以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液；TE緩沖液包括:10mM的Tris-HCL及ImM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7.8 ；PCR酶的組成包括:10mM的Tris-HCL (PH8.3)、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U Polymerase/^L ;陰性對(duì)照為超純水；陽(yáng)性對(duì)照為牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA模板。
[0027]本發(fā)明中，M表示摩爾濃度單位，即是moL/L ;mM毫摩爾濃度單位，即是mmoL/L，N的當(dāng)量濃度單位。
[0028]試劑盒中通常還配備清洗劑，清洗劑的用量是30mL，一般可以自己配制，成分是質(zhì)量百分比為70%的 乙醇。
【權(quán)利要求】
1.一種牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:它包12mL紅細(xì)胞裂解液，6mL TBS 液，1.2mL 蛋白酶 K，5.4mL 裂解液，300μl PCR 酶，300μ? DL2000 Marker,.60μl引物，60μ?陽(yáng)性對(duì)照，330μ?陰性對(duì)照，6mL TE緩沖液，30個(gè)吸附柱；引物包括上引物及下引物，上引物及下引物的體積均為30μ?，濃度均為20μΜ;上引物的序列為:.5’ -CCCCTATCACCTTCAACC -3’，下引物序列為:5’ -ACTGCGAGCACTCAATCC -3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:紅細(xì)胞裂解液組成包括 1.5Μ NH4CL, IOOmM KHCO3 及 IOmM Na4EDTA,用 IN HCL 或 IN NaOH調(diào) pH至 7.2-7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:TBS液包括 10mmoL/L 的 Tris 含 0.9%NaCL,用 IN HCL 調(diào) pH 至 7.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:蛋白酶K用TE溶液配制成20mg/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:裂解液包括IOmMTris-HCL、lmMEDTA、2.5M NaCL以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:TE緩沖液包括=IOmM的Tris-HCL及ImM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的PH值為7.8。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:PCR 酶的組成包括:10mM 的 Tris-HCL (PH8.3)、50mM 的 KCL、1.5mM 的 MgCL2 以及 0.05UPolymerase/M-L 。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病PCR快速診斷試劑盒，其特征在于:陰性對(duì)照為超純水；陽(yáng)性對(duì)照為牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)DNA模板。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103509873SQ201310502734
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】吳位珩, 孫啟躍, 楊莉, 文才智, 張劍剛, 楊茂生 申請(qǐng)人:貴州省畜牧獸醫(yī)研究所