專利名稱：免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含免疫刺激性寡核苷酸序列(ISS)的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。本發(fā)明也涉及施用該多核苷酸來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
針對(duì)感染或其它抗原性攻擊所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答的類型通?？赏ㄟ^(guò)參與該應(yīng)答的T輔助(Th)細(xì)胞亞群而區(qū)分。Th1亞群負(fù)責(zé)經(jīng)典的細(xì)胞介導(dǎo)功能，如遲發(fā)型超敏反應(yīng)和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的活化，而Th2亞群作為B細(xì)胞活化的輔助細(xì)胞更為有效。針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)類型通常受細(xì)胞因子影響，其中所述細(xì)胞因子由細(xì)胞響應(yīng)抗原而產(chǎn)生。Th1和Th2細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子的不同被認(rèn)為可以反映這兩種亞群的不同生物功能。參見(jiàn)如Romagnani(2000)Ann.Allergy Asthma Immunol.859-18。
Th1亞群尤其適于響應(yīng)病毒感染、胞內(nèi)病原體和腫瘤細(xì)胞，因?yàn)樵搧喨悍置诳苫罨疌TL的IL-2和IFN-γ。Th2亞群更適于響應(yīng)自由生活的細(xì)菌和腸道寄生蟲(chóng)并可介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)，因?yàn)镮L-4和IL-5已知可分別誘導(dǎo)IgE產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞活化。總之，Th1和Th2細(xì)胞有不同的細(xì)胞因子分泌模式，故一類反應(yīng)可調(diào)節(jié)另一類反應(yīng)的活性。例如，Th1/Th2平衡的遷移可導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)，或?qū)е略鰪?qiáng)的CTL反應(yīng)。
對(duì)于許多感染性疾病如結(jié)核病和瘧疾，Th2-類反應(yīng)幾乎無(wú)針對(duì)感染的保護(hù)作用。提議使用衍生自靶抗原和其它目前所使用的抗原劑的小肽作為疫苗可避免使用具潛在感染性的完整病毒粒子，但這不總能引起達(dá)到治療效果所需的免疫反應(yīng)。缺乏有效治療人免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗是這種失敗的一個(gè)不幸例子?；诘鞍踪|(zhì)的疫苗一般誘導(dǎo)Th2-類免疫反應(yīng)，其特征在于高滴度的中和抗體但無(wú)顯著的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。
而且，一些類型的抗體反應(yīng)在某些適應(yīng)征中是不合適的，最明顯的是在變態(tài)反應(yīng)中IgE抗體反應(yīng)可導(dǎo)致過(guò)敏性休克。通常變態(tài)反應(yīng)也涉及到Th2-類免疫反應(yīng)。變態(tài)反應(yīng)(包括變應(yīng)性哮喘)的特征在于早期反應(yīng)和晚期反應(yīng)，其中早期反應(yīng)發(fā)生在暴露變應(yīng)原后的數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)且特征在于細(xì)胞脫粒，晚期反應(yīng)發(fā)生在4至24小時(shí)后且特征在于嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)變應(yīng)原暴露位點(diǎn)。具體而言，在變態(tài)反應(yīng)的早期，變應(yīng)原與嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞上的IgE抗體交聯(lián)，結(jié)果引發(fā)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫粒和接下來(lái)的組胺和其它炎癥介質(zhì)釋放。在晚期反應(yīng)期間，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)變應(yīng)原暴露位點(diǎn)(在此處導(dǎo)致組織損傷和功能障礙)。
變應(yīng)性疾病的抗原免疫治療包括皮下注射小量，但漸增量的抗原。此類免疫治療存在誘發(fā)IgE-介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)的危險(xiǎn)性并且不能有效解決晚期變應(yīng)反應(yīng)中細(xì)胞因子-介導(dǎo)的事件。因此至今，該方法只取得了有限的成功。
某些DNA序列(通常稱作免疫刺激性序列或＂ISS＂)的施用可誘導(dǎo)偏向于Th1-類的免疫反應(yīng)，這一點(diǎn)可通過(guò)Th1-相關(guān)細(xì)胞因子的分泌而說(shuō)明。免疫刺激性多核苷酸與抗原一起施用能導(dǎo)致針對(duì)所施用抗原的Th1-類免疫反應(yīng)。Roman等人(1997)自然醫(yī)藥(Nature Med.)3849-854。例如，皮內(nèi)注射于鹽水或佐劑明礬中的大腸桿菌(E.coli)β-半乳糖苷酶(β-Gal)的小鼠產(chǎn)生特異性IgG1和IgE抗體以及分泌IL-4和IL-5而非IFN-γ的CD4+細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，表明這些T細(xì)胞主要為Th2亞群的。但是，皮內(nèi)注射(或使用齒狀皮膚抓涂器施與)編碼β-Gal并含有ISS的質(zhì)粒DNA(在鹽水中)的小鼠產(chǎn)生IgG2a抗體和分泌IFN-γ而非IL-4和IL-5的CD4+細(xì)胞，表明這些T細(xì)胞主要為Th1亞群的。而且，注射質(zhì)粒DNA的小鼠的特異性IgE產(chǎn)生降低66-75％。Raz等人(1996)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)935141-5145?？傊?，針對(duì)裸DNA的免疫反應(yīng)的特征在于抗原刺激的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2、TNF-α和IFN-γ，這表明為Th1-類反應(yīng)。在治療變態(tài)反應(yīng)和哮喘時(shí)這尤其重要，這一點(diǎn)通過(guò)減少的IgE產(chǎn)生即可證實(shí)。免疫刺激性多核苷酸刺激Th1-類免疫反應(yīng)的能力已通過(guò)細(xì)菌抗原、病毒抗原和變應(yīng)原得以證明(參見(jiàn)如WO 98/55495)。
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ISS通常包括CG序列。ISS中CG側(cè)翼的核苷酸也似乎在該多核苷酸的免疫調(diào)節(jié)活性中起作用。仍需要繼續(xù)鑒定ISS以用于免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸中。
此處引用的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物全部并入本文作為參考。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明涉及免疫刺激性序列(ISS)、包含ISS的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以及使用這些多核苷酸調(diào)節(jié)個(gè)體尤其是人的免疫反應(yīng)的方法。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和可藥用賦形劑的組合物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含含有式5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)的序列的ISS，式中X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且該式不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
在另一方面，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含含有式5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)的序列的ISS，式中Z為5-溴胞嘧啶，X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且該式不為5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66；Z＝5溴胞嘧啶)。
在另一方面，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含至少一個(gè)如下序列TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)，GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)，CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)，ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)和GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
在另一方面，相對(duì)于此處公開(kāi)的任何ISS，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還可包含一個(gè)或多個(gè)TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，優(yōu)選地位于ISS的5′(或上游)。
在另一方面，相對(duì)于此處公開(kāi)的任何ISS，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還可包含一個(gè)或多個(gè)TCGA和/或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
在另一方面，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸是經(jīng)穩(wěn)定化處理的。
在另一方面，本發(fā)明提供了免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸/微載體復(fù)合體，其包含本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和與之連接的微載體，特別是尺寸小于10μm的微載體。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含此處描述的任何免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸(包括與微載體復(fù)合的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸)的組合物。組合物也可包含如可藥用賦形劑或許多其它組分中的任一種，如抗原。
在另一方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)個(gè)體免疫反應(yīng)的方法，包括將本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以足以調(diào)節(jié)所述個(gè)體的免疫反應(yīng)的量施與該個(gè)體。根據(jù)本發(fā)明方法的免疫調(diào)節(jié)可在個(gè)體身上應(yīng)用，其中所述個(gè)體包括那些患有Th2-類免疫反應(yīng)相關(guān)疾病(如變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)-誘導(dǎo)的哮喘)的個(gè)體，接受疫苗如治療性疫苗(如包含變態(tài)反應(yīng)表位、分枝桿菌(mycobacterial)表位或腫瘤相關(guān)表位的疫苗)或預(yù)防性疫苗的個(gè)體，患有癌癥的個(gè)體，以及患有感染性疾病的個(gè)體。
在再一方面，本發(fā)明提供了增加個(gè)體的γ-干擾素(IFN-γ)(或刺激個(gè)體的IFN-γ水平(或量))的方法，包括將有效量的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸施與個(gè)體。本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的施用可提高個(gè)體的IFN-γ。這些方法的合適受試者包括那些可從IFN-γ升高而受益的個(gè)體，或患有特發(fā)性肺纖維化(IPF)、硬皮病、輻射引發(fā)的皮膚纖維化、肝纖維化(包括血吸蟲(chóng)病引發(fā)的肝纖維化)、腎纖維化以及其它可通過(guò)施用IFN-γ而改善的疾病的個(gè)體。
在再一方面，本發(fā)明提供了提高個(gè)體的α-干擾素(IFN-α)(或刺激個(gè)體的IFN-α水平(或量))的方法，包括將有效量的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸施與個(gè)體。本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的施用可提高個(gè)體的IFN-α。這些方法的合適受試者包括那些患有病毒感染以及其它可通過(guò)施用IFN-α或提高IFN-α的量而改善的疾病的個(gè)體。
在另一方面，本發(fā)明提供了改善感染性疾病的一種或多種癥狀的方法，其包括將有效量的本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸施與患有感染性疾病的個(gè)體。本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的施用可改善感染性疾病的一種或多種癥狀?？筛鶕?jù)本發(fā)明治療的感染性疾病包括由于細(xì)胞病原體引起的感染性疾病(如分枝桿菌病、瘧疾、利什曼病、弓形體病、血吸蟲(chóng)病或支睪吸蟲(chóng)病)，并且可包括或不包括病毒性疾病。
本發(fā)明還涉及試劑盒，優(yōu)選地用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒通常包含本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸(通常在合適的容器中)，并且還可包含例如當(dāng)個(gè)體患有Th2-類免疫反應(yīng)相關(guān)疾病(如變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)-誘導(dǎo)的哮喘)，當(dāng)個(gè)體接受疫苗如治療性疫苗(如包含變態(tài)反應(yīng)表位、分枝桿菌表位或腫瘤相關(guān)表位的疫苗)或預(yù)防性疫苗，當(dāng)個(gè)體患有癌癥或患有感染性疾病時(shí)使用免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的說(shuō)明書(shū)。還可提供其它合適的說(shuō)明。
實(shí)施本發(fā)明的方式我們發(fā)現(xiàn)了包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以及使用這些免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸調(diào)節(jié)個(gè)體尤其是人的免疫反應(yīng)的方法。本發(fā)明的組合物包含含有此處所述的ISS的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。本發(fā)明的某些免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還包括至少一個(gè)TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列。在一些免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸中，該額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列通過(guò)將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)包含特異性ISS的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可以有效地調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，包括人細(xì)胞。我們的發(fā)現(xiàn)尤其令人感興趣，因?yàn)槿思?xì)胞對(duì)免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的免疫調(diào)節(jié)作用較來(lái)自常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如小鼠的細(xì)胞更具抵抗性。我們也觀察到本發(fā)明的一些多核苷酸能有效地刺激IFN-α，甚至在人細(xì)胞中也是如此。
本發(fā)明也提供了通過(guò)向個(gè)體施用本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸來(lái)調(diào)節(jié)個(gè)體免疫反應(yīng)的方法。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的含有ISS的多核苷酸的試劑盒。這些試劑盒還可包含施用本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的說(shuō)明書(shū)和免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。
一般技術(shù)本發(fā)明的實(shí)踐除非另有說(shuō)明，均采用本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的說(shuō)明，如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版(Sambrook等人，1989)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait編輯1984)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney編輯，1987)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir&C.C.Blackwell編輯)；用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene TransferVectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller&M.P.Calos編輯，1987)；分子生物學(xué)最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等人編輯，1987)；PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PCRThe PolymeraseChain Reaction)，(Mullis等人編輯，1994)；免疫學(xué)最新技術(shù)(CurrentProtocols in Immunology)(J.E.Coligan等人編輯，1991)；免疫試驗(yàn)手冊(cè)(The Immunoassay Handbook)(D.Wild編輯，Stockton Press NY，1994)；生物結(jié)合技術(shù)(Bioconjugate Techniques)(Greg T.Hermanson編輯，Academic Press，1996)；以及免疫學(xué)分析方法(Methods of ImmunologicalAnalysis)(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines編輯，WeinheimVCH Verlags gesellschaft mbH，1993)。
定義本文中，除非另外指出，單數(shù)形式的＂a＂，＂an＂和＂the＂包括復(fù)數(shù)形式。如＂an＂ISS包括一個(gè)或多個(gè)ISS。
本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)＂多核苷酸＂和＂寡核苷酸＂包括單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈RNA(ssRNA)和雙鏈RNA(dsRNA)、修飾的寡核苷酸和寡核苷或其組合。寡核苷酸可為線形或環(huán)狀構(gòu)型，或寡核苷酸可同時(shí)包含線形和環(huán)狀區(qū)段。寡核苷酸為核苷的聚合物，其中核苷通常通過(guò)磷酸二酯鍵連接，但在寡核苷酸中也可使用其它的鍵接如硫代磷酸酯。核苷由與糖鍵接的嘌呤(腺嘌呤(A)或鳥(niǎo)嘌呤(G)或它們的衍生物)或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或它們的衍生物)堿基組成。在DNA中這四種核苷單元(或堿基)稱為脫氧腺苷、脫氧鳥(niǎo)苷、脫氧胸苷和脫氧胞苷。核苷酸為核苷的磷酸酯。
術(shù)語(yǔ)＂ISS＂如此處所用是指實(shí)現(xiàn)體外、體內(nèi)和/或離體測(cè)定中可測(cè)量的免疫反應(yīng)和/或?qū)ζ溆胸暙I(xiàn)的多核苷酸序列?？蓽y(cè)量的免疫反應(yīng)的實(shí)例包括但不限于抗原特異性抗體的產(chǎn)生、細(xì)胞因子分泌、淋巴細(xì)胞群如NK細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等的活化或擴(kuò)增。優(yōu)選地，ISS序列優(yōu)先活化Th1-類反應(yīng)。本發(fā)明中使用的多核苷酸包含至少一個(gè)ISS。如此處所用，＂ISS＂也是含有ISS的多核苷酸，包括本發(fā)明的含有ISS的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的縮寫術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)＂3通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一個(gè)區(qū)域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區(qū)域或位置的3′(下游)。
術(shù)語(yǔ)＂5通常是指多核苷酸或寡核苷酸中的一個(gè)區(qū)域或位置位于此同一多核苷酸或寡核苷酸中的另一區(qū)域或位置的5′(上游)。
＂鄰近＂另一序列的區(qū)域、部分或序列直接與那個(gè)區(qū)域、部分或序列毗連。例如，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸中鄰近ISS部分的其它多核苷酸序列直接與那個(gè)區(qū)域毗連。
術(shù)語(yǔ)＂免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸＂或＂IMP＂或＂含有ISS的多核苷酸＂如此處所用，是指包含至少一個(gè)ISS的多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，IMP為ISS。
術(shù)語(yǔ)＂免疫調(diào)節(jié)的＂或＂調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的＂如此處所用包括免疫刺激和免疫抑制作用。免疫調(diào)節(jié)主要是在總體免疫反應(yīng)中質(zhì)的改變，雖然量的改變也可與免疫調(diào)節(jié)相連而發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明受到免疫調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)將朝向＂Th1-類＂免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)移而背離＂Th2-類＂免疫反應(yīng)。Th1-類反應(yīng)一般被認(rèn)為是細(xì)胞免疫體系的(如細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞)反應(yīng)，而Th2-類反應(yīng)通常為＂體液的＂，或基于抗體的反應(yīng)。Th1-類免疫反應(yīng)通常的特征在于對(duì)抗原的＂遲發(fā)型超敏＂反應(yīng)，并可在生物化學(xué)水平通過(guò)Th1-相關(guān)細(xì)胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-12、TNF-β及IL-6水平的上升而檢測(cè)到，雖然IL-6也可與Th2-類反應(yīng)相關(guān)。Th1-類免疫反應(yīng)通常與細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生和低水平或短暫的抗體產(chǎn)生相關(guān)。Th2-類免疫反應(yīng)通常與較高水平的抗體產(chǎn)生(包括IgE產(chǎn)生)、無(wú)或極少的CTL產(chǎn)生和Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-4的表達(dá)有關(guān)。因此，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)作用可通過(guò)例如本發(fā)明方法治療的個(gè)體與未治療的個(gè)體相比IFN-γ的升高和/或IgE產(chǎn)生的降低而認(rèn)知。
術(shù)語(yǔ)＂偶聯(lián)物＂是指含有ISS的多核苷酸與抗原連接的復(fù)合體。此類偶聯(lián)物的連接包括共價(jià)和/或非共價(jià)連接。
術(shù)語(yǔ)＂抗原＂是指被抗體或被T細(xì)胞抗原受體特異性識(shí)別并結(jié)合的物質(zhì)?？乖砂?、蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖、復(fù)合糖、糖類、神經(jīng)節(jié)苷脂、脂類和磷脂；其部分和其組合。抗原可為自然中存在的抗原或可為合成的。適于與ISS一起施用的抗原包括任何可引發(fā)B細(xì)胞或T細(xì)胞抗原特異性反應(yīng)的分子。優(yōu)選地，抗原引發(fā)特異針對(duì)該抗原的抗體反應(yīng)。半抗原包括在＂抗原＂的范圍內(nèi)。半抗原為本身無(wú)免疫原性的低分子量化合物，但當(dāng)它與含抗原決定簇的免疫原性分子偶聯(lián)時(shí)產(chǎn)生免疫原性。小分子可能需要被半抗原化以產(chǎn)生抗原性。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗原包括肽、脂類(如固醇類、脂肪酸和磷脂)、多糖(如在流感嗜血桿菌(Hemophilus influenza)疫苗中使用的多糖)、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。
＂佐劑＂是指這樣的物質(zhì)，當(dāng)其加入免疫原性劑如抗原中時(shí)可非特異增強(qiáng)或加強(qiáng)受者宿主暴露于該混合物后對(duì)該免疫原性劑的免疫反應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)＂肽＂為具有足以實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)如抗體產(chǎn)生或細(xì)胞因子活性的長(zhǎng)度和組成的多肽，而不管該肽是否為半抗原。一般，肽長(zhǎng)至少為6個(gè)氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)＂肽＂還包括修飾的氨基酸(天然或非天然存在的)，此類修飾包括但不限于磷酸化、糖基化、PEG化(pegylation)、脂化和甲基化。
＂抗原肽＂可包括純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質(zhì)、粗蛋白提取物、減毒或滅活病毒、細(xì)胞、微生物、或此類肽的片段。＂抗原肽＂或＂抗原多肽＂因此指顯示出一種或多種抗原特性的全部或部分多肽。這樣，如＂Amba1抗原多肽＂或＂Amba1多肽抗原＂為來(lái)自Amba1的顯示抗原特性(即特異性結(jié)合抗體或T細(xì)胞受體)的氨基酸序列，不管其是否為全長(zhǎng)序列、序列的一部分和/或序列的修飾物。
＂遞送分子＂或＂遞送載體＂為利于、允許和/或增加免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸遞送至特定位點(diǎn)和/或在特定時(shí)間遞送的化學(xué)部份。遞送載體可以或不可以額外刺激免疫反應(yīng)。
＂針對(duì)抗原的變態(tài)反應(yīng)＂是指這樣的免疫反應(yīng)，其通常的特征在于產(chǎn)生嗜酸性粒細(xì)胞和/或抗原特異性IgE以及它們所導(dǎo)致的作用。如本領(lǐng)域熟知的那樣，IgE結(jié)合肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的IgE受體。當(dāng)隨后暴露于IgE所識(shí)別的抗原時(shí)，該抗原將與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上的IgE交聯(lián)，引起這些細(xì)胞脫粒，包括但不限于釋放組胺。應(yīng)了解并認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明一些方法的應(yīng)用中，術(shù)語(yǔ)＂針對(duì)抗原的變態(tài)反應(yīng)＂、＂變態(tài)反應(yīng)＂和＂變應(yīng)性疾?。⑼鹊剡m用。而且，應(yīng)了解并認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的方法包括那些同樣適用于防止變態(tài)反應(yīng)及治療已存在的變應(yīng)性疾病的方法。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)＂變應(yīng)原＂是指暴露于受試者后可引起變態(tài)反應(yīng)的抗原或分子的抗原性部分，通常為蛋白質(zhì)。一般地受試者如通過(guò)水皰和潮紅試驗(yàn)或任一本領(lǐng)域已知的方法所指出的那樣對(duì)變應(yīng)原具變應(yīng)性。即使受試者中只有少數(shù)亞群在暴露于分子后顯示出變應(yīng)性(例如IgE)免疫反應(yīng)，該分子也被稱為變應(yīng)原。許多分離的變應(yīng)原為本領(lǐng)域公知。它們包括但不限于此處表1中所提供的變應(yīng)原。
術(shù)語(yǔ)＂脫敏＂是指給顯示出敏感性的受試者施用漸增劑量的變應(yīng)原的方法。用于脫敏的變應(yīng)原劑量的實(shí)例為本領(lǐng)域公知，參見(jiàn)如Fornadley(1998)Otolaryngol.Clin.North Am.31111-127。
＂抗原特異的免疫治療＂是指涉及到抗原并可對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)的任何免疫治療形式。在變態(tài)反應(yīng)中，抗原特異性免疫治療包括但不限于脫敏治療。
術(shù)語(yǔ)＂微載體＂是指不溶于水的微粒組合物，其尺寸小于約150、120或100μm，優(yōu)選地小于約50-60μm，優(yōu)選地小于約10μm，優(yōu)選地小于約5、2.5、2或1.5μm。微載體包括＂毫微載體＂，其為尺寸小于約1μm，優(yōu)選地小于約500nm的微載體。微載體包括固相粒子如由生物相容的天然聚合物、合成聚合物或合成共聚物形成的粒子，但此處定義的微載體及其它本領(lǐng)域公知的可生物降解材料可包括或不包括由瓊脂糖或交聯(lián)瓊脂糖形成的微載體。用于本發(fā)明的微載體可以為可生物降解的或不可生物降解的。不可生物降解的固相微載體由在哺乳動(dòng)物生理?xiàng)l件下不易蝕的和/或不可降解的聚合物或其它材料形成，如聚苯乙烯、聚丙烯、硅石、陶瓷、聚丙烯酰胺、金、膠乳、羥基磷灰石、葡聚糖以及鐵磁性和順磁性材料。可生物降解的固相微載體可由在哺乳動(dòng)物生理?xiàng)l件下可降解的聚合物(如聚(乳酸)、聚(羥基乙酸)及其共聚物)或易蝕的聚合物(例如，聚(原酸酯如3，9-二亞乙基-2，4，8，10-四氧雜螺[5.5]十一烷(DETOSU))，或聚(酐類)如癸二酸的聚(酐類))形成。微載體也可為液相(例如，基于油或酯的液相)，如脂質(zhì)體、無(wú)抗原的iscom(免疫刺激復(fù)合體，其為膽固醇、磷脂和具有佐劑活性的皂甙的穩(wěn)定復(fù)合體)或在水包油或油包水乳液中的微滴或微膠粒?？缮锝到獾囊合辔⑤d體通常摻入可生物降解的油，它們中的一些為本領(lǐng)域公知，包括鯊烯和植物油。微載體一般為球狀，但偏離球狀的微載體也是可接受的(如橢圓形、棒狀等)。鑒于微載體的不可溶性(相對(duì)于水)，它們可從水和基于水的(含水的)溶液中過(guò)濾出來(lái)。
術(shù)語(yǔ)＂不可生物降解的＂如此處所用是指在正常的哺乳動(dòng)物生理?xiàng)l件下不被降解或腐蝕的微載體。通常，如果微載體在正常的人血清中37℃孵育72小時(shí)后不被降解(即其質(zhì)量或平均聚合物長(zhǎng)度的損失小于5％)，則認(rèn)為它不可生物降解。
如果微載體在正常的哺乳動(dòng)物生理?xiàng)l件下可降解或易蝕，則認(rèn)為它是＂生物可降解的＂。通常，如果微載體在正常的人血清中37℃孵育72小時(shí)后被降解(即其質(zhì)量或平均聚合物長(zhǎng)度至少損失5％)，則認(rèn)為它可生物降解。
微載體的＂尺寸＂通常為廠商所陳述的粒子的＂設(shè)計(jì)尺寸＂或預(yù)期尺寸。尺寸可直接測(cè)定如測(cè)定平均或最大直徑，或通過(guò)間接試驗(yàn)如過(guò)濾篩選試驗(yàn)測(cè)定。微載體尺寸的直接測(cè)定一般通過(guò)顯微鏡及與已知大小的粒子比較或參照測(cè)微計(jì)而實(shí)施，其中所述顯微鏡通常為光學(xué)顯微鏡或掃描電鏡(SEM)。由于微載體在生產(chǎn)過(guò)程中在尺寸上可產(chǎn)生小的差異，因此當(dāng)實(shí)測(cè)值顯示為聲明的測(cè)量值的約±5-10％時(shí)，認(rèn)為微載體具有所述大小。尺寸特征也可通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射或暗化技術(shù)測(cè)定。另外，微載體的尺寸也可通過(guò)過(guò)濾篩選試驗(yàn)測(cè)定。如果至少97％的粒子能通過(guò)具有所述大小的＂篩式＂濾器(即滯留粒子位于濾器表面的濾器，如聚碳酸酯或聚醚砜濾器，它們不同于將滯留粒子容納于濾器內(nèi)的＂深度濾器＂)，則微載體小于所述大小。如果至少約97％的微載體粒子被具有所述大小的篩式濾器滯留，則微載體大于所述大小。這樣，至少約97％的尺寸為約10μm至約10nm的微載體能通過(guò)10μm孔的篩式濾器而被10nm篩式濾器滯留。
如上述討論中所指出的，談到微載體尺寸或尺寸范圍時(shí)隱含包括所述尺寸和/或尺寸范圍的近似變異值和近似值。當(dāng)談及尺寸和/或尺寸范圍時(shí)，術(shù)語(yǔ)“約”的使用反應(yīng)了這一點(diǎn)，并且當(dāng)談及尺寸或尺寸范圍時(shí)沒(méi)提及“約”并不指該尺寸和/或尺寸范圍是精確的。
術(shù)語(yǔ)＂免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸/微載體復(fù)合體＂或＂IMP/MC復(fù)合體＂是指含有ISS的多核苷酸和微載體的復(fù)合體。復(fù)合體的組分可共價(jià)或非共價(jià)連接。非共價(jià)連接可通過(guò)任何非共價(jià)結(jié)合力介導(dǎo)，包括疏水作用、離子(靜電)鍵、氫鍵和/或范德華引力。當(dāng)為疏水連接時(shí)，該連接通常通過(guò)與IMP共價(jià)連接的疏水部分(如膽固醇)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
＂個(gè)體＂為脊椎動(dòng)物，如鳥(niǎo)，并優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。哺乳動(dòng)物包括但不限于人、靈長(zhǎng)類、農(nóng)畜、體育用動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物和寵物。
物質(zhì)的＂有效量＂或＂足夠量＂是足以實(shí)現(xiàn)有益或所需結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的量，因而＂有效量＂取決于應(yīng)用它的上下文。在施用可調(diào)節(jié)針對(duì)共施用抗原的免疫反應(yīng)的組合物的上下文中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和抗原的有效量為足以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)的量，其中所述調(diào)節(jié)是與單獨(dú)施用抗原時(shí)所達(dá)到的免疫反應(yīng)相比而言的。有效量可在一次施用或多次施用中施與。
術(shù)語(yǔ)＂共施用＂如此處所用是指在足夠接近的時(shí)間內(nèi)施用至少兩種不同的物質(zhì)以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，共施用是指同時(shí)施用至少兩種不同的物質(zhì)。
＂刺激＂反應(yīng)或參數(shù)包括引起和/或增強(qiáng)該反應(yīng)或參數(shù)。例如＂刺激＂免疫反應(yīng)如Th1反應(yīng)是指增強(qiáng)該反應(yīng)，這可通過(guò)引發(fā)該反應(yīng)和/或增強(qiáng)該反應(yīng)產(chǎn)生。同樣地，＂刺激＂細(xì)胞因子或細(xì)胞類型(如CTL)是指細(xì)胞因子或細(xì)胞類型的量或水平的升高。
＂與IgE相關(guān)的疾?。樯韺W(xué)疾病，其特征部分在于升高的IgE水平，這可為持續(xù)性的或可為非持續(xù)性的。IgE相關(guān)疾病包括但不限于變態(tài)反應(yīng)和變應(yīng)性反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)相關(guān)疾病(如下所述)、哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎、風(fēng)疹、休克、膜翅目昆蟲(chóng)叮咬引起的變態(tài)反應(yīng)和藥物變態(tài)反應(yīng)、以及寄生蟲(chóng)感染。該術(shù)語(yǔ)也包括這些疾病的相關(guān)表現(xiàn)。通常，在此類疾病中IgE為抗原特異的。
＂變態(tài)反應(yīng)相關(guān)疾?。⑹侵赣煽乖禺愋訧gE免疫反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致的疾病。此類結(jié)果可包括但不限于低血壓和休克。過(guò)敏反應(yīng)是變態(tài)反應(yīng)相關(guān)疾病的一個(gè)例子，在過(guò)敏反應(yīng)期間，組胺釋放入循環(huán)，引起血管舒張及毛細(xì)血管通透性增加，結(jié)果導(dǎo)致循環(huán)中血漿的顯著丟失。過(guò)敏反應(yīng)可為全身性發(fā)生，整個(gè)身體都經(jīng)歷相關(guān)的影響，也可為局部發(fā)生，反應(yīng)局限于特異的靶組織或器官。
術(shù)語(yǔ)＂病毒性疾病＂如此處所用是指病毒作為致病因子的疾病。病毒性疾病的實(shí)例包括乙型肝炎、丙型肝炎、流感、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)和帶狀皰疹。
如此處所用及本領(lǐng)域所熟知的，＂治療＂為用于獲得有益或所需結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的方法。為了本發(fā)明的目的，有益或所需臨床結(jié)果包括但不限于減輕或改善一種或多種癥狀、減輕疾病的程度、穩(wěn)定(即不加重)疾病的狀態(tài)、防止疾病的擴(kuò)散、延遲或減慢疾病進(jìn)程、改善或緩和疾病狀態(tài)、以及緩解(部分或全部)疾病，無(wú)論其是可檢測(cè)的或是不可檢測(cè)的。＂治療＂也可指與不接受該治療時(shí)的預(yù)期存活期相比延長(zhǎng)存活。
疾病的＂減輕＂是指與不治療該疾病相比，疾病或病狀的程度和/或不想要的臨床表現(xiàn)得以減輕和/或疾病進(jìn)展的時(shí)程減慢或延長(zhǎng)。尤其在變態(tài)反應(yīng)中，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，減輕可在調(diào)節(jié)針對(duì)變應(yīng)原的免疫反應(yīng)后發(fā)生。而且，減輕不一定會(huì)在施用一劑后發(fā)生，它往往在施用一連串的劑量后產(chǎn)生。因此，足以減輕反應(yīng)或疾病的量可一次或多次施用。
通過(guò)施用免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和抗原“引發(fā)”的＂抗體效價(jià)＂或＂抗體量＂是指施用免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和抗原后在某一時(shí)間點(diǎn)測(cè)定到的特定抗體的量。
＂Th1相關(guān)抗體＂為其產(chǎn)生和/或增高與Th1免疫反應(yīng)相關(guān)的抗體。如IgG2a為小鼠Th1相關(guān)抗體。為了本發(fā)明目的，Th1相關(guān)抗體的測(cè)定可為對(duì)一種或多種此類抗體的測(cè)定。如對(duì)人而言，Th1相關(guān)抗體的測(cè)定可能需要對(duì)IgG1和/或IgG3進(jìn)行測(cè)定。
＂Th2相關(guān)抗體＂為其產(chǎn)生和/或增高與Th2免疫反應(yīng)相關(guān)的抗體。如IgG1為小鼠Th2相關(guān)抗體。為了本發(fā)明目的，Th2相關(guān)抗體的測(cè)定可為對(duì)一種或多種此類抗體的測(cè)定。如對(duì)人而言，Th2相關(guān)抗體的測(cè)定可能需要對(duì)IgG2和/或IgG4進(jìn)行測(cè)定。
＂抑制＂或＂阻止＂功能或活性如細(xì)胞因子產(chǎn)生、抗體產(chǎn)生或組胺釋放是指與除了目標(biāo)條件或參數(shù)外的其它相同條件比較或備選地與另一條件比較時(shí)功能或活性的降低。例如，與如僅用抗原時(shí)誘導(dǎo)的組胺釋放相比，抑制組胺釋放的包含免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和抗原的組合物可減少組胺釋放。作為另一實(shí)例，與如僅用抗原時(shí)產(chǎn)生的抗體的程度和/或水平相比，抑制抗體產(chǎn)生的包含免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和抗原的組合物可降低抗體的程度和/或水平。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)＂包含＂及其同族術(shù)語(yǔ)取它們包括在內(nèi)的意思，即等同于術(shù)語(yǔ)＂包括＂及其相應(yīng)的同族詞。
本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)個(gè)體免疫反應(yīng)的免疫刺激性序列(ISS)和免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸(IMP)。每一免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含至少一個(gè)免疫刺激性序列(ISS)。
本發(fā)明的組合物可以僅包含免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸(或兩種或多種免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的組合)，或可以包含免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸與另一免疫調(diào)節(jié)劑如肽、抗原(見(jiàn)下述)和/或其它佐劑的聯(lián)合。本發(fā)明的組合物可包含免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和可藥用賦形劑。可藥用賦形劑，包括緩沖劑，為本領(lǐng)域熟知。RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，MackPublishing(2000)。
包含抗原、本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和任選地佐劑的組合物在施用后，可導(dǎo)致針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，并由此較僅包含ISS和抗原的組合物導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。佐劑為本領(lǐng)域公知，其包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、明礬(鋁鹽)、脂質(zhì)體和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合適的佐劑還包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝桿菌細(xì)胞壁制品、單磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、QuilA、霍亂毒素B亞單位、聚磷腈及衍生物、及免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344873-875中描述的那些免疫刺激復(fù)合物、以及基于脂的佐劑和此處描述的其它佐劑。對(duì)于獸用及在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，可使用弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)的促有絲分裂成分。
本發(fā)明含有ISS的多核苷酸可與其它的治療結(jié)合來(lái)治療特定的適應(yīng)征。例如，除了包含含有ISS的多核苷酸外，本發(fā)明的組合物也可包含抗瘧疾藥如氯喹用于瘧疾患者、包含殺利什曼原蟲(chóng)藥如戊烷脒和/或別嘌呤醇用于利什曼病患者、包含抗分枝桿菌藥如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇用于結(jié)核病患者、包含變應(yīng)原脫敏劑用于特應(yīng)性(變態(tài)反應(yīng))患者。
如此處所述，本發(fā)明的組合物可包括含有ISS的多核苷酸并還可包括一種或多種其它的免疫治療劑(即通過(guò)免疫系統(tǒng)起作用的試劑和/或來(lái)自免疫系統(tǒng)的試劑)，其中所述免疫治療劑包括但不限于細(xì)胞因子、佐劑和抗體。治療性抗體的實(shí)例包括在癌癥中使用的抗體(如抗腫瘤抗體)，如下所述。
免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸根據(jù)本發(fā)明，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含至少一個(gè)ISS，并可包含多個(gè)ISS。在多核苷酸中多個(gè)ISS可相互鄰近，或被其它核苷酸堿基分開(kāi)，或相重疊。在某些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸由ISS組成。
ISS在本領(lǐng)域已有描述，且ISS易于用指示免疫反應(yīng)各方面(如細(xì)胞因子分泌、抗體產(chǎn)生、NK細(xì)胞活化和T細(xì)胞增殖)的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)來(lái)鑒定。參見(jiàn)如WO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Krieg等人(1995)自然(Nature)374546-549；Yamamoto等人(1992a)；Ballas等人(1996)；Klinman等人(1997)；Sato等人(1996)；Pisetsky(1996a)；Shimada等人(1986)日本癌研究雜志(Jpn.J.Cancer Res.)77808-816；Cowdery等人(1996)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1564570-4575；Roman等人(1997)；Lipford等人(1997a)；WO 98/55495和WO 00/61151。因此，這些及其它方法可用于鑒定、試驗(yàn)和/或證實(shí)含有ISS的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。
ISS可為大于10個(gè)堿基或堿基對(duì)的任何長(zhǎng)度，優(yōu)選地長(zhǎng)度大于15個(gè)堿基或堿基對(duì)，更優(yōu)選地長(zhǎng)度大于20個(gè)堿基或堿基對(duì)，且通常包含5′-胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤-3′序列。
如此處所清楚表達(dá)的，應(yīng)理解對(duì)于此處描述的式子，任何和所有參數(shù)都是獨(dú)立地選擇的。例如，如果x＝0-2，則可獨(dú)立地選擇y，而不用管x(或式中任何其它可選擇的參數(shù))的值。
在一些實(shí)施方案中，ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)其中X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且其中ISS不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
在一些實(shí)施方案中，ISS包括如下任一序列TGAACGUTCG(SEQ IDNO67)；TGACCGTTCG(SEQ ID NO68)；TGATCGGTCG(SEQ IDNO69)；TGATCGTTCG(SEQ ID NO70)；TGAACGGTCG(SEQ IDNO71)；GTAACGTTCG(SEQ ID NO72)；GTATCGGTCG(SEQ IDNO73)；GTACCGTTCG(SEQ ID NO74)；GAACCGTTCG(SEQ IDNO75)；ZGACCGTTCG(SEQ ID NO76)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)；CGACCGTTCG(SEQ ID NO78)；ZGAACGTTCG(SEQ ID NO79)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；TTAACGUTCG(SEQ ID NO80)；TUAACGUTCG(SEQ ID NO81)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO82)。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含序列5′-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO1)。
在其它實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含如下任一序列5′-TGACTGTGAACGUTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO2)；5′-TCGTCGAUCGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO3)；5′-TCGTCGAUCGTTCGTUAACGUTCG-3′(SEQ ID NO4)；5′-TCGTCGUACGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO5)；5′-TCGTCGAXCGUTCGTTAACGUTCG-3′(SEQ ID NO6)，其中X＝2-氨基-腺嘌呤；5′-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO7)；5′-TGACTGTGAACGUTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO8)；5′-TGACTGTGACCGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO9)；5′-TGACTGTGATCGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO10)；5′-TCGTCGAACGTTCGTT-3′(SEQ ID NO11)；
5′-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO12)；5′-TCGTCGGTATCGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO13)；5′-CTTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO14)；5′-CTGTGATCGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO15)；5′-TGACTGTGAACGGTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO16)；5′-TCGTCGGTACCGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO17)；5′-TCGTCGGAACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO18)；5′-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO19)；5′-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO20)；5′-TGACTGTGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO21)；5′-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO22)；5′-TZGTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO23)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO24)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTCGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO25)；5′-TZGTZGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO26)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TCGTZGACCGTTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO27)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；5′-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO28)；5′-CTTZGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO29)，其中Z＝5-溴胞嘧啶；.
5′-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO30)；5′-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT-3′(SEQ ID NO132)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)其中Z為5-溴胞嘧啶，X1為T、G、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且其中ISS不為5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66；Z＝5-溴胞嘧啶)。
在一些實(shí)施方案中，ISS包括如下任一序列(其中Z為5-溴胞嘧啶)TGAAZGUTCG(SEQ ID NO83)，TGACZGTTCG(SEQ ID NO84)，TGATZGGTCG(SEQ ID NO85)，GTATZGGTCG(SEQ ID NO86)，GTACZGTTCG(SEQ ID NO87)，GAACZGTTCG(SEQ ID NO88)，GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，ZGACZGTTCG(SEQ ID NO90)，CGAAZGTTCG(SEQ ID NO91)，ZGAAZGTTCG(SEQ ID NO92)，ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)，TTAAZGUTCG(SEQ ID NO94)，TUAAZGUTCG(SEQ ID NO95)和TTAAZGTTCG(SEQ ID NO96)。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含如下任一序列(其中Z為5-溴胞嘧啶)5′-TGACTGTGAAZGUTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO31)；5′-TCGTCGAAZGTTCGTTAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO32)；5′-TGACTGTGAAZGUTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO33)；5′-TGACTGTGAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO34)；5′-TCGTCGGAAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO35)；5′-TCGTZGAAZGUTCGGAATGA-3′(SEQ ID NO36)。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包括下式的10-mer序列5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO133)其中X1為T、C或Z(Z＝5-溴胞嘧啶)，X2為T、G、A或U，X3為T、A或C，X4為T、G或U且其中該式不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)。
在其它實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含如下任一序列(其中Z為5-溴胞嘧啶)5′-TGACTGTGAAZGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO37)；5′-TGACTGTGAAZGTTZGAGATGA-3′(SEQ ID NO38)；5′-TGACTGTGAAZGTTCCAGATGA-3′(SEQ ID NO39)；
5′-TGACTGTGAACGTUCGAGATGA-3′(SEQ ID NO40)；5′-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO41)，其中X＝5-溴尿嘧啶；5′-TGACTGTGAAZGTTCGTUATGA-3′(SEQ ID NO42)；5′-TGACTGTGAAZGTTCGGTATGA-3′(SEQ ID NO43)；5′-CTGTGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO44)；5′-TZGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO45)；5′-TCGTZGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO46)；5′-TGACTGTGAACGXTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO47)，其中X＝4-硫代胸腺嘧啶；5′-TGACTGTGAACXTTCXAGATGA-3′(SEQ ID NO48)；其中X＝6-硫代鳥(niǎo)嘌呤；5 ′-TGACTGTGAACGTTCGTUATGA-3′(SEQ ID NO49)；5′-TGACTGTGAACGTTCGTTATGA-3′(SEQ ID NO50)；5′-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO51)；5′-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO52)；5′-CTGTCAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO53)；5′-TCGTCGGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO55)；5′-TCGTCGGACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO56)；5′-TCGTCGTACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO57)；5′-TCGTCGTTCGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO58)。
在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于此處公開(kāi)的任何ISS，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還可包含一個(gè)或多個(gè)TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，優(yōu)選地位于ISS的5′，例如，一個(gè)或多個(gè)TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′；兩個(gè)或多個(gè)TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′；或三個(gè)或更多個(gè)TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列位于ISS的5′。TCG(一個(gè)或多個(gè))和/或T，5-溴胞嘧啶，G(一個(gè)或多個(gè))可直接或不直接鄰近ISS。這些序列的實(shí)例已在本文中提供。如在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可包括如下任一序列5′-TCGCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO97)；5′-TCGTCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO98)；5′-TZGCGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO99；其中Z＝5-溴胞嘧啶)；5′-TZGTZGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO100；其中Z＝5-溴胞嘧啶)；5′-TCGTTAACGTTCG-3′(SEQ ID NO101)。
在一些實(shí)施方案中，額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一個(gè)或多個(gè))位于ISS的5′并緊鄰ISS。即TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列與ISS之間有0個(gè)堿基的間隔，例如5′-T，C，G，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，ISS-3′。對(duì)于這些實(shí)施方案，ISS可為此處描述的任何10-mer式子。包含此類序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括如SEQ ID NO.12、18和46。
在其它實(shí)施方案中，額外的5′TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列與ISS之間有1個(gè)堿基的間隔，例如5′-T，C，G，N，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，N，ISS-3′(其中N＝任何堿基)。包含此類序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括如SEQ ID NO 19、26和27。在其它實(shí)施方案中，額外的5′TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一個(gè)或多個(gè))與ISS之間有2個(gè)堿基的間隔，例為5′-T，C，G，N，N，ISS-3′或5′-T，5-溴胞嘧啶，G，N，N，ISS-3′(其中N＝任何堿基)。對(duì)于這些實(shí)施方案，ISS可為此處描述的任何10-mer式子。
在免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的一些實(shí)施方案中，額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列(一個(gè)或多個(gè))通過(guò)將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產(chǎn)生。例如在SEQ ID NO14中，額外的TCG中的CG為10mer ISS的前兩個(gè)堿基(5′-CTTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO14))在另一例子中，TCG中的G為SEQ ID NO20中10mer ISS的第一個(gè)堿基(5′-TCGTCGTAACGTTCGAGATG-3 ′ (SEQ ID NO20))。對(duì)于諸如此類的實(shí)施方案，ISS可為此處描述的任一10-mer式子(如SEQ ID NO62，SEQID NO65或SEQ ID NO133)。包含此類序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括如SEQ ID NO.14，19，20，36和55。
因此，例如在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含一個(gè)鄰近于ISS 10-mer序列SEQ ID NO62的5′端的T，其中X1為C且X2為G。參見(jiàn)如SEQ ID NO19。例如在其它實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包含鄰近于ISS 10-mer序列SEQ ID NO62的5′端的TC，其中X1為G。參見(jiàn)如SEQ ID NO55。
在額外的TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列通過(guò)將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5’端而產(chǎn)生的某些實(shí)施方案中，此額外的序列可與ISS一起產(chǎn)生TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。例如在SEQ ID NO19中，額外的TCGA中的CGA為10-mer ISS的前三個(gè)堿基(5′-5′-TCGTCGAACGTTCGAGATG-3′(SEQ ID NO19))。在另一例子中，T，5-溴胞嘧啶，G，A序列中的5-溴胞嘧啶，G，A為SEQ ID NO36中10-mer ISS的前三個(gè)堿基(5′TCGTZGAAZGUTCGGAATG A-3′(SEQ IDNO36))。因此，本發(fā)明包括含有ISS和位于ISS 5’端的TCGA序列或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包括下式5′-(TCG)wNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO126)其中w為1-2，y為0-2，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括但不限于SEQ ID No.1.11，12，13，17，18，14，19，55，20，22，25，28和30。
在一些實(shí)施方案中，ISS包含任一如下序列TCGAACGTTCG(SEQ ID NO102)，TCGTCGAACGTTCG(SEQ IDNO98)，TCGTGAACGTTCG(SEQ ID NO103)，TCGGTATCGGTCG(SEQ ID NO104)，TCGGTACCGTTCG(SEQ ID NO105)，TCGGAACCGTTCG(SEQ ID NO106)，TCGGAACGTTCG(SEQ IDNO107)，TCGTCGGAACGTTCG(SEQ ID NO108)，TCGTAACGTTCG(SEQ ID NO109)，TCGTCGGAACGTTCG(SEQ IDNO108)，TCGACCGTTCG(SEQ ID NO110)，TCGTCGACCGTTCG(SEQ ID NO111)，TCGTTAACGTTCG(SEQ ID NO101)。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TXG)zNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO127)其中z為1-2，y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括但不限于SEQ ID No.45，23，26和29。
在一些實(shí)施方案中，ISS包含如下任一序列(其中X為5-溴胞嘧啶)TXCTGAACGTTCG(SEQ ID NO112)，TXCTXCTGAACGTTCG(SEQID NO113)，TXCAACGTTCG(SEQ ID NO114)，TXCTXCAACGTTCG(SEQ ID NO115)，TXGACCGTTCG(SEQ IDNO116)，TXCTXCACCGTTCG(SEQ ID NO54)。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包含下式5′-TCGTXGNyAX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO128)其中y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括但不限于SEQ IDNO.46，24和27。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS包含任一如下序列(其中X為5-溴胞嘧啶)TCGTXGTGAACGTTCG(SEQ ID NO117)，TCGTXGAACGTTCG(SEQ ID NO118)，TCGTXGACCGTTCG(SEQID NO119)。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TCG)wNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO129)其中w為1-2，y為0-2，N為任何堿基，X3為T、A或C，X為5-溴胞嘧啶，X4為T、G或U。包含此類ISS的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括但不限于SEQ ID NO35。在一些實(shí)施方案中，ISS包含序列TCGGAAAXGTTCG(SEQ ID NO120)或TCGAAXGTTCG(SEQ ID NO121)，其中X為5-溴胞嘧啶。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包含下式5′-(TXG)zNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO130)其中z為1-2，y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。在一些實(shí)施方案中，ISS包括序列TXGAAXGUTCG(SEQ ID NO122)或TXGAAXGTTCG(SEQ ID NO123)，其中X為5-溴胞嘧啶。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的ISS可包含下式5′-TCGTXGNyAX3XGX4TCG-3′(SEQ ID NO131)其中y為0-2，X為5-溴胞嘧啶，N為任何堿基，X3為T、A或C，X4為T、G或U。包含此類ISS序列的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸包括但不限于SEQ IDNO36。在一些實(shí)施方案中，ISS包含序列TCGTXGAAXGUTCG(SEQ IDNO124)或TCGTXGAAXGTTCG(SEQ ID NO125)，其中X為5-溴胞嘧啶。
ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可含有修飾。ISS的修飾包括本領(lǐng)域公知的任何修飾，但不限于對(duì)3′OH或5′OH基團(tuán)的修飾、核苷酸堿基的修飾、糖組分的修飾和磷酸酯基團(tuán)的修飾。多種此類修飾如下所述。
ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可為單鏈或雙鏈DNA，以及單鏈或雙鏈RNA或其它修飾的多核苷酸。ISS可包括或不包括一個(gè)或多個(gè)回文序列區(qū)域，其中所述回文序列區(qū)域可存在于上述的10聚體基序中或可延伸至該基序外。ISS可包含額外的側(cè)翼序列，它們中的一些于文中描述。ISS可包含天然存在的或修飾的、非天然存在的堿基，并可包含修飾的糖、磷酸酯和/或末端。例如，磷酸酯的修飾包括但不限于膦酸甲基酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(橋接或非橋接)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯，并且可以任意組合使用。也可使用其它非磷酸酯連接。優(yōu)選地，本發(fā)明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯主鏈。也可制備本領(lǐng)域公知的糖修飾如2′-烷氧基-RNA類似物、2′-氨基-RNA類似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合體及此處描述的其它修飾并與任意磷酸酯修飾組合。堿基修飾的實(shí)例(以下進(jìn)一步討論)包括但不限于向ISS的胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分(如5-溴胞嘧啶，5-氯胞嘧啶，5-氟胞嘧啶，5-碘胞嘧啶)和向ISS的尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分(如5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-碘尿嘧啶)。參見(jiàn)如國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 99/62923。
ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和核酸合成設(shè)備合成，包括但不限于酶法、化學(xué)法和降解較大的寡核苷酸序列。參見(jiàn)如Ausubel等人(1987)；和Sambrook等人(1989)。當(dāng)用酶促方式組裝時(shí)，可用如連接酶將各單元連接起來(lái)，其中所述連接酶如T4 DNA或RNA連接酶。美國(guó)專利號(hào)5,124,246。寡核苷酸的降解可通過(guò)將寡核苷酸暴露于核酸酶而實(shí)現(xiàn)，如在美國(guó)專利號(hào)4,650,675中所示例的。
ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸也可用常規(guī)的多核苷酸分離法分離。此類方法包括但不限于用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交來(lái)檢測(cè)共有的核苷酸序列、用抗體篩選表達(dá)文庫(kù)來(lái)檢測(cè)共同的結(jié)構(gòu)特征和通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)合成特定的天然序列。
可分離、通過(guò)重組法合成或化學(xué)合成環(huán)狀免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。當(dāng)環(huán)狀I(lǐng)MP通過(guò)分離或通過(guò)重組法獲得時(shí)，IMP優(yōu)選為質(zhì)粒。可用文獻(xiàn)中描述的任一方法化學(xué)合成較小的環(huán)狀寡核苷酸。參見(jiàn)如Gao等人(1995)核酸研究(Nucleic Acids Res.)232025-2029；和Wang等人(1994)核酸研究(Nucleic Acids Res.)222326-2333。
制備寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的技術(shù)為本領(lǐng)域公知。包含磷酸二酯鍵的天然存在DNA或RNA一般通過(guò)將合適的核苷亞磷酰胺依次偶聯(lián)至3′-端固定在固相載體上的、正在生長(zhǎng)的寡核苷酸的5′-羥基上，然后將中間體亞磷酸三酯氧化為磷酸三酯而合成。一旦已合成目標(biāo)寡核苷酸序列，即可從載體上除下寡核苷酸，將磷酸三酯基團(tuán)去保護(hù)成磷酸二酯，并用氨水或其它堿對(duì)核苷堿基去保護(hù)。參見(jiàn)如用于寡核苷酸和類似物的方法、合成和特性(Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis andProperties)(Agrawal編輯)Humana Press，Totowa，NJ一書(shū)中的Beaucage(1993)“寡脫氧核糖核苷酸的合成”(＂OligodeoxyribonucleotideSynthesis＂)；Warner等人(1984)DNA 3401和美國(guó)專利號(hào)4,458,066。
ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸也可包含修飾了磷酸酯的寡核苷酸，它們中的一些公知可穩(wěn)定該多核苷酸。因此，一些實(shí)施方案包括穩(wěn)定的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。包含修飾的磷酸酯鍵或非磷酸酯鍵的多核苷酸的合成也為本領(lǐng)域公知。綜述參見(jiàn)作為治療劑的寡核苷酸(Oligonucleotides asTherapeutic Agents)(D.J.Chadwick和G.Cardew編輯)John Wiley andSons，New York，NY一書(shū)中的Matteucci(1997)“寡核苷酸類似物總覽”(＂Oligonucleotide Analogsan Overview＂)?？膳c本發(fā)明寡核苷酸中的糖或糖類似物部分連接的磷衍生物(或修飾的磷酸酯基)可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備及將它們摻入核苷酸、修飾的核苷酸和寡核苷酸中本身也是公知的并無(wú)需在此詳述。Peyrottes等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)241841-1848；Chaturvedi等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)242318-2323；和Schultz等人(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.)242966-2973。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸的合成類似于上述天然存在寡核苷酸的合成，除了氧化步驟用硫化步驟替換外(用于寡核苷酸和類似物的方法、合成和特性(Protocols for Oligonucleotidesand Analogs，Synthesis and Properties)(Agrawal編輯)Humana Press一書(shū)中的Zon(1993)“寡核苷硫代磷酸酯”(＂OligonucleosidePhosphorothioates＂)165-190頁(yè))。同樣，其它磷酸酯類似物的合成如磷酸三酯的合成(Miller等人(1971)JACS 936657-6665)、非橋接氨基磷酸酯的合成(Jager等人(1988)生物化學(xué)(Biochem.)277247-7246)、N3′至P5′phosphoramidiates的合成(Nelson等人(1997)JOC 627278-7287)和二硫代磷酸酯的合成(美國(guó)專利號(hào)5,453,496)也已有描述。也可使用其它基于非磷的修飾的寡核苷酸(Stirchak等人(1989)核酸研究(Nucleic Acids Res.)176129-6141)。具硫代磷酸酯鍵主鏈的寡核苷酸較具磷酸二酯鍵主鏈的寡核苷酸更具免疫原性并在注射入宿主后似乎更抗降解。Braun等人(1988)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1412084-2089；和Latimer等人(1995)分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)321057-1064。
用于本發(fā)明的ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸(包含核糖作為唯一或主要的糖組分)、脫氧核糖核苷酸(包含脫氧核糖作為主要的糖組分)，或如本領(lǐng)域公知的那樣，可以在ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸中可摻入修飾的糖或糖類似物。因此，糖部分除了核糖和脫氧核糖外，還可為戊糖、脫氧戊糖、己糖、脫氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、來(lái)蘇糖和糖＂類似物＂環(huán)戊基基團(tuán)。糖可為吡喃型或呋喃型。在ISS和/或IMP中，糖部分優(yōu)選為呋喃型的核糖、脫氧核糖、阿拉伯糖或2′-O-烷基核糖，且糖可以以α或β端基異構(gòu)構(gòu)型和各雜環(huán)堿基連接。糖的修飾包括但不限于2′-烷氧基-RNA類似物、2′-氨基-RNA類似物和2′-烷氧基-或氨基-RNA/DNA嵌合體。例如在ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸中的糖修飾包括但不限于2-氨基脫氧腺苷。這些糖或糖類似物以及各＂核苷＂(其中此類糖或類似物與雜環(huán)堿基(核酸堿基)連接)的制備本身是公知的，并無(wú)需在此描述，除非此類制備可能涉及到任何具體的實(shí)施例。在ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸制備物中也可進(jìn)行糖修飾并與任何磷酸酯修飾結(jié)合。
摻入ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸中的雜環(huán)堿基或核酸堿基可為天然存在的主要嘌呤和嘧啶堿基(即尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，如上所述)，以及所述主要堿基的天然和合成的修飾物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到包含各種雜環(huán)堿基和各種糖部分(和糖類似物)的大量＂合成的＂非天然核苷在本領(lǐng)域中是現(xiàn)成的，并且只要滿足本發(fā)明的其它要求，ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可包括不屬于此主要五種天然核酸堿基成分的一種或幾種雜環(huán)堿基。但優(yōu)選地，ISS和/或IMP中的雜環(huán)堿基包括但不限于尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鳥(niǎo)嘌呤-7-基、鳥(niǎo)嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2.3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤通過(guò)9-位、嘧啶通過(guò)1-位、吡咯并嘧啶通過(guò)7-位而吡唑并嘧啶通過(guò)1-位與ISS和/或IMP的糖部分連接。
ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可包含至少一種修飾堿基。如此處所用，術(shù)語(yǔ)＂修飾的堿基＂與＂堿基類似物＂同義，如＂修飾的胞嘧啶＂與＂胞嘧啶類似物＂同義。類似地，＂修飾的＂核苷或核苷酸此處定義為與核苷或核苷酸＂類似物＂同義。堿基修飾的實(shí)例包括但不限于向ISS和/或IMP的胞嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分。優(yōu)選地，該吸電子部分為鹵素。此類修飾的胞嘧啶可包括但不限于氮雜胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、溴尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、氯化胞嘧啶、環(huán)胞嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、5-氟胞嘧啶、氟嘧啶、氟尿嘧啶、5，6--二氫胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、羥基脲、碘尿嘧啶、5-硝基胞嘧啶、尿嘧啶和任何其它嘧啶類似物或修飾的嘧啶的。堿基修飾的其它實(shí)例包括但不限于向ISS和/或免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的尿嘧啶的C-5和/或C-6添加吸電子部分。優(yōu)選地，該吸電子部分為鹵素。此類修飾的尿嘧啶可包括但不限于5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶。
堿基修飾的其它實(shí)例包括添加一個(gè)或多個(gè)硫代基團(tuán)至堿基上，包括，但不限于6-硫代鳥(niǎo)嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶和4-硫代尿嘧啶。
雖然可進(jìn)行其它修飾和/或添加，但優(yōu)選存在于ISS中的CG基序的胞嘧啶不發(fā)生甲基化。但在某些實(shí)施方案中，ISS可包含一個(gè)或多個(gè)甲基化的胞嘧啶。在此類實(shí)施方案中，優(yōu)選10mer ISS序列中的胞嘧啶(即此處描述的式子如SEQ ID NO62，65，126，127，128，129，130，131和133的CG和/或TCG部分中的C)在位置C5處不被甲基化。但在位置N4處的甲基化可考慮存在于包含甲基化胞嘧啶的ISS中。
具有修飾堿基的核苷的制備和使用所述具有修飾堿基的核苷作為前體進(jìn)行的修飾寡核苷酸的合成已在例如美國(guó)專利4,910,300、4,948,882和5,093,232中描述。這些具有修飾堿基的核苷經(jīng)設(shè)計(jì)以致可通過(guò)化學(xué)合成摻入寡核苷酸的末端或內(nèi)部。此類存在于寡核苷酸末端或內(nèi)部的具有修飾堿基的核苷可作為連接肽或其它抗原的位點(diǎn)。糖部分被修飾的核苷也已有描述(包括但不限于例如，美國(guó)專利4,849,513、5,015,733、5,118,800、5,118,802)并可類似使用。
在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸小于約任何以下長(zhǎng)度(以堿基或堿基對(duì)表示)10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；10。在一些實(shí)施方案中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸大于約任何以下長(zhǎng)度(以堿基或堿基對(duì)表示)10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000?；蛘撸庖哒{(diào)節(jié)性多核苷酸的長(zhǎng)度可在如下任何范圍內(nèi)，其上限為10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；50；25；或10，而獨(dú)立選擇的下限為10；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500，其中下限小于上限。
本發(fā)明也提供了制備此處描述的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的方法。此方法可為此處描述的任一方法。例如，此方法可為合成含有ISS的多核苷酸(例如用固相合成)且可進(jìn)一步包括任何純化步驟。純化方法為本領(lǐng)域公知。其它制備方法包括組合免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和抗原。
抗原任何抗原都可與免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸共施用，和/或用于包含免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和抗原的組合物(以及這些組合物的制品)中。
在一些實(shí)施方案中，抗原為變應(yīng)原。重組變應(yīng)原的實(shí)例在表1中提供。許多變應(yīng)原的制備在本領(lǐng)域是熟知的，包括但不限于豚草花粉變應(yīng)原Antigen E(Amb a I)(Rafnar等人(1991)生物化學(xué)雜志(J Biol.Chem.)2661229-1236)、草變應(yīng)原Lol p1(Tamborini等人(1997)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)249886-894)、主要塵螨變應(yīng)原Der pI和Der PII(Chua等人(1988)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)167175-182；Chua等人(1990)Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.91124-129)、家貓變應(yīng)原FeldI(Rogers等人(1993)分子免疫學(xué)(Mol.Immunol.)30559-568)、白樺花粉Betvl(Breiteneder等人(1989)EMBO J 81935-1938)、柳杉變應(yīng)原Cryj1和Cryj2(Kingetsu等人(2000)免疫學(xué)(Immunology)99625-629)和來(lái)自其它樹(shù)木花粉的蛋白質(zhì)抗原(Elsayed等人(1991)Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.20417-31)的制備。如所述的那樣，來(lái)自樹(shù)的變應(yīng)原是公知的，包括來(lái)自樺樹(shù)、杜松和柳杉的變應(yīng)原。已報(bào)導(dǎo)了用于體內(nèi)施用的來(lái)自草花粉的蛋白質(zhì)抗原制品。
在一些實(shí)施方案中，變應(yīng)原為食物變應(yīng)原，包括但不限于花生變應(yīng)原如ArahI(Stanley等人(1996)Adv.Exp.Med.Biol.409213-216)；胡桃變應(yīng)原如JugrI(Tueber等人(1998)J.Allergy Clin.Immunol.101807-814)；巴西堅(jiān)果變應(yīng)原如白蛋白(Pastorello等人(1998)J Allergy Clin.Immunol.1021021-1027)；蝦變應(yīng)原如PenaI(Reese等人(1997)Int.Arch.AllergyImmunol.113240-242)；卵變應(yīng)原如類卵粘蛋白(Crooke等人(1997)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1592026-2032)；奶變應(yīng)原如牛β-乳球蛋白(Selot等(1999)臨床與實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)(Clin.Exp.Allergy)291055-1063)；魚(yú)變應(yīng)原如小白蛋白(Van Do等人(1999)Scand.J Immunol.50619-625；Galland等人(1998)J Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.70663-71.)。在一些實(shí)施方案中，變應(yīng)原為膠乳變應(yīng)原，包括但不限于Hevb7(Sowka等人(1998)歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J Biochem.)255213-219)。表1列出了可使用的變應(yīng)原的示例。
表1重組變應(yīng)原




在一些實(shí)施方案中，抗原來(lái)自感染物，包括原生動(dòng)物、細(xì)菌、真菌(包括單細(xì)胞和多細(xì)胞)和病毒感染物。合適的病毒抗原的實(shí)例于文中描述并為本領(lǐng)域公知。細(xì)菌包括流感嗜血桿菌、分枝結(jié)核桿菌和百日咳桿菌(Bordetella pertussis)。原生動(dòng)物感染物包括瘧原蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)和血吸蟲(chóng)。真菌包括白色念珠菌(Candida albicans)。
在一些實(shí)施方案中，抗原為病毒抗原。病毒多肽抗原包括但不限于HIV蛋白如HIV gag蛋白(包括但不限于膜錨定(MA)蛋白、核心殼(CA)蛋白和核衣殼(NC)蛋白)、HIV聚合酶、流感病毒基質(zhì)(M)蛋白和流感病毒核衣殼(NP)蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)、肝炎e蛋白(HBeAg)、乙肝DNA聚合酶、丙肝抗原等。討論流感接種的文獻(xiàn)包括Scherle和Gerhard(1988)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)854446-4450；Scherle和Gerhard(1986)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1641114-1128；Granoff等(1993)，疫苗(Vaceine)11S46-51；Kodihalli等人(1997)，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)713391-3396；Ahmeida等人(1993)，疫苗(Vaccine)111302-1309；Chen等人(1999)，疫苗(Vaccine)17653-659；Govorkova和Smirnov(1997)Acta Virol.(1997)41251-257；Koide等人(1995)，疫苗(Vaccine)133-5；Mbawuike等人(1994)，疫苗(Vaccine)121340-1348；Tamura等人(1994)，疫苗(Vaccine)12310-316；Tamura等人(1992)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J Immunol.)22477-481；Hirabayashi等人(1990)，疫苗(Vaccine)8595-599?？乖嚯牡钠渌鼘?shí)例為組或亞組特異性抗原，它們公知存在于許多感染物中，其中所述感染物包括但不限于腺病毒(adenovirus)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus)、乳頭狀瘤病毒(papilloma virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)和痘病毒(poxviruse)。
如以下實(shí)施例3中所示，在靈長(zhǎng)類中，含有ISS的多核苷酸與肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原(HBsAg))的聯(lián)合施用導(dǎo)致抗HBsAg抗體效價(jià)較單獨(dú)施用HBsAg時(shí)升高。
許多抗原性肽和蛋白質(zhì)是公知的，并在本領(lǐng)域中是現(xiàn)成的；其它的可用常規(guī)技術(shù)鑒定。對(duì)于通過(guò)免疫抵抗腫瘤形成或治療已存在的腫瘤，免疫調(diào)節(jié)性肽可包括腫瘤細(xì)胞(活的或輻射過(guò)的)、腫瘤細(xì)胞提取物或腫瘤抗原如Her-2/neu、Mart1、癌胚抗原(CEA)的蛋白質(zhì)亞單位、神經(jīng)節(jié)苷酯、人乳脂肪球(HMFG)、粘蛋白(MUC1)、MAGE抗原、BAGE抗原、GAGE抗原、gp100、前列腺特異抗原(PSA)和酪氨酸酶?；诿庖叩谋茉幸呙缈赏ㄟ^(guò)包括精子蛋白與ISS而形成。Lea等人(1996)Biochim.Biophys.Acta1307263。
減毒和滅活病毒適用于本文中用作抗原。這些病毒的制備為本領(lǐng)域熟知并且許多可通過(guò)商業(yè)途徑獲得(參見(jiàn)如Physicians′Desk Reference(1998)第52版，Medical Economics Company，Inc.)。例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)可以以1POL(Pasteur Merieux Connaught)和ORIMUNE(LederleLaboratories)獲得，甲肝病毒可以以VAQTA(Merck)獲得，麻疹病毒(measles virus)可以以ATTENUVAX(Merck)獲得，腮腺炎病毒(mumps virus)可以以MUMPSVAX(Merck)獲得，及風(fēng)疹病毒(rubellavirus)可以以MERUVAXII(Merck)獲得。此外，如HIV-1、HIV-2、單純皰疹病毒、乙肝病毒、輪狀病毒(rotavirus)、人和非人乳頭狀瘤病毒和腦慢病毒(slow brain virus)的減毒和滅活病毒可提供肽抗原。
在一些實(shí)施方案中，抗原包含病毒載體，如痘苗病毒、腺病毒和金絲雀痘病毒載體。
抗原可從它們的來(lái)源中用本領(lǐng)域公知的純化技術(shù)分離，或更方便地，可用重組方法產(chǎn)生。
抗原性肽可包括純化的天然肽、合成肽、重組蛋白質(zhì)、粗蛋白提取物、減毒或滅活病毒、細(xì)胞、微生物或此類肽的片段。，免疫調(diào)節(jié)性肽可為天然肽，或?yàn)榛瘜W(xué)或酶法合成的肽。本領(lǐng)域公知的任何化學(xué)合成法均適用。液相肽合成可用于構(gòu)建中等大小的肽，或肽的化學(xué)構(gòu)建可采用固相合成來(lái)進(jìn)行。Atherton等人(1981)Hoppe Seylers Z.Physiol.Chem.362833-839。也可使用蛋白水解酶來(lái)偶聯(lián)氨基酸而產(chǎn)生肽。Kullmann(1987)EnzymaticPeptide Synthesis，CRC Press，Inc。另外，可通過(guò)使用細(xì)胞的生物化學(xué)機(jī)器或通過(guò)從生物源分離來(lái)獲得肽?？刹捎弥亟MDNA技術(shù)產(chǎn)生肽。Hames等人(1987)，轉(zhuǎn)錄和翻譯實(shí)用方法(Transcription and TranslationAPractical Approach)，IRL Press。也可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如親和層析分離肽。
優(yōu)選地，抗原為肽、脂類(如除膽固醇外的固醇類、脂肪酸和磷脂)、多糖(如那些用于流感嗜血桿菌疫苗中的多糖)、神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白。它們可通過(guò)本領(lǐng)域公知的幾種方法獲得，包括使用化學(xué)和酶法分離和合成。在某些情況下，例如對(duì)于許多固醇類、脂肪酸和磷脂，分子的抗原性部分可通過(guò)商業(yè)途徑得到。
用于本發(fā)明組合物和使用該組合物的方法中的病毒抗原的實(shí)例包括但不限于HIV抗原。此類抗原包括但不限于那些來(lái)自HIV包膜糖蛋白的抗原，其中所述HIV包膜糖蛋白包括但不限于gpl60、gpl20和gp41。許多HIV基因和抗原的序列是公知的。例如Los Alamos National LaboratoryHIV Sequence Database收集、管理和注釋HIV核苷酸和氨基酸序列。該數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址http//hiv-web.lanl.gov/可進(jìn)入，并且在每年公布中，參見(jiàn)Human Retroviruses and AIDS Compendium(如2000版)。
來(lái)自感染物的抗原可用本領(lǐng)域公知的方法獲得，如從天然病毒或細(xì)菌提取物獲得、從感染物感染的細(xì)胞獲得、從純化的多肽獲得、從重組產(chǎn)生的多肽獲得和/或以合成肽的形式獲得。
ISS-抗原當(dāng)與抗原一起使用時(shí)，ISS可以以多種方式與抗原一起施用。在一些實(shí)施方案中，含有ISS的多核苷酸和抗原可以以相互空間接近的方式施用，或以混合物(即在溶液中)施用。如下所述，可以以多種方式實(shí)行空間接近，包括偶聯(lián)(連接)、包囊、通過(guò)添加至平臺(tái)或吸附至表面上。通常且最優(yōu)選地，與ISS和抗原作為混合物施用所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相比，含有ISS的多核苷酸和抗原以有效增強(qiáng)該免疫反應(yīng)的距離相鄰連接。
在一些實(shí)施方案中，含有ISS的多核苷酸與抗原偶聯(lián)。ISS部分可以以多種方式與偶聯(lián)物的抗原部分偶聯(lián)，包括共價(jià)和/或非共價(jià)相互作用。
這些部分間的連接可在ISS的3′或5′末端，或在ISS中間位置的適當(dāng)修飾的堿基處進(jìn)行。如果抗原為肽并包含合適的活性基團(tuán)(如N-羥基琥珀酰亞胺酯)，則它可直接與胞嘧啶殘基的N4氨基反。根據(jù)ISS中胞嘧啶殘基的數(shù)量和位置，可在一個(gè)或多個(gè)殘基處實(shí)現(xiàn)特異性偶聯(lián)。
或者，可將本領(lǐng)域所公知的修飾寡核苷摻入ISS的末端或內(nèi)部位置。它們可包含被封閉的官能團(tuán)，當(dāng)去封閉后，這些官能團(tuán)可與多種存在于或連接在目的抗原上的官能團(tuán)反應(yīng)。
當(dāng)抗原為肽或多肽時(shí)，偶聯(lián)物的該部分可通過(guò)固相載體化學(xué)連接至ISS的3′-端。例如，可將ISS部分添加至已在載體上預(yù)合成的多肽部分上。Haralambidis等人(1990a)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18493-499；和Haralambidis等人(1990b)核酸研究(Nucleic Acids Res.)18501-505。另外，可這樣合成ISS以使其通過(guò)從3′-端延伸出的可切割接頭連接固相載體。當(dāng)ISS從載體上化學(xué)切割下來(lái)后，在寡核苷酸的3’-端留下一個(gè)末端巰基(Zuckermann等人(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)155305-5321；和Corey等人(1987)科學(xué)(Science)2381401-1403)或在寡核苷酸的3’-端留下一個(gè)末端氨基基團(tuán)(Nelson等人(1989)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)171781-1794)。氨基修飾的ISS與肽的氨基的偶聯(lián)可如Benoit等人(1987)Neuromethods 643-72中所述進(jìn)行。巰基修飾的ISS與肽的羧基的偶聯(lián)可如Sinah等人(1991)，寡核苷酸類似物實(shí)用方法(OligonucleotideAnaloguesA Practical Approach)，IRL Press中所述進(jìn)行。攜帶有附加的馬來(lái)酰亞胺的寡核苷酸與肽的半胱氨酸殘基的巰基側(cè)鏈的偶聯(lián)也已有描述。Tung等人(1991)Bioconjug Chem.2464-465。
偶聯(lián)物的肽或多肽部分可通過(guò)在ISS合成過(guò)程中摻入該寡核苷酸的胺、巰基或羧基基團(tuán)連接至ISS的5’-端。優(yōu)選地，當(dāng)寡核苷酸固定于固相載體時(shí)，一端包含被保護(hù)的胺、巰基或羧基且另一端包含亞磷酰胺的連接基團(tuán)可與5′-羥基共價(jià)結(jié)合。Agrawal等人(1986)核酸研究(Nucleic AcidsRes.)146227-6245；Connolly(1985)核酸研究(Nucleic Acids Res.)134485-4502；Kremsky等人(1987)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)152891-2909；Connolly(1987)核酸研究(Nucleic Acids Res.)153131-3139；Bischoff等人(1987)Anal.Biochem.164336-344；Blanks等人(1988)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)1610283-10299；以及美國(guó)專利號(hào)4,849,513、5,015,733、5,118,800和5,118,802。去保護(hù)后，這些胺、巰基和羧基官能團(tuán)可用于使寡核苷酸與肽共價(jià)連接。Benoit等人(1987)；和Sinah等人(1991)。
ISS-抗原偶聯(lián)物也可通過(guò)非共價(jià)相互作用如離子鍵、疏水相互作用、氫鍵和/或范德華引力而形成。
非共價(jià)連接的偶聯(lián)物可包括非共價(jià)相互作用，如生物素-鏈親和素復(fù)合體。生物素基團(tuán)可例如連接至ISS的修飾堿基上。Roget等人(1989)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)177643-7651。將鏈親和素部分摻入肽部分使得鏈親和素偶聯(lián)的肽和生物素化寡核苷酸可以形成非共價(jià)結(jié)合復(fù)合體。
也可通過(guò)涉及到ISS和抗原內(nèi)的殘基如帶電荷氨基酸的離子相互作用，或通過(guò)使用包含有可與寡核苷酸和抗原相互作用的帶電荷殘基的接頭部分來(lái)產(chǎn)生非共價(jià)連接。例如，非共價(jià)偶聯(lián)可以在通常帶負(fù)電的ISS和肽中帶正電的氨基酸殘基如多聚賴氨酸、多聚精氨酸和多聚組氨酸殘基之間發(fā)生。
ISS和抗原間的非共價(jià)偶聯(lián)可通過(guò)與DNA相互作用的分子中的DNA結(jié)合基序而產(chǎn)生，其中DNA為該分子的天然配體。例如，此類DNA結(jié)合基序可在轉(zhuǎn)錄因子和抗DNA抗體中找到。
ISS與脂的連接可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法形成。這些方法包括但不限于合成寡核苷酸-磷脂偶聯(lián)物(Yanagawa等人(1988)Nucleic Acids Symp.Ser.19189-192)、寡核苷酸-脂肪酸偶聯(lián)物(Grabarek等人(1990)生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)185131-135；和Staros等人(1986)生物化學(xué)年鑒(Anal.Biochem.)156220-222)、和寡核苷酸-固醇偶聯(lián)物。Boujrad等人(1993)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905728-5731。
寡核苷酸與寡糖的連接可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的已知方法形成。這些方法包括但不限于合成寡核苷酸-寡糖偶聯(lián)物，其中寡糖為免疫球蛋白的一部分。O′Shannessy等人(1985)，應(yīng)用生物化學(xué)雜志(J.Applied Biochem.)7347-355。
環(huán)狀I(lǐng)SS與肽或抗原的連接可以以幾種方式形成。當(dāng)環(huán)狀I(lǐng)SS是通過(guò)重組或化學(xué)法合成時(shí)，修飾核苷是合適的。參見(jiàn)Ruth(1991)在寡核苷酸和類似物實(shí)用方法(Oligonucleotides and AnaloguesA PracticalApproach)，IRL Press一書(shū)中的描述。然后可用標(biāo)準(zhǔn)的連接技術(shù)將環(huán)狀I(lǐng)SS連接至抗原或其它肽上。Goodchild(1990)Bioconjug.Chem.1165。當(dāng)環(huán)狀I(lǐng)SS為分離的，或使用重組或化學(xué)法合成的時(shí)，可通過(guò)化學(xué)活化或光活化已摻入抗原或其它肽中的活性基團(tuán)(如卡賓、自由基)來(lái)形成連接。
用于將肽和其它分子連接至寡核苷酸上的其它方法可在美國(guó)專利號(hào)5,391,723；Kricka(編輯)，非同位素DNA探針技術(shù)(Nonisotopic DNA ProbeTechniques)，Academic Press一書(shū)中的Kessler(1992)，“核酸的非放射性標(biāo)記法”(＂Nonradioactive labeling methods for nucleic acids＂)；和Geoghegan等人(1992)Bioconjug.Chem.3138-146中找到。
ISS可以以其它方式與抗原緊鄰連接。在一些實(shí)施方案中，ISS和抗原通過(guò)包囊而緊鄰連接。在其它實(shí)施方案中，ISS和抗原通過(guò)與平臺(tái)分子連接而緊鄰連接。＂平臺(tái)分子＂(也稱為＂平臺(tái)＂)為包含允許ISS和抗原連接的位點(diǎn)的分子。在其它實(shí)施方案中，ISS和抗原通過(guò)吸附在表面，優(yōu)選載體粒子上而緊鄰連接。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用了包囊劑(或包含此包囊劑的組合物)，其中所述包囊劑可維持ISS和第一抗原的緊鄰連接，直至該復(fù)合體到達(dá)靶。優(yōu)選地，包含ISS、抗原和包囊劑的組合物為佐劑水包油乳劑、微粒子和/或脂質(zhì)體形式。更優(yōu)選地，包裹有ISS-免疫調(diào)節(jié)分子的佐劑水包油乳劑、微粒子和/或脂質(zhì)體為約0.04μm至約100μm大小的顆粒形式，優(yōu)選地其大小為任一以下范圍約0.1μm至約20μm；約0.15μm至約10μm；約0.05μm至約1.00μm；約0.05μm至約0.5μm。
膠體分散體系如微球、珠、大分子復(fù)合體、毫微膠囊和基于脂的體系如水包油乳劑、微膠粒、混合微膠粒和脂質(zhì)體可有效地包囊含有ISS的組合物。
包囊組合物還可包含如下多種組分中的任何組分。這些組分包括但不限于明礬、脂類、磷脂、脂膜結(jié)構(gòu)(LMS)、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物如多肽、糖肽和多糖。
適用作包囊組分的多肽包括本領(lǐng)域公知的任何多肽，并包括但不限于脂肪酸結(jié)合蛋白。修飾的多肽可包含如下多種修飾中的任何修飾，所述修飾包括但不限于糖基化、磷酸化、肉豆蔻基化、硫酸化和羥化。如此處所用，合適的多肽為能保護(hù)含有ISS的組合物以保留其免疫調(diào)節(jié)活性的多肽。結(jié)合蛋白的實(shí)例包括但不限于白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白。
其它合適的聚合物可為制藥領(lǐng)域公知的任何聚合物，其包括但不限于天然存在的聚合物(如葡聚糖、羥乙基淀粉和多糖)和合成的聚合物。天然存在的聚合物的實(shí)例包括蛋白質(zhì)、糖肽、多糖、葡聚糖和脂類。其它聚合物可為合成的聚合物。適用于本發(fā)明的合成聚合物的實(shí)例包括但不限于聚烷基二醇(PAG)如PEG、聚氧乙基化多元醇(POP)如聚氧乙基化甘油(POG)、聚三亞甲基二醇(PTG)、聚丙二醇(PPG)、聚異丁烯酸羥乙基酯、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氨基酸、聚氨基甲酸酯和聚磷腈。合成的聚合物也可為直鏈或支鏈的、取代或未取代的均聚物、兩種或多種不同的合成單體的共聚物或嵌段共聚物。
用于本發(fā)明包囊組合物中的PEG可購(gòu)自化學(xué)供應(yīng)商或用本領(lǐng)域公知的技術(shù)合成。
術(shù)語(yǔ)＂LMS＂如此處所用是指這樣的層狀脂粒子，其中極性脂的極性頭部基團(tuán)面向界面的水相排列以形成膜結(jié)構(gòu)。LMS的實(shí)例包括脂質(zhì)體、微膠粒、螺旋體(即通常的圓柱狀脂質(zhì)體)、微乳、單層脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體等。
本發(fā)明優(yōu)選的膠體分散體系為脂質(zhì)體。用脂質(zhì)體包裹的抗原免疫小鼠，脂質(zhì)體表現(xiàn)出可促進(jìn)針對(duì)抗原的Th1-類免疫反應(yīng)。Aramaki等人(1995)，疫苗(Vaccine)131809-1814。如此處所用，＂脂質(zhì)體＂或＂脂質(zhì)小泡＂為被至少一個(gè)且可能多于一個(gè)的雙層脂膜包裹的小泡?？梢詮牧字?、糖脂、脂類、類固醇如膽固醇、相關(guān)分子或其組合通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何技術(shù)人工制備脂質(zhì)體，所述技術(shù)包括但不限于超聲處理、擠壓或從脂-去污劑復(fù)合體中去除去污劑。脂質(zhì)體也可任選地包含其它組分如組織靶向組分。應(yīng)理解＂脂膜＂或＂脂雙層＂不一定僅由脂類組成，只要膜的總體結(jié)構(gòu)為兩個(gè)親水表面夾著一個(gè)疏水核的片層，＂脂膜＂或＂脂雙層＂還可包含任何合適的其它組分，所述組分包括但不限于膽固醇和其它類固醇、溶于脂的化學(xué)物質(zhì)、任何長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)以及其它兩親性分子。對(duì)膜結(jié)構(gòu)的綜合討論參見(jiàn)J.Kendrew(1994)的分子生物學(xué)百科全書(shū)(The Encyclopedia of MolecularBiology)。合適的脂類參見(jiàn)如Lasic(1993)＂Liposomesfrom Physics toApplications＂Elsevier，Amsterdam。
用于制備含有ISS組合物的脂質(zhì)體的方法為本領(lǐng)域公知。脂質(zhì)小泡可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任何合適技術(shù)制備。方法包括但不限于微囊化、微流化、LLC法、醇注射、氟利昂注射、＂發(fā)泡＂法、去污劑透析、水合作用、超聲處理和反相蒸發(fā)。綜述見(jiàn)Watwe等人(1995)Curr.Sci.68715-724?？山M合多種技術(shù)以提供具最理想特性的小泡。
本發(fā)明包括含有組織或細(xì)胞靶向組分的LMS的用途。此類靶向組分為這樣的LMS中的組分，當(dāng)LMS施用于完整的動(dòng)物、器官或細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，該組分可促進(jìn)LMS優(yōu)先積聚在特定組織或細(xì)胞位點(diǎn)而非其它組織或細(xì)胞位點(diǎn)。靶向組分通常從脂質(zhì)體外部來(lái)接近，因此其優(yōu)選結(jié)合在外表面或插入外部的脂雙層中。靶向組分尤其可為肽、較大肽的區(qū)域、細(xì)胞表面分子或標(biāo)記物的特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、核酸、糖類、復(fù)合糖的區(qū)域、特異的脂、或可與任一上述分子結(jié)合的小分子如藥物、激素或半抗原。對(duì)細(xì)胞類型特異性細(xì)胞表面標(biāo)記物具特異性的抗體為本領(lǐng)域公知，并易于通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法制備。
可使LMS靶向治療欲指向的任何細(xì)胞類型，如可調(diào)節(jié)和/或參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞類型。此類靶細(xì)胞和器官包括但不限于APC如巨噬細(xì)胞、樹(shù)狀突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、淋巴結(jié)構(gòu)如淋巴結(jié)和脾、以及非淋巴結(jié)構(gòu)，尤其是那些存在樹(shù)狀突細(xì)胞的非淋巴結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的LMS組合物還可包含表面活性劑。表面活性劑可為陽(yáng)離子的、陰離子的、兩親的或非離子的表面活性劑。表面活性劑的優(yōu)選類型為非離子表面活性劑；尤其優(yōu)選那些水溶性的。
在ISS和抗原通過(guò)與平臺(tái)分子的連接而緊鄰連接的實(shí)施方案中，平臺(tái)可為蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)平臺(tái)(即有機(jī)的)。蛋白質(zhì)平臺(tái)的實(shí)例包括但不限于白蛋白、γ球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵白蛋白。Borel等人(1990)，免疫學(xué)方法(Immunol.Methods)126159-168；Dumas等人(1995)Arch.Dematol.Res.287123-128；Borel等人(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107264-267；Borel等人(1996)Ann.N.Y.Acad.Sci.77880-87。平臺(tái)為多價(jià)體(即包含多于一個(gè)的結(jié)合或連接位點(diǎn))以滿足與ISS和抗原兩者的結(jié)合。聚合物平臺(tái)的其它實(shí)例為葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚糖體、羧甲基纖維素、聚乙烯醇和聚D-谷氨酸/D-賴氨酸。
使用平臺(tái)分子的原則在本領(lǐng)域是熟知的。通常，平臺(tái)包含或經(jīng)衍生后包含合適的ISS和抗原結(jié)合位點(diǎn)。此外或備選地，通過(guò)衍生ISS和/或抗原以提供合適的連接基團(tuán)。例如，簡(jiǎn)單的平臺(tái)為雙功能接頭(即具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn))，如肽。在下文中討論了其它的實(shí)例。
平臺(tái)分子可為生物穩(wěn)定的，即它們顯示的體內(nèi)排泄半衰期通常為數(shù)小時(shí)至數(shù)天至數(shù)月從而可賦予治療功效，且平臺(tái)分子優(yōu)選由規(guī)定組合物的合成單鏈組成。它們通常具有的分子量為約200至約1,000,000，優(yōu)選在如下任一范圍內(nèi)約200至約500,000；約200至約200,000；約200至約50,000(或更小，如30,000)。價(jià)平臺(tái)分子的實(shí)例為聚合物(或由聚合物組成)，如聚乙二醇(PEG，優(yōu)選地具有約200至約8000的分子量)、聚-D-賴氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-賴氨酸(比率為3∶2)?？墒褂玫钠渌肿訛榘椎鞍缀虸gG。
適用于本發(fā)明的其它平臺(tái)分子為在美國(guó)專利5,552,391中公開(kāi)的化學(xué)定義的非聚合價(jià)平臺(tái)分子。適用于本發(fā)明的其它均質(zhì)的化學(xué)定義的價(jià)平臺(tái)分子為衍生的2，2′-亞乙二氧基二乙胺(EDDA)和三甘醇(TEG)。
其它合適的價(jià)平臺(tái)分子包括但不限于四氨基苯、七氨基β-環(huán)糊精、四氨基季戊四醇、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(Cyclam)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(Cyclen)。
通常，這些平臺(tái)分子通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)合成技術(shù)制備。PEG必須被衍生并制成多價(jià)的。這通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。適用于偶聯(lián)物合成的一些物質(zhì)如PEG、白蛋白和IgG可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。
ISS和抗原與平臺(tái)分子的偶聯(lián)可以以多種方式實(shí)現(xiàn)，一般涉及到一種或多種交聯(lián)劑、抗原和ISS及平臺(tái)分子上的官能基。平臺(tái)分子及ISS和抗原必須具有合適的連接基團(tuán)?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)的合成化學(xué)技術(shù)向平臺(tái)分子添加連接基團(tuán)。而可用標(biāo)準(zhǔn)的固相合成技術(shù)或重組技術(shù)將連接基團(tuán)添加至多肽抗原和ISS上。重組方法可能需要翻譯后修飾以連接接頭，此類方法在本領(lǐng)域是公知的。
例如，多肽可包含含有官能團(tuán)如氨基、羧基或巰基的氨基酸側(cè)鏈部分，這些基團(tuán)可作為將該多肽偶聯(lián)至平臺(tái)分子上的位點(diǎn)。如果多肽不包含這些基團(tuán)，可將具有此類官能團(tuán)的殘基添加至該多肽。此類殘基可通過(guò)固相合成技術(shù)或重組技術(shù)摻入，這兩種技術(shù)為肽合成領(lǐng)域所熟知。當(dāng)多肽具有糖側(cè)鏈(或當(dāng)抗原為糖)時(shí)，可通過(guò)常規(guī)化學(xué)向其中摻入官能團(tuán)氨基、巰基和/或醛基。例如，通過(guò)氧化糖的反應(yīng)在氰基硼氫化鈉存在下使用乙二胺可摻入伯氨基基團(tuán)，通過(guò)半胱胺二鹽酸化物反應(yīng)然后用標(biāo)準(zhǔn)的二硫化物還原劑還原可摻入巰基，而醛基可在高碘酸氧化后產(chǎn)生。如果平臺(tái)分子不具有合適的官能團(tuán)，也可以以類似方式衍生平臺(tái)分子以包含官能團(tuán)。
可變長(zhǎng)度的親水接頭可用于將ISS和抗原連接至平臺(tái)分子。合適的接頭包括乙二醇的線性寡聚體或多聚體。此類接頭包括具有下式的接頭R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2，其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保護(hù)基如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基如4-硝基苯基酯。這些接頭可用于將含有硫基反應(yīng)基如haloaceyl、maleiamide等的分子(通過(guò)硫醚)和含有氨基的第二分子(通過(guò)酰胺鍵)連接。就連接的次序而言，這些接頭具彈性，即硫醚可首先或最后形成。
在ISS和抗原通過(guò)吸附至表面而緊鄰連接的實(shí)施方案中，表面可為用無(wú)機(jī)或有機(jī)核心制備的載體粒子(如毫微粒子)形式。此類毫微粒子的實(shí)例包括但不限于毫微結(jié)晶粒子、通過(guò)聚合氰基丙烯酸烷基酯而制備的毫微粒子和通過(guò)丙二酸亞甲酯聚合而制備的毫微粒子?？晌絀SS和抗原的其它表面包括但不限于活性碳粒子和蛋白質(zhì)-陶瓷毫微板。本文提供了載體粒子的其它實(shí)例。
通過(guò)將多核苷酸和多肽吸附至表面來(lái)實(shí)現(xiàn)所吸附的分子向細(xì)胞的遞送是本領(lǐng)域所熟知的。參見(jiàn)如Douglas等人(1 987)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier Syst.3233-261；Hagiwara等人(1987)In Vivo 1241-252；Bousquet等人(1999)Pharm.Res.16141-147；和Kossovsky等人，美國(guó)專利5,460,831。優(yōu)選地，含有吸附表面的材料是可生物降解的。ISS和/或抗原可通過(guò)非共價(jià)相互作用(包括離子和/或疏水相互作用)吸附至表面。
總之，載體如毫微粒子的特征如表面電荷、粒子大小和分子量取決于聚合條件、單體濃度和在聚合過(guò)程中穩(wěn)定劑的存在(Douglas等人，1987)。載體粒子的表面可通過(guò)如表面包被來(lái)修飾，以允許或促進(jìn)ISS和/或抗原的吸附。吸附了ISS和/或抗原的載體粒子可進(jìn)一步用其它物質(zhì)包被。此類其它物質(zhì)的添加如此處所述可例如在將粒子施用于受試者后延長(zhǎng)粒子的半衰期，和/或可將粒子靶向特定的細(xì)胞類型或組織。
可吸附ISS和抗原的毫微結(jié)晶表面已有描述(參見(jiàn)如美國(guó)專利5,460,831)。毫微結(jié)晶核心粒子(直徑為1μm或更小)用促進(jìn)多肽、多核苷酸和/或其它藥劑吸附的表面能量修飾層包被。如在美國(guó)專利5,460,831中所述，例如核心粒子可以用促進(jìn)寡核苷酸吸附的表面包被，接下來(lái)用抗原制品包被，其中所述抗原制品為例如脂-抗原混合物形式。此類毫微粒子為毫微米大小粒子的自我組裝復(fù)合體，一般為0.1μm級(jí)，其具有ISS內(nèi)層和抗原外層。
另一吸附表面為通過(guò)聚合氰基丙烯酸烷基酯而制備的毫微粒子。氰基丙烯酸烷基酯可在酸化的水性介質(zhì)中通過(guò)陰離子聚合法而聚合。根據(jù)聚合條件，這些小粒子趨向于具有20至3000nm的尺寸，并且可制備具有特定表面特征和特定表面電荷的毫微粒子(Douglas等人，1987)。例如，在存在疏水陽(yáng)離子如氯化四苯鏻或季銨鹽如溴化十六烷基三甲基銨時(shí)，寡核苷酸可被吸附至聚氰基丙烯酸異丁酯和聚氰基丙烯酸異己酯毫微粒子上。寡核苷酸吸附在這些毫微粒子上似乎是通過(guò)核酸鏈的帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)和疏水陽(yáng)離子之間形成的離子對(duì)介導(dǎo)的。參見(jiàn)如Lambert等人(1998)，生物化學(xué)(Biochimie)80969-976，Chavany等人(1994)Pharm.Res.111370-1378；Chavany等人(1992)Pharm.Res.9441-449。多肽也可吸附在聚氰基丙烯酸烷基酯毫微粒子上。參見(jiàn)如Douglas等人，1987；Schroeder等人(1998)肽(Peptide s)19777-780。
另一吸附表面為通過(guò)丙二酸亞甲酯聚合而制備的毫微粒子。例如，如Bousquet等人，1999所述，多肽吸附至聚(丙二酸亞甲酯2.1.2)毫微粒子上似乎最初是通過(guò)靜電力然后是通過(guò)疏水力穩(wěn)定來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
IMP/MC復(fù)合體含有ISS的多核苷酸可以以免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸/微載體(IMP/MC)復(fù)合體的形式施用。因此，本發(fā)明提供了包含IMP/MC復(fù)合體的組合物。
用于本發(fā)明的微載體尺寸小于約150、120或100μm，較常見(jiàn)地為小于約50-60μm，優(yōu)選小于約10μm，并且不可溶于純水。用于本發(fā)明的微載體優(yōu)選地為可生物降解的，但不可生物降解的微載體也是可接受的。微載體通常為固相，如＂珠＂或其它粒子，但液相微載體如包含可生物降解聚合物的水包油乳液或油也可考慮。可接受用作微載體的大量可生物降解和不可生物降解物質(zhì)為本領(lǐng)域所公知。
用于本發(fā)明組合物或方法中的微載體通常小于約10μm(如具有的平均直徑小于約10μm，或至少約97％的粒子能通過(guò)10μm篩式濾器)，并且包括毫微載體(即尺寸小于約1μm的載體)。優(yōu)選地，選擇上限尺寸約為9、7、5、2或1μm或900、800、700、600、500、400、300、250、200或100nm，而獨(dú)立選擇的下限尺寸約為4、2或11μm或約800、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25或10 nm的微載體，其中下限小于上限。在一些實(shí)施方案中，微載體具有的尺寸約1.0-1.5μm，約1.0-2.0μm或約0.9-1.6μm。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，微載體具有的尺寸為約10nm至約5μm，或約25nm至約4.5μm，約1μm，約1.2μm，約1.4μm，約1.5μm，約1.6μm，，約1.8μm，約2.0μm，約2.5μm或約4.5μm。當(dāng)微載體為毫微載體時(shí)，優(yōu)選的實(shí)施方案包括約25至約300nm，、50至約200nm、約50nm或約200nm的毫微載體。
可生物降解的固相微載體可由可生物降解的聚合物制備，其中所述可生物降解的聚合物包括但不限于可生物降解的聚酯如聚(乳酸)、聚羥基乙酸及它們的共聚物(包括嵌段共聚物)，以及聚(乳酸)和聚(乙二醇)的嵌段共聚物；聚原酸酯如以3，9--二亞乙基-2，4，8，10-四氧雜螺[5.5]十一烷(DETOSU)為基礎(chǔ)的聚合物；聚酐類，如基于相對(duì)親水單體如癸二酸的聚(酐)聚合物；聚二酰亞胺，如基于摻入氨基酸如甘氨酸或丙氨酸的癸二酸衍生單體(即利用二酰亞胺鍵通過(guò)氨基末端的氮與癸二酸連接)的聚(酐)聚合物；聚酐酯；聚磷腈，尤其是含有易水解酯基的聚(磷腈)，其中所述易水解酯基可以通過(guò)產(chǎn)生羧酸基團(tuán)催化聚合物主鏈的降解(Schacht等人，(1996)Biotechnol.Bioeng 1996102)；和聚酰胺如聚(乳酸-共-賴氨酸)。
適用于制備微載體的大量不可降解物質(zhì)也是公知的，其包括但不限于聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、乳膠、金以及鐵磁性和順磁性物質(zhì)。某些實(shí)施方案不包括金、乳膠和/或磁珠。在某些實(shí)施方案中，微載體可由用第二種物質(zhì)(如聚苯乙烯)包封的第一種物質(zhì)(如磁性物質(zhì))制成。
固相微球體可用本領(lǐng)域公知的技術(shù)制備。例如，它們可通過(guò)乳液-溶劑提取/蒸發(fā)技術(shù)制備。一般，在此技術(shù)中，將可生物降解的聚合物如聚酐、聚(α-氰基丙烯酸烷基酯)和聚(α-羥基酯)，如聚(乳酸)、聚(羥基乙酸)、聚(D，L-乳酸-共-羥基乙酸)和聚(己內(nèi)酯)溶于合適的有機(jī)溶劑如二氯甲烷中，以構(gòu)建乳液的分散相(DP)。該DP在過(guò)量體積的含有溶解的表面活性劑如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的連續(xù)水相(CP)中高速勻漿而乳化。CP中的表面活性劑可以確保形成離散的且合適大小的乳液小滴。然后將有機(jī)溶劑提取入CP并接下來(lái)通過(guò)升高系統(tǒng)溫度來(lái)蒸發(fā)。固體微粒子然后通過(guò)離心或過(guò)濾分離，并干燥如通過(guò)冷凍干燥或應(yīng)用真空干燥，然后置于4℃保存。
可測(cè)定干燥微粒子的物理化學(xué)特性如平均尺寸、尺寸分布和表面電荷。尺寸特性可以例如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)定，表面電荷通過(guò)測(cè)定ζ電位而確定。
液相微載體包括脂質(zhì)體、微膠粒、油滴和其它其中摻入了可生物降解的聚合物或油類的基于脂或油的粒子。在某些實(shí)施方案中，可生物降解的聚合物為表面活性劑。在其它實(shí)施方案中，液相微載體為可生物降解的，因?yàn)槠浒缮锝到獾挠腿珲徬┗蛑参镉?。一種優(yōu)選的液相微載體是在水包油乳液中的油滴。優(yōu)選地，用作微載體的水包油乳液包含可生物降解的代用品如鯊烯。
IMP/MC復(fù)合體包含連接在微載體表面的IMP(即IMP不是被包裹在MC中)，并優(yōu)選每一微載體連接有多個(gè)IMP分子。在某些實(shí)施方案中，不同IMP的混合物可與一種微載體復(fù)合，這樣該微載體將連接有多種的IMP。IMP和MC之間的鍵可為共價(jià)或非共價(jià)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以修飾或衍生IMP，并且可以選擇和/或修飾微載體的組成以適應(yīng)用于形成IMP/MC復(fù)合體的期望結(jié)合類型。
共價(jià)結(jié)合的IMP/MC復(fù)合體可用本領(lǐng)域公知的任一共價(jià)交聯(lián)技術(shù)連接。一般，對(duì)IMP部分進(jìn)行修飾，以摻入額外部分(如游離胺、羧基或巰基)或摻入修飾的(如硫代磷酸酯)核苷酸堿基，從而提供IMP部分可與微載體連接的位點(diǎn)。復(fù)合體中IMP和MC部分之間的連接可發(fā)生在IMP的3′或5′端，或在IMP內(nèi)部經(jīng)合適修飾的堿基處。通常也修飾微載體以摻入通過(guò)其可形成共價(jià)連接的部分，但也可利用正常存在于微載體上的官能團(tuán)。通過(guò)將IMP與微載體在允許共價(jià)復(fù)合體形成的條件下(如在存在交聯(lián)劑時(shí)或通過(guò)使用包含可與IMP形成共價(jià)鍵的活化部分的活化微載體)孵育來(lái)形成IMP/MC。
大量的交聯(lián)技術(shù)為本領(lǐng)域所公知，并包括與氨基、羧基和巰基反應(yīng)的交聯(lián)劑。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是交聯(lián)劑和交聯(lián)法的選擇取決于IMP和微載體的構(gòu)型及所期望的IMP/MC復(fù)合體的最終構(gòu)型。交聯(lián)劑可為同雙功能的或異雙功能的。當(dāng)使用同雙功能交聯(lián)劑時(shí)，交聯(lián)劑利用IMP和MC上的相同部分(如當(dāng)IMP和MC包含一個(gè)或多個(gè)游離胺時(shí)，可使用醛交聯(lián)劑來(lái)共價(jià)連接IMP和MC)。異雙功能交聯(lián)劑利用IMP和MC上的不同部分(如馬來(lái)酰亞胺基-N-羥基琥珀酰亞胺酯可用于共價(jià)連接IMP上的游離巰基和MC上的游離胺)，并且其在使微載體間鍵的形成最小化方面是優(yōu)選的。在大多數(shù)情況下，優(yōu)選通過(guò)在微載體上的第一交聯(lián)部分和在IMP上的第二交聯(lián)部分來(lái)交聯(lián)，其中第二交聯(lián)部分不存在于微載體上。產(chǎn)生IMP/MC復(fù)合體的一種優(yōu)選方法是通過(guò)與異雙功能交聯(lián)劑孵育來(lái)活化微載體，然后將IMP與活化的MC在適于反應(yīng)的條件下孵育而形成IMP/MC復(fù)合體。交聯(lián)劑可在兩個(gè)反應(yīng)部分之間摻入＂間隔臂＂，或交聯(lián)劑中的兩個(gè)反應(yīng)部分可直接連接。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，IMP部分包含至少一個(gè)游離巰基(如由5′-巰基修飾的堿基或接頭提供)用于交聯(lián)微載體，同時(shí)微載體包含游離氨基?？梢允褂门c這兩個(gè)基團(tuán)反應(yīng)的異雙功能交聯(lián)劑(如包含馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)和NHS-酯的交聯(lián)劑)，諸如琥珀酰亞胺基4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯活化MC，然后共價(jià)交聯(lián)IMP以形成IMP/MC復(fù)合體。
非共價(jià)IMP/MC復(fù)合體可通過(guò)任何非共價(jià)結(jié)合或相互作用連接，其中非共價(jià)結(jié)合或相互作用包括離子(靜電)鍵、疏水相互作用、氫鍵、范德華引力、或兩種或多種不同相互作用的組合，當(dāng)利用結(jié)合對(duì)連接IMP和MC時(shí)通常就是這樣。
優(yōu)選的非共價(jià)IMP/MC復(fù)合體一般通過(guò)疏水或靜電(離子)相互作用或它們的組合而復(fù)合(例如，通過(guò)IMP和連接至MC上的多核苷酸之間的堿基配對(duì)，即使用結(jié)合對(duì))。由于多核苷酸主鏈的親水特性，依賴疏水相互作用形成復(fù)合體的IMP/MC復(fù)合體通常需要修飾復(fù)合體的IMP部分以摻入高度疏水部分。優(yōu)選地，疏水部分為生物相容的、非免疫原性的并天然存在于該組合物欲施用的個(gè)體體內(nèi)(例如，該疏水部分可在哺乳動(dòng)物，尤其是人體內(nèi)找到)。優(yōu)選的疏水部分的實(shí)例包括脂類、類固醇類、固醇類如膽固醇和萜類。當(dāng)然，將疏水部分連接至IMP的方法取決于IMP的構(gòu)型和疏水部分的特性?？稍贗MP中的任何適宜位點(diǎn)添加疏水部分，優(yōu)選地在5′或3′端添加；在將膽固醇部分添加至IMP時(shí)，優(yōu)選地使用常規(guī)化學(xué)反應(yīng)將該膽固醇部分添加至IMP的5′端(參見(jiàn)如Godard等人(1995)，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)232404-410)。優(yōu)選地，用于通過(guò)疏水鍵連接的IMP/MC復(fù)合體中的微載體由疏水材料如油滴或疏水聚合物制成，但也可使用經(jīng)修飾摻入了疏水部分的親水材料。當(dāng)該微載體為脂質(zhì)體或其它包含腔的液相微載體時(shí)，在制備MC后通過(guò)混合IMP和MC而形成IMP/MC復(fù)合體，從而避免在MC制備過(guò)程中對(duì)IMP的包裹。
通過(guò)靜電結(jié)合的非共價(jià)IMP/MC復(fù)合體一般利用多核苷酸主鏈的高負(fù)電荷。因此，用于非共價(jià)結(jié)合的IMP/MC復(fù)合體中的微載體通常在生理pH(如約pH 6.8-7.4)下為帶正電荷的(陽(yáng)離子)。微載體可本身就具有正電荷，但使用一般不具有正電荷的化合物制備的微載體可通過(guò)衍生或修飾而成為帶正電荷的(陽(yáng)離子)。例如，可衍生用于制備微載體的聚合物，以添加帶正電荷的基團(tuán)，如伯胺。另外，可在生產(chǎn)過(guò)程中將帶正電的化合物摻入微載體制劑中(例如，在聚(乳酸)/聚(羥基乙酸)共聚物的生產(chǎn)過(guò)程中可使用帶正電荷的表面活性劑，以在所得的微載體粒子上賦予正電荷)。
如此處所述，為制備陽(yáng)離子微球，可將陽(yáng)離子脂類或聚合物，如1，2-二油酰基-1，2，3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)或聚賴氨酸根據(jù)它們?cè)贒P或CP相中的溶解度加至DP或CP中。
如此處所述，可以通過(guò)多核苷酸和微球粒子一起孵育，優(yōu)選地在含水混合物中孵育，使多核苷酸吸附至陽(yáng)離子微球上預(yù)形成IMP/MC復(fù)合體。此孵育可在任何期望條件下實(shí)施，包括環(huán)境溫度(室溫)(如，約20℃)或在冷藏下(如4℃)。由于陽(yáng)離子微球和多核苷酸能相對(duì)快地結(jié)合，孵育可持續(xù)任一適宜的時(shí)間段，如5、10、15分鐘或更多，包括過(guò)夜和更長(zhǎng)的孵育。例如，通過(guò)將包含ISS的多核苷酸和微球于4℃過(guò)夜含水孵育可使其吸附至陽(yáng)離子微球上。但是，由于陽(yáng)離子微球和多核苷酸能自發(fā)結(jié)合，通過(guò)將多核苷酸和MC簡(jiǎn)單地共施用也可形成IMP/MC復(fù)合體。在多核苷酸結(jié)合前后可通過(guò)微球的大小和表面電荷對(duì)其進(jìn)行表征。然后在如本文描述的建立的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)和小鼠脾細(xì)胞試驗(yàn)中評(píng)估所選擇批次與合適的對(duì)照相比的活性。也可在合適的動(dòng)物模型中評(píng)估該制劑。
通過(guò)核苷酸堿基配對(duì)連接的非共價(jià)IMP/MC復(fù)合體可用常規(guī)方法制備。通常，用包含連接有，優(yōu)選地共價(jià)連接有至少部分互補(bǔ)于IMP的多核苷酸(＂捕捉多核苷酸＂)的微載體制備堿基配對(duì)的IMP/MC復(fù)合體。IMP和捕捉核苷酸之間的互補(bǔ)片段優(yōu)選至少有6、8、10或15個(gè)相鄰堿基對(duì)，更優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)堿基對(duì)。捕捉核苷酸可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任一方法連接至MC，且優(yōu)選在5′或3′端共價(jià)連接IMP。
在其它實(shí)施方案中，可使用結(jié)合對(duì)連接IMP/MC復(fù)合體中的IMP和MC。結(jié)合對(duì)可為受體和配體、抗體和抗原(或表位)、或任何其它以高親和性結(jié)合的結(jié)合對(duì)(例如，Kd小于約10-8)。一類優(yōu)選的結(jié)合對(duì)為生物素和鏈親和素或?yàn)樯锼睾陀H和素，它們可形成緊密的復(fù)合體。當(dāng)使用結(jié)合對(duì)介導(dǎo)IMP/MC復(fù)合體的結(jié)合時(shí)，用結(jié)合對(duì)中的一員衍生IMP，一般通過(guò)共價(jià)鍵合衍生，且用結(jié)合對(duì)中的另一員衍生MC。這兩種衍生化合物的混合將導(dǎo)致IMP/MC復(fù)合體的形成。
許多IMP/MC復(fù)合體的實(shí)施方案不包括抗原，且某些實(shí)施方案排除與疾病或紊亂相關(guān)的抗原，其中所述疾病或紊亂為IMP/MC復(fù)合體的治療對(duì)象。在另外的實(shí)施方案中，IMP還結(jié)合一個(gè)或多個(gè)抗原分子。抗原可以以多種方式(包括共價(jià)和/或非共價(jià)相互作用)與IMP/MC復(fù)合體中的IMP部分偶聯(lián)，這一點(diǎn)參見(jiàn)例如WO 98/16247中描述。另外，抗原可與微載體連接。IMP上連接有抗原的IMP/MC復(fù)合體中，抗原與IMP的連接可通過(guò)本文中描述的技術(shù)和本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些技術(shù)包括但不限于直接的共價(jià)鍵合、通過(guò)交聯(lián)劑部分(其可包括間隔臂)的共價(jià)偶聯(lián)、通過(guò)特異結(jié)合對(duì)(如生物素和親和素)的非共價(jià)偶聯(lián)以及通過(guò)靜電或疏水作用的非共價(jià)偶聯(lián)。
本發(fā)明的方法本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)個(gè)體免疫反應(yīng)的方法，其中個(gè)體優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選地為人，該方法包括施與個(gè)體此處所述的含有ISS的多核苷酸。免疫調(diào)節(jié)可包括刺激Th1-類免疫反應(yīng)和/或抑制或降低Th2-類免疫反應(yīng)。含有ISS的多核苷酸以足以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的量施用。如本文所述，免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)可為對(duì)體液和/或細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，并且該調(diào)節(jié)可用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)及按此處所述測(cè)定。
許多個(gè)體適于接受本文所述的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。優(yōu)選地(但非必需)，個(gè)體為人。
在某些實(shí)施方案中，個(gè)體患有與Th2-類免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病，如變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)-誘導(dǎo)的哮喘。含有ISS的多核苷酸的施用將導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)，提高一種或多種與Th1-類反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子的水平，這可導(dǎo)致與個(gè)體的變應(yīng)原反應(yīng)相關(guān)的Th2-類反應(yīng)特征的減少。對(duì)患有Th2-類反應(yīng)相關(guān)疾病的個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)可導(dǎo)致減輕或改善一個(gè)或多個(gè)疾病癥狀。如果疾病為變態(tài)反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)-誘導(dǎo)的哮喘，一個(gè)或多個(gè)癥狀的改善包括減輕一個(gè)或多個(gè)以下癥狀鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、循環(huán)IgE水平、循環(huán)組胺水平和/或?qū)Α鋼尵刃浴湮肫鳢煼?例如，通過(guò)計(jì)量給藥吸入器或噴霧器而施用的吸入舒喘靈)的需要。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，接受本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)治療的個(gè)體為接受疫苗的個(gè)體。疫苗可為預(yù)防性疫苗或治療性疫苗。預(yù)防性疫苗包含與個(gè)體可能有危險(xiǎn)罹患的疾病相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)表位(例如，分枝結(jié)核桿菌抗原作為疫苗用于預(yù)防結(jié)核病)。治療性疫苗包含與感染個(gè)體的特定疾病相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)表位，如結(jié)核病患者體內(nèi)的分枝結(jié)核桿菌或牛結(jié)核分枝桿菌(M.bovis)表面抗原、在產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的個(gè)體體內(nèi)使個(gè)體產(chǎn)生變應(yīng)性的抗原(即變態(tài)反應(yīng)脫敏療法)、來(lái)自癌癥患者的腫瘤細(xì)胞(例如，在美國(guó)專利號(hào)5,484,596中所述)、或癌癥患者的腫瘤相關(guān)抗原。如以下實(shí)施例3中所示，將含有ISS的多核苷酸與肝炎病毒抗原(乙肝表面抗原(HBsAg))聯(lián)合施用導(dǎo)致靈長(zhǎng)類體內(nèi)的抗HBsAg抗體效價(jià)較僅施用HBsAg時(shí)產(chǎn)生的抗體效價(jià)升高。
含有ISS的多核苷酸可以與疫苗聯(lián)用(例如，與疫苗一同注射或同時(shí)但分別注射)或含有ISS的多核苷酸可分開(kāi)施用(例如，在疫苗施用前后至少12小時(shí))。在某些實(shí)施方案中，疫苗的抗原是ISS的一部分，該抗原共價(jià)或非共價(jià)連接至ISS。與接受疫苗但不接受含有ISS的多核苷酸的個(gè)體比較，對(duì)接受疫苗的個(gè)體施用免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸治療導(dǎo)致對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)移向Th1-類反應(yīng)。向Th1-類反應(yīng)的偏移可通過(guò)如下來(lái)識(shí)別，即，出現(xiàn)對(duì)疫苗中抗原的遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)、升高的IFN-γ和其它Th1-類反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子、特異針對(duì)疫苗中抗原的CTL的產(chǎn)生、特異針對(duì)疫苗中抗原的IgE水平的下降或減少、特異針對(duì)疫苗中抗原的Th2-相關(guān)抗體的減少、和/或?qū)σ呙缰锌乖哂刑禺愋缘腡h1-相關(guān)抗體的升高。在治療性疫苗的情況下，含有ISS的多核苷酸和疫苗的施用可導(dǎo)致疫苗所欲治療的疾病的一種或多種癥狀得以改善。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的，改進(jìn)的確切癥狀和改進(jìn)的方式取決于所欲治療的疾病。例如，當(dāng)治療性疫苗針對(duì)結(jié)核病時(shí)，用含有ISS的多核苷酸與疫苗治療導(dǎo)致咳嗽、胸膜或胸壁痛、發(fā)燒和/或本領(lǐng)域公知的其它癥狀減輕。當(dāng)疫苗為用于變態(tài)反應(yīng)脫敏療法中的變應(yīng)原時(shí)，所述治療導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)癥狀的減輕(例如，鼻炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎減輕、循環(huán)IgE水平和/或循環(huán)組胺水平降低)。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及對(duì)已患有疾病或紊亂如癌癥或感染性疾病的個(gè)體的免疫調(diào)節(jié)治療。癌癥是有吸引力的進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的靶標(biāo)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)癌表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原和/或腫瘤特異性抗原，這些抗原在體內(nèi)其它細(xì)胞上不存在。刺激針對(duì)腫瘤細(xì)胞的Th1-類反應(yīng)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)直接和/或旁觀者殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞減少和/或癥狀減輕。將含有ISS的多核苷酸施用給患有癌的個(gè)體可導(dǎo)致刺激針對(duì)腫瘤細(xì)胞的Th1-類免疫反應(yīng)。此免疫反應(yīng)通過(guò)細(xì)胞免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(如CTL)或體液免疫系統(tǒng)的組分的直接作用，或通過(guò)對(duì)免疫系統(tǒng)靶向細(xì)胞的鄰近細(xì)胞的旁觀者效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞。參見(jiàn)如Cho等人(2000)，自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)18509-514。在癌癥的情況下，含有ISS的多核苷酸的施用還可包括一種或多種其它治療劑如抗腫瘤抗體、化學(xué)治療方案和/或放射治療的施用?？鼓[瘤抗體包括但不限于抗腫瘤抗體片段和/或其衍生物、以及單克隆抗腫瘤抗體、片段和/或其衍生物，它們是本領(lǐng)域公知的，且在腫瘤治療中施用此類抗體制劑(例如，RITUXAN(rituximab)；HERCEPTIN(trastuzumab))也為本領(lǐng)域公知。一種或多種其它治療劑的施用可在含有ISS的多核苷酸施用前、后和/或同時(shí)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)治療也可用于患有感染性疾病的個(gè)體，其中感染性疾病尤其是抗體液免疫反應(yīng)的感染性疾病(例如，由分枝桿菌感染和胞內(nèi)病原體引起的疾病)。免疫調(diào)節(jié)治療可用于治療由細(xì)胞病原體(如細(xì)菌或原生動(dòng)物)或亞細(xì)胞病原體(如病毒)引起的感染性疾病?？蓪SS治療施與患有分枝桿菌疾病的個(gè)體，其中疾病如結(jié)核病(例如，分枝結(jié)核桿菌和/或牛結(jié)核分枝桿菌感染)、麻風(fēng)病(即麻風(fēng)分枝桿菌(M leprae)感染)或海分枝桿菌(M.marinum)或潰瘍分枝桿菌(M.ulcerans)感染。ISS治療也可用于治療病毒性感染，包括流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、乙肝病毒、丙肝病毒、皰疹病毒尤其是單純皰疹病毒和乳頭瘤病毒感染。由胞內(nèi)寄生蟲(chóng)引起的疾病也可受益于ISS治療，所述疾病如瘧疾(例如，間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodium vivax)、卵形瘧原蟲(chóng)(P.ovale)、惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)和/或三日瘧原蟲(chóng)(P.malariae)引起的感染)、利什曼病(例如，杜氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmania donovani)、熱帶利什曼原蟲(chóng)(L.tropica)、墨西哥利什曼原蟲(chóng)(L.mexicana)、巴西利什曼原蟲(chóng)(L.braziliensis)、秘魯利什曼原蟲(chóng)(L.peruviana)、嬰兒利什曼原蟲(chóng)(L.infantum)、L.chagasi和/或埃塞俄比亞利什曼原蟲(chóng)(Leishmania aethiopica)引起的感染)、以及弓形體病(即鼠弓形體(Toxoplasmosis gondii)引起的感染)。ISS治療也可用于治療寄生蟲(chóng)病如血吸蟲(chóng)病(即由血吸蟲(chóng)屬血吸蟲(chóng)如埃及血吸蟲(chóng)(S.haematobium)、曼氏血吸蟲(chóng)(S.mansoni)、日本血吸蟲(chóng)(S.japonicum)和湄公血吸蟲(chóng)(S.mekongi)引起的血吸蟲(chóng)感染)和枝睪吸蟲(chóng)病(即由華支睪吸蟲(chóng)(Clonorchis sinensis)引起的感染)。將含有ISS的多核苷酸施與患有感染性疾病的個(gè)體可導(dǎo)致感染性疾病的癥狀改善。在一些實(shí)施方案中，感染性疾病非病毒性疾病。
本發(fā)明還提供了升高或刺激個(gè)體的至少一種Th1-相關(guān)細(xì)胞因子的方法，其中所述Th1-相關(guān)細(xì)胞因子包括IL-2、IL-12、TNF-β、IFN-γ和IFN-α。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了升高或刺激個(gè)體體內(nèi)的IFN-γ的方法，所述個(gè)體尤其是需要增高的IFN-γ水平的個(gè)體，其方式是通過(guò)給個(gè)體施用有效量的含有ISS的多核苷酸，從而升高IFN-γ。需要增高的IFN-γ水平的個(gè)體為那些患有一般對(duì)施用IFN-γ有反應(yīng)的疾病的個(gè)體。此類疾病包括許多炎性疾病，包括但不限于潰瘍性結(jié)腸炎。此類疾病也包括許多纖維化疾病，包括但不限于特發(fā)性肺纖維化(IPF)、硬皮病、輻射引發(fā)的皮膚纖維化、肝纖維化(包括血吸蟲(chóng)病引發(fā)的肝纖維化)、腎纖維化以及其它可通過(guò)施用IFN-γ而改善的疾病。施用本發(fā)明的含有ISS的多核苷酸將導(dǎo)致IFN-γ水平升高，并導(dǎo)致響應(yīng)IFN-γ的疾病的一種或多種癥狀得以改善、一種或多種癥狀得以穩(wěn)定和/或疾病的發(fā)展得以防止或減緩(例如，減輕或消除額外的損傷或癥狀)。
本發(fā)明的方法可與組成疾病護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的其它療法聯(lián)用，如對(duì)IPF與施用抗炎劑諸如全身皮質(zhì)類固醇療法(如考的松)聯(lián)用。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了升高個(gè)體體內(nèi)的IFN-α的方法，所述個(gè)體尤其是需要增高的IFN-α水平的個(gè)體，其方式是通過(guò)給個(gè)體施用有效量的含有ISS的多核苷酸，從而升高IFN-α水平。需要增高的IFN-α的個(gè)體為那些患有一般對(duì)施用IFN-α(包括重組IFN-α)有反應(yīng)的疾病的個(gè)體，此類疾病包括但不限于病毒性感染和癌癥。在某些實(shí)施方案中，如本文所述，能有效誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸除了包含ISS外，還包含一個(gè)或多個(gè)TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列，尤其是包含在ISS的5’端。該額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列可緊挨著ISS的5′，或位于ISS的5′但兩者之間有1個(gè)或多個(gè)堿基的間隔。在一些實(shí)施方案中，該額外的TCG和/或T，5-溴胞嘧啶，G序列通過(guò)將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，如果額外的TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列是通過(guò)將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產(chǎn)生的，則該額外的序列可與ISS一起產(chǎn)生TCGA或T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
可特別有效地誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的實(shí)例包括但不限于SEQ ID NO1、14、19、46、24、11、18、35、12、13、28和36。
施用本發(fā)明的含有ISS的多核苷酸可導(dǎo)致IFN-α水平升高，并導(dǎo)致響應(yīng)IFN-α的疾病的一種或多種癥狀得以改善、一種或多種癥狀得以穩(wěn)定和/或疾病的發(fā)展得以防止或減緩(例如，減輕或消除額外的損傷或癥狀)。本發(fā)明的方法可與組成疾病護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的其它療法聯(lián)用，如對(duì)于病毒性感染可與施用抗病毒劑聯(lián)用。
本發(fā)明還提供了對(duì)患有IgE-相關(guān)疾病的個(gè)體降低其IgE水平，尤其是血清IgE水平的方法，其方式是向個(gè)體施用有效量的含有ISS的多核苷酸。在此類方法中，免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可單獨(dú)施用(如，無(wú)抗原)或與抗原如變應(yīng)原聯(lián)合施用。IgE的降低將導(dǎo)致IgE-相關(guān)疾病的一種或多種癥狀得以改善。此類癥狀包括變態(tài)反應(yīng)癥狀(如鼻炎、結(jié)膜炎)，癥狀改善包括對(duì)變應(yīng)原的敏感性降低、發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的個(gè)體的變態(tài)反應(yīng)癥狀減輕或變態(tài)反應(yīng)的嚴(yán)重程度降低。因此，本發(fā)明也提供了治療個(gè)體的變應(yīng)性疾病的方法。在一些實(shí)施方案中，治療變應(yīng)性疾病的方法包括將免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸與一定量或劑量的抗原聯(lián)合施用。對(duì)于任何額外的抗原施用，所施用的抗原量或劑量在治療期間可保持相同、或可減少或增加(如在常規(guī)的脫敏療法中一樣)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了刺激個(gè)體產(chǎn)生CTL的方法，所述個(gè)體尤其是需要增高的CTL數(shù)目和/或活性的個(gè)體，該方法包括施用有效量的含有ISS的多核苷酸給個(gè)體，從而提高CTL的產(chǎn)生。需要增高的CTL產(chǎn)生的個(gè)體為那些患有一般對(duì)CTL活性有反應(yīng)的疾病的個(gè)體。此類疾病包括但不限于癌癥和胞內(nèi)感染。施用本發(fā)明的含有ISS的多核苷酸將導(dǎo)致CTL水平升高，并導(dǎo)致響應(yīng)CTL活性的疾病的一種或多種癥狀得以改善、一種或多種癥狀得以穩(wěn)定和/或疾病的發(fā)展得以防止或減緩(例如，減輕或消除額外的損傷或癥狀)。
本發(fā)明的方法包括本文所述的任何實(shí)施方案，如以免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸/微載體復(fù)合體形式(有或沒(méi)有抗原，或在施用過(guò)程中有或沒(méi)有抗原)，或與抗原緊鄰連接的形式施用含有ISS的多核苷酸。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，對(duì)于施用含有ISS的多核苷酸的特定適應(yīng)癥，本發(fā)明的方法可與其它療法聯(lián)用。例如，ISS療法可與抗瘧疾藥如氯喹聯(lián)用施與瘧疾患者、可與殺利什曼原蟲(chóng)藥如戊烷脒和/或別嘌呤醇聯(lián)用施與利什曼病患者、可與抗分枝桿菌藥如雷米封、利福平和/或乙胺丁醇聯(lián)用施與結(jié)核病患者、或可與變應(yīng)原脫敏療法聯(lián)用施與特應(yīng)性(變態(tài)反應(yīng))患者。
如此處所述，含有ISS的多核苷酸的施用還可包括一種或多種其它免疫治療劑(即通過(guò)免疫系統(tǒng)起作用的治療劑和/或來(lái)自于免疫系統(tǒng)的治療劑)的施用，其中所述免疫治療劑包括但不限于細(xì)胞因子、佐劑和抗體(包括但不限于抗體片段和/或衍生物，以及單克隆抗體、其片段和/或衍生物)。治療性抗體的實(shí)例包括那些用于癌癥的抗體(如抗腫瘤抗體)。此類額外免疫治療劑的施用適用于本文所述的所有方法。
含有ISS的多核苷酸也可與佐劑聯(lián)用。與僅包含ISS和抗原的組合物所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相比，抗原與ISS和佐劑聯(lián)合施用可導(dǎo)致對(duì)抗原的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，并由此導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫反應(yīng)。佐劑為本領(lǐng)域公知，其包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、明礬(鋁鹽)、脂質(zhì)體和微粒子(包括但不限于聚苯乙烯、淀粉、聚磷腈和聚交酯/聚糖苷)。其它合適的佐劑還包括但不限于MF59、DETOXTM(Ribi)、鯊烯混合物(SAF-1)、胞壁酰肽、皂甙衍生物、分枝桿菌細(xì)胞壁制品、單磷酰酯A、霉菌酸衍生物、非離子嵌段共聚物表面活性劑、Quil A、霍亂毒素B亞單位、聚磷腈及衍生物、以及免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)如Takahashi等人(1990)自然(Nature)344873-875中描述的那些免疫刺激復(fù)合物、以及基于脂的佐劑和本文描述的其它佐劑。對(duì)于獸用及在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，可使用弗氏佐劑(完全和不完全弗氏佐劑)的促有絲分裂組分。
施用和評(píng)估免疫反應(yīng)如此處所述，含有ISS的多核苷酸可與其它藥劑和/或免疫原性試劑和/或免疫刺激劑聯(lián)合施用，并可組合其生理可接受載體(就此本發(fā)明包括這些組合物)。含有ISS的多核苷酸可為本文描述的任何此類多核苷酸。
因此，含有ISS的多核苷酸可與其它免疫治療劑聯(lián)用，所述免疫治療劑包括但不限于細(xì)胞因子、佐劑和抗體。
如所有的免疫原性組合物一樣，特定的含有ISS的多核苷酸制劑的免疫有效量和施用方法根據(jù)個(gè)體、欲治療的疾病和為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然的其它因素的不同而不同。待考慮的因素包括所施用抗原的抗原性、含有ISS的多核苷酸是否與佐劑、遞送分子或和/或抗原聯(lián)合施用或與它們共價(jià)連接、施用途徑和欲施用的免疫給藥次數(shù)。此類因素為本領(lǐng)域公知，并且不用過(guò)多試驗(yàn)而對(duì)它們作出確定也屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍。合適的劑量范圍是能為免疫反應(yīng)提供所需調(diào)節(jié)(如刺激IFN-γ和/或IFN-α)的劑量范圍。當(dāng)針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)為所需要的時(shí)，合適的劑量范圍為能為抗原免疫反應(yīng)提供所需調(diào)節(jié)的劑量范圍。通常，劑量由施用于患者的含有ISS的多核苷酸的量而不是由所施用的含有ISS的組合物的總量而確定。含有ISS的多核苷酸的有用劑量范圍(以遞送的含有ISS的多核苷酸的量給出)可以例如為下列任一個(gè)約1至500μg/kg，100至400μg/kg，200至300μg/kg，1至100μg/kg，100至200μg/kg，300至400μg/kg，400至500μg/kg。施與每一患者的絕對(duì)量取決于藥理學(xué)特性如生物利用度、清除率和施用途徑。
特定的含有ISS的多核苷酸制劑的有效量和施用方法根據(jù)患者個(gè)體、所需結(jié)果和/或疾病類型、疾病價(jià)段和本領(lǐng)域技術(shù)人員明了的其它因素可不同。具體應(yīng)用時(shí)的施用途徑對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。施用途徑包括但不限于局部的、皮膚的、經(jīng)皮膚的、經(jīng)粘膜的、表皮的、腸胃外的、腸胃的以及鼻咽的和肺的(包括經(jīng)支氣管的和經(jīng)肺泡的)施用途徑。合適的劑量范圍為這樣的劑量范圍，其提供了足夠的含有ISS的組合物，通過(guò)測(cè)定血液水平足以達(dá)到約1-10μM的組織濃度。施與每一患者的絕對(duì)量取決于藥理學(xué)特性如生物利用度、清除率和施用途徑。
如此處所述，APC和具有高濃度APC的組織為含有ISS的多核苷酸的優(yōu)選靶。因此，將含有ISS的多核苷酸施用至APC以相對(duì)高的濃度存在的哺乳動(dòng)物皮膚和/或粘膜處是優(yōu)選的。
本發(fā)明提供了適用于局部應(yīng)用的含有ISS的多核苷酸制劑，包括但不限于生理可接受的植入物、軟膏、霜?jiǎng)?、洗劑和凝膠。局部施用為例如通過(guò)其中分散有遞送系統(tǒng)的敷料或繃帶施用、將遞送系統(tǒng)直接施用入切口或開(kāi)放性傷口、或通過(guò)定向于目標(biāo)位點(diǎn)的經(jīng)皮膚施用裝置來(lái)施用。其中分散有含有ISS的多核苷酸的霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠或軟膏適用于用作局部軟膏或傷口充填劑。
優(yōu)選的皮膚施用途徑為那些對(duì)皮膚侵害最小的途徑。這些方式中優(yōu)選的為經(jīng)皮膚遞送、表皮施用和皮下注射。在這些方式中，由于預(yù)計(jì)皮內(nèi)組織中存在較高濃度的APC，優(yōu)選表皮施用。
經(jīng)皮膚施用通過(guò)應(yīng)用可使得含有ISS的多核苷酸透過(guò)皮膚并進(jìn)入血流的霜?jiǎng)?、洗劑、凝膠等來(lái)實(shí)現(xiàn)。適于經(jīng)皮膚施用的組合物包括但不限于直接應(yīng)用于皮膚或摻入保護(hù)性載體如經(jīng)皮膚載置(所謂＂貼劑＂)中的可藥用混懸液、油、霜?jiǎng)┖蛙浉?。合適的霜?jiǎng)?、軟膏等的?shí)例可例如在Physician′s Desk Reference中找到。
對(duì)于經(jīng)皮膚遞送，離子電滲是一合適的方法。離子電滲遞送可通過(guò)市售的貼劑而完成，其中貼劑可以通過(guò)未破損皮膚持繼遞送它們的產(chǎn)物幾天或更長(zhǎng)時(shí)間。該方法的使用使得藥物組合物能以相對(duì)大的濃度受控遞送、并允許輸注組合藥物及同時(shí)使用吸收促進(jìn)劑。
用于該方法中的示例性貼劑產(chǎn)品是Los Angeles，CA的GeneralMedical Company的商標(biāo)為L(zhǎng)ECTRO PATCH的產(chǎn)品。該產(chǎn)品通過(guò)電子方式維持貯庫(kù)電極在中性pH并能適應(yīng)于提供不同濃度的劑量以及連續(xù)地和/或周期性地給藥。貼劑的準(zhǔn)備和使用應(yīng)按照與LECTRO PATCH產(chǎn)品在一起的、廠商印制的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；這些說(shuō)明書(shū)在此引用作為參考。其它封閉式貼劑體系也是合適的。
對(duì)于經(jīng)皮膚遞送，低頻超聲遞送也是一合適的方法。Mitragotri等人(1995)科學(xué)(Science)269850-853。低頻超聲頻率(約1MHz)的應(yīng)用允許治療組合物(包括那些具有高分子量的治療組合物)的總體受控遞送。
表皮施用基本上涉及機(jī)械刺激或化學(xué)刺激最外層表皮，而且所述刺激將足以激發(fā)對(duì)該刺激的免疫反應(yīng)。具體而言，該刺激應(yīng)足以將APC吸引至刺激位點(diǎn)。
一個(gè)示例性的機(jī)械刺激方式使用多個(gè)直徑非常狹窄的短齒，其可用于刺激皮膚并將APC吸引至刺激位點(diǎn)，以攝取從齒的末端轉(zhuǎn)移出的ISS。例如，法國(guó)Lyon的Pasteur Merieux生產(chǎn)的MONOVACC舊結(jié)核菌素試驗(yàn)包含適于導(dǎo)入含免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的組合物的裝置。
該裝置(由Swiftwater，PA的Connaught Laboratories，Inc.在美國(guó)供銷)由在一端具有注射器推進(jìn)器和在另一端具有齒盤的塑料容器組成。齒盤上固定著具有一定長(zhǎng)度的多個(gè)直徑狹窄的齒，以致其恰好能刮搔表皮的最外層細(xì)胞。MONO-VACC試劑盒中的每個(gè)齒都包被有舊結(jié)核菌素；在本發(fā)明中，每個(gè)針都包被有免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸制劑的藥物組合物。該裝置的使用優(yōu)選按照包括在該裝置產(chǎn)品中的、廠商所寫的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在此實(shí)施方案中也可使用的類似裝置為目前用于實(shí)施變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)的那些。
表皮施用含有ISS的多核苷酸的另一合適方法是使用化學(xué)品，該化學(xué)品能刺激表皮的最外層細(xì)胞，因此激發(fā)可吸引APC至該區(qū)域的足夠的免疫反應(yīng)。一個(gè)實(shí)例為角質(zhì)裂解劑，如由Noxema Corporation以商標(biāo)NAIR賣出的市售局部脫毛霜?jiǎng)┲惺褂玫乃畻钏帷Ｔ摲椒ㄒ部捎糜趯?shí)現(xiàn)粘膜的上皮施用?；瘜W(xué)刺激劑也可與機(jī)械刺激物聯(lián)合應(yīng)用(例如，如果MONO-VACC類齒也包被有化學(xué)刺激劑，則存在此聯(lián)合應(yīng)用)。含有ISS的多核苷酸也可懸于包含化學(xué)刺激劑的載體中或與該化學(xué)刺激劑共施用。
腸胃外的施用途徑包括但不限于電注射(離子電滲)或直接注射如直接注射入中央靜脈、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹腔注射、皮內(nèi)注射或皮下注射。適用于腸胃外施用的含有ISS的多核苷酸的制劑通常配制在USP水或注射用水中，并且還可包含pH緩沖劑、鹽填充劑、防腐劑和其它可藥用賦形劑。用于腸胃外注射的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可配制在可藥用無(wú)菌等滲溶液如注射用鹽水和磷酸鹽緩沖鹽水中。
胃腸施用途徑包括但不限于吞咽和直腸途徑。本發(fā)明包括的適于胃腸施用的含有ISS的多核苷酸的制劑，包括但不限于用于吞咽給藥的可藥用粉劑、片劑或液體及用于直腸施用的栓劑。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是片劑或栓劑還將包含可藥用固體如淀粉，以填充組合物。
鼻咽的和肺的施用可通過(guò)吸入實(shí)施，并包括遞送途徑如鼻內(nèi)途徑、經(jīng)支氣管途徑和經(jīng)肺泡途徑。本發(fā)明包括適于吸入施用的含有ISS的多核苷酸的制劑，包括但不限于用于形成氣霧的液態(tài)懸浮劑及用于干粉吸入遞送系統(tǒng)的粉劑。對(duì)于吸入施用ISS制劑，適用的裝置包括但不限于噴霧器、蒸發(fā)器、霧化器和干粉吸入遞送裝置。
本領(lǐng)域熟知，用于本文所述施用途徑的溶液或懸液可包括任一或多種下列組分無(wú)菌稀釋劑如用于注射的水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)節(jié)張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。可用酸或堿如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。腸胃外制品可封裝在用玻璃或塑料制備的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
本領(lǐng)域熟知，適于注射用的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(如果溶于水的話)或分散體和用于當(dāng)時(shí)制備可注射的無(wú)菌溶液或分散體的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑制細(xì)菌的水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物必須無(wú)菌并應(yīng)為流動(dòng)性達(dá)到易于注射程度的流體。該組合物在制備和存儲(chǔ)條件下應(yīng)是穩(wěn)定的，并且必須在抗微生物如細(xì)菌或真菌的污染作用的條件下存儲(chǔ)。載體可為含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)和它們的合適混合物的溶劑或分散介質(zhì)。合適的流動(dòng)性可以如通過(guò)使用包衣劑如卵磷脂、對(duì)于分散體通過(guò)保持所需的粒徑、以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持。微生物作用的防止可通過(guò)多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在組合物中包括等張劑，如糖、聚醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化鈉可能是優(yōu)選的?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠而產(chǎn)生。
本領(lǐng)域熟知，無(wú)菌可注射液可通過(guò)將活性化合物以所需量摻入合適的溶劑中，然后過(guò)濾除菌而制備，其中所述溶劑根據(jù)需要具有上面列舉的一種成分或多種成分的組合。一般，分散體通過(guò)將活性化合物摻入無(wú)菌賦形劑而制備，其中所述無(wú)菌賦形劑包含基本分散介質(zhì)和所需的來(lái)自上述的其它成分。對(duì)于用于制備無(wú)菌可注射液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，這些方法產(chǎn)生含有來(lái)自前述無(wú)菌過(guò)濾溶液的活性成分及任何其它所需成分的粉末。
遞送途徑的選擇可用于調(diào)節(jié)所引發(fā)的免疫反應(yīng)。例如，當(dāng)流感病毒載體通過(guò)肌內(nèi)或表皮(基因槍)途徑施用時(shí)，IgG效價(jià)和CTL活性是相同的；但是，肌肉接種主要產(chǎn)生IgG2a，而表皮途徑主要產(chǎn)生IgG1。Pertmer等人(1996)，病毒學(xué)雜志(J.Virol.)706119-6125。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的不同施用途徑所引發(fā)的免疫原性的輕微差別。
上述組合物和施用方法旨在描述而不用于限制本發(fā)明含有ISS的多核苷酸制劑的施用方法。制備各種組合物和裝置的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，在此不再詳述。
針對(duì)ISS的免疫反應(yīng)可以按任一本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行分析(定性和定量分析)，包括但不限于測(cè)定抗原特異性的抗體產(chǎn)生(包括測(cè)定特異的抗體亞類)、特異淋巴細(xì)胞群如CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞或CTL的活化、細(xì)胞因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10或IL-12的產(chǎn)生和/或組胺的釋放。測(cè)定特異性抗體反應(yīng)的方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，并且為本領(lǐng)域熟知。特定類型淋巴細(xì)胞如CD4+T細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定可例如用熒光激活的細(xì)胞分選法(FACS)完成。細(xì)胞毒性和CTL試驗(yàn)可例如如Raz等人(1994)，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)919519-9523和Cho等人(2000)所述進(jìn)行。細(xì)胞因子濃度可例如通過(guò)ELISA測(cè)定。這些和其它用于評(píng)估針對(duì)免疫原的免疫反應(yīng)的試驗(yàn)為本領(lǐng)域熟知。參見(jiàn)如細(xì)胞免疫學(xué)中的選擇方法(Selected Methods inCellular Immunology)(1980)Mishell和Shiigi編輯，W.H.Freeman andCo.。
優(yōu)選地，刺激，即引發(fā)和/或增強(qiáng)Th1-類反應(yīng)。關(guān)于本發(fā)明，對(duì)Th1-類免疫反應(yīng)的刺激可通過(guò)體外或離體測(cè)定ISS處理的細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生并與未用ISS處理的細(xì)胞相比來(lái)確定。確定細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法包括那些本文中描述的方法及本領(lǐng)域公知的任何方法。響應(yīng)ISS處理產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型表明了細(xì)胞產(chǎn)生的是偏向Th1-類或Th2-類的免疫反應(yīng)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)＂偏向于Th1-類的＂細(xì)胞因子產(chǎn)生是指在存在刺激劑時(shí)Th1-類免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生與缺乏刺激時(shí)此類細(xì)胞因子的產(chǎn)生相比，前者可測(cè)量地升高。此類偏向于Th1-類的細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于IL-2、IL-12、IFN-γ和IFN-α。相反，＂偏向于Th2-類的細(xì)胞因子＂是指那些與Th2-類免疫反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子，其包括但不限于IL-4、IL-5和IL-13?？捎糜跍y(cè)定ISS活性的細(xì)胞包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞、分離自宿主的原代細(xì)胞和/或細(xì)胞系，優(yōu)選地為APC和淋巴細(xì)胞，甚至更優(yōu)選地為巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞。
對(duì)Th1-類免疫反應(yīng)的刺激也可在使用含有ISS的多核苷酸處理的宿主中測(cè)定，并且可用本領(lǐng)域公知的任一方法測(cè)定，包括但不限于(1)任選地與接觸過(guò)抗原的或接觸過(guò)抗原并被攻擊過(guò)的、未用ISS處理過(guò)的對(duì)照比較，在ISS處理的宿主中抗原攻擊前后測(cè)定到IL-4或IL-5的水平降低；或檢測(cè)到較低(或甚至沒(méi)有檢測(cè)到)IL-4或IL-5水平，(2)與接觸過(guò)抗原的、或接觸過(guò)抗原并被攻擊過(guò)的未用ISS處理過(guò)的對(duì)照比較，在ISS處理的宿主中抗原攻擊前后IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)的水平升高；或檢測(cè)到較高的IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ)水平；(3)與未用ISS處理的對(duì)照比較，在ISS處理的宿主中產(chǎn)生＂偏向于Th1-類的＂抗體；和/或(4)與接觸過(guò)抗原的或接觸過(guò)抗原并被攻擊過(guò)的、未用ISS處理過(guò)的對(duì)照比較，在ISS處理的宿主中抗原攻擊前后檢測(cè)到抗原特異性IgE的水平降低；或檢測(cè)到較低(或甚至沒(méi)有檢測(cè)到)抗原特異性IgE的水平。這些測(cè)定中的許多可通過(guò)使用此處描述的方法或任一本領(lǐng)域公知的方法體外或離體測(cè)量由APC和/或淋巴細(xì)胞，優(yōu)選地由巨噬細(xì)胞和/或T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些測(cè)定中的一些測(cè)定可通過(guò)使用此處描述的方法或任一本領(lǐng)域公知的方法測(cè)量抗原特異性抗體的類和/或亞類來(lái)實(shí)現(xiàn)。
應(yīng)答含有ISS的多核苷酸處理所產(chǎn)生的抗原特異性抗體的類和/或亞類表明細(xì)胞產(chǎn)生的是偏向于Th1-類或偏向于Th2-類的免疫反應(yīng)。如此處所用，術(shù)語(yǔ)＂偏向于Th1-類的＂抗體產(chǎn)生是指與Th1-類免疫反應(yīng)相關(guān)的抗體(即Th1-相關(guān)抗體)的產(chǎn)生可測(cè)定地升高?？蓽y(cè)定一種或多種Th1相關(guān)抗體。此類偏向于Th1-類的抗體的實(shí)例包括但不限于人IgG1和/或IgG3(參見(jiàn)如Widhe等人(1 998)Scand.J Immunol.47575-581和deMartino等人(1999)Ann.Allergy Asthma Immunol.83160-164)和鼠IgG2a。相反，＂偏向于Th2-類的抗體＂是指那些與Th2-類免疫反應(yīng)相關(guān)的抗體，其包括但不限于人IgG2、IgG4和/或IgE(參見(jiàn)如Widhe等人(1998)和de Martino等人(1999))以及鼠IgG1和/或IgE。
由于施用含有ISS的多核苷酸而發(fā)生的對(duì)偏向于Th1-類的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)可導(dǎo)致增強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，如那些由NK細(xì)胞、細(xì)胞毒殺傷細(xì)胞、Th1輔助細(xì)胞和記憶細(xì)胞實(shí)施的免疫反應(yīng)。這些反應(yīng)用在抗病毒、真菌、原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、變應(yīng)性疾病、哮喘及腫瘤的預(yù)防性或治療性疫苗接種上尤其有益。
在一些實(shí)施方案中，Th2反應(yīng)被抑制(減少)。Th2反應(yīng)的抑制可通過(guò)如Th2相關(guān)細(xì)胞因子(諸如IL-4和IL-5)水平的降低、Th2相關(guān)抗體水平的降低、及應(yīng)答變應(yīng)原的IgE的降低和組胺釋放的減少來(lái)確定。
本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明提供了試劑盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒一般包含一個(gè)或多個(gè)容器，容器中包含有本文所述的任何含有ISS的多核苷酸。試劑盒還可包含一套有關(guān)含有ISS的多核苷酸的用途的適當(dāng)說(shuō)明書(shū)，通常為書(shū)面說(shuō)明書(shū)，所述用途為在任一本文所述的方法中的應(yīng)用(例如，免疫調(diào)節(jié)、改善感染性疾病的一種或多種癥狀、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相關(guān)疾病)。
試劑盒可包含包裝在任一方便合適的包裝中的含有ISS的多核苷酸。例如，如果該含有ISS的多核苷酸為干燥制劑(例如，冷凍干燥的或干粉)，通常使用帶彈性塞的小瓶，這樣通過(guò)彈性塞注入液體可容易地將含有ISS的多核苷酸重懸。帶有無(wú)彈性可摘取封口(如封口玻璃)的安瓿或帶有彈性塞的安瓿最適用于含有ISS的多核苷酸的液體制劑。也可考慮使用與特定的裝置如吸入器、鼻施用裝置(如噴霧器)或輸注裝置如微型泵組合應(yīng)用的包裝。
有關(guān)含有ISS的多核苷酸的用途的說(shuō)明書(shū)通常包括劑量、給藥方案及針對(duì)預(yù)期使用方法的施用途徑的信息。用于含有ISS的多核苷酸的容器可為單位劑量、大包裝(如多劑量包裝)或亞單位劑量。本發(fā)明試劑盒中提供的說(shuō)明書(shū)一般為標(biāo)簽或包裝插入物上的書(shū)面說(shuō)明書(shū)(如，包括在試劑盒中的紙片)，但可機(jī)讀的說(shuō)明書(shū)(如在磁盤或光存儲(chǔ)盤上攜帶的說(shuō)明書(shū))也可接受。
在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含抗原(或包含一種或多種抗原)，該抗原可與或不與含有ISS的多核苷酸包裝在同一容器(制劑)中。文中已描述了抗原。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含以免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸/微載體復(fù)合體(IMP/MC)形式存在的含有ISS的多核苷酸，并還可包含一套涉及該IMP/MC復(fù)合體用途的說(shuō)明書(shū)，通常為書(shū)面說(shuō)明書(shū)，所述用途為在任一此處所述的方法中的應(yīng)用(例如，免疫調(diào)節(jié)、改善感染性疾病的一種或多種癥狀、升高IFN-γ水平、升高IFN-α水平、或改善IgE-相關(guān)疾病)。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含用于產(chǎn)生IMP/MC復(fù)合體的材料，通常包括分開(kāi)裝有IMP和MC的容器，但在某些實(shí)施方案中提供的是用于產(chǎn)生MC的材料而不是預(yù)形成的MC。IMP和MC優(yōu)選以如下形式提供，所述形式允許所提供的IMP和MC在混合后可形成IMP/MC復(fù)合體。當(dāng)IMP/MC復(fù)合體通過(guò)非共價(jià)鍵連接時(shí)，優(yōu)選這種配置。當(dāng)IMP和MC待通過(guò)異雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)時(shí)；當(dāng)IMP或MC以＂活化＂形式(例如，連接在異雙功能交聯(lián)劑上，這樣可獲得與IMP反應(yīng)的部分)提供時(shí)，也優(yōu)選這種配置。
對(duì)于包含液相MC的IMP/MC復(fù)合體，試劑盒優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)容器，容器中含有用于產(chǎn)生液相MC的材料。例如，對(duì)于水包油的乳液MC，IMP/MC試劑盒可包含一個(gè)或多個(gè)含有油相和水相的容器。乳化容器中的內(nèi)容物以產(chǎn)生MC，然后其可與IMP混合，優(yōu)選地與已修飾而摻入了疏水部分的IMP混合。此類材料包括用于產(chǎn)生水包油乳液的油和水，或者包括含有冷凍干燥脂質(zhì)體組分(如磷脂、膽固醇和表面活性劑的混合物)的容器加上含有水相(例如，可藥用的水性緩沖液)的一個(gè)或多個(gè)容器。
提供下列實(shí)施例來(lái)舉例闡述而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1含有ISS的多核苷酸對(duì)鼠細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)了免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸(即含有ISS)或?qū)φ斩嗪塑账?即不合ISS)對(duì)小鼠脾細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。受試多核苷酸為充分修飾的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸。在受試多核苷酸中設(shè)置了5′-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3′(SEQ ID NO59)(陽(yáng)性對(duì)照)和5′-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO60)(陰性對(duì)照)。
BALB/c小鼠脾的碎片用溶解于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的膠原酶/分散酶(0.1U/mL/0.8U/mL)于37℃消化45分鐘，然后將消化的碎片通過(guò)金屬篩機(jī)械分散。離心沉淀分散的脾細(xì)胞，然后重懸于新鮮培養(yǎng)基(具10％胎牛血清的RPMI 1640，加上50單位/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素、2mM谷氨酰胺和0.05mM β-巰基乙醇)中。
將小鼠脾細(xì)胞分散在96孔板的孔中(7×107個(gè)細(xì)胞/ml)并于37℃孵育1小時(shí)。加入2倍濃度的試驗(yàn)樣本或?qū)φ?00μL，并再孵育細(xì)胞24小時(shí)。從每孔收獲培養(yǎng)基并通過(guò)ELISA試驗(yàn)細(xì)胞因子濃度。在多個(gè)濃度包括5.0、1.0和0.1μg/ml下試驗(yàn)多核苷酸。對(duì)照樣本包括單獨(dú)的培養(yǎng)基和PANSORBIN熱滅活的、福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌(SAC)(CalBiochem)。
用夾心ELISA測(cè)定IFN-γ。來(lái)自小鼠脾細(xì)胞試驗(yàn)的培養(yǎng)基在包被有抗IFN-γ單克隆抗體的微滴定板(Nunc)中孵育。用生物素化的抗IFN-γ抗體和鏈親和素-辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二級(jí)抗體檢測(cè)結(jié)合的IFN-γ，用生色過(guò)氧化物酶底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在過(guò)氧化物酶存在下顯色，并用Emax精確微板讀數(shù)儀(Molecular Devices)在450nm處測(cè)定光吸收值而定量。
與對(duì)照多核苷酸相比，含有ISS的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸實(shí)質(zhì)性地提高了小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的分泌。表2-5總結(jié)了應(yīng)答5μg/ml多核苷酸所產(chǎn)生的IFN-γ的試驗(yàn)結(jié)果。
表2.小鼠脾細(xì)胞試驗(yàn)-IFNγ(pg/ml)

表3.小鼠脾細(xì)胞試驗(yàn)-IFNγ(pg/ml)

表4.小鼠脾細(xì)胞試驗(yàn)-IFNγ(pg/ml)

表5.小鼠脾細(xì)胞試驗(yàn)-IFNγ(pg/ml)


實(shí)施例2含有ISS的多核苷酸對(duì)人細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)了免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸(即含有ISS)或?qū)φ諛颖緦?duì)人外周血單核細(xì)胞(PBMC)的免疫調(diào)節(jié)活性，其中所述對(duì)照樣本包括不含ISS的多核苷酸(5′-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO60)和5′-TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA-3′(SEQ ID NO61))、SAC及僅培養(yǎng)基。受試多核苷酸為充分修飾的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸。
用肝素抗凝的注射器通過(guò)靜脈穿刺從自愿者收集外周血。將血液置于FICOLL(Amersham Pharmacia Biotech)墊層上并離心。收集位于FICOLL分界處的PBMC，然后用冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗兩次。重懸細(xì)胞，在24孔板或48孔板中以2×106個(gè)細(xì)胞/mL在含10％熱滅活的人AB血清加上50單位/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素、300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉和1×MEM非必需氨基酸(NEAA)的RPMI1640中培養(yǎng)細(xì)胞。
細(xì)胞在存在20μg/ml受試樣本(免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸或?qū)φ?時(shí)培養(yǎng)24小時(shí)，然后從每孔收集無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基并檢測(cè)IFN-γ和IFN-α濃度。用來(lái)自BioSource International，Inc.的CYTOSCREENTMELISA試劑盒按照廠商的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IFN-γ和IFN-α。
含有ISS的多核苷酸刺激人PBMC分泌IFN-γ和/或IFN-α。在人PBMC試驗(yàn)中，IFN-γ的背景水平可隨著供體的不同而不同，甚至是明顯不同。但其它細(xì)胞因子如IFN-α顯示了大體穩(wěn)定的活化模式并且在未受刺激的情況下常規(guī)顯示低的背景水平。來(lái)自獨(dú)立PBMC供體的此類試驗(yàn)結(jié)果的例子總結(jié)在表6中。
如表6中所示，對(duì)人細(xì)胞而言，某些免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸可有效升高IFN-γ水平。同樣如表6中所示，對(duì)人細(xì)胞而言，某些免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸在提升IFN-α水平方面尤其有效。此類多核苷酸通常包括那些在ISS的5′含有至少一個(gè)TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列的多核苷酸，或那些通過(guò)將T或TC或T，5-溴胞嘧啶加至ISS的5′端而產(chǎn)生的含有至少一個(gè)TCG或T，5-溴胞嘧啶，G序列的多核苷酸。此類免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的例子包括但不限于SEQ ID NO1，14，19，46，24，11，18，12，13，28和36。
表6.人PBMC試驗(yàn)-IFN(pg/ml)


表6(續(xù))


表6(續(xù))


表6(續(xù))


表6(續(xù))

表6(續(xù))

表6(續(xù))


實(shí)施例3靈長(zhǎng)類動(dòng)物對(duì)抗原+ISS的免疫反應(yīng)檢測(cè)了狒狒對(duì)存在本發(fā)明的含有ISS的多核苷酸時(shí)施用的乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫反應(yīng)。
HBsAg為酵母中產(chǎn)生的重組HBsAg。在研究開(kāi)始時(shí)，狒狒的組中(每組5只)包括雄性和雌性狒狒，體重范圍為8-31kg(組平均體重為13-16kg)。
通過(guò)肌內(nèi)注射(IM)1ml體積的20μg HBsAg免疫狒狒三次，間隔期為兩個(gè)月(第0、2和4月)。如下所列出的，一些組還接受了ISS加HBsAg。
在免疫前和免疫后2周收集所有動(dòng)物的血。如下測(cè)定抗HBsAg IgG效價(jià)。用包被有來(lái)自人血漿的HBsAg的珠，使用AUSAB EIA商業(yè)試劑盒(Abbott Labs Cat.#9006-24和1459-05)分析狒狒血清樣本。一系列范圍在0-150mIU/ml的來(lái)自人血漿的HBsAg陽(yáng)性和陰性標(biāo)準(zhǔn)品與試驗(yàn)樣本一起進(jìn)行測(cè)試。生物素偶聯(lián)的HBsAg和兔抗-生物素-HRP偶聯(lián)的抗體用作檢測(cè)用的二級(jí)抗體復(fù)合體。該試驗(yàn)用鄰苯二胺(OPD)顯色，并在492nm處測(cè)定吸光值，在600nm處扣除本底(Quantum II分光光度計(jì)，Abbott Labs)。根據(jù)廠商確定的參數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用樣本的吸光值從此曲線確定相應(yīng)的抗HBsAg濃度，以毫國(guó)際單位/ml(mIU/ml)表示。對(duì)于稀釋的樣本，以樣本產(chǎn)生的導(dǎo)致0-150mIU/ml值的吸光度為基礎(chǔ)來(lái)定量，然后乘以稀釋系數(shù)可得到終濃度。
用單因素分差設(shè)計(jì)的比較(α＝0.05)，通過(guò)方差分析(NCSS97統(tǒng)計(jì)軟件程序，Kaysville，UT)對(duì)對(duì)數(shù)變換數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。認(rèn)為p≤0.05時(shí)具有顯著性。
試驗(yàn)動(dòng)物組如下進(jìn)行免疫組1-20μg HBsAg；組2-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO59(ISS)；組3-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO60(無(wú)ISS)；組4-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO38(ISS)；組5-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO2(ISS)；組6-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO18(ISS)；組7-20μg HBsAg+1000μg SEQ ID NO35(ISS)；研究結(jié)果如下表7所示。與僅施用HBsAg或施用HBsAg和無(wú)ISS的寡核苷酸相比，聯(lián)合施用包含ISS序列的寡核苷酸與HBsAg導(dǎo)致增高的抗HBsAg抗體效價(jià)。在成對(duì)比較中，組2(ISS寡核苷酸)中檢測(cè)到的免疫反應(yīng)與組3(無(wú)ISS寡核苷酸)中檢測(cè)到的免疫反應(yīng)有顯著性差異(第一次免疫后p＜0.05，第三次免疫后p＝0.06)。在與組2的成對(duì)比較中，組2和其它接受ISS寡核苷酸的組(組4、組5、組6和組7)在產(chǎn)生的免疫反應(yīng)方面無(wú)顯著性差異。表7.免疫后血液樣本中的抗HBsAg

與僅施用HBsAg(組1)的成對(duì)比較**p＜0.05；*p＝0.05
實(shí)施例4可生物降解的陽(yáng)離子微球的制備如下制備陽(yáng)離子聚(乳酸、羥基乙酸)(PLGA)微球。將本身粘度為0.41dl/g(0.1％，氯仿，25℃)的0.875g聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)5050聚合物以10％w/w的濃度溶解于7.875g二氯甲烷中，同時(shí)加入0.3g DOTAP。然后將澄清的有機(jī)相在500ml聚乙烯醇(PVA)水溶液(0.35％w/v)中用實(shí)驗(yàn)室混合器(Silverson L4R，Silverson Instruments)室溫下以4000轉(zhuǎn)/分鐘均化30分鐘而乳化。然后用通過(guò)混合器套管的循環(huán)熱水升高系統(tǒng)溫度至40℃。同時(shí)，將攪拌速率降低至1500轉(zhuǎn)/分鐘，并維持這些條件2小時(shí)以提取和蒸發(fā)二氯甲烷。用循環(huán)冷水將微球懸液冷卻至室溫。
室溫下8000轉(zhuǎn)/分鐘離心(Beckman Instruments)10分鐘分離微粒子并通過(guò)溫和的浴內(nèi)超聲處理將其重懸于去離子水中。該離心洗滌再重復(fù)兩次，以從粒子表面去除過(guò)量的PVA。將粒子的最終離心沉淀懸于約10ml水中，并過(guò)夜冷凍干燥。鑒定干燥陽(yáng)離子微球粉末的大小和表面電荷平均大小(所稱重的數(shù)目，μ)＝1.4；ζ電位(mV)＝32.4。
實(shí)施例5IMP/MC復(fù)合體對(duì)人細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)用人PBMC試驗(yàn)測(cè)試了多核苷酸單獨(dú)的免疫調(diào)節(jié)活性和與陽(yáng)離子PLGA微球(cPLGA)復(fù)合的多核苷酸的免疫調(diào)節(jié)活性。人PBMC試驗(yàn)如實(shí)施例2中所述進(jìn)行。陽(yáng)離子PLGA微球如實(shí)施例4中所述制備。測(cè)試了單獨(dú)的多核苷酸，或與cPLGA微球組合的多核苷酸。受試多核苷酸為SEQ IDNO59、60、1和132。所有多核苷酸含有100％的硫代磷酸酯鍵，并以20μg/ml的濃度試驗(yàn)。以100μg/ml的濃度加入cPLGA。當(dāng)多核苷酸與cPLGA復(fù)合進(jìn)行測(cè)試時(shí)，將多核苷酸和cPLGA室溫下預(yù)混合15分鐘，然后加至培養(yǎng)物中。SAC(PANSORBINCalBiochem，1/5000稀釋)和IMP(含ISS)(SEQ ID NO59)用作陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)照多核苷酸SEQ ID NO60和單獨(dú)的細(xì)胞用作陰性對(duì)照。還單獨(dú)測(cè)試了陽(yáng)離子PLGA。SAC含有金黃色葡萄球菌(Cowan I)細(xì)胞物質(zhì)。每次試驗(yàn)在四個(gè)健康供者中對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)試。
如下表8中所示，含有ISS的多核苷酸(IMP)，SEQ ID NO59、1和132單獨(dú)使用時(shí)可誘導(dǎo)IFN-γ和IFN-α。這些IMP與cPGLA陽(yáng)離子微載體(cat MC)的復(fù)合顯著增強(qiáng)了對(duì)這兩種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。對(duì)照多核苷酸SEQ ID NO60當(dāng)單獨(dú)使用或與cPLGA復(fù)合時(shí)，均既不誘導(dǎo)IFN-γ也不誘導(dǎo)IFN-α。
表8IFN-γ(pg/ml)IFN-α(pg/ml)樣本Ex1Ex2Ex3Ex4平均值Ex1Ex2Ex3Ex4平均值SEQ ID NO59 324 1036 529 653 636 9 432210843SEQ ID NO60 430 19483534 0 0 4 54 15SEQ ID NO1 287 278 2679 1057 1075 230 268 295 798398cat MC 9 5 597236 7 0 9811254SEQ ID 601 358 1474 1941 1093 115 116 515 1298 511NO59/cat MCSEQ ID 1313466534 5 0 0 43 12NO60/cat MCSEQ ID NO1/cat 1645 770 3322 3355 2273 1896 1078 2691 1728 1848MC僅細(xì)胞 114 0 1378 2 3 64 19表8(續(xù))IFN-γ(pg/ml) IFN-α(pg/ml)樣本Ex1Ex2Ex3Ex4平均值Ex1Ex2Ex3Ex4平均值SEQ ID NO591508344144104525 50 172 234 72 132SEQ ID NO60124 24 16 40 512 32 474 2 128SEQ ID NO132 29289363801081088 4968 72 129011821878cat MC 32 8 72 1205810 2 60 92 41SEQ ID 16409689602300 1467 948260 12981470994NO59/cat MCSEQ ID 72 16 32 316109 14 14 22 2 13NO60/cat MCSEQ ID 10604584 5172 1188 3001 5292 1050377232143332NO132/cat MC僅細(xì)胞 44 24 20 28 2920 2002 2 56為了清楚和理解的目的，對(duì)前述發(fā)明以闡述和實(shí)施例方式較詳細(xì)地進(jìn)行了描述，但對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)講，顯然可實(shí)施某些變化和改變。因此，詳述和實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明范圍在所附權(quán)利要求書(shū)中描述。
權(quán)利要求
1.一種包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中ISS包括下式5′-X1X2AX3CGX4TCG-3′(SEQ ID NO62)其中X1為T、G、C或Z，其中Z為5-溴胞嘧啶；其中X2為T、G、A或U；其中X3為T、A或C；其中X4為T、G或U；且其中ISS不為5′-TGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO63)或5′-GGAACGTTCG-3′(SEQ ID NO64)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中ISS選自TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)、TGACCGTTCG(SEQ ID NO68)、TGATCGGTCG(SEQ ID NO69)、TGATCGTTCG(SEQ ID NO70)、TGAACGGTCG(SEQ ID NO71)、GTAACGTTCG(SEQ ID NO72)、GTATCGGTCG(SEQ ID NO73)、GTACCGTTCG(SEQ ID NO74)、GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)、ZGACCGTTCG(SEQ ID NO76)，其中Z為5-溴胞嘧啶、CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)、CGACCGTTCG(SEQ ID NO78)、ZGAACGTTCG(SEQ ID NO79)，其中Z為5-溴胞嘧啶、TTAACGUTCG(SEQ ID NO82)、TUAACGUTCG(SEQ ID NO81)和TTAACGTTCG(SEQ ID NO80)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中ISS選自TGAACGUTCG(SEQ ID NO67)、GAACCGTTCG(SEQ ID NO75)和CGAACGTTCG(SEQ ID NO77)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19和SEQ ID NO132的序列。
5.一種包含免疫刺激性序列(ISS)的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中ISS包含下式5′-X1X2AX3ZGX4TCG-3′(SEQ ID NO65)其中Z為5-溴胞嘧啶；其中X1為T、G、C或Z，其中Z為5-溴胞嘧啶；其中X2為T、G、A或U；其中X3為T、A或C；其中X4為T、G或U；且其中ISS不為5′-TGAAZGTTCG-3′(SEQ ID NO66)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中ISS選自TGAAZGUTCG(SEQ ID NO83)、TGACZGTTCG(SEQ ID NO84)、TGATZGGTCG(SEQ ID NO85)、GTATZGGTCG(SEQ ID NO86)、GTACZGTTCG(SEQ ID NO87)、GAACZGTTCG(SEQ ID NO88)、GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)、ZGACZGTTCG(SEQ ID NO90)、CGAAZGTTCG(SEQ ID NO91)、ZGAAZGTTCG(SEQ ID NO92)、ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)、TTAAZGUTCG(SEQ ID NO94)、TUAAZGUTCG(SEQ ID NO95)和TTAAZGTTCG(SEQ ID NO96)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中ISS選自ZGAAZGUTCG(SEQ ID NO93)和GAAAZGUTCG(SEQ ID NO89)，其中Z為5-溴胞嘧啶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO35和SEQ ID NO36的序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還包含至少一個(gè)TCG序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中TCG序列鄰近于ISS的5’端。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還包含TCGA序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還包含至少一個(gè)T，5-溴胞嘧啶，G序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中T，5-溴胞嘧啶，G序列鄰近于ISS的5’端。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸還包含T，5-溴胞嘧啶，G，A序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的長(zhǎng)度小于約150個(gè)堿基或堿基對(duì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的長(zhǎng)度小于約100個(gè)堿基或堿基對(duì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的長(zhǎng)度小于約50個(gè)堿基或堿基對(duì)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸為單鏈。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸為雙鏈。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸是經(jīng)穩(wěn)定化處理的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸，其中該多核苷酸包含硫代磷酸酯鍵。
22.包含根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸的免疫調(diào)節(jié)性組合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含可藥用賦形劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含抗原。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含可藥用賦形劑。
26.一種免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸/微載體(IMP/MC)復(fù)合體，其包含連接至可生物降解的微載體(MC)上的根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中該MC的尺寸小于10μm。
27.一種免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸/微載體(IMP/MC)復(fù)合體，其包含連接至可生物降解的微載體(MC)上的根據(jù)權(quán)利要求5的多核苷酸，其中該MC的尺寸小于10μm。
28.一種調(diào)節(jié)個(gè)體免疫反應(yīng)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以足以調(diào)節(jié)所述個(gè)體的免疫反應(yīng)的量施與個(gè)體。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體患有與Th2-類免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述與Th2-類免疫反應(yīng)相關(guān)的疾病為變態(tài)反應(yīng)或哮喘。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所述個(gè)體患有感染性疾病。
32.升高個(gè)體的γ-干擾素(IFN-γ)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以足以升高所述個(gè)體的IFN-γ的量施與該個(gè)體。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述個(gè)體患有特發(fā)性肺纖維化。
34.升高個(gè)體的α-干擾素(IFN-α)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以足以升高所述個(gè)體的IFN-α的量施與該個(gè)體。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述個(gè)體患有病毒性感染。
36.升高個(gè)體的α-干擾素(IFN-α)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求9的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以足以升高所述個(gè)體的IFN-α的量施與該個(gè)體。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述個(gè)體患有病毒性感染。
38.升高個(gè)體的α-干擾素(IFN-α)的方法，其包括將根據(jù)權(quán)利要求11的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸以足以升高所述個(gè)體的IFN-α的量施與該個(gè)體。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述個(gè)體患有病毒性感染。
40.改善個(gè)體的感染性疾病的癥狀的方法，其包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸施與個(gè)體，其中有效量為足以改善所述感染性疾病的癥狀的量。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述感染性疾病為由細(xì)胞病原體引起的感染性疾病。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述由細(xì)胞病原體引起的感染性疾病選自分枝桿菌病、瘧疾、利什曼病、弓形體病、血吸蟲(chóng)病和枝睪吸蟲(chóng)病。
43.改善個(gè)體的IgE-相關(guān)疾病的癥狀的方法，其包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸施與患有IgE-相關(guān)疾病的個(gè)體，其中有效量為足以改善所述IgE-相關(guān)疾病的癥狀的量。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述IgE-相關(guān)疾病為變態(tài)反應(yīng)。
45.權(quán)利要求43的方法，其中所述IgE-相關(guān)疾病為變態(tài)反應(yīng)相關(guān)疾病。
46.權(quán)利要求43的方法，其中所述IgE-相關(guān)疾病為哮喘。
47.一種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸。
48.權(quán)利要求47的試劑盒，其還包含使用免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的說(shuō)明書(shū)。
全文摘要
本發(fā)明提供了免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸和用該免疫調(diào)節(jié)性多核苷酸對(duì)個(gè)體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的方法。
文檔編號(hào)A61P33/12GK1483079SQ01821490
公開(kāi)日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2001年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月27日
發(fā)明者K·L·費(fèi)倫, D·迪納, K L 費(fèi)倫 申請(qǐng)人:戴納瓦克斯技術(shù)公司