專利名稱：胎盤來源間充質干細胞及其制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及胎盤來源間充質干細胞及其制備，屬于干細胞與組織工程領域。
背景技術：
種子細胞來源是組織工程和細胞治療的首要問題。由于自體組織細胞來源少、擴增困難，體外培養(yǎng)時容易丟失表型，因此近年來人們逐漸把注意力投注在干細胞上。這些細胞在體外具有一定的自我更新能力，能在特定的誘導條件下分化為一種、多種，甚至人體所有的細胞類型，因而顯示了很好的臨床應用前景。目前為止分離獲得的干細胞包括兩種，即胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞具有全能的分化能力和無限的增殖能力，但受倫理學和本身在分離、培養(yǎng)、誘導分化和免疫原性等方面人類認識和控制上的不足，短期內無法應用于臨床。成體干細胞是從成體的組織中分離獲得的一類干細胞，這些細胞具有一定的體外增殖能力，在一定的條件下能在體外或體內分化為一種或多種細胞類型。目前研究最多的是骨髓來源的間充質干細胞，該細胞取材相對較為容易。其他組織，包括脂肪、肌肉、神經、牙髓等成體組織中也發(fā)現(xiàn)有干細胞的存在，但取材和分離相對而言較為困難。并且這些細胞在取材的時候都會對患者造成創(chuàng)傷，因而不容易被患者接受；體外擴增條件也不容易控制、花費大。另外一個不容忽略的問題是，這些細胞都具有一定的抗原性，異體移植時會帶來免疫排斥反應問題，因此在臨床應用時會受到限制。基于此，尋找一種收獲量大、免疫原性小、而又容易獲得的干細胞來源更具有實際應用價值。
胎盤是胎兒的附屬物，也是一個暫時性器官，在胎兒娩出后即完成了歷史使命，通常都被遺棄處理。胎盤本身結構復雜，由血管系統(tǒng)、間充質成分和滋養(yǎng)細胞組成。除具有母兒物質交換功能外，還是一個重要的分泌器官，執(zhí)行著極其復雜的生理功能。近年研究表明，胎盤組織中具有與骨髓間充質干細胞類似的貼壁細胞。國外Jaroscak等(2000年)報道從凍存的胎盤組織中分離培養(yǎng)出異質性貼壁細胞。國內張毅等報道采用酶消化法從胎盤組織中獲得貼壁細胞作為造血干細胞的支持細胞。因此，胎盤組織有望成為間充質干細胞的潛在的豐富的來源。目前國內外僅有零星文獻涉及胎盤來源貼壁細胞的小量分離，主要用于造血支持研究，而對胎盤來源間充質干細胞的規(guī)?；蛛x、純化和擴增方法則缺乏的詳細的技術資料。本發(fā)明的目的在于公開一種胎盤來源的間充質干細胞以及從胎盤組織中大規(guī)模獲取間充質干細胞的方法，具體涉及細胞的分離、純化、鑒定和擴增。

發(fā)明內容
本發(fā)明是一種胎盤來源的間充質干細胞及其制備方法。該細胞取自產后廢棄的健康胎盤組織，該細胞群具有與骨髓來源的間充質干細胞類似的生物學特性，是細胞治療和組織工程研究與應用潛在的細胞來源。其制備方法如下1)對新鮮娩出胎盤立即進行放血、灌注，以去除血細胞和組織碎片；2)持續(xù)灌注，或將胎盤小葉剪碎，用膠原酶消化，收集細胞成分；3)采用免疫磁珠吸附法或Percoll密度梯度離心法收集單個核細胞；4)采用流式細胞儀或體外誘導分化法鑒定所獲得細胞群的表型和細胞周期特征；5)測定細胞倍增時間和生長曲線；6)采用常規(guī)的體外誘導體系，體外誘導胎盤來源的間充質干細胞分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞的能力。
7)將胎盤來源的間充質干細胞與同種異體的外周血T-淋巴細胞共同培養(yǎng)，檢測胎盤來源的間充質干細胞是否刺激T-淋巴細胞增殖，是否抑制同種異體樹突狀細胞介導，不依賴于分泌因子的通過細胞機制產生的T-淋巴細胞增殖；將胎盤來源的間充質干細胞注入大鼠皮下，檢測免疫反應情況，以確定該細胞的免疫原性。
8)采用生物反應器對所獲得的細胞進行規(guī)?；瘮U增。
有益效果本發(fā)明從產后廢棄的胎盤組織中提取間充質干細胞。該細胞取材容易，產量高，體外容易擴增，擴增過程中能夠保持細胞表型和多向分化能力。并且，該細胞群還具有較低的免疫原性，因而是細胞治療、基因治療，以及骨與軟骨組織工程理想的種子細胞來源，具有廣闊的臨床應用前景。
具體實施例方式
實施例1灌注法獲得胎盤來源間充質干細胞胎盤娩出后立即置于無菌托盤或容器中，經臍動脈注入含有抗凝劑和抗生素的平衡鹽溶液，放血，并開始灌注?？鼓齽┛梢允?~100u/mL的肝素，抗生素可以是100u/mL的青鏈霉素。收集灌注液，離心獲得細胞成分，再將細胞成分重新懸浮，用密度為1.073g/mL的percoll，以500g離心力離心30分鐘，收獲界面細胞層，PBS洗滌后接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR標記的免疫磁珠來分離帶有某種特殊標記的間充質干細胞。
實施例2酶消化法獲得胎盤來源間充質干細胞胎盤娩出后立即置于無菌托盤或容器中，經臍動脈注入含有抗凝劑和抗生素的平衡鹽溶液，放血，并開始灌注?？鼓齽┛梢允?~100u/mL的肝素，抗生素可以是100u/mL的青鏈霉素。初步灌注后無菌剪取胎盤小葉，用胰蛋白酶或膠原酶消化胎盤組織，獲得細胞懸液，再將細胞懸液過細胞篩，除去組織碎片和血細胞，獲得的細胞重新懸浮，用密度為1.073g/mL的percoll，以500g離心力離心30分鐘，收獲界面細胞層，PBS洗滌后接種培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板，或直接用于其它目的。也可以用D7-FIB或NGFR標記的免疫磁珠來分離帶有某種特殊標記的間充質干細胞。
實施例3胎盤來源間充質干細胞的鑒定根據文獻報道體外誘導骨髓間充質干細胞分化的方法誘導胎盤來源的間充質干細胞分化為成骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞。采用流式細胞儀檢測胎盤來源間充質干細胞的表型，如CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR等。同時檢測細胞周期，確定處于G0-G1期細胞的比例。
結果顯示，經過體外誘導后的胎盤來源的間充質干細胞可以分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞。流式細胞以檢測表明該細胞CD29、CD44、CD105、CD166陽性，CD34、CD45、HLA-DR陰性。處于G0-G1期的細胞占95％以上。
權利要求
1.一種胎盤間充質干細胞的制備方法，其特征在于應用灌注法或酶消化法從胎盤組織中分離間充質干細胞。所獲得的細胞具有與骨髓間充質干細胞相似的特征，如自我更新能力和多向分化潛力。
2.權利要求1中所述的胎盤可以是人自然分娩或剖腹產后廢棄的胎盤，也可以是哺乳動物的胎盤。產婦或動物必須經過健康檢查，無遺傳病、感染性疾病，不攜帶病原。胎盤本身必須新鮮，或放血后4℃保存2-24小時，或冷凍保存后仍有活力，同時離體后保持清潔無污染。
3.權利要求1中所述的灌注法是指在胎兒娩出后立即放血，并經臍動脈插管進行灌注。灌注液可以是生理鹽水或PBS類的平衡鹽溶液，也可以是無血清的細胞培養(yǎng)基。灌注液中添加抗凝劑和抗生素?？鼓齽┛梢允歉嗡?。抗生素可以是青霉素和鏈霉素，也可以是慶大霉素。
4.權利要求1中所述的酶消化法是指應用膠原酶I，濃度可以是0.5％-1.5％，或應用胰蛋白酶，濃度可以是0.1％-1％，胰蛋白酶中可以加入0.01％-0.02％的EDTA。
5.權利要求1中所述的胚胎來源的間充質干細胞表面標志CD29、CD44、CD105、CD166陽性，CD34、CD45、HLA-DR陰性。處于G0-G1期的細胞占95％以上。細胞經相應的誘導液處理后可以分化為成骨細胞、軟骨細胞或脂肪細胞等細胞類型。
6.權利要求1中所述的胎盤來源的間充質干細胞可以通過percoll密度梯度離心法或免疫磁珠分離法得到純化。
7.權利要求6中所述的percoll的密度可以是1.073g/ml。
8.權利要求6中所述的免疫磁珠法可以是D7-FIB標記，也可以是NGFR標記。
9.權利要求1中所述的胎盤來源間充質干細胞可以用于細胞治療、基因治療，也可以作為種子細胞用于組織工程。
全文摘要
本發(fā)明涉及胎盤來源間充質干細胞及其制備，屬于干細胞和組織工程領域。胎盤從子宮娩出后立即放血、灌注。然后采用持續(xù)灌注或膠原酶消化法獲得單細胞懸液，后者經密度梯度離心法或免疫磁珠分離法獲得間充質干細胞。所獲得的間充質干細胞具有與骨髓來源的間充質干細胞類似的體外增殖潛力和多向分化潛力。該細胞群還具有免疫原性較低的特點，是組織工程和細胞治療潛在的種子細胞來源，具有重要的臨床意義。
文檔編號A61K48/00GK1746297SQ20041000953
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月9日 優(yōu)先權日2004年9月9日
發(fā)明者王常勇, 郭希民, 周曉東, 段翠密, 江紅, 董靈芝, 李晶 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所