專利名稱：引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法和試劑盒、引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和 /或治療 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法和試劑盒、引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療藥、以及對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
α1IV膠原(collagen)(Col4)是存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞與中膜平滑肌細(xì)胞之間的血管基底膜的主要構(gòu)成成分，Col4的過(guò)量產(chǎn)生在糖尿病性血管損害、動(dòng)脈硬化、老化相關(guān)疾病中起到?jīng)Q定性作用。另外，持續(xù)的高血糖狀態(tài)被認(rèn)為是糖尿病的并發(fā)癥的主要原因(非專利文獻(xiàn)1和2)。已知過(guò)量的晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end productsAGEs)通過(guò)高血糖存在，在血管和其它細(xì)胞中誘導(dǎo)各種事件，認(rèn)為可能是通過(guò)多種AGEs受體與病情相關(guān)(非專利文獻(xiàn)3、4和5)。
近年來(lái)，認(rèn)為AGEs不僅與糖尿病合并癥有關(guān)，而且還與由老化引起的動(dòng)脈硬化有關(guān)(非專利文獻(xiàn)6和7)。進(jìn)而，切斷型的可溶性AGEs受體被報(bào)道為抑制糖尿病性動(dòng)脈硬化的進(jìn)展(非專利文獻(xiàn)8)。
糖尿病性腎病的進(jìn)展的特征在于，在形態(tài)學(xué)上腎小球基底膜(GBM)的肥厚和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的增大。由于Col4為腎小球基底膜肥厚和細(xì)胞外基質(zhì)增大的主要構(gòu)成成分，所以弄清Col4在糖尿病的狀態(tài)中怎樣被轉(zhuǎn)錄控制比較重要。Col4的雙向性130bp的啟動(dòng)子(promoter)具有已知與幾種DNA結(jié)合蛋白發(fā)生反應(yīng)的大的莖-環(huán)(stem-loop)結(jié)構(gòu)(CIV)(非專利文獻(xiàn)9)。本發(fā)明人等在以前的報(bào)道中顯示，利用凝膠遷移檢測(cè)(gel shift assay)，未知的蛋白質(zhì)只在通過(guò)向AGEs的暴露來(lái)誘導(dǎo)Col4的情況下才會(huì)結(jié)合CIV(非專利文獻(xiàn)10)。
腎小球系膜細(xì)胞的增殖和腎小球硬化均為進(jìn)行性腎小球損害的主要病理學(xué)特征。在很多伴隨腎小球硬化的疾病中可見腎小球系膜細(xì)胞的增殖，這表明在進(jìn)行性腎小球損害中，該過(guò)程很重要(非專利文獻(xiàn)11(A1)、非專利文獻(xiàn)12(A2))。這兩個(gè)事件幾乎在所有的腎小球疾病中均可見到，但尚不清楚腎小球系膜細(xì)胞的增殖到底怎樣參與腎小球硬化的進(jìn)展。
體內(nèi)(in vivo)和體外(in vitro)均顯示血小板來(lái)源增殖因子(PDGF)為腎小球系膜細(xì)胞的重要分裂促進(jìn)因子(非專利文獻(xiàn)13(A3)、非專利文獻(xiàn)14(A4))。對(duì)于PDGF起到腎小球硬化的進(jìn)展的關(guān)鍵作用這一點(diǎn)，不僅用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?model)，而且在人的腎小球疾病中也有幾個(gè)證據(jù)(非專利文獻(xiàn)13(A3))。PDGF-BB也被報(bào)道成在腎小球系膜細(xì)胞的增殖中有重要作用(非專利文獻(xiàn)15(A5))，在殘存腎模型中，腎小球硬化持續(xù)進(jìn)展(非專利文獻(xiàn)16(A6))。在大鼠的腎小球腎炎模型中，給針對(duì)PDGF的中和抗體后，腎小球系膜細(xì)胞的增殖和腎小球硬化這雙方均顯著恢復(fù)(非專利文獻(xiàn)17(A7))，但幾乎不清楚抑制細(xì)胞增殖會(huì)抑制腎小球硬化病變的機(jī)制。
非專利文獻(xiàn)1The Diabetes Control and Complications Trial ResearchGroup.N.Engl.J.Med.329，977-986(1993).
非專利文獻(xiàn)2UK Prospective Diabetes Study(UKPDS)Group.Lancet352，837-853(1998)非專利文獻(xiàn)3H.Vlassara，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，11704-11708(1994).
非專利文獻(xiàn)4M.Brownlee，A.Cerami，H.Vlassara，N.Engl.J.Med.318，1315-1321(1988).
非專利文獻(xiàn)5T.Doi，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，2873-2877(1992).
非專利文獻(xiàn)6H.Vlassara，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，12043-12047(1992).
非專利文獻(xiàn)7M.S.Huijberts，et al.，J.Clin.Invest.92，1407-1411(1993).
非專利文獻(xiàn)8S.L.Park，et al.，Nature Med.9，1025-1031(1998)非專利文獻(xiàn)9L.A.Bruggeman，P.D.Burbelo，Y.Yamada，P.E.Klotman，Oncogene7，1497-1502(1992).
非專利文獻(xiàn)10N.Iehara，H.Takeoka，Y.Yamada，T.Kita，T.Doi，Kidney Int.50，1166-1172(1996).
非專利文獻(xiàn)11Fogo A，Ichikawa I.Evidence for the central role ofglomerular growth promoters in the development of sclerosis.Semin Nephrol.1989 Dec；9(4)329-42非專利文獻(xiàn)12Striker LJ，Doi T，Elliot S，Striker GE.The contributionof glomerular mesangial cells to progressive glomerulosclerosis.SeminNephrol.1989 Dec；9(4)318-28.Review.
非專利文獻(xiàn)13Floege J，Johnson RJMultiple roles for platelet-derivedgrowth factor in renal disease.Miner Electrolyte Metab 21271-282，1995非專利文獻(xiàn)14Doi T，Vlassara H，Kirstein M，Yamada Y，Striker GE，Striker LJReceptor-specific increase in extracellular matrix production bymesangial cells by advanced glycosylation end products is mediated viaplatelet-derived growth factor.Proc Natl Acad Sci USA 892873-2877，1992非專利文獻(xiàn)15Barnes JL，Hevey KA.Glomerular mesangial cellmigration in response to platelet-derived growth factor.Lab Invest.1990Mar；62(3)379-82.
非專利文獻(xiàn)16Floege，J.，Burns，M.W.，Alpers，C.E.，Yoshimura，A.，Pritzl，P.，Gordon，K.，Seifert，R.A.，Bowen-Pope，D.F.，Couser，W.G.，andJohnson，R.J.Glomerular cell proliferation and PDGF expression precedeglomerulosclerosis in the remnant kidney model.Kidney Int.41297-309，1992非專利文獻(xiàn)17Johnson，R.J.，Raines，E.W.，F(xiàn)loege，J，et alInhibitionof mesangial cell proliferation and matrix expansion in glomerulonephritis inthe rat by antibody to platelet-derived growth factor.J Exp Med 1751413-1416，1992

發(fā)明內(nèi)容
糖尿病性腎病為晚期腎功能衰竭的主要原因。IV型膠原是血管基底膜或腎小球的腎小球系膜基質(zhì)的主要構(gòu)成成分，在糖尿病中的血管損害中起到重大作用，在糖尿病狀態(tài)下，什么與IV型膠原的過(guò)量產(chǎn)生直接相關(guān)尚不清楚。本發(fā)明的目的在于，鑒定與IV型膠原的過(guò)量產(chǎn)生直接相關(guān)的物質(zhì)，顯示該物質(zhì)作為糖尿病性腎病的病因起到?jīng)Q定性作用。另外，本發(fā)明的目的還在于，提供一種利用了與IV型膠原的過(guò)量產(chǎn)生直接相關(guān)的物質(zhì)的糖尿病性腎病的檢測(cè)方法和試劑盒。進(jìn)而，本發(fā)明的目的還在于，提供一種具有對(duì)與IV型膠原的過(guò)量產(chǎn)生直接相關(guān)的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)的用途。進(jìn)而，本發(fā)明的目的還在于，提供一種鑒定在糖尿病性腎病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)的方法和試劑盒、鑒定在抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖中有效的物質(zhì)的方法和試劑盒、以及鑒定在抑制α1IV型膠原的表達(dá)中有效的物質(zhì)的方法和試劑盒。
另外，本發(fā)明的目的在于，在大鼠的腎小球腎炎中顯示對(duì)PDGF-B鏈引起的活化進(jìn)行抑制的PDGFβ受體抗體(APB5)的用藥效果，在體內(nèi)和體外顯示PDGF信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)腎小球細(xì)胞增殖和腎小球硬化兩方面。本發(fā)明在目的還在于，提供一種利用了與腎小球細(xì)胞增殖和腎小球硬化相關(guān)的物質(zhì)的、引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法和試劑盒。進(jìn)而，另外，本發(fā)明在目的還在于，提供一種具有對(duì)與腎小球細(xì)胞增殖和腎小球硬化相關(guān)的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)的用途。進(jìn)而，另外本發(fā)明在目的在于，提供一種鑒定在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)的方法和試劑盒、鑒定在抑制細(xì)胞外基質(zhì)的增殖中有效的物質(zhì)的方法和試劑盒、以及鑒定在抑制α1IV型膠原的表達(dá)中有效的物質(zhì)的方法和試劑盒。
本發(fā)明人等鑒定了作為與IV型膠原的過(guò)量產(chǎn)生直接相關(guān)的物質(zhì)的Smad1，并揭示了Smad1作為糖尿病性腎病的病因具有決定性作用。另外，本發(fā)明人等研究了正常人和糖尿病性腎病患者的腎小球中的Smad1和活化素(activin)受體樣激酶1(ALK1)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在糖尿病性腎病患者中Smad1和ALK1的表達(dá)與硬化性病變的嚴(yán)重程度成比例，在正常人中幾乎未見Smad1和ALK1的表達(dá)。進(jìn)而，還發(fā)現(xiàn)在AGEs的刺激下，控制Smad1表達(dá)的BMP2和4的表達(dá)增加。
不過(guò)，在很多伴隨腎小球硬化的疾病人群中，可見腎小球系膜細(xì)胞的增殖，這表明在進(jìn)行性腎小球損害中，該過(guò)程很重要，但細(xì)胞增殖與腎小球硬化之間的關(guān)系不明。最近，本發(fā)明人等揭示了在糖尿病性腎小球硬化中，作為腎小球硬化的主要構(gòu)成成分的IV型膠原(Col4)的過(guò)量表達(dá)由Smad1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。在本研究中，本發(fā)明人等在大鼠的腎小球腎炎中顯示了對(duì)由PDGF-B鏈引起的活化進(jìn)行抑制的PDGFβ受體抗體(APB5)的給藥效果，在體內(nèi)和體外揭示了PDGF信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)腎小球細(xì)胞增殖和腎小球硬化兩方面。
腎小球系膜增殖性腎小球腎炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?Thy1 GN)被抗大鼠Thy-1.1單克隆抗體的一次靜脈注射所誘發(fā)。在Thy1 GN中，腎小球系膜細(xì)胞的增殖和Col4的表達(dá)在第六天變?yōu)樽畲蟆?duì)Smad1、磷酸化Smad1(pSmad1)、磷酸化STAT3(pSTAT3)進(jìn)行免疫組織染色的結(jié)果，腎小球的Smad1的表達(dá)峰值在第六天，與腎小球系膜增殖的峰值一致。腎小球的pSmad1的表達(dá)從Thy1 GN的第一天開始上升，發(fā)病后第四天成為最大。在用APB5處置后的組中，腎小球系膜細(xì)胞增殖和腎小球硬化均有意義地減少。Smad1、pSmad1、pSTAT3的表達(dá)也在通過(guò)APB5的給藥進(jìn)行研究的所有方面存在有意義的減少。APB5處理在體外隨著pSmad1、pSTAT3的表達(dá)降低或Col4蛋白的表達(dá)減少而使腎小球系膜細(xì)胞的增殖減少。在培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞中，顯性陰性的STAT3的導(dǎo)入使Col4的表達(dá)有意義地降低。這些數(shù)據(jù)表明STAT3和Smad1的活化與從腎小球系膜細(xì)胞增殖到腎小球硬化的進(jìn)展相關(guān)。
本發(fā)明正是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的發(fā)明。
本發(fā)明的目的如下所述。
(1)引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法，其中，包括測(cè)定生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1(activin receptor-like kinase 1)、活化素受體樣激酶3(activinreceptor-like kinase 3)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein)中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)。
(2)對(duì)引起硬化的增殖性疾病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法，其中，包括測(cè)定生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)。
(3)用于對(duì)引起硬化的增殖性疾病進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒，其中，含有用于對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
(4)用于對(duì)引起硬化的增殖性疾病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)的試劑盒，其，含有用于對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
(5)糖尿病性腎病的檢測(cè)方法，其中，包括對(duì)生物體樣品中的Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。
(6)對(duì)糖尿病性腎病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法，其中，包括對(duì)生物體樣品中的Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。
(7)用于檢測(cè)糖尿病性腎病的試劑盒，其中含有用于對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
(8)用于評(píng)價(jià)糖尿病性腎病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性的試劑盒，其中含有用于對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
(9)引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療藥，其中，作為有效成分，含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)。
(10)抑制細(xì)胞外基質(zhì)的增殖的藥劑，其中，作為有效成分，含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)。
(11)抑制α1IV型膠原的表達(dá)的藥劑，其中，作為有效成分，含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)。
(12)對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法，其中，包括判定受檢物質(zhì)是否對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制。
(13)對(duì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法，其中，包括判定受檢物質(zhì)是否對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制。
(14)對(duì)在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法，其中，包括判定受檢物質(zhì)是否對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制。
(15)用于對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒，其中，含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
(16)用于對(duì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒，其中，含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
(17)用于對(duì)在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒，其中，含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
通過(guò)本發(fā)明，作為與α1IV型膠原的過(guò)量產(chǎn)生直接相關(guān)的物質(zhì)，Smad1被鑒定，表明Smad1作為糖尿病性腎病的病因具有決定性的作用。這樣，可以檢測(cè)出糖尿病性腎病，進(jìn)而提供了糖尿病性腎病的預(yù)防和/或治療藥、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的增殖的藥劑、抑制α1IV型膠原的表達(dá)的藥劑。另外，通過(guò)本發(fā)明，還提供了對(duì)在糖尿病性腎病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、對(duì)在抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、以及對(duì)在抑制α1IV型膠原的表達(dá)中有效的物質(zhì)在進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
另外，通過(guò)本發(fā)明，還揭示了STAT3和Smad1的活化是調(diào)節(jié)進(jìn)行性腎小球損害時(shí)的兩個(gè)現(xiàn)象、細(xì)胞增殖和腎小球硬化的相互作用的關(guān)鍵的途徑。這樣，可以檢測(cè)出引起硬化的增殖性疾病，進(jìn)而，提供了引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療藥、抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖的藥劑、抑制α1IV型膠原的表達(dá)的藥劑。另外，通過(guò)本發(fā)明，還提供了對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、對(duì)在抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、以及對(duì)在抑制α1IV型膠原的表達(dá)中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
本說(shuō)明書包括了作為本發(fā)明的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本國(guó)專利申請(qǐng)、特愿2003-319538號(hào)說(shuō)明書和/或附圖中記載的內(nèi)容。


圖1表示通過(guò)Smad1活化Col4啟動(dòng)子。(A)使用AGEs存在下或BSA存在下(對(duì)照)的培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，使用圖示的抗體，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀法。使用針對(duì)CIV-1模體的引物進(jìn)行PCR。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)中的1次結(jié)果。(B)將CMV-LUC作為內(nèi)部對(duì)照，將加入了CIV-1-LacZ報(bào)告質(zhì)粒和野生型Smad1的載體或單純載體(mock)同時(shí)導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞中。利用Western印跡法并通過(guò)抗Smad1抗體和抗pSmad1抗體，分析細(xì)胞提取液。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)的1次結(jié)果。(C)48小時(shí)后，溶解培養(yǎng)細(xì)胞，檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性和螢光素酶活性。測(cè)定各進(jìn)行3次，顯示SD。
圖2表示通過(guò)暴露于AGEs而進(jìn)行動(dòng)態(tài)變動(dòng)的Smad1表達(dá)。(A)用RNA酶保護(hù)檢測(cè)(RNase protection assay)觀察被暴露于AGEs或BSA中的腎小球系膜細(xì)胞的Smad1和Col4mRNA表達(dá)的經(jīng)時(shí)變化。持續(xù)暴露于AGEs使Smad1的表達(dá)持續(xù)亢進(jìn)，Col4的表達(dá)也平行增加。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)的1次結(jié)果。(B)在AGEs或BSA存在下培養(yǎng)72小時(shí)、120小時(shí)后腎小球系膜細(xì)胞的免疫螢光照片。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)的1次結(jié)果。(C)用Western印跡觀察在AGEs或BSA存在下已進(jìn)行72小時(shí)培養(yǎng)時(shí)的Smad1和pSmad1。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)的1次結(jié)果。
圖3表示針對(duì)腎小球系膜細(xì)胞中的Smad1的特異性反義寡(脫氧)核苷酸的效果。(A)72小時(shí)的AGEs處理后，用針對(duì)Samd1的反義寡(脫氧)核苷酸、和4個(gè)錯(cuò)配寡(脫氧)核苷酸(對(duì)照)處理腎小球系膜細(xì)胞16小時(shí)。用抗Smad1抗體(綠)對(duì)用反義寡(脫氧)核苷酸處理過(guò)的細(xì)胞的腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行免疫螢光染色，進(jìn)而進(jìn)行DAPI染色(藍(lán))。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)的1次結(jié)果。(B)向AGEs暴露后的腎小球系膜細(xì)胞中導(dǎo)入針對(duì)Smad1的反義寡(脫氧)核苷酸和4個(gè)錯(cuò)配寡(脫氧)核苷酸(對(duì)照)。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)的1次結(jié)果。(C)針對(duì)Smad1的反義寡(脫氧)核苷酸抑制Smad1的表達(dá)亢進(jìn)，但同時(shí)也抑制Col4的表達(dá)亢進(jìn)。顯示反復(fù)進(jìn)行3次的實(shí)驗(yàn)的1次結(jié)果。
圖4表示在糖尿病性腎病的人中檢測(cè)出Smad1和ALK1的表達(dá)的結(jié)果。使用抗Smad1抗體和抗ALK1抗體對(duì)5例糖尿病、3例非糖尿病的腎小球進(jìn)行免疫組織染色。Smad1和ALK1糖尿病的腎小球中的的表達(dá)顯著可見，而在非糖尿病的腎小球未見。用蘇木精對(duì)所有的切片進(jìn)行對(duì)比染色。照片的放大率全部為400倍。
圖5表示將在AGEs存在下培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)量與BSA存在下的培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行比較的結(jié)果。
圖6表示用Western印跡法測(cè)定糖尿病性腎病患者的尿中BMP2的結(jié)果。
圖7表示用Western印跡法測(cè)定在通過(guò)TGF-β信號(hào)的慢性刺激下BMP2和BMP4蛋白的表達(dá)的結(jié)果。
圖8是根據(jù)實(shí)施例1的結(jié)果的信號(hào)傳導(dǎo)通路的模式圖。
圖9表示Thy1 GN大鼠形成彌漫性腎小球系膜基質(zhì)的增殖和腎小球系膜區(qū)域的擴(kuò)大的顯微鏡像。在使用抗Col4抗體的免疫組織染色中，在Thy1 GN的腎小球的已擴(kuò)大的腎小球系膜區(qū)域，可見ColIV過(guò)量表達(dá)。APB5使腎小球系膜的增殖和ColIV表達(dá)減少。在Thy1 GN腎小球中，PDGF-B鏈和PDGFβ受體也為顯著陽(yáng)性，而APB5也使它們的過(guò)量表達(dá)減少。A-CPAM、D-FColIV、G-HPDGF-B鏈、J-KPDGFβ受體、A、D、G、J正常對(duì)照大鼠、B、E、H、J第六天的疾病對(duì)照大鼠、C、F、I、L第六天的APB5處置大鼠圖10表示Thy GN中的組織學(xué)變化和APB5給藥效果的定量。A腎小球細(xì)胞數(shù)。在Thy1 GN組中可見腎小球細(xì)胞數(shù)的增加。BThy1 GN的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。APB5處理過(guò)的腎小球的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在任何調(diào)查點(diǎn)(point)中均有意義地減少。C腎小球系膜基質(zhì)的增殖。在第六天的Thy1 GN大鼠中，觀察到腎小球系膜基質(zhì)的增殖。APB5在各調(diào)查點(diǎn)均使腎小球系膜基質(zhì)的增殖有意義地減少。DIV型膠原的表達(dá)。在對(duì)照組中，Col4在已擴(kuò)大的腎小球系膜區(qū)域?yàn)閺?qiáng)陽(yáng)性。APB5使Col4的表達(dá)有意義地減少。*P＜0.001vs.對(duì)照組、**P＜0.001vs.APB5非處理疾病對(duì)照組圖11表示Thy1 GN中的Smad1、磷酸化Smad1、磷酸化STAT3的免疫組織化學(xué)染色。在Thy1 GN大鼠的腎小球的免疫組織化學(xué)染色中，Smad1、磷酸化Smad1、磷酸化STAT3的表達(dá)上升得驚人。在Thy1 GN中，明顯可見磷酸化Smad1與核在相同部位。在APB5處置中，各自的減少都非常有意義。A-CSmad1、D-F磷酸化Smad1、G-I磷酸化STAT3、A、D、G正常對(duì)照大鼠、B、E、H第六天的未處置Thy1大鼠、C、F、I第六天的APB5處置大鼠圖12表示Smad1、pSmad1、pSTAT3表達(dá)的時(shí)程(time course)。在Thy1 GN大鼠的第0、1、2、4、6、12天的腎切片上，進(jìn)行使用了針對(duì)Smad1、磷酸化Smad1、磷酸化STAT3的抗體的熒光組織染色。A在Thy1 GN中的Smad1表達(dá)。Smad1表達(dá)在第六天變?yōu)樽畲?，在?2天沉默。BpSmad1陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)整個(gè)腎小球細(xì)胞的比例的時(shí)程。pSmad1的表達(dá)在第四天變?yōu)樽畲?。CpSTAT3表達(dá)的時(shí)程。腎小球系膜區(qū)域的pSTAT3陽(yáng)性部分的比例增大到第六天，在第12天沉默。*P＜0.001vs.對(duì)照組、**P＜0.001vs.各調(diào)查點(diǎn)圖13表示Smad1、pSmad1、pSTAT3表達(dá)中的APB5的效果。進(jìn)行免疫組織染色和Smad1、pSmad1、pSTAT3表達(dá)的定量，結(jié)果這些蛋白像腎小球系膜基質(zhì)和腎小球的ColIV表達(dá)那樣，通過(guò)APB5處置而減少。ASmad1的表達(dá)。BpSmad1的表達(dá)。CpSTAT3的表達(dá)。*P＜0.01vs.APB5非處理疾病對(duì)照?qǐng)D14表示在體內(nèi)的APB5的效果。AAPB5抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖的效果。BDGF-B的添加使腎小球系膜細(xì)胞增殖增大，APB5有意義地抑制該增大。*P＜0.05vs.對(duì)照、**P＜0.05vs.接受PDGF-B刺激的對(duì)照、BWestern印跡分析通過(guò)APB5的添加引起的pSTAT3、pSmad1、Col4蛋白的表達(dá)減少。顯示3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的1次。
圖15表示已導(dǎo)入基因的腎小球系膜細(xì)胞的Western印跡分析結(jié)果。顯性陰性(dominant negative)STAT3引起pSmad1和Col4蛋白的表達(dá)減少。顯示3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的1次。
圖16表示根據(jù)實(shí)施例1和2的結(jié)果的信號(hào)傳導(dǎo)通路的模式圖。
圖17表示用患者和正常人的尿，將抗ALK-1作為第一抗體進(jìn)行Western印跡的結(jié)果。道1～5糖尿病性腎病患者，道6糖尿病合并伴隨硬化的腎增殖性疾病的線粒體病患者，道7、8糖尿病合并不伴隨硬化的腎疾病的患者，道9～10正常人圖18表示用治療中的糖尿病性腎病患者尿，將抗ALK-1作為第一抗體進(jìn)行Western印跡的結(jié)果。表示從左道開始，從治療開始時(shí)每周的泳動(dòng)圖像。
圖19表示用患者和正常人的尿，將抗Smad1作為第一抗體進(jìn)行Western印跡的結(jié)果。道1～5糖尿病性腎病患者，道6糖尿病合并伴隨硬化的腎增殖性疾病的線粒體病患者，道7、8糖尿病合并不伴隨硬化的腎疾病的患者，道9～10正常人具體實(shí)施方式
1.糖尿病性腎病的檢測(cè)方法和試劑盒本發(fā)明提供一種包括對(duì)生物體樣品中Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的糖尿病性腎病的檢測(cè)方法。
生物體樣品可以是能夠檢測(cè)出Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的任何生物體樣品。作為生物體樣品的例子，可以舉出腎臟組織切片、血液、血清、尿等。
在哺乳類中，Smad從1到9已被鑒定，Smad1已知作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一員，BMP借助活化素受體激酶2、3、6(ALK2、ALK3、ALK6)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄(ZwijsenA.et al.，F(xiàn)EBS Letters546，2003，133-139)。與BMP信號(hào)特異相關(guān)的Smad另外還有Smad5和8。另外還有與TGF-β/活化素信號(hào)特異相關(guān)的Smad，可以舉出Smad2和Smad3。另一方面，Smad1已知在內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞等中，借助活化素受體樣激酶1(ALK1)傳導(dǎo)TGF-β的信號(hào)，進(jìn)行靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Goumans MJ.et al.，EMBO J.，2002，Apr 2，21(7)，1743-53)。即，通過(guò)活化Smad1來(lái)調(diào)整靶基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，主要存在BMP系統(tǒng)和TGF-β系統(tǒng)兩條途經(jīng)(圖8)。但是，沒(méi)有充分探討哪一種組合引導(dǎo)的通路最重要。
“具有Smad1活化作用的物質(zhì)”，可以是能夠活化Smad1的物質(zhì)，可以是活化素受體樣激酶1(ALK1)、活化素受體樣激酶3(ALK3)之類的直接活化Smad1的物質(zhì)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)之類的通過(guò)活化活化素受體激酶(ALKs)而間接活化Smad1的物質(zhì)。
另外，PDGF是直接、間接并不明確，但根據(jù)本發(fā)明人等的研究(實(shí)施例2)，活化Smad1是明確的。
“活化Smad1”是指磷酸化Smad1的絲氨酸殘基和/或使其向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
活化素受體樣激酶1(ALK1)是與TGF-β家族的蛋白結(jié)合的I型受體之一，已知具有活化Smad1的作用(Chen YG，et al.，Smad1 recognitionand activation by the ALK1 group of transforming growth factor-βfamilyreceptors J.Biol.Chem.Vol.274，No.6，3672-3677，1999)。ALK1在人的胎盤、肺、血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，ALK1的變異會(huì)引起作為Osler-Rendu-Weber綜合癥而周知的2型遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(非專利文獻(xiàn)17)。
活化素受體樣激酶3(ALK3)又稱為BMPR-IA，活化素受體樣激酶3(ALK3)是與BMP家族的蛋白結(jié)合的I型受體之一，是絲氨酸—蘇氨酸型受體。與BMPs結(jié)合的ALK3活化Smad1/5/8，向核內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)是TGF-β超家族的一員，以骨形成為代表，與發(fā)育期的四肢發(fā)育或神經(jīng)系統(tǒng)的分化相關(guān)。但是，近年來(lái)，有幾個(gè)報(bào)道稱BMPs與后腎的發(fā)育調(diào)節(jié)有關(guān)，引起了人們的注意。腎臟從中間中胚層發(fā)育而來(lái)，經(jīng)過(guò)了前腎、中腎、后腎的三個(gè)階段而形成。幾乎全部的前腎、中腎在后來(lái)發(fā)生退化變性，在發(fā)育成熟的哺乳類發(fā)揮功能的腎臟是后腎。BMP與其受體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物局部存在于發(fā)育過(guò)程中的后腎，BMP2、4、7在體外具有直接或間接調(diào)節(jié)尿道的分支的形態(tài)形成和分支的結(jié)構(gòu)的作用。已報(bào)道在體內(nèi)，BMP7無(wú)表達(dá)突變純合子的突變小鼠和BMP4無(wú)表達(dá)突變雜合子的突變小鼠在腎臟的表現(xiàn)型上存在變化(Martinez G，et al，Int J Dev Biol.2002；46(4)525-33)。
TGF-β具有多方面作用，在各種細(xì)胞的增殖/分化、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、調(diào)亡、免疫系統(tǒng)等中具有重要作用。TGF-β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)其信號(hào)。在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)中，一系列的Smad蛋白分子群發(fā)揮了重要作用。
以往認(rèn)為在糖尿病性腎病的發(fā)病和進(jìn)展中，在高血糖狀態(tài)下，TGF-β借助ALK5活化Smad2和Smad3，與在過(guò)量產(chǎn)生以α1IV型膠原為代表的細(xì)胞外基質(zhì)的方向上發(fā)揮作用的通路有關(guān)(Jin H.et al.，KidneyInternational，63，2003，2010-2019)，本研究首次表明在高血糖狀態(tài)下存在借助Smad1引起細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生的通路。
Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)可以在核酸水平(即mRNA的表達(dá))和/或蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行測(cè)定。
對(duì)于在核酸水平的測(cè)定，從生物體樣品提取所有RNA，使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)，可以利用RT-PCR，對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的mRNA進(jìn)行測(cè)定。適當(dāng)?shù)囊飳?duì)例如被設(shè)計(jì)成能夠特異性地?cái)U(kuò)增NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_005900的人來(lái)源的Smad1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)1)、NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_000020的人來(lái)源的活化素受體樣激酶1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)2)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001200VERSION NM_001200.1的BMP2的mRNA的堿基序列(序列號(hào)3)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001202VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的堿基序列(序列號(hào)4)等特定的區(qū)域。適當(dāng)?shù)囊飳?duì)的堿基序列如下所示。
用于特異性擴(kuò)增Smad1的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-ACTACCACCACGGCTTTCAC-3’(序列號(hào)5)、反向引物5’-AATAGGATTGTGGGGTGAGC-3’(序列號(hào)6)用于特異性擴(kuò)增ALK1的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-ccgtcaagatcttctcctcg-3’(序列號(hào)7)、反向引物5’-tcatgtctgaggcgatgaag-3’(序列號(hào)8)用于特異性擴(kuò)增BMP2的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-cccagcgtgaaaagagagac-3’(序列號(hào)9)、反向引物5’-gagaccgcagtccgtctaag-3’(序列號(hào)10)
用于特異性擴(kuò)增BMP4的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-tgagcctttccagcaagttt-3’(序列號(hào)11)、反向引物5’-cttccccgtctcaggtatca-3’(序列號(hào)12)或者，可以從生物體樣品提取全RNA，使用適當(dāng)?shù)奶结?，利用Northern雜交(hybridization)法測(cè)定Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的mRNA。適當(dāng)?shù)奶结樌缈梢员辉O(shè)計(jì)成以NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_005900的人來(lái)源的Smad1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)1)、NCBIRefseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_000020的人來(lái)源的活化素受體樣激酶1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)2)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001200VERSION NM_001200.1的BMP2的mRNA的堿基序列(序列號(hào)3)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001202VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的堿基序列(序列號(hào)4)等，特異性地與這些序列的一部分或全部區(qū)域雜交(hybridize)。探針可以用32P等標(biāo)記。
對(duì)于蛋白質(zhì)水平的測(cè)定，例如使用針對(duì)Smad1和/或針對(duì)具有Smad1活化作用的物質(zhì)的抗體，通過(guò)Western印跡、ELISA或免疫組織化學(xué)分析等方法，測(cè)定Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)。針對(duì)Smad1的抗體和/或針對(duì)具有Smad1活化作用的物質(zhì)的抗體可以用螢光色素、酶、重金屬等進(jìn)行標(biāo)記(直接法)?；蛘呖梢杂梦灩馍?、酶、重金屬等標(biāo)記針對(duì)這些抗體(第一抗體)具有特異性的抗體(第二抗體)(間接法)來(lái)代替標(biāo)記這些抗體?？贵w優(yōu)選被固定于試驗(yàn)片或乳膠(latex)顆粒等固相擔(dān)體上。
對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，包括測(cè)定Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)有無(wú)表達(dá)、對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行定量。
通過(guò)本發(fā)明，能夠檢測(cè)出糖尿病性腎病。即，Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)表示糖尿病性腎病的發(fā)病。以往，在糖尿病性腎病的診斷中，使用尿中IV型膠原、尿中白蛋白測(cè)定，但有取代或補(bǔ)充這種檢測(cè)的可能性。
另外，通過(guò)本發(fā)明，能夠評(píng)價(jià)糖尿病性腎病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性。即，Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)量與糖尿病性腎病的嚴(yán)重程度成比例。另外，如果糖尿病性腎病的治療有效，則在患者恢復(fù)的同時(shí)，Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)量也減少。
糖尿病性腎病是由慢性高血糖狀態(tài)引起的細(xì)小血管損害之一。病理學(xué)上表現(xiàn)出腎小球基底膜的肥厚、腎小球系膜區(qū)域的擴(kuò)大、腎小球的硬化病變，臨床上表現(xiàn)出蛋白尿(微量白蛋白尿)、高血壓、浮腫等癥狀，大多最終成為腎功能衰竭。另外，在是糖尿病的情況下，在腎小球以外的組織也可見細(xì)動(dòng)脈硬化癥、腎小管間質(zhì)的變性/纖維化等異常，使腎小球的病變進(jìn)一步惡化。即，可以將在患有一定期間的糖尿病之后，蛋白尿、高血壓、腎功能損害逐漸進(jìn)展的病情定義為腎病。
近年來(lái)，成為晚期腎功能衰竭狀態(tài)并新導(dǎo)入透析療法中的病例的本來(lái)疾病中，30％以上是糖尿病性腎病，如今還有增加的趨勢(shì)。進(jìn)而，導(dǎo)入透析后的預(yù)后未必好，在醫(yī)療方面，正成為大問(wèn)題。因而，闡明糖尿病性腎病的發(fā)病/進(jìn)展機(jī)制、進(jìn)行診斷和治療的開發(fā)正在成為重要的課題。(日本臨床55卷、1997年增刊號(hào)“糖尿病”(1))另外，本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)糖尿病性腎病的試劑盒，其含有用于對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種用于評(píng)價(jià)糖尿病性腎病的進(jìn)行程度和/或治療的有效性的試劑盒，其含有用于對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
作為用于對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的例子，可以舉出能夠特異性擴(kuò)增Smad1的mRNA的堿基序列的特定區(qū)域的引物對(duì)、能夠特異性擴(kuò)增具有Smad1活化作用的物質(zhì)的mRNA的堿基序列的特定區(qū)域的引物對(duì)、能夠特異性雜交Smad1的mRNA的一部分或全部區(qū)域的探針、能夠特異性雜交具有Smad1活化作用的物質(zhì)的mRNA的一部分或全部區(qū)域的探針、針對(duì)Smad1的抗體、針對(duì)具有Smad1活化作用的物質(zhì)的抗體等。這些引物對(duì)和抗體如上所述。
本發(fā)明的試劑盒進(jìn)而還可以包括逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、無(wú)RNA酶水(RNase-free water)、緩沖液(buffer)、對(duì)照mRNA、對(duì)照引物對(duì)、dNTP混合物、試劑盒的使用說(shuō)明書等(在核酸水平，使用引物對(duì)，對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
或者，本發(fā)明的試劑盒另外還可以包括轉(zhuǎn)錄用緩沖液、封閉(blocking)試劑、清洗液、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用Western印跡法對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
在其它方式中，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括被標(biāo)記的第二抗體、基質(zhì)(第二抗體被酶標(biāo)記的情況)、稀釋液、反應(yīng)終止劑、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用ELISA對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
進(jìn)而，在其它方式中，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括顯色劑、過(guò)氧化氫水、緩沖液、計(jì)數(shù)染色用色素、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用免疫組化學(xué)分析對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
2.引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法和試劑盒本發(fā)明提供一種包括對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的、引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法。
引起硬化的增殖性疾病是指被觀察到臟器硬化的疾病，是在硬化之前，或者并行可見細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞外基質(zhì)的增加的狀態(tài)。其中包括糖尿病性腎病、慢性腎小球腎炎、膜性增殖性腎小球腎炎、局灶性腎小球硬化病、Light Chain Disease(L鏈沉淀病)、紅斑狼瘡性腎炎、冷球蛋白(cryoglobulin)血癥性腎炎、HIV相關(guān)腎炎、紫癲性腎炎等損害腎小球的腎疾病，肝纖維化，動(dòng)脈硬化等。
慢性腎小球腎炎是指引起腎小球的炎癥和進(jìn)展性破壞的、腎臟疾病慢性持續(xù)的狀態(tài)。是膜性增殖性腎小球腎炎、局灶性腎小球硬化病、LightChain Disease(L鏈沉淀病)、紅斑狼瘡性腎炎、冷球蛋白(cryoglobulin)血癥性腎炎、HIV相關(guān)腎炎、紫癲性腎炎等綜合征。
糖尿病性腎病是糖尿病具有代表性的合并癥之一，是指隨著糖尿病引起的高血糖狀態(tài)的持續(xù)而腎功能進(jìn)行性減少的狀態(tài)。
肝纖維化是指見于肝硬化或慢性肝炎等的、在肝血竇壁和肝細(xì)胞索之間(Disse腔)中可見膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的增加的狀態(tài)。肝纖維化是肝細(xì)胞癌發(fā)生的危險(xiǎn)因子，已知纖維化越進(jìn)展則肝細(xì)胞癌的發(fā)病率越高。
動(dòng)脈硬化是動(dòng)脈壁肥厚或硬化的病變的統(tǒng)稱，被認(rèn)為是起因于氧化應(yīng)激等引起的內(nèi)皮細(xì)胞的傷害的慢性炎癥性、增殖性病變。通過(guò)動(dòng)脈硬化的進(jìn)展，當(dāng)引起動(dòng)脈的狹窄、閉塞時(shí)，引起血壓上升、心肌梗塞、腦梗塞等，但在引起臟器損害之前缺乏自覺(jué)癥狀。
生物體樣品可以是能夠檢測(cè)出從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的任何生物體樣品。作為生物體樣品的例子，可以舉出腎臟組織切片、血液、血清、尿等。
STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducer andactivator of transcription)(STAT)蛋白之一。STAT3在干擾素、上皮生長(zhǎng)因子、白介素因子5、白介素6、肝細(xì)胞增殖因子、白血病抑制因子、成骨因子2等各種細(xì)胞因子或增殖因子與它們的受體結(jié)合時(shí)，通過(guò)受體相關(guān)激酶被酪氨酸磷酸化，由此被活化(磷酸化STAT3)。
磷酸化Smad1是指Smad1的絲氨酸殘基被磷酸化而被活化的狀態(tài)的Smad1。
從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)，可以在核酸水平(即mRNA的表達(dá))和/或蛋白質(zhì)水平進(jìn)行測(cè)定。
對(duì)于在核酸水平的測(cè)定，可以從生物體樣品提取全RNA，使用適當(dāng)?shù)囊飳?duì)，利用RT-PCR，對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的mRNA進(jìn)行測(cè)定。適當(dāng)?shù)囊飳?duì)例如被設(shè)計(jì)成能夠特異性地?cái)U(kuò)增NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_139276的人來(lái)源的STAT3的mRNA的堿基序列(序列號(hào)19)、NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_0059000的人來(lái)源的Smad1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)1)、NCBIRefseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_000020的人來(lái)源的活化素受體樣激酶1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)2)、NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_004329的人來(lái)源的活化素受體樣激酶3的mRNA的堿基序列(序列號(hào)20)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001200VERSION NM_001200.1的BMP2的mRNA的堿基序列(序列號(hào)3)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001202VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的堿基序列(序列號(hào)4)等特定的區(qū)域。適當(dāng)?shù)囊飳?duì)的堿基序列如下所示。
用于特異性擴(kuò)增STAT3的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-agatgctcactgcgctgga-3’(序列號(hào)21)、反向引物5’-tccaatgcaggcaatctgtt-3’(序列號(hào)22)用于特異性擴(kuò)增Smad1的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-ACTACCACCACGGCTTTCAC-3’(序列號(hào)5)、反向引物5’-AATAGGATTGTGGGGTGAGC-3’(序列號(hào)6)用于特異性擴(kuò)增ALK1的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-ccgtcaagatcttctcctcg-3’(序列號(hào)7)、反向引物5’-tcatgtctgaggcgatgaag-3’(序列號(hào)8)用于特異性擴(kuò)增ALK3的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-tggcactgggatgaaatca-3’(序列號(hào)23)、反向引物5’-tggttacataaattggtccga-3’(序列號(hào)24)用于特異性擴(kuò)增BMP2的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-cccagcgtgaaaagagagac-3’(序列號(hào)9)、反向引物5’-gagaccgcagtccgtctaag-3’(序列號(hào)10)用于特異性擴(kuò)增BMP4的mRNA的RT-PCR的正向引物5’-tgagcctttccagcaagttt-3’(序列號(hào)11)、反向引物5’-cttccccgtctcaggtatca-3′(序列號(hào)12)或者，可以從生物體樣品提取全RNA，使用適當(dāng)?shù)奶结槪肗orthern雜交法對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的mRNA進(jìn)行測(cè)定。適當(dāng)?shù)奶结樌绫辉O(shè)計(jì)成基于NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_139276的人來(lái)源的STAT3的mRNA的堿基序列(序列號(hào)19)、NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_0059000的人來(lái)源的Smad1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)1)、NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_000020的人來(lái)源的活化素受體樣激酶1的mRNA的堿基序列(序列號(hào)2)、NCBI Refseq數(shù)據(jù)庫(kù)的NM_004329的人來(lái)源的活化素受體樣激酶3的mRNA的堿基序列(序列號(hào)20)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001200 VERSIONNM_001200.1的BMP2的mRNA的堿基序列(序列號(hào)3)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的ACCESSION NM_001202 VERSION NM_001202.2的BMP4的mRNA的堿基序列(序列號(hào)4)等，特異地與這些序列的一部分或全部區(qū)域雜交。探針可以用32P等進(jìn)行標(biāo)記。
對(duì)于蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)，例如可以使用針對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的抗體，用Western印跡、ELISA或免疫組織化學(xué)分析等方法，對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定?？贵w可以用螢光色素、酶、重金屬等標(biāo)記(直接法)?；蛘撸鎸?duì)這些抗體進(jìn)行標(biāo)記，可以用螢光色素、酶、重金屬等標(biāo)記針對(duì)這些抗體(第一抗體)具有特異性的抗體(第二抗體)(間接法)。抗體優(yōu)選被固定于試驗(yàn)片或乳膠顆粒等固相擔(dān)體上。
對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，這包括檢測(cè)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)有無(wú)表達(dá)，對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行定量。
通過(guò)本發(fā)明，能夠檢測(cè)引起硬化的增殖性疾病。即，從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)，表示引起硬化的增殖性疾病的發(fā)病。在糖尿病性腎病或慢性腎小球腎炎等損害腎小球的腎疾病的診斷中，以往使用尿中IV型膠原、尿中白蛋白測(cè)定，但有取代或補(bǔ)充這種檢測(cè)的可能性。
另外，通過(guò)本發(fā)明，能夠評(píng)價(jià)引起硬化的增殖性疾病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性。即，從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)量，與引起硬化的增殖性疾病的嚴(yán)重程度成比例。另外，如果引起硬化的增殖性疾病的治療是有效的，則在患者恢復(fù)的同時(shí)，從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)量減少。
另外，本發(fā)明還提供一種含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的、用于檢測(cè)引起硬化的增殖性疾病的試劑盒。
進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的、用于評(píng)價(jià)引起硬化的增殖性疾病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性的試劑盒。
引起硬化的增殖性疾病如前所述。
作為用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的例子，可以舉出能夠特異性擴(kuò)增從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的mRNA的堿基序列的特定區(qū)域的引物對(duì)，能夠特異性雜交從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的mRNA的一部分或全部區(qū)域的探針，針對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的抗體等。這些引物對(duì)和抗體如上所述。
本發(fā)明的試劑盒進(jìn)而還可以包括逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、無(wú)RNA酶水(RNase-free water)、緩沖液、對(duì)照mRNA、對(duì)照引物對(duì)、dNTP混合物、試劑盒的使用說(shuō)明書等(在核酸水平，使用引物對(duì)，對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
或者，本發(fā)明的試劑盒另外還可以包括轉(zhuǎn)錄用緩沖液、封閉試劑、清洗液、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用Western印跡法，對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
在其它方式中，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括被標(biāo)記的第二抗體、基質(zhì)(在第二抗體被酶標(biāo)記的情況)、稀釋液、反應(yīng)終止劑、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用ELISA對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
進(jìn)而，在其它方式中，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括顯色劑、過(guò)氧化氫水、緩沖液、計(jì)數(shù)染色用色素、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用免疫組化分析，對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
3.藥劑和醫(yī)藥組合物本發(fā)明提供含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)作為有效成分的、引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療藥。
引起硬化的增殖性疾病如上所述。
另外，本發(fā)明還提供含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1構(gòu)成的組中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)作為有效成分的、抑制細(xì)胞外基質(zhì)的增殖的藥劑。細(xì)胞外基質(zhì)是指存在于動(dòng)物組織中的細(xì)胞外側(cè)的穩(wěn)定的生物體結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是細(xì)胞合成并分泌、蓄積于細(xì)胞外的生物體高分子的締合體。也包括培養(yǎng)細(xì)胞合成、分泌并沉淀于細(xì)胞周邊的結(jié)構(gòu)物質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)在結(jié)締組織中大量可見，基底膜也是細(xì)胞外基質(zhì)的一種。
進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種含有具有對(duì)STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)作為有效成分的、抑制α1IV型膠原的表達(dá)的藥劑。
這些藥劑可以用作醫(yī)藥品或者實(shí)驗(yàn)用試劑。
作為具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)的例子，可以舉出針對(duì)Smad1的反義寡核苷酸(將其堿基序列的一個(gè)例子顯示于序列號(hào)13)、SANE(Smad1拮抗效應(yīng)子(Antagonistic Effector))(Raju GP et al.，J BiolChem.2003 Jan 3；278(1)428-437)、PDGFβ受體抗體(APB5)、針對(duì)STAT3的反義寡核苷酸等。任意蛋白質(zhì)均可以用基因重組技術(shù)在大腸桿菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)等中產(chǎn)生。針對(duì)Smad1或STAT3的反義寡核苷酸可以用市售的DNA合成機(jī)并利用公知的方法合成。作為抗小鼠PDGFR-β抗體的APB5可以按照如下所述的方法制作。將相當(dāng)于小鼠PDGFR-β的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA片斷(frgment)插入到CD4Rg載體中，在COS-1細(xì)胞株中使與人IgG的融合蛋白質(zhì)PDGFR-β/Human IgG1表達(dá)。從上清純化融合蛋白質(zhì)并免疫Wistar種的大鼠，制成其脾臟細(xì)胞與骨髓瘤(myeloma)細(xì)胞株之間的融合細(xì)胞，篩選出產(chǎn)生針對(duì)PDGFR-β的抗體的細(xì)胞。不僅使用APB5，還可以與APB5一樣使用能通過(guò)公知的方法制成的抗PDGFR-β特異抗體。
具有抑制STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1構(gòu)成的組中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)的作用的物質(zhì)可以只使用一種，也可以組合使用多種。
具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)，可以使用一種，還可以組合多種使用。
具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)，可以單獨(dú)或者與藥理學(xué)上允許的擔(dān)體、稀釋劑或賦形劑一起作為適當(dāng)?shù)膭┬偷尼t(yī)藥組合物，對(duì)哺乳動(dòng)物(例如人、兔、狗、貓、大鼠、小鼠)經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。給藥量根據(jù)給藥對(duì)象、疾病的種類、癥狀、給藥途經(jīng)等不同，例如在向成人給藥時(shí)，具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)(例如SANE)，作為一次量，通常為10～100mg/kg體重左右，優(yōu)選為60～40mg/kg體重左右，一個(gè)月1～2次左右，優(yōu)選在治療開始時(shí)連續(xù)2～3天給同樣量，靜脈注射即可。其它非經(jīng)口給藥和經(jīng)口給藥的情況也可以給以此為標(biāo)準(zhǔn)的量。當(dāng)癥狀特別嚴(yán)重時(shí)，也可以根據(jù)其癥狀增量。
作為用于經(jīng)口給藥的組合物，可以舉出固體或液體的劑型、具體地說(shuō)片劑(包括糖衣片、包膜片)、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑(包括軟(soft)膠囊劑)、糖漿劑、乳劑、懸浮劑等。該組合物可以利用通常的方法制造，可以含有在制劑領(lǐng)域中通常使用的擔(dān)體、稀釋劑或賦形劑。例如，作為片劑用的擔(dān)體、賦形劑，可以舉出乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
作為用于非經(jīng)口給藥的組合物，例如可以舉出注射劑、栓劑等，注射劑可以是靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、點(diǎn)滴注射劑等劑型。該注射劑是采用通常的方法、即把具有抑制Smad1的表達(dá)的作用的物質(zhì)溶解、懸浮或乳化在通常用于注射劑的無(wú)菌的水性或油性液體中調(diào)制而成的。作為注射用水性液體，可以舉出生理鹽水、葡萄糖或含有其它輔助藥物的等滲溶液等，也可以與適當(dāng)?shù)闹軇├绱?例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性表面活性劑(例如聚山梨酸酯80、HCO-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成物(polyoxyethyleneadduct ofhydrogenated castor oil))等并用。作為油性液體，可以舉出芝麻油、大豆油等，作為助溶劑，可以并用苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。被調(diào)制的注射液通常被填充到適當(dāng)?shù)陌碴持?。用于直腸給藥的栓劑，可以通過(guò)將具有抑制Smad1的表達(dá)的作用的物質(zhì)混合于通常的栓劑用基質(zhì)中調(diào)制而成。
上述經(jīng)口用或非經(jīng)口用醫(yī)藥組合物，可以被調(diào)制成適合于有效成分的給藥量的給藥單位的劑型。作為該給藥單位的劑型，可以舉出片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。
另外，就上述的醫(yī)藥組合物而言，只要與具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)相配合時(shí)不產(chǎn)生不希望的相互作用，就可以含有其它有效成分。
當(dāng)具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)，是針對(duì)Smad1或STAT3的反義寡核苷酸時(shí)，可以通過(guò)公知的基因?qū)敕▽?dǎo)入到受檢者或受檢者的細(xì)胞中。例如，可以通過(guò)將針對(duì)Smad1或STAT3的反義寡核苷酸封入到脂質(zhì)體(liposome)中并攝入到細(xì)胞中的方法(“Lipidic vector systems forgene transfer”(1997)R.J.Lee and L.Huang Crit.Rev.Ther. Drug CarrierSyst 14，173-206；中西守等、蛋白質(zhì)核酸酶Vol.44，No.11，1590-1596(1999))、磷酸鈣法、電穿孔(Electroporation)法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Lipofection)法、微注射法(microinjection)、利用基因槍的方法等進(jìn)行。在將針對(duì)Smad1或STAT3的反義寡核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞中時(shí)，例如也可以部分取出疾病部位的細(xì)胞，在體外進(jìn)行基因?qū)牒?，再將該?xì)胞送回組織中，或者，也可以直接導(dǎo)入到疾病部位的組織。
在含有針對(duì)Smad1或STAT3的反義寡核苷酸作為有效成分的醫(yī)藥組合物中，根據(jù)需要，可以含有醫(yī)藥上允許的擔(dān)體(例如生理鹽水、緩沖液等稀釋劑)。用藥是根據(jù)疾病的狀態(tài)的嚴(yán)重程度或生物體的敏感度，但在治療的有效性被認(rèn)可之前或者在實(shí)現(xiàn)減輕疾病狀態(tài)的目的之前的期間，可以以適當(dāng)?shù)挠昧?、給藥方法、頻率進(jìn)行用藥。
4.對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、對(duì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、以及對(duì)在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒本發(fā)明提供一種包括判定受檢物質(zhì)是否抑制從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)的、對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
引起硬化的增殖性疾病如上所述。
另外，本發(fā)明還提供一種包括判定受檢物質(zhì)是否抑制從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)的、對(duì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種包括判定受檢物質(zhì)是否抑制從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)的、對(duì)在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
對(duì)本發(fā)明的上述方法的一種實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。
首先，準(zhǔn)備具有表達(dá)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的能力的細(xì)胞。作為具有表達(dá)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的能力的細(xì)胞，可以使用任何細(xì)胞，但作為其中的例子，可以舉出動(dòng)物的腎小球來(lái)源的腎小球系膜細(xì)胞(例如，后述的引用文獻(xiàn)S1中記載的細(xì)胞)、血管平滑肌細(xì)胞等。
在受檢物質(zhì)的存在或不存在下，分別對(duì)具有表達(dá)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的能力的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)。作為受檢物質(zhì)的例子，例如可以舉出肽、蛋白質(zhì)、非肽性化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取物、植物提取液、動(dòng)物組織提取液等，這些物質(zhì)可以是新物質(zhì)，也可以是公知的物質(zhì)。就對(duì)具有表達(dá)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的能力的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而言，可以在適合培養(yǎng)該細(xì)胞的條件下進(jìn)行。例如，小鼠的腎小球來(lái)源的腎小球系膜細(xì)胞(后述的引用文獻(xiàn)S1)，可以如后述的實(shí)施例1中記載的那樣來(lái)培養(yǎng)。對(duì)STAT3和Smad1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的方法如上所述。
磷酸化STAT3和磷酸化Smad1的表達(dá)分別可以通過(guò)將抗磷酸化STAT3抗體(Santa Cruz Biotechnology)和抗磷酸化Smad1抗體(Calbiochem)用作第一抗體的免疫染色來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
比較在受檢物質(zhì)的存在下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)量，和在受檢物質(zhì)不存在下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)量。如果前者比后者少，則判定為受檢物質(zhì)對(duì)引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療有效。或者，另外，受檢物質(zhì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效，或者，被判定為在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效。相反，如果前者與后者相同，或者比后者多，則判定為受檢物質(zhì)對(duì)引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療無(wú)效。或者，另外，受檢物質(zhì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中無(wú)效，或者，被判定為在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中無(wú)效。
本發(fā)明提供一種含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的、用于對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒。
另外，本發(fā)明還提供一種含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的、用于對(duì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒。
進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的、用于對(duì)在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒。
引起硬化的增殖性疾病如上所述。
作為用于對(duì)STAT3或Smad1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的例子，可以舉出能夠特異性擴(kuò)增STAT3或Smad1的mRNA的堿基序列的特定區(qū)域的引物對(duì)、能夠特異性雜交STAT3或Smad1的mRNA的一部分或全部區(qū)域的探針、針對(duì)STAT3或Smad1的抗體等。這些引物對(duì)和抗體如上所述。
作為用于對(duì)磷酸化STAT3或磷酸化Smad1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑的例子，可以舉出抗磷酸化STAT3抗體(Santa Cruz Biotechnology)和抗磷酸化Smad1抗體(Calbiochem)等。這些抗體如上所述。
本發(fā)明的試劑盒進(jìn)而還可以包括逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、無(wú)RNA酶水、緩沖液、對(duì)照mRNA、對(duì)照引物對(duì)、dNTP混合物、試劑盒的使用說(shuō)明書等(在核酸水平，使用引物對(duì)，對(duì)STAT3或Smad1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
或者，本發(fā)明的試劑盒另外還可以包括轉(zhuǎn)錄用緩沖液、封閉試劑、清洗液、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用Western印跡法，對(duì)STAT3或Smad1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
在其它方式中，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括被標(biāo)記的第二抗體、基質(zhì)(第二抗體被酶標(biāo)記的情況)、稀釋液、反應(yīng)終止劑、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用ELISA對(duì)STAT3、磷酸化STAT3、Smad1或磷酸化Smad1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
進(jìn)而，在其它方式中，本發(fā)明的試劑盒還可以進(jìn)一步包括顯色劑、過(guò)氧化氫水、緩沖液、計(jì)數(shù)染色用色素、試劑盒的使用說(shuō)明書等(用免疫組織化學(xué)分析對(duì)STAT3、磷酸化STAT3、Smad1或磷酸化Smad1的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑盒的情況)。
下面，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。此外，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明，并不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1為了鑒定在小鼠Col4基因的啟動(dòng)子區(qū)域的CIV部位結(jié)合的蛋白質(zhì)，從AGEs處理過(guò)的小鼠的腎小球系膜細(xì)胞建立cDNA文庫(kù)。在本實(shí)驗(yàn)中，使用酵母單雜交系統(tǒng)(Yeast one-hybrid system)，從文庫(kù)選擇編碼特異性轉(zhuǎn)錄因子的克隆，對(duì)該克隆編碼Smad1進(jìn)行鑒定。為了在體內(nèi)確認(rèn)Smad1與Col4啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀法(ChIP)。純化已沉淀的DNA，用PCR檢測(cè)出Col4的啟動(dòng)子區(qū)域。抗Sma1抗體使含有從被AGEs處理過(guò)的細(xì)胞得到的CIV-1部位的染色質(zhì)沉淀(圖1A)。在已被BSA處理過(guò)的細(xì)胞中不沉淀。發(fā)現(xiàn)Smad4另外也與CIV-1部位結(jié)合(圖1A)。接著，利用報(bào)告基因檢測(cè)(reporter assay)研究Col4的轉(zhuǎn)錄活性。制作在LacZ前連接CIV-1啟動(dòng)子的載體，與野生型Smad1載體一起同時(shí)導(dǎo)入到COS7細(xì)胞中。首先，利用Western印跡確認(rèn)Smad1的表達(dá)(圖1B)，在導(dǎo)入了野生型Samd1載體的細(xì)胞上清中檢測(cè)出磷酸化Smad1(pSmad1)。通過(guò)野生型Smad1的同時(shí)導(dǎo)入，與Col4單獨(dú)(Mock)的情況相比，β-半乳糖苷酶的活性為18倍(圖1C)。用螢光素酶活性校正β-半乳糖苷酶活性，以同時(shí)導(dǎo)入了Mock載體的細(xì)胞中的活性為基準(zhǔn)。Mock對(duì)同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性沒(méi)有帶來(lái)任何影響。結(jié)果表明Smad1確實(shí)誘導(dǎo)了Col4基因轉(zhuǎn)錄。即，Smad調(diào)節(jié)Col4的轉(zhuǎn)錄。
為了確認(rèn)Smad1是否被ADEs上調(diào)(up regulate)，檢查在AGEs存在下、不存在下的腎小球系膜細(xì)胞中的Smad1的表達(dá)。在AGE存在下，Smad1的mRNA量經(jīng)時(shí)上升(圖2A)。同樣，Col4的mRNA也與Smad1的轉(zhuǎn)錄上升平行上升。但是，在BSA存在下，Smad1的轉(zhuǎn)錄和Col4的轉(zhuǎn)錄均沒(méi)有變化。已知Smad1通過(guò)被磷酸化，向核內(nèi)移動(dòng)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄(11)(12)。因而，本發(fā)明人等接著用腎小球系膜細(xì)胞研究是否通過(guò)AGEs，Smad1的磷酸化和向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移受到影響(圖2B)。與mRNA的結(jié)果一致，在AGEs存在下培養(yǎng)72小時(shí)，優(yōu)先在細(xì)胞質(zhì)中存在。進(jìn)而，在AGEs存在下培養(yǎng)120小時(shí)，可見Smad1和pSmad1向核內(nèi)集聚。當(dāng)在BSA存在下培養(yǎng)時(shí)，僅表達(dá)少量Smad1和pSmad1。同樣在AGEs處理細(xì)胞的提取液中可見Smad1和pSmad1，而在BSA處理細(xì)胞的提取液中未見(圖2C)。這些發(fā)現(xiàn)表明Col4的調(diào)節(jié)在AGEs存在下與Smad1的表達(dá)聯(lián)動(dòng)。
為了確認(rèn)在介導(dǎo)AGE誘導(dǎo)性的Col4的過(guò)量產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的Smad1的重要性，本發(fā)明人等使用反義基因特異性地抑制該系統(tǒng)。在反義基因存在下，Smad1通過(guò)AGE的誘導(dǎo)完全消失，而在對(duì)照寡(脫氧)核苷酸的存在下不消失(4個(gè)錯(cuò)配寡(脫氧)核苷酸)(圖3A、B)。接著，通過(guò)Smad1的抑制，Col4的過(guò)量表達(dá)被顯著減弱。Smad1的錯(cuò)配寡(脫氧)核苷酸不對(duì)Col4的表達(dá)造成影響(圖3C)。這些數(shù)據(jù)表明Smad1在Col4的表達(dá)控制中起到?jīng)Q定性作用。在糖尿病患者中，糖尿病性腎病的發(fā)病、進(jìn)展在患病率/死亡率兩方面均為臨床上的重大問(wèn)題。在現(xiàn)行的治療方法中，只要血糖值的控制良好，就可以延緩糖尿病性腎病的發(fā)病、進(jìn)展，但不能預(yù)防。(1)(2)針對(duì)Smad1的反義寡(脫氧)核苷酸會(huì)使AGE引起的Col4的過(guò)量表達(dá)顯著減弱。這些發(fā)現(xiàn)表明通過(guò)Smad1信號(hào)系統(tǒng)的抑制，可以防止糖尿病性腎病中的腎小球系膜細(xì)胞的ECM的產(chǎn)生。由于可以在AGEs的持續(xù)刺激存在下可見本實(shí)驗(yàn)的效果，所以提示Smad1是糖尿病的合并癥的新靶點(diǎn)(target)，通過(guò)與目前的治療方法組合發(fā)揮效果。為了進(jìn)一步闡明AGEs處理引起的Smad1表達(dá)的機(jī)制，本發(fā)明人等檢測(cè)了腎小球系膜細(xì)胞中的活化素受體樣激酶1(ALK1)的表達(dá)。ALK1是TGF-β受體家族的蛋白質(zhì)之一，具有特異性地對(duì)Smad1和Smad5進(jìn)行磷酸化的作用。ALK1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)(13)(14)，對(duì)血管的成熟和穩(wěn)定化很重要(15)(16)。ALK1的變異會(huì)引起作為Osler-Rendu-Weber綜合癥而周知的II型遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(17)。有最近的報(bào)道稱ALK1借助Smad1傳導(dǎo)來(lái)自TGF-β的信號(hào)，調(diào)節(jié)TGF-β反應(yīng)性基因群(18)(19)。本發(fā)明人等使用RNA酶保護(hù)檢測(cè)法和Western印跡法，對(duì)AGEs處理過(guò)的腎小球系膜細(xì)胞中的ALK1的表達(dá)，分別檢測(cè)出mRNA、蛋白質(zhì)兩方面(數(shù)據(jù)未顯示)。最后，檢測(cè)了人的糖尿病性腎病中的Smad1和ALK1在腎小球的表達(dá)。將糖尿病性腎病和健康腎的活組織檢查(biopsy)作為樣品，實(shí)施間接抗體法，在作為糖尿病性腎病的腎小球中，在腎小球中的針對(duì)Smad1與ALK1抗體的反應(yīng)性與硬化性疾病的嚴(yán)重程度成比例，但在健康腎中幾乎未見表達(dá)(圖4)。這些組織學(xué)發(fā)現(xiàn)提示Col4的正調(diào)節(jié)與Smad1/ALK1信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)。由于人的糖尿病性腎病長(zhǎng)年緩慢地進(jìn)展，所以為了詳細(xì)評(píng)價(jià)這種現(xiàn)象，不得不弄清糖尿病與Smad1和ALK1的關(guān)系。
從小鼠中的Smad1基因的特異性破壞在胎兒期是致死性的可知Smad1在早期胚發(fā)育中起到?jīng)Q定性作用(20)。但是，由于胚胎期早期的致死性，所以Smad1在體內(nèi)的作用、尤其是對(duì)于成人，不是很清楚。已知Smad1傳導(dǎo)BMP信號(hào)(12)，特別在腎發(fā)育中很重要(21)。但是，Smad1在成年小鼠的腎小球中未見表達(dá)(22)。本實(shí)驗(yàn)首先揭示了在成年小鼠中，Smad1被AGEs誘導(dǎo)。本發(fā)明人等觀察到慢性暴露于AGEs時(shí)Smad1表達(dá)的持續(xù)性上升，Col4的過(guò)量表達(dá)，表明Smad1在糖尿病存在下是決定性調(diào)節(jié)因子。AGEs由于與糖尿病的并發(fā)癥顯著相關(guān)，所以本發(fā)明人等的研究結(jié)果在伴隨膠原沉淀的糖尿病或老化之類的疾病中是有用的。在糖尿病性腎病中，GMB的結(jié)構(gòu)變化由于是在微量白蛋白尿發(fā)生以前的初期發(fā)生，所以Smad1可能是糖尿病性腎病的最初期的標(biāo)志物質(zhì)(marker)。在最近的報(bào)道中，表明ALK1借助Smad1介導(dǎo)TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)(18)(19)。因而，本發(fā)明人等研究了小鼠的腎小球系膜細(xì)胞與人的腎組織中的ALK1的表達(dá)。其結(jié)果，在本實(shí)驗(yàn)中揭示了ALK1和Smad1在腎小球中與糖尿病的進(jìn)展對(duì)應(yīng)表達(dá)。這些結(jié)果通過(guò)抑制膠原的病理產(chǎn)生而與在各種臟器中發(fā)生的糖尿病的合并癥的治療聯(lián)系在一起(1)。該結(jié)果確認(rèn)了持續(xù)的血糖值上升會(huì)帶來(lái)AGEs的上升，在長(zhǎng)期糖尿病的合并癥的進(jìn)展中是必須的(23)(24)。通過(guò)糖化，膠原交聯(lián)而促進(jìn)動(dòng)脈硬化(25)。進(jìn)而，近年來(lái)通過(guò)使用了AGEs特異性抑制劑的研究，強(qiáng)調(diào)AGEs與糖尿病的合并癥和動(dòng)脈硬化的相關(guān)(26)(27)。與Col4是血管基底膜的主要構(gòu)成成分無(wú)關(guān)，關(guān)于糖尿病或老化中的Col4的產(chǎn)生增進(jìn)，無(wú)論在細(xì)胞水平還是在分子水平，其機(jī)制都不清楚。因而，本發(fā)明人等推測(cè)ALK1/Smad1信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在糖尿病和老化兩方面，通過(guò)使ECM過(guò)量表達(dá)而與動(dòng)脈硬化的進(jìn)展關(guān)聯(lián)。使用糖尿病或老化的動(dòng)物模型，進(jìn)一步闡明ALK1/Smad1信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，這正處于研究中。
進(jìn)而，將AGEs存在下培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中的mRNA的表達(dá)量與BSA存在下培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行比較(圖5)。在AGEs存在下，可見BMPRII、BMP4的顯著的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。未見Smad1的轉(zhuǎn)錄量有大的變動(dòng)，而這是由于Smad1是轉(zhuǎn)錄因子，很難捕捉到表達(dá)量的大的變動(dòng)，另外，在轉(zhuǎn)錄因子的作用中比較重要的從細(xì)胞質(zhì)向核內(nèi)的轉(zhuǎn)移或磷酸化等，在微陣列(microarray)的結(jié)果中不被反映出來(lái)。
另外，用Western印跡法測(cè)定糖尿病性腎病患者的尿中BMP2，可見通過(guò)治療疾病得到改善，同時(shí)尿中BMP2減少(圖6)。
另外，通過(guò)TGF-β信號(hào)導(dǎo)致的慢性刺激，可見BMP2和BMP4蛋白的顯著表達(dá)亢進(jìn)(圖7)，在TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中，這些BMPs可能承擔(dān)了中心功能。
在實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)建立正常的4周齡小鼠(C57BL/6JxSJL/J)的腎小球來(lái)源的腎小球系膜細(xì)胞株，按照以往報(bào)道的方法鑒定為腎小球系膜細(xì)胞(S1)。加入1mM谷氨酰胺、100units/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素、20％FCS，在B培養(yǎng)基(最低限度營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和添加了微量元素的F12培養(yǎng)基的31混合培養(yǎng)基)中培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞株。培養(yǎng)細(xì)胞滿足通常用于判定腎小球系膜細(xì)胞的基準(zhǔn)(S2)。AGEs或BSA處理按照以往已報(bào)道的方法進(jìn)行(S3)。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和酵母單雜交篩選從已進(jìn)行AGEs處理的小鼠腎小球培養(yǎng)細(xì)胞制備cDNA，插入到pGAD載體中。酵母單雜交篩選使用MATCHMAKER單雜交(Clontech，Palo Alto，California)試劑盒進(jìn)行。使小鼠來(lái)源Col4基因的27bp的串聯(lián)反復(fù)序列(TTCCTCCCCTTGGAGGAGCGCCGCCCGCIV-1)(序列號(hào)14)與酵母的作為整合和報(bào)告基因載體(integration and reporter vector)的pHISi(MATCHMAKER單雜交(Clontech，Palo Alto，California)或pLacZi(MATCHMAKER單雜交(Clontech，Palo Alto，California)連接，制作CIV-1-pHISi和CIV-1-pLacZi載體，使其直線化，插入到酵母株YM4271(MATCHMAKER單雜交(Clontech，Palo Alto，California)的染色體中。使用已插入CIV-1-pHISi和CIV-1-pLacZi的酵母，進(jìn)行已進(jìn)行AGEs處理的小鼠腎小球系膜細(xì)胞來(lái)源的cDNA文庫(kù)的單雜交篩選。在已添加45mM的3-氨基-1，2，4-三唑(3-AT)的SD/-His/-Leu培養(yǎng)基中選擇陽(yáng)性克隆(positive clone)。為了除去假陽(yáng)性克隆，進(jìn)行β-半乳糖苷酶濾提檢測(cè)(β-galactosidase filter lift assay)(Clontech)，將從殘留的酵母克隆中回收的質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌(DH5α)。
ChIP檢測(cè)ChIP檢測(cè)是按照Luo(S5)的方法進(jìn)行的。使用抗Smad1抗體、抗Smad-4抗體(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California)、對(duì)照IgG，在4℃下過(guò)夜(over night)。用PCR擴(kuò)增CIV-1區(qū)域。使用引物為5’側(cè)(5’-GGAGCTCCCCAATTTGTTG-3’)(序列號(hào)15)、3’側(cè)(5’-CAGCCTCCGCCTCTTACC-3’)(序列號(hào)16)。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中為100bp左右。
報(bào)告基因檢測(cè)使用已添加10％FBS的Dulbecco的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，在六孔板中培養(yǎng)1.3×105COS7細(xì)胞。8小時(shí)后，同時(shí)導(dǎo)入750ng的CIV-1-LacZ和等量的結(jié)合Smad-1的載體、或者作為空載體(dummy)的mock載體。接著，作為內(nèi)部對(duì)照，也導(dǎo)入75ng的CMV-LUC(在CMV啟動(dòng)子的下游連接螢光素酶基因)。在導(dǎo)入中使用FuGENE6(Roche molecularbiochemicals，Indianapolis，Indiana)。48小時(shí)后，將細(xì)胞回收到報(bào)告基因溶胞緩沖液(reporter lysis buffer)中，分別使用β-半乳糖苷酶報(bào)告基因系統(tǒng)(BD Bioscience，San Jose，California)和螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Promega，Madison，Wisconsin)，測(cè)定β-半乳糖苷酶活性和螢光素酶活性，用螢光素酶活性的測(cè)定結(jié)果校正β-半乳糖苷酶活性。
RNA酶保護(hù)檢測(cè)按照以往的報(bào)道(S6)進(jìn)行RNA酶保護(hù)檢測(cè)。
用于該檢測(cè)的探針的堿基序列為Acc No.U58992的1172-1433的序列，如下所述。
cccaccacc gtctgcaaga tccccagcgg gtgcagcttg aaaatcttca acaaccaaga gtttgctcagctactggcgc agtctgtgaaccacgggttc gagaccgtgt atgaactcac caaaatgtgc actattcgga tgagcttcgtgaagggttgg ggagccgaat accaccggca ggatgttacc agcaccccct gctggattgagatccatctg catggccctc tccagtggct ggataaggtt ctgacccaga tgg(序列號(hào)17)Western印跡在ADEs或作為對(duì)照的BSA的存在下，培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞72小時(shí)。將細(xì)胞回收到樣品緩沖液(Sample buffer)中，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析，轉(zhuǎn)(blotting)到硝酸纖維素膜上，使其與已稀釋501倍的抗Smad1和抗pSmad1抗體(Santa Cruz Biotechnology)發(fā)生反應(yīng)，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光探測(cè)系統(tǒng)(enhanced chemiluminescence detection system)(Invitrogen，Carlsbad，California)檢測(cè)。
培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞片的免疫染色(Immunostaining of cultured cells cytosections)用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定培養(yǎng)細(xì)胞，使用已稀釋100倍的抗Smad1抗體(Santa Cruz Biotechnology)、已稀釋100倍的抗pSmad-1抗體(Calbiochem)。用激光顯微鏡和熒光顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)觀察適量的fluoroscein isothiocyanate結(jié)合第二抗體。
Smad1嗎啉代(morpholino)反義寡核苷酸合成針對(duì)Smad1的25個(gè)堿基長(zhǎng)度的反義寡核苷酸(Genetools LLC，Philomath，Oregon)。序列為5’-CAAGCTGGTCACATTCATAGCGGCT-3’(序列號(hào)13)。作為對(duì)照，使用合成寡核苷酸5’-CAtGCTcGTCACATTCAaAGCcGCT-3’(序列號(hào)18)，按照已經(jīng)報(bào)道的(S7)進(jìn)行體外RNA轉(zhuǎn)錄(in vitro RNA transcription)。
組織學(xué)(Histology)使用人組織進(jìn)行病理組織學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)基于赫爾辛基宣言而得到了倫理委員會(huì)的許可而進(jìn)行的。從患者取得了組織提供和用于研究的書面承諾。得到5例糖尿病性腎病的腎活檢樣品的提供。就作為對(duì)照的正常組織而言，從腫瘤的相反側(cè)將由于腎的惡性腫瘤而接受腎摘除手術(shù)的患者的腎的正常皮質(zhì)制成樣品。冰凍腎組織后切出5μm厚的切片，用丙酮固定5分鐘。為了消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，放入到1％過(guò)氧化氫-甲醇中，遮光孵育20分鐘。進(jìn)而，為了防止非特異性染色，使用適量的免疫前血清，在室溫下，孵育20分鐘。將抗Smad1抗體(Santa Cruz Biotechnology)和抗ALK1抗體(R&D，Mickinley Place，Nebraska)作為第一抗體進(jìn)行免疫染色。
通過(guò)微陣列的表達(dá)量的分析用Agilent技術(shù)小鼠cDNA微陣列試劑盒(Agilent Technologies MousecDNA Microarray Kit)，分別檢測(cè)AGEs存在下培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞和BSA存在下培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞中的各mRNA的表達(dá)量。
實(shí)施例2腎小球硬化具有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的量增加的特征。IV型膠原(Col4)在腎小球疾病中是已增量的ECM的主要構(gòu)成成分之一，但在本發(fā)明人等的最近的報(bào)道之前，Col4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚不清楚。本發(fā)明人等揭示了在糖尿病性腎病中，Smad1在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Col4的過(guò)量表達(dá)(A8)。Smad1直接向下游的靶基因傳導(dǎo)信號(hào)。例如，在骨橋蛋白(osteopontin)(A9)、分化的抑制(A10)、I型膠原(A11)、甚至在腎疾病的進(jìn)展中，本質(zhì)上很重要(A12)。這些發(fā)現(xiàn)表明Smad1是對(duì)腎小球硬化的進(jìn)展具有重大的意義的轉(zhuǎn)錄因子。
信號(hào)傳導(dǎo)因子和活化因子(signal transducer and activator)(STAT)蛋白與很多細(xì)胞因子和增殖因子的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。STAT3的活化是PDGF誘導(dǎo)的分裂促進(jìn)的關(guān)鍵控制因子(A13)。Nakashima等報(bào)道了在星型膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)的分化中，作為轉(zhuǎn)錄的共活化劑(coactivator)的p300與STAT3和Smad1發(fā)生物理性相互作用，接著，引起靶基因的轉(zhuǎn)錄活化(A14)。從以上發(fā)現(xiàn)可以建立如下所述的假說(shuō)PDGF在腎小球系膜細(xì)胞的增殖中，活化STAT3-Smad1信號(hào)傳導(dǎo)通路，此過(guò)程在從腎小球系膜細(xì)胞增殖進(jìn)展到腎小球硬化中很重要。
在本研究中，本發(fā)明人等揭示了在大鼠的腎小球腎炎中抑制PDGF-B鏈引起的活化的抗PDGF-β受體抗體的給藥效果，在體內(nèi)、體外對(duì)調(diào)節(jié)腎小球的細(xì)胞增殖、腎小球硬化兩方面的信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行了研究。在實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法動(dòng)物在本研究中使用體重180～200g的雄性Wsitar大鼠(日本クレァ，日本)。大鼠在除去特定病原體的環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究得到了德島大學(xué)的倫理審查委員會(huì)的許可，所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都在學(xué)科內(nèi)的方針(guideline)下進(jìn)行。
Thy1腎小球性腎炎的誘導(dǎo)(Induction of Thy1 glomerulogephritis)按照已經(jīng)報(bào)道的方法(A15)，通過(guò)抗大鼠Thy-1.1單克隆(monoclonal)抗體(セダ一レ一ンラボラトリ一ズ公司，ォンタリォ，加拿大)的一次給藥(1mg/kg)，誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性腎小球系膜增殖性腎小球腎炎(Thy1 GN)。這些大鼠在抗Thy-1.1抗體給藥后1、2、4、6、12天之后(n＝6/組)被處死。向6只符合年齡數(shù)的大鼠只給溶劑，作為各組的對(duì)照，處死。
用抗PDGFβ-R抗體處理Thy1 GN的草案(protocol)此前已有報(bào)道在體內(nèi)、體外，大鼠單克隆抗PDGFβ受體抗體(APB5)和其在PDGFβ受體信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的拮抗效果(A16、A17)。從抗Thy-1.1(0天)的給藥開始，每日向大鼠給APB5(理化學(xué)研究所/西川伸一教授惠贈(zèng))或與APB5相同的同型(isotype)IgG(理化學(xué)研究所/西川伸一教授惠贈(zèng))，每天腹腔內(nèi)給藥各400μg，在1、2、4、6、12天后(n＝6/組)處死。
組織學(xué)檢查(Histology examination)光學(xué)顯微鏡檢查(Light microscopy)取出腎臟后，為了進(jìn)行通過(guò)光學(xué)顯微鏡的研究而用carnoy液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)固定并石蠟包埋組織片。用蘇木精/伊紅(eosin)(HE)、過(guò)碘酸希夫(shiff)試劑(PAS)、過(guò)碘酸六亞甲四胺(methenamine)銀試劑(PAM)對(duì)切片(2μm)進(jìn)行染色。
免疫組化(Immunohistochemistry)用通常的方法對(duì)腎切片進(jìn)行免疫組織染色。為了檢驗(yàn)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Col4、Smad1，使用用carnoy液固定并用石蠟包埋的組織片。腎切片發(fā)生再水化并用0.3％的過(guò)氧化氫加甲醇在30分鐘進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活處理。為了除去非特異性染色，在適量的免疫前血清中室溫下孵育切片20分鐘，分別用親和素(avidin)D封閉液和生物素(biotin)封閉液(Vector，加利福尼亞，美國(guó))各處理15分鐘。用抗PCNA抗體(1∶200稀釋)、抗Col4抗體(1∶200稀釋)、抗Smad1抗體(1∶100稀釋)(Santa Cruz Biotechnology公司，加利福尼亞，美國(guó))室溫孵育切片60分鐘，與適量的生物素化第二抗體、然后與親和素-生物素化過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ベクタスタチンABC系統(tǒng)，Vector公司)孵育，使用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)四醋酸鹽(DAB)使其顯色。為了驗(yàn)證磷酸化Smad1(pSmad1)和磷酸化STAT3(pSTAT3)，將切片包埋于冰凍切片用包埋劑OCT復(fù)合物(マィルズ公司，印第安納，美國(guó))，放入冷卻后的丙酮中，瞬間冷凍。制作4μm厚的切片，用丙酮固定5分鐘，進(jìn)而用0.3％的過(guò)氧化氫加甲醇30分鐘進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶失活處理。用與PCNA同樣的方法，將抗pSmad1抗體(1∶100稀釋)(Calbiochem，加利福尼亞，美國(guó))、抗pSTAT3抗體(1∶100稀釋)(Santa CruzBiotechnology)作為第一抗體，對(duì)切片進(jìn)行免疫染色。為了研究核數(shù)，用蘇木精液體對(duì)切片進(jìn)行對(duì)比染色。
光學(xué)顯微鏡定量使用已PAM染色的組織，進(jìn)行腎小球的形態(tài)測(cè)量。使用帶有圖像分析系統(tǒng)的顯微鏡(IPAP，住友化學(xué)工業(yè)公司，大阪，日本)，按照已經(jīng)報(bào)道的方法(A18～A20)來(lái)測(cè)量相對(duì)腎小球面積的腎小球表面和PAM陽(yáng)性的面積(％)。對(duì)每一只大鼠分析50個(gè)腎小球。
免疫組化的定量PCNA為了對(duì)增殖的細(xì)胞(PCNA陽(yáng)性細(xì)胞)進(jìn)行定量，在觀察者沒(méi)有樣品的信息的情況下，對(duì)每一個(gè)標(biāo)本的50個(gè)腎小球進(jìn)行計(jì)數(shù)，算出每一個(gè)腎小球的平均值。為了對(duì)pSmad1∶pSmad1的表達(dá)進(jìn)行定量，計(jì)數(shù)相對(duì)于腎小球細(xì)胞數(shù)的pSmad1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，算出pSmad1陽(yáng)性細(xì)胞的比例。對(duì)于Col4、Smad1、pSTAT3，相對(duì)切片上的整個(gè)腎小球間質(zhì)，用范圍(カラ一レンジ)選擇被免疫過(guò)氧化物酶染色染成茶色的部分，用IPAP對(duì)其面積占全部面積的比例進(jìn)行定量。對(duì)每一只大鼠分析50個(gè)腎小球。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(Cell culture experiment)按照已經(jīng)報(bào)道的方法(A21)，從正常的4周齡的小鼠(C57BL/6JxSJL/J)摘出的腎小球中分離腎小球系膜細(xì)胞，建立腎小球腎系膜細(xì)胞的細(xì)胞株。在添加了微量元素、1mM谷氨酰胺、100單位/ml的青霉素、100mg/ml的鏈霉素、20％胎牛血清(FCS)的B培養(yǎng)基(最低限度營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基與F12培養(yǎng)基＝3∶1混合培養(yǎng)基)中培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞滿足通常被接受的作為腎小球系膜細(xì)胞的必要條件(A22)。將培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞用已添加了20％FCS的B培養(yǎng)基種在100mm直徑的培養(yǎng)皿中。24小時(shí)后換成已添加了0.1％BSA的B培養(yǎng)基，在饑餓狀態(tài)下放置2天，然后向已添加2％FCS的B培養(yǎng)基中添加5ng/ml的PDGF-B(Calbiochem)，進(jìn)而加入100ng/ml的APB5或作為對(duì)照的大鼠IgG，培養(yǎng)24小時(shí)。
利用BrdU ELISA的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)?zāi)I小球系膜細(xì)胞的增殖可以通過(guò)用于定量細(xì)胞增殖的、將DNA合成時(shí)的攝取BrdU的定量作為原理的比色免疫測(cè)定法(immunoassay)(Amersham Pharmacia Biotech，新澤西，美國(guó))進(jìn)行評(píng)價(jià)。BrdU ELISA按照試劑盒制造商的手冊(cè)使用。用添加了10％FCS的B培養(yǎng)基以低密度將腎小球系膜細(xì)胞種于96孔的平底微滴定板中，使其過(guò)夜貼壁。換成準(zhǔn)集密度的添加了0.1％BSA的B培養(yǎng)基，在饑餓狀態(tài)下放置2天，然后換成已添加2％FCS、5ng/ml的PDGF-B、10mM BrdU的B培養(yǎng)基，進(jìn)而添加100ng/ml的APB5。培養(yǎng)6小時(shí)后，將板離心，用固定液固定細(xì)胞，與1∶100稀釋過(guò)的過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗BrdU單克隆抗體孵育30分鐘。清洗標(biāo)記抗體之后，加基質(zhì)液，放置15分鐘，用1M硫酸使反應(yīng)停止。在5分鐘內(nèi)用ELISA板閱讀器(plate reader)，將690nm作為對(duì)象波長(zhǎng)，測(cè)量450nm的吸光度(Model550，バィォラツドラボラトリ一ズ，加利福尼亞，美國(guó))?？瞻?blank)是不添加100μL的BrdU的培養(yǎng)基。
Western印跡分析培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞在添加0.1％BSA的B培養(yǎng)基中24小時(shí)處于饑餓狀態(tài)。用添加了100ng/ml的APB5或?qū)φ誌gG的5ng/ml的PDGF-BB，刺激培養(yǎng)細(xì)胞120分鐘。將細(xì)胞懸浮于溶解緩沖液中，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺電泳分離。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，使用1∶1000稀釋抗pSTAT抗體、1∶1000稀釋抗pSmad1抗體、1∶2000稀釋抗Col4抗體，進(jìn)行Wetern印跡。使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)(Amersham Pharmacia)檢測(cè)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染(Cell Transfection)已與表達(dá)載體結(jié)合的野生型STAT3和加入了顯性陰性的STAT3的質(zhì)粒由Jackie.Bromberg(洛克菲勒大學(xué))惠贈(zèng)(A23)。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Lipofectamine)2000(Invitrogen)，按照廠商的手冊(cè)，將已結(jié)合野生型或顯性陰性STAT3(8mg)的表達(dá)載體導(dǎo)入到腎小球系膜細(xì)胞(60mm培養(yǎng)皿)中。6小時(shí)后，將培養(yǎng)基換成增殖培養(yǎng)基(60％DMEM、20％F12、20％胎牛血清)。48小時(shí)后，將細(xì)胞懸浮于溶解緩沖液中，如上所述地進(jìn)行Western印跡分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Statistical analysis)全部數(shù)值用平均值±SE表示，使用Mann-Whitney非參數(shù)分析或者t檢驗(yàn)，進(jìn)行單側(cè)的方差分析。設(shè)P＜0.05為具有顯著差異。
在細(xì)胞增殖試驗(yàn)和培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞中的Smad1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析中使用t檢驗(yàn)。免疫組織染色的定量和腎小球的Smad1 mRNA表達(dá)是進(jìn)行單側(cè)ANOVA之后，然后進(jìn)行多重比較。設(shè)P＜0.05為具有顯著差異。全部數(shù)值用平均值±SD表示。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果Thy1 GN的形態(tài)改變?cè)赥hy1 GN中，腎小球系膜細(xì)胞的增殖在注射后第二天開始到第六天變?yōu)樽畲?，在?2天平靜下來(lái)。圖9表示各組在第六天的代表性光學(xué)顯微鏡像。Thy1 GN組的腎小球間質(zhì)增加，這與第六天的峰值一致(圖9B)。用PCNA的免疫染色評(píng)價(jià)腎小球細(xì)胞的增殖。PCNA陽(yáng)性細(xì)胞在Thy1 GN組中顯著增加，在第六天變?yōu)樽畲笾?圖9E)。
Col4在腎小球硬化中是ECM的主要構(gòu)成成分之一。Col4在正常對(duì)照組中沿著腎小球基底膜被弱染色，但腎小球部分幾乎不顯示陽(yáng)性(圖9G)。另一方面，在Thy1 GN組中，在已擴(kuò)張的腎小球系膜部分顯示強(qiáng)陽(yáng)性(圖9H)。
在Thy1 GN中，在腎小球，PDGF-B、BDGFβ受體也有意義地顯示陽(yáng)性(圖10)。這些發(fā)現(xiàn)揭示了腎小球系膜細(xì)胞的過(guò)量增殖、腎小球的肥大、腎小球硬化病變是在由抗Thy1抗體誘發(fā)的腎小球腎炎中同時(shí)發(fā)生的。
抗PDGFβ受體抗體在體內(nèi)抑制腎小球細(xì)胞增殖和腎小球硬化如已報(bào)道中的所述的那樣，APB5抑制PDGFβ受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。在Thy1 GN中，APB5處理在處理后的任何時(shí)刻都會(huì)使腎小球細(xì)胞數(shù)和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩方面減少(圖9C、9F、11A、11B)。PDGF-B鏈的過(guò)量表達(dá)和PDGFβ受體在APB5處理后呈有意義的減少(圖10C、10F)。就APB5處理而言，也使Thy1 GN中的腎小球系膜間質(zhì)增大有意義地減少。這是用占整個(gè)腎小球的PAM陽(yáng)性的面積的比例來(lái)評(píng)價(jià)(圖11C)。另外，Thy1 GN中的腎小球系膜細(xì)胞的Col4表達(dá)在APB5處理下減少(圖11D)。在Thy1 GN中，這些數(shù)據(jù)揭示了APB5處理會(huì)使腎小球系膜細(xì)胞的增殖和腎小球系膜間質(zhì)的增大這兩方面減少。
在Thy1 GN中Smad1、磷酸化Smad1(pSmad1)和磷酸化STAT3(pSTAT3)的表達(dá)的時(shí)程本發(fā)明人等用免疫染色對(duì)Thy1 GN大鼠腎中的Smad1的表達(dá)進(jìn)行了研究。Smad1在正常對(duì)照的腎小球中幾乎沒(méi)有被檢測(cè)出(圖12A)，第六天的Thy1 GN組的腎小球顯示了典型的腎小球系膜肥大像，Smad1強(qiáng)表達(dá)(圖12B)。為了定量Smad1的表達(dá)，使用IPAP圖像分析系統(tǒng)。腎小球的Smad1表達(dá)在第六天變?yōu)樽畲?圖13A)，與腎小球系膜細(xì)胞的增殖的峰值一致。如圖12C所示，腎小球的Smad1表達(dá)在第六天以后急劇地減少。
本發(fā)明人等接著研究了在Thy1 GN中是否發(fā)生Smad1的轉(zhuǎn)錄和Samd1的磷酸化。免疫組織染色的結(jié)果，在正常對(duì)照組中幾乎未見pSmad1(圖14A)。但是，在Thy1 GN組中，pSmad1在核部分顯示強(qiáng)陽(yáng)性(圖14B)。為了定量pSmad1的表達(dá)，檢測(cè)了每個(gè)腎小球的pSmad1陽(yáng)性細(xì)胞(圖13B)。腎小球的pSmad1的表達(dá)在Thy1 GN的第一天上升，在作為細(xì)胞增殖的初期的第四天與峰值一致。
從PDGF-B和PDGFβR在Thy1 GN中增加以及APB5抑制其過(guò)量表達(dá)的情況出發(fā)，本發(fā)明人等進(jìn)行了作為PDGF信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化STAT3的免疫染色(A24)。在Thy1 GN中，pSTAT3的表達(dá)在廣泛增加(圖15A、15B、15C)，在第六天變?yōu)樽畲?圖13C)。
在APB5處理組中，在Thy1 GN的腎小球中的Smad1和pSmad1蛋白的表達(dá)有意義地減少(圖12D、12E、14D、14E、16A、16B)。pSTAT3的過(guò)量表達(dá)也在APB5給藥后的任意調(diào)查點(diǎn)有意義地減少(圖15D、15E、16C)。
體外的抗PDGFβ-R抗體效應(yīng)為了確認(rèn)APB5是否抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖，本發(fā)明人等用BrdUELIZA對(duì)在APB5存在下或者不存在下的腎小球系膜細(xì)胞的增殖進(jìn)行探研究。如圖17A所示，APB5的添加抑制由PDGF引起的在腎小球中發(fā)生的DNA合成。
使用Wetern印跡研究APB5是否抑制用PDGF-B刺激的腎小球系膜細(xì)胞的pSTAT3、pSmad1、Col4的表達(dá)。APB5使STAT3和Smad1的磷酸化以及Col4的表達(dá)減少(圖17B)。
STAT3和Smad1的相互作用為了明確STAT3與使Col4表達(dá)增加的Smad1的相互作用，將結(jié)合了顯性陰性的STAT3的載體導(dǎo)入培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞中。
顯性陰性的STAT3的導(dǎo)入與導(dǎo)入野生型STAT3時(shí)相比，確實(shí)使pSmad1和Col4的表達(dá)減少(圖18)。
分析很多腎小球損害都以腎小球系膜細(xì)胞的增殖和腎小球硬化為特征，但這兩個(gè)重要的病理所見中共通的機(jī)制至今不明。在本研究中，首次揭示了STAT3和Smad1的活化是調(diào)節(jié)進(jìn)行性腎小球損害時(shí)的兩個(gè)現(xiàn)象、細(xì)胞增殖和腎小球硬化的相互作用的關(guān)鍵的路徑(pathway)。這些結(jié)果支持在成為21世紀(jì)全世界的主要問(wèn)題的慢性腎小球腎炎和糖尿病性腎病的病因研究和治療中存在新方向性。
腎小球硬化是包括慢性腎小球腎炎、IgG腎病、糖尿病性腎病的進(jìn)行展性腎小球損害的病理學(xué)特征。在很多腎小球疾病的初期，都發(fā)生腎小球細(xì)胞的增殖，接著發(fā)生腎小球硬化的進(jìn)展，逐漸進(jìn)入腎小球損害的晚期(A1、A2)。該過(guò)程的例子可在IgA腎病、膜增殖性腎小球腎炎、糖尿病性腎病、人和Thy1 GN、大鼠的腎切除模型等之類的全身性輕鏈病(A25、A26)。揭示了當(dāng)通過(guò)抗PDGF抗體(A7)、作為抗凝血?jiǎng)┑母嗡?A27)、維生素D類似物(A19)抑制腎小球細(xì)胞的增殖時(shí)，可以使持續(xù)進(jìn)展的進(jìn)行性腎小球硬化不發(fā)生，但其機(jī)制不明。在本研究中，本發(fā)明人等提示了有可能調(diào)節(jié)作為它們的病理學(xué)過(guò)程的、腎小球系膜細(xì)胞的增殖與腎小球硬化的相互作用的機(jī)制。
對(duì)小鼠和人腎小球系膜細(xì)胞的PDGF受體進(jìn)行鑒定(A28)。PDGF是腎小球系膜細(xì)胞的強(qiáng)大的成為關(guān)鍵的分裂促進(jìn)因子，在體外的腎小球系膜細(xì)胞中，作為自身分泌型的細(xì)胞增殖因子而被持續(xù)恒定地合成(A28、A29)。PDGF無(wú)論在體內(nèi)還是在體外，都在腎小球腎炎、糖尿病性腎病、進(jìn)行性腎小球硬化等病理學(xué)狀態(tài)的進(jìn)展中起到重要的作用(A3、A4)。已有報(bào)道PDGF受體酪氨酸激酶如果被活化，則STAT3蛋白被酪氨酸磷酸化(A30、A31)。該活化調(diào)節(jié)增殖和分化(A32、A33)。發(fā)明人等在體內(nèi)和體外揭示了已磷酸化的STAT3的過(guò)量表達(dá)伴隨PDGF和PDGFβ受體兩方面的過(guò)量表達(dá)已被確認(rèn)，在體內(nèi)和體外揭示了APB5減少PDGF、PDGFβ受體、STAT3的表達(dá)量而使腎小球腎炎恢復(fù)。
腎小球硬化的主要特征在于腎小球系膜的ECM量的增加。腎小球硬化的主要構(gòu)成要素之一是Col4(A34)。本發(fā)明人等最近報(bào)道了在糖尿病腎病中，Smad1無(wú)論在體內(nèi)還是在體外都是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子(A8)。揭示了已被磷酸化的Smad1與Col4的表達(dá)上升和腎小球ECM的增量并行強(qiáng)表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)明確了Smad1不僅在糖尿病性腎病中的腎小球硬化而且在腎小球腎炎中起到?jīng)Q定性的作用。本研究揭示了無(wú)論在體內(nèi)還是在體外，PDGF均誘導(dǎo)腎小球的已被磷酸化的Samd1的表達(dá)。
本發(fā)明人等確認(rèn)了STAT3和Smad1的相互作用調(diào)節(jié)腎小球硬化中的重要基因。通過(guò)導(dǎo)入顯性陰性的STAT3，在培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞中Col4的表達(dá)有意義地減少。STAT3和Smad1的活化可能分別獨(dú)立，但均被PDGF活化。進(jìn)而，從導(dǎo)入顯性陰性STAT3時(shí)Smad1的磷酸化會(huì)部分減少可以認(rèn)為Smad1的活化是STAT3活化機(jī)制的一部分。這些發(fā)現(xiàn)提示在腎小球腎炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，PDGF引起的STAT3活化與Smad1表達(dá)發(fā)生相互作用，然后發(fā)生Col4的活化。理解這兩個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路在明確進(jìn)行性腎小球損害的病理學(xué)過(guò)程方面很重要。
針對(duì)在各種臟器中發(fā)生的硬化的治療，被限定為對(duì)失去這些臟器功能進(jìn)行減速的輔助性治療。本發(fā)明人等的發(fā)現(xiàn)為引起硬化的其它增殖性疾病的本質(zhì)帶來(lái)了深入探討的空間。Smad1和STAT3由于在正常的腎小球中幾乎沒(méi)有，所以抑制Smad1和/或STAT3信號(hào)會(huì)通過(guò)所謂抑制病態(tài)活化的細(xì)胞增殖和ECM產(chǎn)生的機(jī)制，而在抑制引起硬化的各種腎疾病的進(jìn)展中發(fā)揮作用。
實(shí)施例3對(duì)糖尿病性腎病患者5名、糖尿病伴隨硬化病變的腎炎發(fā)病患者1名、糖尿病不伴隨硬化病變的腎炎發(fā)病患者2名、正常人2名的尿進(jìn)行取樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。將抗Smad-1抗體(Santa Cruz Biotechnology)和抗ALK-1抗體(R&S systems，ミネァポリス，美國(guó))作為第-抗體，使用Weaternブリ一ズ試劑盒(Invitrogen，東京，日本)，進(jìn)行Western印跡法。
提取作為糖尿病性腎病住院的患者的治療開始前的尿樣，然后在治療開始后每周提取尿樣，將抗ALK-1抗體作為第一抗體，同樣進(jìn)行Western印跡法。
Smad-1和ALK-3在糖尿病性腎病和已在腎中可見硬化的患者尿中檢測(cè)出，但在正常人和不伴隨硬化的腎炎患者的尿中沒(méi)有檢測(cè)出(圖17、圖19)。另外，ALK-1隨著糖尿病性腎病的治療而向尿中的排泄量經(jīng)時(shí)減少(圖18)。
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28.We thank K.Miyazono for providing a plasmid encoding Smad1，and Y.Takishita for hisassistance with histological analysis.We also thank the members of ourlaboratory for discussion.
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在本說(shuō)明書中引用的全部刊物、專利以及專利申請(qǐng)被直接作為參考引入本說(shuō)明書中。
工業(yè)上的可利用性通過(guò)本發(fā)明，揭示了Smad1作為與IV型膠原的過(guò)量產(chǎn)生直接相關(guān)的物質(zhì)而被鑒定，Smad1作為糖尿病性腎病的病因具有決定性的作用。這樣，糖尿病性腎病的檢測(cè)成為可能，進(jìn)而，提供了糖尿病性腎病的預(yù)防和/或治療藥、抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖的藥劑、抑制α1IV型膠原的表達(dá)的藥劑。另外，通過(guò)本發(fā)明，還提供了對(duì)在糖尿病性腎病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、對(duì)在抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、以及對(duì)在抑制α1IV型膠原的表達(dá)中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
另外，通過(guò)本發(fā)明，還揭示了STAT3和Smad1的活化是調(diào)節(jié)進(jìn)行性腎小球損害時(shí)的兩個(gè)現(xiàn)象、細(xì)胞增殖和腎小球硬化的相互作用的關(guān)鍵路徑。這樣，引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)成為可能，進(jìn)而，提供了引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療藥、抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖的藥劑、抑制α1IV型膠原的表達(dá)的藥劑。另外，本發(fā)明還提供了對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒、對(duì)在抑制細(xì)胞外基質(zhì)增殖中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒，以及對(duì)在抑制α1IV型膠原的表達(dá)中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒。
序列表自由文本(free text)<序列號(hào)1>
序列號(hào)1表示人來(lái)源的Smad1的mRNA的堿基序列。
<序列號(hào)2>
序列號(hào)2表示人來(lái)源的ALK1的mRNA的堿基序列。
<序列號(hào)3>
序列號(hào)3表示人來(lái)源的BMP2的mRNA的堿基序列。
<序列號(hào)4>
序列號(hào)4表示人來(lái)源的BMP4的mRNA的堿基序列。
<序列號(hào)5>
序列號(hào)5表示在對(duì)Smad1的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的正向引物(forward primer)的堿基序列。
<序列號(hào)6>
序列號(hào)6表示在對(duì)Smad1的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的反向引物(reverse primer)的堿基序列。
<序列號(hào)7>
序列號(hào)7表示在對(duì)ALK1的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的正向引物的堿基序列。
<序列號(hào)8>
序列號(hào)8表示在對(duì)ALK1的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的反向引物的堿基序列。
<序列號(hào)9>
序列號(hào)9表示在對(duì)BMP2的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的正向引物的堿基序列。
<序列號(hào)10>
序列號(hào)10表示在對(duì)BMP2的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的反向引物的堿基序列。
<序列號(hào)11>
序列號(hào)11表示在對(duì)BMP4的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的正向引物的堿基序列。
<序列號(hào)12>
序列號(hào)12表示在對(duì)BMP4的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的反向引物的堿基序列。
<序列號(hào)13>
序列號(hào)13表示相對(duì)Smad1的反義寡核苷酸的堿基序列。
<序列號(hào)14>
序列號(hào)14表示小鼠來(lái)源Col4基因的27bp的串聯(lián)反復(fù)序列。
<序列號(hào)15>
序列號(hào)15表示在ChIP檢測(cè)(assay)中使用的5’側(cè)的引物的堿基序列。
<序列號(hào)16>
序列號(hào)16表示在ChIP檢測(cè)中使用的3’側(cè)的引物的堿基序列。
<序列號(hào)17>
序列號(hào)17表示在RNA酶保護(hù)檢測(cè)中使用的探針的堿基序列。
<序列號(hào)18>
序列號(hào)18表示合成寡核苷酸的堿基序列。
<序列號(hào)19>
序列號(hào)19表示人來(lái)源的STAT3的mRNA的堿基序列。
<序列號(hào)20>
序列號(hào)20表示人來(lái)源的ALK3的mRNA的堿基序列。
<序列號(hào)21>
序列號(hào)21表示在對(duì)人來(lái)源的STAT3的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的正向引物的堿基序列。
<序列號(hào)22>
序列號(hào)22表示在對(duì)人來(lái)源的STAT3的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的反向引物的堿基序列。
<序列號(hào)23>
序列號(hào)23表示在對(duì)人來(lái)源的ALK3的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的正向引物的堿基序列。
<序列號(hào)24>
序列號(hào)24表示在對(duì)人來(lái)源的ALK3的mRNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增的RT-PCR中使用的反向引物的堿基序列。
序列表<110>秀比特生物技術(shù)公司土井俊夫中外制藥株式會(huì)社<120>引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法和試劑盒、引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療藥、以及對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法和試劑盒<130>FP-039PCT<140>
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<150>JP P2003-319538<151>2003-09-11<160>24<170>Patentln Ver.2.1<210>1<211>1990<212>mRNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(433)..(1830)<400>1gaattccggg ggtattggca gctgaggagt ggaggctggg cagctccgac tccctgacgc 60cagcgcgacc agatcaatcc aggctccagg agaaagcagg cgggcgggcg gagaaaggag 120aggccgagcg gctcaacccg ggccgaggct cggggagcgg agagtggcgc accgcccggc 180cgtccggacc cgggccgcga gaccccgctc gcccggccac tcgtgctccc gcacggacgg 240gcgcgccgcc aacccggtgc tgactgggtt acttttttaa acactaggaa tggtaatttc 300tactcttctg gacttcaaac taagaagtta aagagacttc tctgtaaata aacaaatctc 360ttctgctgtc cttttgcatt tggagacagc tttatttcac catatccaag gagtataact 420
agtgctgtca tt atg aat gtg aca agt tta ttt tcc ttt aca agt cca gct 471Met Asn Val Thr Ser Leu Phe Ser Phe Thr Ser Pro Ala1 5 10gtg aag aga ctt ctt ggg tgg aaa cag ggc gat gaa gaa gaa aaa tgg519Val Lys Arg Leu Leu Gly Trp Lys Gln Gly Asp Glu Glu Glu Lys Trp15 20 25gca gag aaa gct gtt gat gct ttg gtg aaa aaa ctg aag aaa aag aaa567Ala Glu Lys Ala Val Asp Ala Leu Val Lys Lys Leu Lys Lys Lys Lys30 35 40 45ggt gcc atg gag gaa ctg gaa aag gcc ttg agc tgc cca ggg caa ccg615Gly Ala Met Glu Glu Leu Glu Lys Ala Leu Ser Cys Pro Gly Gln Pro50 55 60agt aac tgt gtc acc att ccc cgc tct ctg gat ggc agg ctg caa gtc663Ser Asn Cys Val Thr Ile Pro Arg Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gln Val65 70 75tcc cac cgg aag gga ctg cct cat gtc att tac tgc cgt gtg tgg cgc711Ser His Arg Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr Cys Arg Val Trp Arg80 85 90tgg ccc gat ctt cag agc cac cat gaa cta aaa cca ctg gaa tgc tgt759Trp Pro Asp Leu Gln Ser His His Glu Leu Lys Pro Leu Glu Cys Cys95 100 105gag ttt cct ttt ggt tcc aag cag aag gag gtc tgc atc aat ccc tac807Glu Phe Pro Phe Gly Ser Lys Gln Lys Glu Val Cys Ile Asn Pro Tyr110 115 120 125cac tat aag aga gta gaa agc cct gta ctt cct cct gtg ctg gtt cca855His Tyr Lys Arg Val Glu Ser Pro Val Leu Pro Pro Val Leu Val Pro130 135 140aga cac agc gaa tat aat cct cag cac agc ctc tta gct cag ttc cgt903Arg His Ser Glu Tyr Asn Pro Gln His Ser Leu Leu Ala Gln Phe Arg145 150 155aac tta gga caa aat gag cct cac atg cca ctc aac gcc act ttt cca951Asn Leu Gly Gln Asn Glu Pro His Met Pro Leu Asn Ala Thr Phe Pro160 165 170gat tct ttc cag caa ccc aac agc cac ccg ttt cct cac tct ccc aat999Asp Ser Phe Gln Gln Pro Asn Ser His Pro Phe Pro His Ser Pro Asn175 180 185
agc agt tac cca aac tct cct ggg agc agc agc agc acc tac cct cac1047Ser Ser Tyr Pro Asn Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Pro His190 195 200 205tct ccc acc agc tca gac cca gga agc cct ttc cag atg cca gct gat1095Ser Pro Thr Ser Ser Asp Pro Gly Ser Pro Phe Gln Met Pro Ala Asp210 215 220acg ccc cca cct gct tac ctg cct cct gaa gac ccc atg acc cag gat1143Thr Pro Pro Pro Ala Tyr Leu Pro Pro Glu Asp Pro Met Thr Gln Asp225 230 235ggc tct cag ccg atg gac aca aac atg atg gcg cct ccc ctg ccc tca1191Gly Ser Gln Pro Met Asp Thr Asn Met Met Ala Pro Pro Leu Pro Ser240 245 250gaa atc aac aga gga gat gtt cag gcg gtt gct tat gag gaa cca aaa1239Glu Ile Asn Arg Gly Asp Val Gln Ala Val Ala Tyr Glu Glu Pro Lys255 260 265cac tgg tgc tct att gtc tac tat gag ctc aac aat cgt gtg ggt gaa1287His Trp Cys Ser Ile Val Tyr Tyr Glu Leu Asn Asn Arg Val Gly Glu270 275 280 285gcg ttc cat gcc tcc tcc aca agt gtg ttg gtg gat ggt ttc act gat1335Ala Phe His Ala Ser Ser Thr Ser Val Leu Val Asp Gly Phe Thr Asp290 295 300cct tcc aac aat aag aac cgt ttc tgc ctt ggg ctg ctc tcc aat gtt1383Pro Ser Asn Asn Lys Asn Arg Phe Cys Leu Gly Leu Leu Ser Asn Val305 310 315aac cgg aat tcc act att gaa aac acc agg cgg cat att gga aaa gga1431Asn Arg Asn Ser Thr Ile Glu Asn Thr Arg Arg His Ile Gly Lys Gly320 325 330gtt cat ctt tat tat gtt gga ggg gag gtg tat gcc gaa tgc ctt agt1479Val His Leu Tyr Tyr Val Gly Gly Glu Val Tyr Ala Glu Cys Leu Ser335 340 345gac agt agc atc ttt gtg caa agt cgg aac tgc aac tac cat cat gga1527Asp Ser Ser Ile Phe Val Gln Ser Arg Asn Cys Asn Tyr His His Gly350 355 360 365ttt cat cct act act gtt tgc aag atc cct agt ggg tgt agt ctg aaa1575Phe His Pro Thr Thr Val Cys Lys Ile Pro Ser Gly Cys Ser Leu Lys370 375 380
att ttt aac aac caa gaa ttt gct cag tta ttg gca cag tct gtg aac 1623Ile Phe Asn Asn Gln Glu Phe Ala Gln Leu Leu Ala Gln Ser Val Asn385 390 395cat gga ttt gag aca gtc tat gag ctt aca aaa atg tgt act ata cgt 1671His Gly Phe Glu Thr Val Tyr Glu Leu Thr Lys Met Cys Thr Ile Arg400 405 410atg agc ttt gtg aag ggc tgg gga gca gaa tac cac cgc cag gat gtt 1719Met Ser Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala Glu Tyr His Arg Gln Asp Val415 420 425act agc acc ccc tgc tgg att gag ata cat ctg cac ggc ccc ctc cag 1767Thr Ser Thr Pro Cys Trp Ile Glu Ile His Leu His Gly Pro Leu Gln430 435 440 445tgg ctg gat aaa gtt ctt act caa atg ggt tca cct cat aat cct att 1815Trp Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser Pro His Asn Pro Ile450 455 460tca tct gta tct taa atggccccag catctgcctc tggaaaacta ttgagccttg 1870Ser Ser Val Ser465catgtacttg aaggatggat gagtcagaca cgattgagaa ctgacaaagg agccttgata 1930atacttgacc tctgtgacca actgttggat tcagaaattt aaacaaaaaa aaaaaaaaaa 1990<210>2<211>1970<212>mRNA<213>人<220>
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Met Thr Leu Gly1tcc ccc agg aaa ggc ctt ctg atg ctg ctg atg gcc ttg gtg acc cag342Ser Pro Arg Lys Gly Leu Leu Met Leu Leu Met Ala Leu Val Thr Gln5 10 15 20gga gac cct gtg aag ccg tct cgg ggc ccg ctg gtg acc tgc acg tgt390Gly Asp Pro Val Lys Pro Ser Arg Gly Pro Leu Val Thr Cys Thr Cys25 30 35gag agc cca cat tgc aag ggg cct acc tgc cgg ggg gcc tgg tgc aca438Glu Ser Pro His Cys Lys Gly Pro Thr Cys Arg Gly Ala Trp Cys Thr40 45 50gta gtg ctg gtg cgg gag gag ggg agg cac ccc cag gaa cat cgg ggc486Val Val Leu Val Arg Glu Glu Gly Arg His Pro Gln Glu His Arg Gly55 60 65tgc ggg aac ttg cac agg gag ctc tgc agg ggg cgc ccc acc gag ttc534Cys Gly Asn Leu His Arg Glu Leu Cys Arg Gly Arg Pro Thr Glu Phe70 75 80gtc aac cac tac tgc tgc gac agc cac ctc tgc aac cac aac gtg tcc582Val Asn His Tyr Cys Cys Asp Ser His Leu Cys Asn His Asn Val Ser85 90 95 100ctg gtg ctg gag gcc acc caa cct cct tcg gag cag ccg gga aca gat630Leu Val Leu Glu Ala Thr Gln Pro Pro Ser Glu Gln Pro Gly Thr Asp105 110 115ggc cag ctg gcc ctg atc ctg ggc ccc gtg ctg gcc ttg ctg gcc ctg678Gly Gln Leu Ala Leu Ile Leu Gly Pro Val Leu Ala Leu Leu Ala Leu120 125 130gtg gcc ctg ggt gtc ctg ggc ctg tgg cat gtc cga cgg agg cag gag726Val Ala Leu Gly Val Leu Gly Leu Trp His Val Arg Arg Arg Gln Glu135 140 145aag cag cgt ggc ctg cac agc gag ctg gga gag tcc agt ctc atc ctg774Lys Gln Arg Gly Leu His Ser Glu Leu Gly Glu Ser Ser Leu Ile Leu150 155 160aaa gca tct gag cag ggc gac acg atg ttg ggg gac ctc ctg gac agt822Lys Ala Ser Glu Gln Gly Asp Thr Met Leu Gly Asp Leu Leu Asp Ser165 170 175 180gac tgc acc aca ggg agt ggc tca ggg ctc ccc ttc ctg gtg cag agg870
Asp Cys Thr Thr Gly Ser Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg185 190 195aca gtg gca cgg cag gtt gcc ttg gtg gag tgt gtg gga aaa ggc cgc918Thr Val Ala Arg Gln Val Ala Leu Val Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg200 205 210tat ggc gaa gtg tgg cgg ggc ttg tgg cac ggt gag agt gtg gcc gtc966Tyr Gly Glu Val Trp Arg Gly Leu Trp His Gly Glu Ser Val Ala Val215 220 225aag atc ttc tcc tcg agg gat gaa cag tcc tgg ttc cgg gag act gag1014Lys Ile Phe Ser Ser Arg Asp Glu Gln Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu230 235 240atc tat aac aca gta ttg ctc aga cac gac aac atc cta ggc ttc atc1062Ile Tyr Asn Thr Val Leu Leu Arg His Asp Asn Ile Leu Gly Phe Ile245 250 255 260gcc tca gac atg acc tcc cgc aac tcg agc acg cag ctg tgg ctc atc1110Ala Ser Asp Met Thr Ser Arg Asn Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile265 270 275acg cac tac cac gag cac ggc tcc ctc tac gac ttt ctg cag aga cag1158Thr His Tyr His Glu His Gly Ser Leu Tyr Asp Phe Leu Gln Arg Gln280 285 290acg ctg gag ccc cat ctg gct ctg agg cta gct gtg tcc gcg gca tgc1206Thr Leu Glu Pro His Leu Ala Leu Arg Leu Ala Val Ser Ala Ala Cys295 300 305ggc ctg gcg cac ctg cac gtg gag atc ttc ggt aca cag ggc aaa cca1254Gly Leu Ala His Leu His Val Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro310 315 320gcc att gcc cac cgc gac ttc aag agc cgc aat gtg ctg gtc aag agc1302Ala Ile Ala His Arg Asp Phe Lys Ser Arg Asn Val Leu Val Lys Ser325 330 335 340aac ctg cag tgt tgc atc gcc gac ctg ggc ctg gct gtg atg cac tca1350Asn Leu Gln Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser345 350 355cag ggc agc gat tac ctg gac atc ggc aac aac ccg aga gtg ggc acc1398Gln Gly Ser Asp Tyr Leu Asp Ile Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr360 365 370aag cgg tac atg gca ccc gag gtg ctg gac gag cag atc cgc acg gac1446
Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp Glu Gln Ile Arg Thr Asp375 380 385tgc ttt gag tcc tac aag tgg act gac atc tgg gcc ttt ggc ctg gtg 1494Cys Phe Glu Ser Tyr Lys Trp Thr Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val390 395 400ctg tgg gag att gcc cgc cgg acc atc gtg aat ggc atc gtg gag gac 1542Leu Trp Glu Ile Ala Arg Arg Thr Ile Val Asn Gly Ile Val Glu Asp405 410 415 420tat aga cca ccc ttc tat gat gtg gtg ccc aat gac ccc agc ttt gag 1590Tyr Arg Pro Pro Phe Tyr Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu425 430 435gac atg aag aag gtg gtg tgt gtg gat cag cag acc ccc acc atc cct 1638Asp Met Lys Lys Val Val Cys Val Asp Gln Gln Thr Pro Thr Ile Pro440 445 450aac cgg ctg gct gca gac ccg gtc ctc tca ggc cta gct cag atg atg 1686Asn Arg Leu Ala Ala Asp Pro Val Leu Ser Gly Leu Ala Gln Met Met455 460 465cgg gag tgc tgg tac cca aac ccc tct gcc cga ctc acc gcg ctg cgg 1734Arg Glu Cys Trp Tyr Pro Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg470 475 480atc aag aag aca cta caa aaa att agc aac agt cca gag aag cct aaa 1782Ile Lys Lys Thr Leu Gln Lys Ile Ser Asn Ser Pro Glu Lys Pro Lys485 490 495 500gtg att caa tag cccaggagca cctgattcct ttctgcctgc agggggctgg 1834Val Ile Glngggggtgggg ggcagtggat ggtgccctat ctgggtagag gtagtgtgag tgtggtgtgt 1894gctggggatg ggcagctgcg cctgcctgct cggcccccag cccacccagc caaaaataca 1954gctgggctga aacctg 1970<210>3<211>1547<212>mRNA<213>人<220>
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atc ccc acg gag gag ttt atc acc tca gca gag ctt cag gtt ttc cga785Ile Pro Thr Glu Glu Phe Ile Thr Ser Ala Glu Leu Gln Val Phe Arg140 145 150gaa cag atg caa gat gct tta gga aac aat agc agt ttc cat cac cga833Glu Gln Met Gln Asp Ala Leu Gly Asn Asn Ser Ser Phe His His Arg155 160 165 170att aat att tat gaa atc ata aaa cct gca aca gcc aac tcg aaa ttc881Ile Asn Ile Tyr Glu Ile Ile Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser Lys Phe175 180 185ccc gtg acc aga ctt ttg gac acc agg ttg gtg aat cag aat gca agc929Pro Val Thr Arg Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val Asn Gln Asn Ala Ser190 195 200agg tgg gaa agt ttt gat gtc acc ccc gct gtg atg cgg tgg act gca977Arg Trp Glu Ser Phe Asp Val Thr Pro Ala Val Met Arg Trp Thr Ala205 210 215cag gga cac gcc aac cat gga ttc gtg gtg gaa gtg gcc cac ttg gag1025Gln Gly His Ala Asn His Gly Phe Val Val Glu Val Ala His Leu Glu220 225 230gag aaa caa ggt gtc tcc aag aga cat gtt agg ata agc agg tct ttg1073Glu Lys Gln Gly Val Ser Lys Arg His Val Arg Ile Ser Arg Ser Leu235 240 245 250cac caa gat gaa cac agc tgg tca cag ata agg cca ttg cta gta act1121His Gln Asp Glu His Ser Trp Ser Gln Ile Arg Pro Leu Leu Val Thr255 260 265ttt ggc cat gat gga aaa ggg cat cct ctc cac aaa aga gaa aaa cgt1169Phe Gly His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg270 275 280caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga1217Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg285 290 295cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att1265His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile300 305 310gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct1313Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro315 320 325 330
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>9cccagcgtga aaagagagac20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>10gagaccgcag tccgtctaag20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>11tgagcctttc cagcaagttt20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>12cttccccgtc tcaggtatca20<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>13caagctggtc acattcatag cggct 25<210>14<211>27<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>14ttcctcccct tggaggagcg ccgcccg27<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA
<400>15ggagctcccc aatttgttg 19<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>16cagcctccgc ctcttacc 18<210>17<211>262<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>17cccaccaccg tctgcaagat ccccagcggg tgcagcttga aaatcttcaa caaccaagag 60tttgctcagc tactggcgca gtctgtgaac cacgggttcg agaccgtgta tgaactcacc 120aaaatgtgca ctattcggat gagcttcgtg aagggttggg gagccgaata ccaccggcag 180gatgttacca gcaccccctg ctggattgag atccatctgc atggccctct ccagtggctg 240gataaggttc tgacccagat gg 262<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>18catgctcgtc acattcaaag ccgct 25<210>19<211>4978<212>mRNA<213>人
<220>
<221>CDS<222>(241)..(2553)<400>19ggtttccgga gctgcggcgg cgcagactgg gagggggagc cgggggttcc gacgtcgcag 60ccgagggaac aagccccaac cggatcctgg acaggcaccc cggcttggcg ctgtctctcc 120ccctcggctc ggagaggccc ttcggcctga gggagcctcg ccgcccgtcc ccggcacacg 180cgcagccccg gcctctcggc ctctgccgga gaaacagttg ggacccctga ttttagcagg 240atg gcc caa tgg aat cag cta cag cag ctt gac aca cgg tac ctg gag 288Met Ala Gln Trp Asn Gln Leu Gln Gln Leu Asp Thr Arg Tyr Leu Glu1 5 10 15cag ctc cat cag ctc tac agt gac agc ttc cca atg gag ctg cgg cag 336Gln Leu His Gln Leu Tyr Ser Asp Ser Phe Pro Met Glu Leu Arg Gln20 25 30ttt ctg gcc cct tgg att gag agt caa gat tgg gca tat gcg gcc agc 384Phe Leu Ala Pro Trp Ile Glu Ser Gln Asp Trp Ala Tyr Ala Ala Ser35 40 45aaa gaa tca cat gcc act ttg gtg ttt cat aat ctc ctg gga gag att 432Lys Glu Ser His Ala Thr Leu Val Phe His Asn Leu Leu Gly Glu Ile50 55 60gac cag cag tat agc cgc ttc ctg caa gag tcg aat gtt ctc tat cag 480Asp Gln Gln Tyr Ser Arg Phe Leu Gln Glu Ser Asn Val Leu Tyr Gln65 70 75 80cac aat cta cga aga atc aag cag ttt ctt cag agc agg tat ctt gag 528His Asn Leu Arg Arg Ile Lys Gln Phe Leu Gln Ser Arg Tyr Leu Glu85 90 95aag cca atg gag att gcc cgg att gtg gcc cgg tgc ctg tgg gaa gaa 576Lys Pro Met Glu Ile Ala Arg Ile Val Ala Arg Cys Leu Trp Glu Glu100 105 110tca cgc ctt cta cag act gca gcc act gcg gcc cag caa ggg ggc cag 624Ser Arg Leu Leu Gln Thr Ala Ala Thr Ala Ala Gln Gln Gly Gly Gln115 120 125gcc aac cac ccc aca gca gcc gtg gtg acg gag aag cag cag atg ctg 672Ala Asn His Pro Thr Ala Ala Val Val Thr Glu Lys Gln Gln Met Leu130 135 140
gag cag cac ctt cag gat gtc cgg aag aga gtg cag gat cta gaa cag720Glu Gln His Leu Gln Asp Val Arg Lys Arg Val Gln Asp Leu Glu Gln145 150 155 160aaa atg aaa gtg gta gag aat ctc cag gat gac ttt gat ttc aac tat768Lys Met Lys Val Val Glu Asn Leu Gln Asp Asp Phe Asp Phe Asn Tyr165 170 175aaa acc ctc aag agt caa gga gac atg caa gat ctg aat gga aac aac816Lys Thr Leu Lys Ser Gln Gly Asp Met Gln Asp Leu Asn Gly Asn Asn180 185 190cag tca gtg acc agg cag aag atg cag cag ctg gaa cag atg ctc act864Gln Ser Val Thr Arg Gln Lys Met Gln Gln Leu Glu Gln Met Leu Thr195 200 205gcg ctg gac cag atg cgg aga agc atc gtg agt gag ctg gcg ggg ctt912Ala Leu Asp Gln Met Arg Arg Ser Ile Val Ser Glu Leu Ala Gly Leu210 215 220ttg tca gcg atg gag tac gtg cag aaa act ctc acg gac gag gag ctg960Leu Ser Ala Met Glu Tyr Val Gln Lys Thr Leu Thr Asp Glu Glu Leu225 230 235 240gct gac tgg aag agg cgg caa cag att gcc tgc att gga ggc ccg ccc1008Ala Asp Trp Lys Arg Arg Gln Gln Ile Ala Cys Ile Gly Gly Pro Pro245 250 255aac atc tgc cta gat cgg cta gaa aac tgg ata acg tca tta gca gaa1056Asn Ile Cys Leu Asp Arg Leu Glu Asn Trp Ile Thr Ser Leu Ala Glu260 265 270tct caa ctt cag acc cgt caa caa att aag aaa ctg gag gag ttg cag1104Ser Gln Leu Gln Thr Arg Gln Gln Ile Lys Lys Leu Glu Glu Leu Gln275 280 285caa aaa gtt tcc tac aaa ggg gac ccc att gta cag cac cgg ccg atg1152Gln Lys Val Ser Tyr Lys Gly Asp Pro Ile Val Gln His Arg Pro Met290 295 300ctg gag gag aga atc gtg gag ctg ttt aga aac tta atg aaa agt gcc1200Leu Glu Glu Arg Ile Val Glu Leu Phe Arg Asn Leu Met Lys Ser Ala305 310 315 320ttt gtg gtg gag cgg cag ccc tgc atg ccc atg cat cct gac cgg ccc1248Phe Val Val Glu Arg Gln Pro Cys Met Pro Met His Pro Asp Arg Pro325 330 335
ctc gtc atc aag acc ggc gtc cag ttc act act aaa gtc agg ttg ctg1296Leu Val Ile Lys Thr Gly Val Gln Phe Thr Thr Lys Val Arg Leu Leu340 345 350gtc aaa ttc cct gag ttg aat tat cag ctt aaa att aaa gtg tgc att1344Val Lys Phe Pro Glu Leu Asn Tyr Gln Leu Lys Ile Lys Val Cys Ile355 360 365gac aaa gac tct ggg gac gtt gca gct ctc aga gga tcc cgg aaa ttt1392Asp Lys Asp Ser Gly Asp Val Ala Ala Leu Arg Gly Ser Arg Lys Phe370 375 380aac att ctg ggc aca aac aca aaa gtg atg aac atg gaa gaa tcc aac1440Asn Ile Leu Gly Thr Asn Thr Lys Val Met Asn Met Glu Glu Ser Asn385 390 395 400aac ggc agc ctc tct gca gaa ttc aaa cac ttg acc ctg agg gag cag1488Asn Gly Ser Leu Ser Ala Glu Phe Lys His Leu Thr Leu Arg Glu Gln405 410 415aga tgt ggg aat ggg ggc cga gcc aat tgt gat gct tcc ctg att gtg1536Arg Cys Gly Asn Gly Gly Arg Ala Asn Cys Asp Ala Ser Leu Ile Val420 425 430act gag gag ctg cac ctg atc acc ttt gag acc gag gtg tat cac caa1584Thr Glu Glu Leu His Leu Ile Thr Phe Glu Thr Glu Val Tyr His Gln435 440 445ggc ctc aag att gac cta gag acc cac tcc ttg cca gtt gtg gtg atc1632Gly Leu Lys Ile Asp Leu Glu Thr His Ser Leu Pro Val Val Val Ile450 455 460tcc aac atc tgt cag atg cca aat gcc tgg gcg tcc atc ctg tgg tac1680Ser Asn Ile Cys Gln Met Pro Asn Ala Trp Ala Ser Ile Leu Trp Tyr465 470 475 480aac atg ctg acc aac aat ccc aag aat gta aac ttt ttt acc aag ccc1728Asn Met Leu Thr Asn Asn Pro Lys Asn Val Asn Phe Phe Thr Lys Pro485 490 495cca att gga acc tgg gat caa gtg gcc gag gtc ctg agc tgg cag ttc1776Pro Ile Gly Thr Trp Asp Gln Val Ala Glu Val Leu Ser Trp Gln Phe500 505 510tcc tcc acc acc aag cga gga ctg agc atc gag cag ctg act aca ctg1824Ser Ser Thr Thr Lys Arg Gly Leu Ser Ile Glu Gln Leu Thr Thr Leu515 520 525
gca gag aaa ctc ttg gga cct ggt gtg aat tat tca ggg tgt cag atc1872Ala Glu Lys Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Tyr Ser Gly Cys Gln Ile530 535 540aca tgg gct aaa ttt tgc aaa gaa aac atg gct ggc aag ggc ttc tcc1920Thr Trp Ala Lys Phe Cys Lys Glu Asn Met Ala Gly Lys Gly Phe Ser545 550 555 560ttc tgg gtc tgg ctg gac aat atc att gac ctt gtg aaa aag tac atc1968Phe Trp Val Trp Leu Asp Asn Ile Ile Asp Leu Val Lys Lys Tyr Ile565 570 575ctg gcc ctt tgg aac gaa ggg tac atc atg ggc ttt atc agt aag gag2016Leu Ala Leu Trp Asn Glu Gly Tyr Ile Met Gly Phe Ile Ser Lys Glu580 585 590cgg gag cgg gcc atc ttg agc act aag cct cca ggc acc ttc ctg cta2064Arg Glu Arg Ala Ile Leu Ser Thr Lys Pro Pro Gly Thr Phe Leu Leu595 600 605aga ttc agt gaa agc agc aaa gaa gga ggc gtc act ttc act tgg gtg2112Arg Phe Ser Glu Ser Ser Lys Glu Gly Gly Val Thr Phe Thr Trp Val610 615 620gag aag gac atc agc ggt aag acc cag atc cag tcc gtg gaa cca tac2160Glu Lys Asp Ile Ser Gly Lys Thr Gln Ile Gln Ser Val Glu Pro Tyr625 630 635 640aca aag cag cag ctg aac aac atg tca ttt gct gaa atc atc atg ggc2208Thr Lys Gln Gln Leu Asn Asn Met Ser Phe Ala Glu Ile Ile Met Gly645 650 655tat aag atc atg gat gct acc aat atc ctg gtg tct cca ctg gtc tat2256Tyr Lys Ile Met Asp Ala Thr Asn Ile Leu Val Ser Pro Leu Val Tyr660 665 670ctc tat cct gac att ccc aag gag gag gca ttc gga aag tat tgt cgg2304Leu Tyr Pro Asp Ile Pro Lys Glu Glu Ala Phe Gly Lys Tyr Cys Arg675 680 685cca gag agc cag gag cat cct gaa gct gac cca ggt agc gct gcc cca2352Pro Glu Ser Gln Glu His Pro Glu Ala Asp Pro Gly Ser Ala Ala Pro690 695 700tac ctg aag acc aag ttt atc tgt gtg aca cca acg acc tgc agc aat2400Tyr Leu Lys Thr Lys Phe Ile Cys Val Thr Pro Thr Thr Cys Ser Asn705 710 715 720
acc att gac ctg ccg atg tcc ccc cgc act tta gat tca ttg atg cag2448Thr Ile Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Thr Leu Asp Ser Leu Met Gln725 730 735ttt gga aat aat ggt gaa ggt gct gaa ccc tca gca gga ggg cag ttt2496Phe Gly Asn Asn Gly Glu Gly Ala Glu Pro Ser Ala Gly Gly Gln Phe740 745 750gag tcc ctc acc ttt gac atg gag ttg acc tcg gag tgc gct acc tcc2544Glu Ser Leu Thr Phe Asp Met Glu Leu Thr Ser Glu Cys Ala Thr Ser755 760 765ccc atg tga ggagctgaga acggaagctg cagaaagata cgactgaggc2593Pro Met770gcctacctgc attctgccac ccctcacaca gccaaacccc agatcatctg aaactactaa 2653ctttgtggtt ccagattttt tttaatctcc tacttctgct atctttgagc aatctgggca 2713cttttaaaaa tagagaaatg agtgaatgtg ggtgatctgc ttttatctaa atgcaaataa 2773ggatgtgttc tctgagaccc atgatcaggg gatgtggcgg ggggtggcta gagggagaaa 2833aaggaaatgt cttgtgttgt tttgttcccc tgccctcctt tctcagcagc tttttgttat 2893tgttgttgtt gttcttagac aagtgcctcc tggtgcctgc ggcatccttc tgcctgtttc 2953tgtaagcaaa tgccacaggc cacctatagc tacatactcc tggcattgca ctttttaacc 3013ttgctgacat ccaaatagaa gataggacta tctaagccct aggtttcttt ttaaattaag 3073aaataataac aattaaaggg caaaaaacac tgtatcagca tagcctttct gtatttaaga 3133aacttaagca gccgggcatg gtggctcacg cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 3193gcggatcata aggtcaggag atcaagacca tcctggctaa cacggtgaaa ccccgtctct 3253actaaaagta caaaaaatta gctgggtgtg gtggtgggcg cctgtagtcc cagctactcg 3313ggaggctgag gcaggagaat cgcttgaacc tgagaggcgg aggttgcagt gagccaaaat 3373tgcaccactg cacactgcac tccatcctgg gcgacagtct gagactctgt ctcaaaaaaa 3433aaaaaaaaaa aaagaaactt cagttaacag cctccttggt gctttaagca ttcagcttcc 3493ttcaggctgg taatttatat aatccctgaa acgggcttca ggtcaaaccc ttaagacatc 3553
tgaagctgca acctggcctt tggtgttgaa ataggaaggt ttaaggagaa tctaagcatt 3613ttagactttt ttttataaat agacttattt tcctttgtaa tgtattggcc ttttagtgag 3673taaggctggg cagagggtgc ttacaacctt gactcccttt ctccctggac ttgatctgct 3733gtttcagagg ctaggttgtt tctgtgggtg ccttatcagg gctgggatac ttctgattct 3793ggcttccttc ctgccccacc ctcccgaccc cagtccccct gatcctgcta gaggcatgtc 3853tccttgcgtg tctaaaggt ccctcatcctg tttgttttag gaatcctggt ctcaggacct 3913catggaagaa gagggggaga gagttacagg ttggacatga tgcacactat ggggccccag 3973cgacgtgtct ggttgagctc agggaatatg gttcttagcc agtttcttgg tgatatccag 4033tggcacttgt aatggcgtct tcattcagtt catgcagggc aaaggcttac tgataaactt 4093gagtctgccc tcgtatgagg gtgtatacct ggcctccctc tgaggctggt gactcctccc 4153tgctggggcc ccacaggtga ggcagaacag ctagagggcc tccccgcctg cccgccttgg 4213ctggctagct cgcctctcct gtgcgtatgg gaacacctag cacgtgctgg atgggctgcc 4273tctgactcag aggcatggcc ggatttggca actcaaaacc accttgcctc agctgatcag 4333agtttctgtg gaattctgtt tgttaaatca aattagctgg tctctgaatt aagggggaga 4393cgaccttctc taagatgaac agggttcgcc ccagtcctcc tgcctggaga cagttgatgt 4453gtcatgcaga gctcttactt ctccagcaac actcttcagt acataataag cttaactgat 4513aaacagaata tttagaaagg tgagacttgg gcttaccatt gggtttaaat catagggacc 4573tagggcgagg gttcagggct tctctggagc agatattgtc aagttcatgg ccttaggtag 4633catgtatctg gtcttaactc tgattgtagc aaaagttctg agaggagctg agccctgttg 4693tggcccatta aagaacaggg tcctcaggcc ctgcccgctt cctgtccact gccccctccc 4753catccccagc ccagccgagg gaatcccgtg ggttgcttac ctacctataa ggtggtttat 4813aagctgctgt cctggccact gcattcaaat tccaatgtgt acttcatagt gtaaaaattt 4873atattattgt gaggtttttt gtcttttttt tttttttttt tttttggtat attgctgtat 4933ctactttaac ttccagaaat aaacgttata taggaaccgt aaaaa 4978
<210>20<211>3631<212>mRNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(549)..(2147)<400>20gcggccgctg cagagattgg aatccgcctg ccgggcttgg cgaaggagaa gggaggaggc 60aggagcgagg agggaggagg gccaagggcg ggcaggaagg cttaggctcg gcgcgtccgt 120ccgcgcgcgg cgaagatcgc acggcccgat cgaggggcga ccgggtcggg gccgctgcac 180gccaagggcg aaggccgatt cgggccccac ttcgccccgg cggctcgccg cgcccacccg 240ctccgcgccg agggctggag gatgcgttcc ctggggtccg gacttatgaa aatatgcatc 300agtttaatac tgtcttggaa ttcatgagat ggaagcatag gtcaaagctg tttggagaaa 360atcagaagta cagttttatc tagccacatc ttggaggagt cgtaagaaag cagtgggagt 420tgaagtcatt gtcaagtgct tgcgatcttt tacaagaaaa tctcactgaa tgatagtcat 480ttaaattggt gaagtagcaa gaccaattat taaaggtgac agtacacagg aaacattaca 540attgaaca atg cct cag cta tac att tac atc aga tta ttg gga gcc tat 590Met Pro Gln Leu Tyr Ile Tyr Ile Arg Leu Leu Gly Ala Tyr1 5 10ttg ttc atc att tct cgt gtt caa gga cag aat ctg gat agt atg ctt 638Leu Phe Ile Ile Ser Arg Val Gln Gly Gln Asn Leu Asp Ser Met Leu15 20 25 30cat ggc act ggg atg aaa tca gac tcc gac cag aaa aag tca gaa aat 686His Gly Thr Gly Met Lys Ser Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ser Glu Asn35 40 45gga gta acc tta gca cca gag gat acc ttg cct ttt tta aag tgc tat 734Gly Val Thr Leu Ala Pro Glu Asp Thr Leu Pro Phe Leu Lys Cys Tyr50 55 60tgc tca ggg cac tgt cca gat gat gct att aat aac aca tgc ata act 782Cys Ser Gly His Cys Pro Asp Asp Ala Ile Asn Asn Thr Cys Ile Thr
65 70 75aat gga cat tgc ttt gcc atc ata gaa gaa gat gac cag gga gaa acc830Asn Gly His Cys Phe Ala Ile Ile Glu Glu Asp Asp Gln Gly Glu Thr80 85 90aca tta gct tca ggg tgt atg aaa tat gaa gga tct gat ttt cag tgc878Thr Leu Ala Ser Gly Cys Met Lys Tyr Glu Gly Ser Asp Phe Gln Cys95 100 105 110aaa gat tct cca aaa gcc cag cta cgc cgg aca ata gaa tgt tgt cgg926Lys Asp Ser Pro Lys Ala Gln Leu Arg Arg Thr Ile Glu Cys Cys Arg115 120 125acc aat tta tgt aac cag tat ttg caa ccc aca ctg ccc cct gtt gtc974Thr Asn Leu Cys Asn Gln Tyr Leu Gln Pro Thr Leu Pro Pro Val Val130 135 140ata ggt ccg ttt ttt gat ggc agc att cga tgg ctg gtt ttg ctc att1022Ile Gly Pro Phe Phe Asp Gly Ser Ile Arg Trp Leu Val Leu Leu Ile145 150 155tct atg gct gtc tgc ata att gct atg atc atc ttc tcc agc tgc ttt1070Ser Met Ala Val Cys Ile Ile Ala Met Ile Ile Phe Ser Ser Cys Phe160 165 170tgt tac aaa cat tat tgc aag agc atc tca agc aga cgt cgt tac aat1118Cys Tyr Lys His Tyr Cys Lys Ser Ile Ser Ser Arg Arg Arg Tyr Asn175 180 185 190cgt gat ttg gaa cag gat gaa gca ttt att cca gtt gga gaa tca cta1166Arg Asp Leu Glu Gln Asp Glu Ala Phe Ile Pro Val Gly Glu Ser Leu195 200 205aaa gac ctt att gac cag tca caa agt tct ggt agt ggg tct gga cta1214Lys Asp Leu Ile Asp Gln Ser Gln Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Leu210 215 220cct tta ttg gtt cag cga act att gcc aaa cag att cag atg gtc cgg1262Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Lys Gln Ile Gln Met Val Arg225 230 235caa gtt ggt aaa ggc cga tat gga gaa gta tgg atg ggc aaa tgg cgt1310Gln Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Met Gly Lys Trp Arg240 245 250ggc gaa aaa gtg gcg gtg aaa gta ttc ttt acc act gaa gaa gcc agc1358Gly Glu Lys Val Ala Val Lys Val Phe Phe Thr Thr Glu Glu Ala Ser
255 260 265 270tgg ttt cga gaa aca gaa atc tac caa act gtg cta atg cgc cat gaa1406Trp Phe Arg Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Thr Val Leu Met Arg His Glu275 280 285aac ata ctt ggt ttc ata gcg gca gac att aaa ggt aca ggt tcc tgg1454Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Ile Lys Gly Thr Gly Ser Trp290 295 300act cag ctc tat ttg att act gat tac cat gaa aat gga tct ctc tat1502Thr Gln Leu Tyr Leu Ile Thr Asp Tyr His Glu Asn Gly Ser Leu Tyr305 310 315gac ttc ctg aaa tgt gct aca ctg gac acc aga gcc ctg ctt aaa ttg1550Asp Phe Leu Lys Cys Ala Thr Leu Asp Thr Arg Ala Leu Leu Lys Leu320 325 330gct tat tca gct gcc tgt ggt ctg tgc cac ctg cac aca gaa att tat1598Ala Tyr Ser Ala Ala Cys Gly Leu Cys His Leu His Thr Glu Ile Tyr335 340 345 350ggc acc caa gga aag ccc gca att gct cat cga gac cta aag agc aaa1646Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Lys355 360 365aac atc ctc atc aag aaa aat ggg agt tgc tgc att gct gac ctg ggc1694Asn Ile Leu Ile Lys Lys Asn Gly Ser Cys Cys Ile Ala Asp Leu Gly370 375 380ctt gct gtt aaa ttc aac agt gac aca aat gaa gtt gat gtg ccc ttg1742Leu Ala Val Lys Phe Asn Ser Asp Thr Asn Glu Val Asp Val Pro Leu385 390 395aat acc agg gtg ggc acc aaa cgc tac atg gct ccc gaa gtg ctg gac1790Asn Thr Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Asp400 405 410gaa agc ctg aac aaa aac cac ttc cag ccc tac atc atg gct gac atc1838Glu Ser Leu Asn Lys Asn His Phe Gln Pro Tyr Ile Met Ala Asp Ile415 420 425 430tac agc ttc ggc cta atc att tgg gag atg gct cgt cgt tgt atc aca1886Tyr Ser Phe Gly Leu Ile Ile Trp Glu Met Ala Arg Arg Cys Ile Thr435 440 445gga ggg atc gtg gaa gaa tac caa ttg cca tat tac aac atg gta ccg1934Gly Gly Ile Val Glu Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asn Met Val Pro
450 455 460agt gat ccg tca tac gaa gat atg cgt gag gtt gtg tgt gtc aaa cgt1982Ser Asp Pro Ser Tyr Glu Asp Met Arg Glu Val Val Cys Val Lys Arg465 470 475ttg cgg cca att gtg tct aat cgg tgg aac agt gat gaa tgt cta cga2030Leu Arg Pro Ile Val Ser Asn Arg Trp Asn Ser Asp Glu Cys Leu Arg480 485 490gca gtt ttg aag cta atg tca gaa tgc tgg gcc cac aat cca gcc tcc2078Ala Val Leu Lys Leu Met Ser Glu Cys Trp Ala His Asn Pro Ala Ser495 500 505 510aga ctc aca gca ttg aga att aag aag acg ctt gcc aag atg gtt gaa2126Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ala Lys Met Val Glu515 520 525tcc caa gat gta aaa atc tga tggttaaacc atcggaggag aaactctaga 2177Ser Gln Asp Val Lys Ile530ctgcaagaac tgtttttacc catggcatgg gtggaattag agtggaataa ggatgttaac 2237ttggttctca gactctttct tcactacgtg ttcacaggct gctaatatta aacctttcag 2297tactcttatt aggatacaag ctgggaactt ctaaacactt cattctttat atatggacag 2357ctttatttta aatgtggttt ttgatgcctt tttttaagtg ggtttttatg aactgcatca 2417agacttcaat cctgattagt gtctccagtc aagctctggg tactgaattg cctgttcata 2477aaacggtgct ttctgtgaaa gccttaagaa gataaatgag cgcagcagag atggagaaat 2537agactttgcc ttttacctga gacattcagt tcgtttgtat tctacctttg taaaacagcc 2597tatagatgat gatgtgtttg ggatactgct tattttatga tagtttgtcc tgtgtcctta 2657gtgatgtgtg tgtgtctcca tgcacatgca cgccgggatt cctctgctgc catttgaatt 2717agaagaaaat aatttatatg catgcacagg aagatattgg tggccggtgg ttttgtgctt 2777taaaaatgca atatctgacc aagattcgcc aatctcatac aagccattta ctttgcaagt 2837gagatagctt ccccaccagc tttatttttt aacatgaaag ctgatgccaa ggccaaaaga 2897agtttaaagc atctgtaaat ttggactgtt ttccttcaac caccattttt tttgtggtta 2957
ttatttttgt cacggaaagc atcctctcca aagttggagc ttctattgcc atgaaccatg 3017cttacaaaga aagcacttct tattgaagtg aattcctgca tttgatagca atgtaagtgc 3077ctataaccat gttctatatt ctttattctc agtaactttt aaaagggaag ttatttatat 3137tttgtgtata atgtgcttta tttgcaaatc acccactcct ttacaaccat actttatata 3197tgtacataca ttcatactgt agaaaccagc tcatgtgtac ctcatatccc atccttaaga 3257gaagaaatgt tataaagtag aactaaatat aaattttcag aattaatgca ttcaaagtaa 3317tatatcaaat ccaggacttt gttaacttca ggtaaaaact tcattagggt aatatcatct 3377caattttttc aaatgaaagg attctctaat tagaaattta tatgtcagag ctgttataaa 3437tttatcaact gtcaaatatg ttctggacag ctaaatcatt tgagattttt ggttttttga 3497tttctattcc ctaacttgtg aagacaatga aaaatcaggc agaaatattt agtatctagt 3557cagtatctgt agctacactg tataactgtt cttcaataaa atggttcata ttttatagaa 3617aaaaaaaaaa aaaa 3631<210>21<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>21agatgctcac tgcgctgga 19<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>22tccaatgcag gcaatctgtt 20
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>24tggttacata aattggtccg a 2權(quán)利要求
1.一種引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法，其中，包括對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。
2.一種評(píng)價(jià)引起硬化的增殖性疾病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性的方法，其中，包括對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。
3.一種用于檢測(cè)引起硬化的增殖性疾病的試劑盒，其中，含有用于對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
4.一種用于評(píng)價(jià)引起硬化的增殖性疾病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性的試劑盒，其中，含有用于對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
5.一種糖尿病性腎病的檢測(cè)方法，其中，包括對(duì)生物體樣品中Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。
6.一種評(píng)價(jià)糖尿病性腎病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性的方法，其中，包括對(duì)生物體樣品中Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。
7.一種用于檢測(cè)糖尿病性腎病的試劑盒，其中，含有用于對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
8.一種用于評(píng)價(jià)糖尿病性腎病的進(jìn)展程度和/或治療的有效性的試劑盒，其中，含有用于對(duì)Smad1和/或具有Smad1活化作用的物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
9.一種引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療藥，其中，含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)作為有效成分。
10.一種抑制細(xì)胞外基質(zhì)的增殖的藥劑，其中，含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)作為有效成分。
11.一種抑制α1IV型膠原的表達(dá)的藥劑，其中，含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)作為有效成分。
12.一種對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法，其中，包括判定受檢物質(zhì)是否抑制從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)。
13.一種對(duì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法，其中，包括判定受檢物質(zhì)是否抑制從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)。
14.一種對(duì)在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法，其中，包括判定受檢物質(zhì)是否抑制從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)。
15.一種用于對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒，其中，含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
16.一種用于對(duì)在細(xì)胞外基質(zhì)的增殖抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒，其中，含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
17.一種用于對(duì)在α1IV型膠原的表達(dá)抑制中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的試劑盒，其中，含有用于對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定的試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供引起硬化的增殖性疾病的檢測(cè)方法及其試劑盒，包括對(duì)生物體樣品中的從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1、磷酸化Smad1、活化素受體樣激酶1、活化素受體樣激酶3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明還提供引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防 和/或治療藥，其中作為有效成分含有具有對(duì)從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1以及磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制的作用的物質(zhì)。本發(fā)明還提供對(duì)在引起硬化的增殖性疾病的預(yù)防和/或治療中有效的物質(zhì)進(jìn)行鑒定的方法及其試劑盒，其中包括判定受檢物質(zhì)是否抑制從STAT3、磷酸化STAT3、Smad1以及磷酸化Smad1中選擇的至少一種物質(zhì)的表達(dá)。
文檔編號(hào)A61P13/12GK1871347SQ20048002630
公開日2006年11月29日 申請(qǐng)日期2004年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月11日
發(fā)明者土井俊夫, 安部秀齊 申請(qǐng)人:秀比特生物技術(shù)公司, 土井俊夫, 中外制藥株式會(huì)社