專(zhuān)利名稱：節(jié)省佐劑的多劑量流感疫苗接種方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于保護(hù)以免遭流感病毒感染的疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
接受流感疫苗的患者目前需要每年接種一次，但首次接種疫苗時(shí)年齡在8
歲或以下的兒童除外，他們要間隔至少4周接受兩次劑量。
考慮過(guò)(例如見(jiàn)參考文獻(xiàn)l)在大流行狀態(tài)也需要兩次劑量方案，此時(shí)的人群 對(duì)于新的流感病毒毒株沒(méi)有免疫力。
需要兩次劑量意味著，當(dāng)抗原供應(yīng)量固定時(shí)，可制備的藥劑數(shù)量將是一次 劑量方案下可制備的數(shù)量的一半。因此提出每劑使用較低量的抗原并采用佐劑 補(bǔ)償這種減少。
如果添加佐劑的疫苗的單次劑量方案不能引起充分的免疫應(yīng)答，則無(wú)論如 何都將需要兩次劑量方案，而添加足量佐劑的附帶缺點(diǎn)也將顯露出來(lái)。當(dāng)制造 數(shù)億添加佐劑的疫苗劑量時(shí)這一問(wèn)題將非常重要，對(duì)于合成佐劑而言尤其重 要。
本發(fā)明的目的是減輕或避免這些缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，流感疫苗是通過(guò)一種多劑量方案施用的，其中，(i)第一劑量 與佐劑一起施用，而(ii)隨后劑量不與佐劑一起或與不同佐劑一起施用。因此， 本發(fā)明在無(wú)需加倍提供特定佐劑的情況下便可提供兩次劑量方案的益處。第一 劑量和隨后劑量?jī)?yōu)選通過(guò)相同給藥途徑給予(例如都通過(guò)肌內(nèi)注射)，而參考文 獻(xiàn)2的研究采用未添加佐劑的粘膜加強(qiáng)劑(booster)作為三劑量方案的第三劑量，以便確定小鼠中的腸胃外初免途徑(背部和頸部)是否會(huì)影響添加佐劑的疫 苗的免疫原性。
因此，本發(fā)明提供了一種免疫患者免遭流感病毒感染的方法，該方法包括 以下步驟(i)施用與第一佐劑組合的流感病毒疫苗劑量；和(ii)施用不含該佐 劑的流感病毒疫苗的進(jìn)一步劑量。所述進(jìn)一步劑量可以不包含佐劑或者可包含 不同于第一佐劑的第二佐劑。
本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其中裝有(i)與第一佐劑組合的第一流感病 毒疫苗；和(ii)不含該佐劑的第二流感病毒疫苗。本發(fā)明還提供了(i)與第一佐 劑組合的第一流感病毒疫苗；和(ii)不含該佐劑的第二流感病毒疫苗在制造多劑 量流感疫苗中的應(yīng)用。所述第二疫苗可以不包含佐劑或者可包含不同于第一佐 劑的第二佐劑。
本發(fā)明還提供了一種完成對(duì)患者進(jìn)行免疫，以免遭流感病毒感染的方法， 其中，所述患者之前已接受與第一佐劑組合的流感病毒疫苗劑量，且其中所述 方法包括給患者施用不含該佐劑的流感病毒疫苗的進(jìn)一步劑量的步驟。所述進(jìn) 一步劑量可以不包含佐劑或者可包含不同于第一佐劑的第二佐劑。
本發(fā)明還提供了未添加佐劑的流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流感 病毒感染的藥物中的應(yīng)用，其中，所述患者之前已接受添加佐劑的流感病毒疫 苗。本發(fā)明還提供了添加佐劑的第二流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流 感病毒感染的藥物中的應(yīng)用，其中，所述患者之前已接受添加佐劑的第一流感 病毒疫苗，其中第一和第二流感病毒的佐劑是不同的。
如果兩次免疫接種時(shí)的血凝素劑量低于15pg/毒株/劑的標(biāo)準(zhǔn)值，這些方法、 試劑盒和應(yīng)用將特別有利，這是由于本發(fā)明允許放松對(duì)抗原和佐劑的要求。
流感病毒抗原
本發(fā)明組合物包含流感病毒抗原。通?？蓮牧鞲胁《玖Ｗ又苽溥@些抗原， 或者可在重組宿主(例如，利用桿狀病毒載體的昆蟲(chóng)細(xì)胞)中表達(dá)諸如血凝素和 神經(jīng)氨酸酶等抗原并以純化形式使用[3,4,5]。然而，抗原一般來(lái)自病毒粒子。
抗原可采用活病毒，或者更優(yōu)選滅活病毒的形式。滅活病毒的化學(xué)方法包
括用有效量的一種或多種以下試劑處理洗滌劑、甲醛、福爾馬林、P-丙內(nèi)酯
或紫外光。滅活的其它化學(xué)方法包括用亞甲基藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯(C60)
5或它們?nèi)魏蔚慕M合處理。本領(lǐng)域知道滅活病毒的其它方法，例如二元乙胺
(binary ethylamine)、乙?；襾啺坊騳射線。INFLEXAL 產(chǎn)品是完整的病毒 粒子滅活疫苗。
如果使用滅活病毒，疫苗可包含完整的病毒、裂解病毒或純化的表面抗原 (包含血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶)。
通常，多劑量方案中的每種疫苗將采用相同的抗原形式，例如，不會(huì)第一 劑量采用裂解病毒粒子疫苗而第二劑量采用全病毒粒子疫苗。
可通過(guò)各種方法從含病毒的液體收集病毒粒子。例如，純化方法可包括利 用線性蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，所述蔗糖溶液含有洗漆劑以使病毒粒子破 裂。任選稀釋后，可通過(guò)滲濾純化抗原。
用洗滌劑(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三-N-丁酯、曲 通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、TergitolNP9，等等)處理病毒粒 子，包括"吐溫-醚"裂解方法來(lái)產(chǎn)生亞病毒粒子制品，從而獲得了裂解病毒。本 領(lǐng)域熟知裂解流感病毒的方法，例如參見(jiàn)參考文獻(xiàn)6-11等。通常利用破裂濃度 (disrupting concentration)的裂解劑(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病 毒破裂或破碎來(lái)進(jìn)行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白質(zhì)完全或部分溶解，從而 改變了病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子和離子性(例如，陽(yáng)離子)表面活 性劑，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯垸 基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、?？他湼?Hecameg)、垸基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二垸基肌氨酸鈉、CTAB (溴化十六垸基三甲 銨)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗倫(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基 銨鹽、脂轉(zhuǎn)染試劑、脂轉(zhuǎn)染胺、和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例 如，曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯 (吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。 一種有用的裂解方法利用脫 氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，裂解發(fā)生在最初的病毒粒子純化期間(例如，在 蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒粒子的物質(zhì)澄清(以除去 非病毒粒子物質(zhì))，濃縮收集的病毒粒子(例如，采用吸附法，如CaHP04吸附)， 分離完整病毒粒子與非病毒粒子物質(zhì)，在密度梯度離心步驟中利用裂解劑裂解 病毒粒子(例如，利用含有裂解劑，如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度(溶液))，然后過(guò)濾(例如，超濾)以除去不需要的物質(zhì)?？蓪⒘呀獾牟《玖Ｗ佑杏玫刂貞以诹姿?br> 鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。BEGRIVACTM、 FLUARIXTM、 FLUZONE 和 FLUSHIELDTM產(chǎn)品是裂解疫苗。
純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶。 本領(lǐng)域熟知制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法。FLUVIRINTM、 AGRIPPAL 和INFLUVACTM產(chǎn)品是亞單位疫苗。
流感抗原還可以病毒體形式存在[12](不含核酸的病毒樣脂質(zhì)體顆粒)，如 INFLEXALVTM和INVAVACTM產(chǎn)品那樣，但本發(fā)明優(yōu)選不施用病毒體。因此， 在一些實(shí)施方式中，流感抗原不釆取病毒體的形式。
流感病毒可以是減毒的。流感病毒可以對(duì)溫度敏感。流感病毒可以是冷適 應(yīng)的。這三種可能性特別適用于采用活病毒作為抗原。
用于疫苗中的流感病毒毒株每季不同。在目前的流行間期，疫苗通常包含 兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株， 一般是三價(jià)疫苗。本 發(fā)明還用這些疫苗，但特別有用的是來(lái)自流行毒株(即，對(duì)疫苗受者和普通人 群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、 H5、 H7或H9亞型毒株(特別是甲 型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是單價(jià)疫苗，或者可以添加了流行毒 株的普通三價(jià)疫苗為基礎(chǔ)。然而，取決于季節(jié)和疫苗所含抗原的性質(zhì)，本發(fā)明 可起保護(hù)作用以抵御以下一種或多種甲型流感病毒血凝素亞型Hl、 H2、 H3、 H4、 H5、 H6、 H7、 H8、 H9、 HIO、 Hll、 H12、 H13、 H14、 H15或H16。本 發(fā)明可起保護(hù)作用以抵御以下一種或多種甲型流感病毒NA亞型Nl、 N2、 N3、 N4、 N5、 N6、 N7、 N8或N9。
可有用地包含在組合物中的其它毒株是耐受抗病毒治療的毒株(例如，耐受 奧塞米韋[13]和/或扎那米韋)的毒株，包括耐藥性流行毒株[14]。
本發(fā)明特別適用于免疫接種以抵御大流行毒株。能導(dǎo)致大流行爆發(fā)的流感 毒株的特征在于(a)與目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝 素，即，未在人群中出現(xiàn)超過(guò)10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人 群中見(jiàn)到的毒株(例如，通常只在鳥(niǎo)群中發(fā)現(xiàn)的H5、 H6或H9)，從而使得人群 對(duì)該毒株的血凝素而言在免疫學(xué)上是原初的；(b)其能在人群中水平轉(zhuǎn)移；和
7(C)其對(duì)人具有致病性。對(duì)于免疫接種抵御流行性流感，優(yōu)選具有H5血凝素
類(lèi)型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、 H9N2、 H2N2、 H7N1和H7N7，及任何其它可能出現(xiàn)的流行毒株。在H5亞型內(nèi)，病毒可能屬 于HA進(jìn)化枝1、 HA進(jìn)化枝1'、 HA進(jìn)化枝2或HA進(jìn)化枝3[15]，其中進(jìn)化 枝1和3特別相關(guān)。
通常，多劑量方案中的每種疫苗將共用至少一種常見(jiàn)血凝素亞型，例如本 發(fā)明將不會(huì)第一劑量采用單價(jià)H5N1疫苗而第二劑量采用單價(jià)H9N2疫苗。
本發(fā)明組合物可包含一種或多種(例如，1、 2、 3、 4或更多種)流感病毒毒 株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多種流感毒株， 通常分別培養(yǎng)不同的毒株，收集病毒后混合來(lái)制備抗原。因此，本發(fā)明方法可 包括混合多種流感毒株的抗原的步驟。然而對(duì)于大流行情況，單價(jià)疫苗是優(yōu)選 的。
流感病毒可以是重配毒株，可通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得。反向遺傳學(xué)技術(shù) [例如，16-20]能利用質(zhì)粒在體外制備含所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術(shù)通 常涉及表達(dá)(a)例如能從polI啟動(dòng)子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和 (b)例如能從polII啟動(dòng)子編碼病毒蛋白質(zhì)的DNA分子，從而使得在細(xì)胞中表 達(dá)兩種類(lèi)型的DNA能裝配完整的感染性病毒粒子。DNA優(yōu)選能提供所有病毒 RNA和蛋白質(zhì)，但也可能利用輔助病毒提供所述RNA和蛋白質(zhì)中的一些。優(yōu) 選質(zhì)粒方法，從而能用不同質(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA[21-23]，這些方法還包括利 用質(zhì)粒來(lái)表達(dá)所有病毒蛋白質(zhì)或其中一些(例如，PB1、 PB2、 PA和NP蛋白質(zhì))， 一些方法利用了 12種質(zhì)粒。
為減少所需的質(zhì)粒數(shù)，最近的方法[24]在同一質(zhì)粒上組合了多個(gè)RNA聚合 酶I轉(zhuǎn)錄盒(對(duì)于病毒RNA合成)(例如，編碼1、 2、 3、 4、 5、 6、 7或所有8 個(gè)甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，在另一質(zhì)粒上組合了含RNA聚合酶II啟動(dòng)子 的多個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)(例如，編碼1、 2、 3、 4、 5、 6、 7或所有8個(gè)甲型流感 mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)。參考文獻(xiàn)24所述方法的優(yōu)選方面包括(a) —個(gè)質(zhì)粒 上的PB1、 PB2和PA mRNA編碼區(qū)；和(b) —個(gè)質(zhì)粒上的所有8個(gè)vRNA編 碼區(qū)段。包含一個(gè)質(zhì)粒上的NA和HA區(qū)段和另一質(zhì)粒上的6個(gè)其它區(qū)段也是
8有利的。
除了用poll啟動(dòng)子編碼病毒RNA區(qū)段，還可能用細(xì)菌噬菌體聚合酶啟動(dòng) 子[25]。例如，可方便地使用SP6、 T3或T7聚合酶的啟動(dòng)子。由于poll啟動(dòng) 子的種類(lèi)特異性，細(xì)菌噬菌體聚合酶啟動(dòng)子對(duì)于許多細(xì)胞類(lèi)型(例如，MDCK) 更方便，雖然還必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
其它技術(shù)可能采用雙重poll和polll啟動(dòng)子來(lái)同時(shí)編碼一個(gè)模板的病毒 RNA和可表達(dá)的mRNA [26,27]。
因此，甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段(通常 是A/PR/8/34的6個(gè)區(qū)段，其中HA和N區(qū)段來(lái)自疫苗毒株，即6:2重配株)， 特別是用卵培養(yǎng)病毒時(shí)。還可包含用于生產(chǎn)疫苗制備用重配病毒的A/WSN/33 病毒或任何其它病毒毒株的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段。通常，本發(fā)明保護(hù)抵御能 人向人傳播的毒株，因此毒株的基因組一般包含源自哺乳動(dòng)物(例如人)流感病 毒的至少一個(gè)RNA區(qū)段。其可包含源自禽流感病毒的NS區(qū)段。
可用卵或細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)用作抗原來(lái)源的病毒。目前培養(yǎng)流感病毒的標(biāo)準(zhǔn) 方法利用無(wú)特定病原體(SPF)的含胚雞蛋以及從雞蛋內(nèi)含物(尿囊液)中純化病 毒。然而，近年來(lái)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)病毒，出于速度和患者變態(tài)反應(yīng)的原 因，優(yōu)選該培養(yǎng)方法。如果采用雞蛋培養(yǎng)病毒，則可將病毒與一種或多種氨基 酸一起引入雞蛋的尿囊液中[ll]。
當(dāng)采用細(xì)胞培養(yǎng)物時(shí)，病毒生長(zhǎng)物質(zhì)將通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。合適的哺 乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)源包括但不限于倉(cāng)鼠、牛、靈長(zhǎng)類(lèi)(包括人和猴)和犬細(xì)胞?？?利用各種細(xì)胞類(lèi)型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適 的倉(cāng)鼠細(xì)胞的例子是名為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞是，例如 非洲綠猴細(xì)胞，例如Vero細(xì)胞系中的腎細(xì)胞。合適的犬細(xì)胞是，例如MDCK 細(xì)胞系中的腎細(xì)胞。因此，合適的細(xì)胞系包括但不限于MDCK; CHO; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6; WI-38;等等。用于培養(yǎng)流感病毒的優(yōu)選哺乳 動(dòng)物細(xì)胞系包括源自馬-達(dá)二氏犬腎的MDCK細(xì)胞[28-31];源自非洲綠猴 (C^ro; 她ecm aeA/o/w)腎臟的Vero細(xì)胞[32-34];或源自人胚胎成視網(wǎng)膜細(xì)胞 的PER.C6細(xì)胞[35]。這些細(xì)胞系可廣泛購(gòu)自，例如美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所
9(ATCC) [36]、寇里爾細(xì)胞保藏中心(Coriell Cell Repositories) [37]或歐洲細(xì)胞培 養(yǎng)物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目錄號(hào)為CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586 和CRL-1587的各種不同Vero細(xì)胞，目錄號(hào)為CCL-34的MDCK細(xì)胞。PER.C6 可以保藏號(hào)96022940購(gòu)自ECACC。作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的次選替代，可用禽 細(xì)胞系培養(yǎng)病毒[例如，參考文獻(xiàn)38-40]，包括源自鴨(例如，鴨視網(wǎng)膜)或母雞 的細(xì)胞系。禽細(xì)胞系的例子包括禽胚胎干細(xì)胞[38,41]和鴨視網(wǎng)膜細(xì)胞[39]。合 適的禽胚胎肝細(xì)胞包括源自雞胚胎干細(xì)胞的EBx細(xì)胞系、EB45、 EB14和 EB14-074 [42]。也可使用雞胚胎干細(xì)胞(CEF)。
培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選細(xì)胞系是MDCK細(xì)胞系。原始MDCK細(xì)胞系可以 CCL-34購(gòu)自ATCC，但也可使用該細(xì)胞系的衍生物。例如，參考文獻(xiàn)28披露 了適應(yīng)于在懸浮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞系("MDCK 33016"，以DSM ACC 2219保藏)。類(lèi)似地，參考文獻(xiàn)43披露了生長(zhǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)懸液中的MDCK 衍生細(xì)胞系("B-702"，以FERM BP-7449保藏)。參考文獻(xiàn)44披露了非致瘤性 MDCK細(xì)胞，包括"MDCK-S" (ATCC PTA-6500)、 "MDCK-SF101" (ATCC PTA-6501)、 "MDCK-SF102" (ATCC PTA-6502)和"MDCK-SF103" (PTA-6503)。 參考文獻(xiàn)45披露了對(duì)感染高度敏感的MDCK細(xì)胞系，包括"目(:^5 1"細(xì)胞 (ATCC CRL-12042)。可使用任何這些MDCK細(xì)胞系。
如果利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系培養(yǎng)病毒，則組合物優(yōu)選不含卵蛋白質(zhì)(例如，卵 白蛋白和卵類(lèi)黏蛋白)和雞DNA，從而能降低變應(yīng)原性。
如果用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒，則生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及用于啟動(dòng)培養(yǎng)的病毒接種物優(yōu) 選不含(g卩，經(jīng)測(cè)試得到污染的陰性結(jié)果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、
副流感病毒3、 SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸病毒、多瘤病毒、雙 RNA病毒、環(huán)病毒和/或細(xì)小病毒[46]。特別優(yōu)選不含單純皰疹病毒。
對(duì)于用細(xì)胞系，例如MDCK細(xì)胞培養(yǎng)，可用懸液培養(yǎng)[47-49]或貼壁培養(yǎng)的 細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)病毒。用于懸液培養(yǎng)的一種合適的MDCK細(xì)胞系是MDCK 33016(保藏號(hào)為DSM ACC 2219)?；蛘撸刹捎梦⑤d體培養(yǎng)。
優(yōu)選用無(wú)血清的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)支持流感病毒復(fù)制的 細(xì)胞系。本發(fā)明將其中不含人或動(dòng)物來(lái)源的血清添加劑的培養(yǎng)基稱為無(wú)血清培
10養(yǎng)基。無(wú)蛋白質(zhì)應(yīng)理解為表示發(fā)生細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基中不含蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子、 其它蛋白質(zhì)添加劑和非血清蛋白質(zhì)，但可包含病毒生長(zhǎng)所需的蛋白質(zhì)，例如胰 蛋白酶或其它蛋白酶。在這種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞自身可天然含有蛋白質(zhì)。 在病毒復(fù)制期間，支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系優(yōu)選在37'C以下生長(zhǎng)，例如
30-36。C [50]。
在培養(yǎng)的細(xì)胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步驟給培養(yǎng)的細(xì)胞接種待 培養(yǎng)的毒株，將受感染的細(xì)胞培養(yǎng)病毒繁殖所需的時(shí)間，例如通過(guò)病毒滴度或
抗原表達(dá)測(cè)定的(如，接種后24-168小時(shí))，收集繁殖的病毒。以病毒和細(xì)胞之 比為1:500 - 1:1,優(yōu)選1:100-1:5，更優(yōu)選1:50 - 1:10(通過(guò)PFU或TCID5o檢領(lǐng)!j) 接種培養(yǎng)的細(xì)胞?？蓪⒉《炯尤爰?xì)胞懸液中，或施加于細(xì)胞單層，病毒于 25-40°C，優(yōu)選28-37。C，在細(xì)胞上吸附至少60分鐘，但通常少于300分鐘， 優(yōu)選在90-240分鐘之間?？赏ㄟ^(guò)凍融或酶促作用除去感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(例如， 單層)，從而增加了收集的培養(yǎng)上清液中的病毒含量。然后使收集的液體滅活 或冷凍保存。以約0.0001 - 10，優(yōu)選0.002 - 5，更優(yōu)選0.001 -2的感染復(fù)數(shù) ("m.o丄")感染培養(yǎng)的細(xì)胞。更優(yōu)選以約0.01的m.o丄感染細(xì)胞。感染后30-60 小時(shí)收集感染的細(xì)胞。優(yōu)選在感染后34-48小時(shí)收集細(xì)胞。更優(yōu)選在感染后 38-40小時(shí)收集細(xì)胞。通常在細(xì)胞培養(yǎng)期間加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以釋放 病毒，可在培養(yǎng)期間的任何合適階段加入蛋白酶。
血凝素(HA)是滅活流感疫苗中的主要免疫原，參考HA水平使疫苗劑量標(biāo) 準(zhǔn)化， 一般通過(guò)單向輻射狀免疫擴(kuò)散(SRID)試驗(yàn)檢測(cè)。疫苗通常含有約15 )ig HA/毒株，雖然在例如兒童，或流行情況下還可使用較低的劑量。與較高劑量(例 如，3x或9x劑量[53,54])—樣，已使用了部分劑量，例如V2(即，7.5ngHA/毒 株)、V4和V8[51,52]。因此，疫苗可包含O. 1-150 iagHA/流感毒株，優(yōu)選0.1-50 Hg，例如0.1-20 )xg、 0.1-15 pg、 0.1-10 pg、 0.1-7.5 (ig、 0.5-5 pg，等等。具體 的劑量包括，例如約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約1.9、 約1.5，等等。與本發(fā)明一樣，當(dāng)疫苗中存在佐劑時(shí)，這些較低的劑量最有用。
對(duì)于活疫苗，通過(guò)中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5。)而不是HA含量來(lái)檢測(cè)給 藥，每種毒株的TCID5o—般在106 - 108之間(優(yōu)選1065-107'5)。
11本發(fā)明所用的HA可以是病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或者可經(jīng)修飾。例如，已 知可修飾HA以除去致使病毒在禽類(lèi)中高度致病的決定簇(例如，圍繞HA1和 HA2之間的切割位點(diǎn)的超堿性區(qū)域(hyper-basic region)),否則這些決定簇可阻 止病毒在卵中生長(zhǎng)。
本發(fā)明試劑盒的抗原組分可包含洗滌劑，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇 酯表面活性劑(稱為"吐溫")，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9 (曲通X-100)或叔辛 基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲銨(CTAB)，或脫氧膽酸鈉，特別 是對(duì)于裂解或表面抗原疫苗?？梢灾淮嬖诤哿康南礈靹Ｒ虼?，疫苗中所含的 辛苯聚醇-10、 a-生育酚半琥珀酸酯(a-tocopheryl hydrogen succinate)和聚山梨醇 酯80各自低于1 mg/ml。其它痕量的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、 卡那霉素、多粘菌素B)。
滅活但非全細(xì)胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或純化的表面抗原疫苗)可包 含基質(zhì)蛋白，從而受益于位于該抗原內(nèi)的其它T細(xì)胞表位。因此，包含血凝素 和神經(jīng)氨酸酶的非全細(xì)胞疫苗(特別是裂解疫苗)還可包含Ml和/或M2基質(zhì)蛋 白。如果存在基質(zhì)蛋白，優(yōu)選包含可檢測(cè)水平的M2基質(zhì)蛋白。還可存在核蛋 白。
宿主細(xì)胞DNA
當(dāng)用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)方法是使最終疫苗中殘余細(xì)胞系DNA的量 最小化，以便使DNA的致癌活性最小化。因此，當(dāng)用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒，則每 劑組合物優(yōu)選含有少于10ng(優(yōu)選少于1 ng，更優(yōu)選少于100pg)的殘留宿主細(xì) 胞DNA，雖然可以存在痕量的宿主細(xì)胞DNA。優(yōu)選任何殘余宿主細(xì)胞DNA 的平均長(zhǎng)度小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp， 等等。總之，本發(fā)明組合物中的宿主細(xì)胞DNA不能長(zhǎng)于100bp。
現(xiàn)在，檢測(cè)殘留的宿主細(xì)胞DNA是生物制品的常規(guī)要求，屬于技術(shù)人員 的普通能力。用于檢測(cè)DNA的試驗(yàn)通常是確認(rèn)試驗(yàn)[55,56]?？衫脭?shù)學(xué)和可 定量的術(shù)語(yǔ)描述確認(rèn)試驗(yàn)的性能特征，已鑒定了其可能的誤差來(lái)源。已總體上 檢驗(yàn)了該試驗(yàn)的諸如準(zhǔn)確度、精密度、特異性等特征。 一旦校驗(yàn)(例如，用已 知標(biāo)準(zhǔn)量的宿主細(xì)胞DNA)及檢驗(yàn)好某試驗(yàn)，可常規(guī)進(jìn)行定量DNA檢測(cè)?？刹捎萌N主要的DNA定量技術(shù)雜交方法，例如Sourthern印跡或槽印跡[57]; 免疫測(cè)定方法，例如ThresholdTM系統(tǒng)[58];和定量PCR [59]。技術(shù)人員熟知 這些方法，雖然各方法的精確特征取決于所研究的宿主細(xì)胞，例如雜交探針的 選擇，擴(kuò)增用引物和/或探針的選擇，等等。分子裝置公司(Molecular Devices) 的ThresholdTM系統(tǒng)是用于皮克水平總DNA的定量試驗(yàn)，其已用于監(jiān)測(cè)生物藥 品中的污染DNA水平[58]。典型的試驗(yàn)包括在生物素化的ssDNA結(jié)合蛋白、 脲酶偶聯(lián)的抗-ssDNA抗體和DNA之間非序列特異性地形成反應(yīng)復(fù)合物。所有 試驗(yàn)組分均裝入購(gòu)自生產(chǎn)商的完整的總DNA測(cè)定試劑盒(Total DNA Assay Kit) 中。各種商品化生產(chǎn)商提供檢測(cè)殘留宿主細(xì)胞DNA的定量PCR試驗(yàn)，例如 AppTecTM實(shí)驗(yàn)室服務(wù)公司(AppTecTM Laboratory Services)、 BioRelianceTM、亞瑟 技術(shù)公司(Althea Technologies),等等。檢測(cè)人病毒疫苗中宿主細(xì)胞DNA污染 的化學(xué)發(fā)光雜交試驗(yàn)和總DNAThresholdTM系統(tǒng)的比較見(jiàn)參考文獻(xiàn)60。
可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，例如層析等在疫苗制備期間除去污染性DNA。通過(guò) 核酸酶處理，例如用DNA酶可促進(jìn)除去殘留的宿主細(xì)胞DNA。參考文獻(xiàn)59 和60披露了減少宿主細(xì)胞DNA污染的便利方法，其涉及兩步處理，首先可在 病毒培養(yǎng)期間使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒粒子破裂期間使 用陽(yáng)離子洗滌劑(例如，CTAB)。用垸化劑，例如P-丙內(nèi)酯處理也可用于除去 宿主細(xì)胞DNA，該方法還可優(yōu)選用于滅活病毒粒子[63]。
優(yōu)選在每15嗎血凝素中含有< 10ng(例如，〈1 ng、< 100pg)宿主細(xì)胞DNA 的疫苗，例如每0.25 ml體積含有< 10 ng(例如，< 1 ng、 < 100 pg)宿主細(xì)胞DNA 的疫苗。更優(yōu)選在每50嗎血凝素中含有〈10ng(例如，<lng、 〈100pg)宿主 細(xì)胞DNA的疫苗，例如每0.5ml體積含有〈10ng(例如，< 1 ng、 〈100pg)宿 主細(xì)胞DNA的疫苗。
佐劑
本發(fā)明涉及首先施用添加佐劑的疫苗。之后的疫苗可以是未添加佐劑的， 或者可以是添加佐劑的，但該佐劑與初次施用時(shí)的佐劑不同。佐劑的功能可以 是增強(qiáng)在接受組合物的患者中引起的免疫應(yīng)答(體液免疫和/或細(xì)胞免疫)。
適用于第一疫苗并可任選用于之后的疫苗劑量的佐劑包括但不限于- 含礦物質(zhì)的組合物，包括鈣鹽和鋁鹽(或其混合物)。鈣鹽包括磷酸鈣(例 如參考文獻(xiàn)64中所述的"CAP"顆粒)。鋁鹽包括氫氧化物、磷酸鹽、硫酸鹽等 等，該鹽可采取任何合適形式(例如凝膠、結(jié)晶、無(wú)定形，等等)。優(yōu)選吸附在
這些鹽上。含礦物質(zhì)的組合物也可被制成金屬鹽顆粒[65]。鋁鹽佐劑將在下文
中更詳細(xì)地描述。
水包油乳液，如下文中更加詳細(xì)地描述。
免疫刺激性寡核苷酸，如下文中更加詳細(xì)地描述。
'3-0-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A('3dMPL，，也稱為'MPI/M，)，如下文中更加詳細(xì) 地描述。
咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特("R837")[66,67]、瑞喹莫德("R-848")[68] 和它們的類(lèi)似物；和它們的鹽(例如，鹽酸鹽)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它 細(xì)節(jié)見(jiàn)參考文獻(xiàn)69-73。
縮氨基硫脲化合物，例如參考文獻(xiàn)74披露的那些。參考文獻(xiàn)74還描述 了配制、制造和篩選活性化合物的方法?？s氨基硫脲對(duì)于刺激人外周血單核細(xì) 胞產(chǎn)生細(xì)胞因子如TNF-a尤其有效。
核苷類(lèi)似物，例如(a)艾沙托拉濱(Isatorabine)(ANA-245; 7-硫雜-8-氧 代鳥(niǎo)苷)及其前藥
O O
(b)ANA975; (c) ANA-025-l; (d)ANA380; (e)參考文獻(xiàn)75-77所述的化合 物；(f)下式所示化合物
式中
F^和R2各自獨(dú)立為H、鹵素、-NRaRb、 -OH、 CL6垸氧基、取代的Cw垸氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、(:6.1()芳基、取代的CVh)芳基、Cl6院基或取代 的C"6院基；
R3不存在，或是h、 Cl6院基、取代的Cl6焼基、<:6.1()芳基、取代的(:6.10
芳基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；
R4和Rs各自獨(dú)立為H、鹵素、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、-C(O)-Rd、 Cl6院
基、取代的Cw垸基，或結(jié)合在一起形成5元環(huán)，如R4-5:
.J產(chǎn)^ D
、>4 ^-s
在^所示鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合。
Xj和X2各自獨(dú)立為N、 C、 O或S;
R8是H、鹵素、-OH、 d.6垸基、C2.6烯基、C2.6炔基、-OH、 -NRaRb、 -(CH2)n-0-Re、 -0-((:1.6垸基)、陽(yáng)S(O)pRe或-C(O)-Rd;
R9是H、 Cl6焼基、取代的Cl6院基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基或R9a，其中
R%是
在一所示鍵處實(shí)現(xiàn)結(jié)合。
Rh)和Ru各自獨(dú)立為H、鹵素、d-6垸氧基、取代的CL6垸氧基、-NRaRb
或-OH;
Ra和Rb各自獨(dú)立為H、 C^烷基、取代的Q-6垸基、-C(O)Rd、 C6-k)芳基；
Rc各自獨(dú)立為H、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、Cl6院基或取代 的C"6院基；
Rd各自獨(dú)立為H、鹵素、d—6烷基、取代的Cl6院基、d—6烷氧基、取代的
cl6烷氧基、-NH2、 -NH(cl6垸基)、-NH(取代的Q-6垸基)、-N(Cl6院基)2、 -N(取
代的Cl6焼基)2、 06.1()芳基或雜環(huán)基；
Re各自獨(dú)立為H、 Cl6院基、取代的Cl6院基、(:6.1()芳基、取代的C,芳
基、雜環(huán)基或取代的雜環(huán)基；
Rf各自獨(dú)立地為H、 Cl6院基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、磷酸酯基、二
15磷酸酯基或三磷酸酯基；
n各自獨(dú)立為0、 1、 2或3; p各自獨(dú)立為0、 l或2;或者
(g)(a)-(f)中任一項(xiàng)的藥學(xué)上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項(xiàng)的互變異構(gòu)體，或 該互變異構(gòu)體的藥學(xué)上可接受的鹽。
色胺酮化合物，例如參考文獻(xiàn)78披露的那些。參考文獻(xiàn)78還描述了配 制、制造和篩選活性化合物的方法。縮氨基硫脲對(duì)于刺激人外周血單核細(xì)胞產(chǎn) 生細(xì)胞因子如TNF-a尤其有效。
羅唑利賓(Loxoribine) (7-烯丙基-8-氧代鳥(niǎo)苷)[79]。
參考文獻(xiàn)80披露的化合物，包括:?；哙夯衔铩⑦胚岫?Indoledione) 化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環(huán)二酮(Benzocyclodione)化合物、氨 基氮雜乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮 (Aminobenzimidazole quinolinone) (ABIQ)化合物[81,82]、羥鄰苯二甲酰胺 (Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、異噁唑化合物、固醇化合物、喹 唑酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物[83]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、 三嗪化合物、吡唑嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮茚(Benzazole)化合物 [84]。
參考文獻(xiàn)85披露的化合物，包括3,4-二(lH-吲哚-3-基)-lH-吡咯-2,5-二酮、 星形孢菌素類(lèi)似物、衍生的噠嗪、色烯-4-酮、吲哚酮、喹唑啉和核苷類(lèi)似物。
氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，如RC-529[86,87]。
磷腈，例如參考文獻(xiàn)88和89中描述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈]("PCPP"， poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])。
小分子免疫增強(qiáng)劑(SMIP)，例如
N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；
l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；
N2-丁基-1 -(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺； N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺； N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺； l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；
1- (2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；
2- [[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇； 2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑射4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸
酯；
4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l,3-二氫-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮； N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二
胺；
N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹 啉-2,4-二胺；
N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二
胺；
N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉 匿2，4-二胺；
l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇； l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇； N4,N4-二芐基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉 -2,4-二胺。
皂苷[參考文獻(xiàn)131第22章],皂苷是甾醇糖苷類(lèi)(glycoside)和三萜系糖苷 類(lèi)的異種類(lèi)型，其存在于眾多植物種類(lèi)的樹(shù)皮、葉、莖、根以及甚至花中。已 對(duì)作為佐劑的從皂樹(shù)皮(2""/"a s";w"an》Molina )中分離的皂苷進(jìn)行了廣泛的 研究。皂苷還可從商業(yè)途徑獲自麗花菝葜0^/^1 wwafa)(墨西哥菝葜， sarsaprilla)、 滿天星(G^/wop/z/〃a / am'cw/ato) (brides veil)禾口月巴皇草(Sapowor/a c^c/awa/W(皂根，soaproot)。皂苷佐劑制劑包括純化的制劑，例如QS21，以 及脂質(zhì)制劑，例如ISCOM。 QS21的商品名為StimulonTM。已通過(guò)HPLC和 RP-HPLC純化了皂苷組合物。已對(duì)用這些技術(shù)獲得的特定純化部分進(jìn)行了鑒別，包括QS7、 QS17、 QS18、 QS21、 QH-A、 QH-B和QH-C。優(yōu)選地，所述 皂苷是QS21。生產(chǎn)QS21的方法描述于參考文獻(xiàn)90。皂苷制劑還可包括甾醇， 例如膽固醇[91]?？蓪⒃碥蘸湍懝檀嫉慕M合用于形成被稱為免疫刺激復(fù)合物 (ISCOM)的獨(dú)特顆粒[參考文獻(xiàn)131第23章]。ISCOM通常還包括磷脂，例如 磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿?？蓪⑷魏我阎脑碥沼糜贗SCOM中。優(yōu)選地， ISCOM包括Quil A、 QHA和QHC中的一種或多種。ISCOM在參考文獻(xiàn)91-中有進(jìn)一步的描述。任選地，ISCOMS可不含一種或多種其它去污劑[94]。有 關(guān)皂苷基佐劑的發(fā)展可見(jiàn)參考文獻(xiàn)95和96。
細(xì)菌ADP-核糖基化毒素(例如大腸桿菌不耐熱腸毒素"LT"、霍亂毒素 "CT"、或百日咳毒素"PT")以及它們的解毒衍生物，如稱為L(zhǎng)T-K63和LT-R72 的突變體毒素[97]。將解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑描述于參考文獻(xiàn) 98，用作腸胃外佐劑描述于參考文獻(xiàn)99。
生物粘附劑和粘膜粘著劑，如酯化的透明質(zhì)酸微球[100]或脫乙酰殼多糖 及其衍生物[IOI]。
由生物可降解和無(wú)毒性材料形成的微粒(即直徑為約100nm到約150pm， 更優(yōu)選約200nm到約30pm，或者約500nm到約10pm的顆粒)，所述材料例如 聚(a-羥酸)、聚羥丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚已酸內(nèi)酯等等，其中優(yōu)選聚(丙交 酯-共-乙交酯)，任選地對(duì)其處理，使其具有帶負(fù)電荷表面(例如用SDS處理) 或帶正電荷表面(例如用陽(yáng)離子型去污劑，例如CTAB)處理。
脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)131第13和14章)。適合用于佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子 描述于參考文獻(xiàn)102-104。
聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[105]。此類(lèi)制劑還包括與辛苯聚醇(octoxynol) 組合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑[106]，以及與至少一種其它非離 子型表面活性劑(例如辛苯聚醇)組合的聚氧乙烯垸基醚或酯表面活性劑[107]。 優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂?；?steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂?；?、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯 -35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
胞壁酰肽，例如N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨?；?D-異谷氨酰胺 ("thr-MDP")、 N-乙?；?去甲胞壁酰-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺("nor-MDF，)、
18N-乙?；咸前?N-乙酰基胞壁酰-L-Al-D-異谷-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺
(N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxy
propylamide) ("DTP-DPP"，或"TheramideTM")或N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨?；?D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺 ("MTP-PE，，)。
從第一種革蘭氏陰性菌制備的外膜蛋白蛋白體制品與衍生自第二種革蘭 氏陰性菌的脂多糖(LPS)制品的組合，其中所述外膜蛋白蛋白體和LPS制品形 成穩(wěn)定的非共價(jià)佐劑復(fù)合物。這種復(fù)合物包括"IVX- 908"(包含腦膜炎奈瑟氏球 菌外膜和LPS的復(fù)合物)。它們已被用作流感疫苗的佐劑[108]。
polyoxidonium聚合物[109， IIO]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。
甲基肌苷5'-單磷酸酯("MIMP")[lll]。
多羥基化吡咯雙烷(pyrrolizidine)化合物[112]或其藥學(xué)上可接受的鹽或 衍生物，例如下式所示
其中R選自下組氫，直鏈或支鏈、未取代或取代的、飽和或不飽和的?；?、
垸基(例如，環(huán)烷基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于木麻黃素
(casuarine)、木麻黃素-6-a-D-吡喃型葡萄糖、3-表-木麻黃素、7-表-木麻黃素、 3,7-二表-木麻黃素，等等。
.CDld配體，如a-糖基神經(jīng)酰胺[113-120](例如a-半乳糖苷神經(jīng)酰胺)、含 有植物鞘氨醇的a-糖基神經(jīng)酰胺、OCH、 KRN7000[(2S,3S,4R)-l-O-(a-D-半乳 糖苷吡喃糖基)-2-(N-二十六烷基氨基)-U,4-十八烷三醇]、CRONY-lOl、 3"-0-磺基-半乳糖苷神經(jīng)酰胺，等等。
Y菊粉[121]或其衍生物，如algammulin。
式I、 II或III所示化合物，或它們的鹽
19如參考文獻(xiàn)122所述，如'ER 803058'、 'ER 803732'、 'ER 804053'、 'ER 804058'、 'ER 804059'、 'ER 804442'、 'ER 804680'、 'ER 804764'、 ER 803022或 'ER 804057，，例如
0
大腸桿菌脂質(zhì)A衍生物，如OM-174(描述于參考文獻(xiàn)123和124)。
陽(yáng)離子脂質(zhì)禾n(通常是中性的)輔脂質(zhì)(co-lipid)形成的制劑，如氨基丙基-二甲基-肉豆寇基氧基-丙基溴化銨-二植垸基磷脂酰基-乙醇胺("VaxfectinTM")
<formula>formula see original document page 20</formula>或氨基丙基-二甲基-雙-十二垸基氧基-丙基溴化銨-二油?；字；?乙醇胺
("GAP-DLRIE: DOPE")。優(yōu)選含(士)-N- (3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(合-9-十四垸基氧基)-l-丙基銨鹽的制劑[125]。
含有連接于含磷酸無(wú)環(huán)主鏈的脂質(zhì)的化合物，例如TLR4拮抗劑E5564[126、 127]:
這些佐劑和其他佐劑活性物質(zhì)更加詳細(xì)描述于參考文獻(xiàn)131和132。
用于本發(fā)明的佐劑可以是Toll樣受體(TLR)調(diào)節(jié)劑和/或激動(dòng)劑。例如，它們可以是人TLR1、 TLR2、 TLR3、 TLR4、 TLR7、 TLR8禾口/或TLR9蛋白中的一種或多種的激動(dòng)劑。優(yōu)選的免疫增強(qiáng)劑是TLR7的激動(dòng)劑(例如，咪唑并喹啉類(lèi))和/或更優(yōu)選TLR9的激動(dòng)劑(例如，CpG寡核苷酸)。這些免疫增強(qiáng)劑可用于活化先天免疫途徑。
一種疫苗可包含兩種或多種所述佐劑。
組合物中的抗原和佐劑通常是摻合在一起的。
鋁鹽佐劑
合適的鋁鹽包括稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是慣常的，但只是為方便而使用，并未精確描述所存在的實(shí)際化學(xué)構(gòu)成[例如，見(jiàn)參考文獻(xiàn)131的第9章]。本發(fā)明可用常規(guī)用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸鹽"佐劑。
稱為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽，其通常至少部分結(jié)晶。羥基氧化鋁以分子式A10(OH)表示，其與其它鋁化合物，例如氫氧化鋁Al(OH)3的區(qū)別在于紅外(IR)光譜，特別是在1070 cm"處存在吸收帶和在3090-3100 cm"處存在強(qiáng)烈的肩峰[參考文獻(xiàn)131的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶程度，結(jié)晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強(qiáng)的
21譜線增寬。表面積隨WHH的增加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強(qiáng)。氫氧化鋁佐劑呈典型的纖維形態(tài)(例如，電子透射顯微照片所見(jiàn)
的)。氫氧化鋁佐劑的pl通常約11，即在生理pH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報(bào)道，pH7.4時(shí)，氫氧化鋁佐劑的吸附能力在每1^八1+++1.8-2.6 mg蛋白質(zhì)之間。
稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，這些佐劑也常含有少量硫酸根(即，羥基磷酸硫酸鋁)?？赏ㄟ^(guò)沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代該鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽中P04/A1摩爾比通常在0.3-1.2之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴(yán)格的A1P04。例如，3164cm—1的IR光譜帶(例如，當(dāng)加熱至20(TC時(shí))表明存在結(jié)構(gòu)性羥基[參考文獻(xiàn)131的第9章]。
磷酸鋁佐劑的P(VAlS+摩爾比通常在0.3-1.2之間，優(yōu)選在0.8-1.2之間，更優(yōu)選0.95 ± 0.1。磷酸鋁通常是無(wú)定形的，特別是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是POVA產(chǎn)摩爾比在0.84-0.92之間，含0.6mg A產(chǎn)/ml的無(wú)定形羥基磷酸鋁。磷酸鋁通常是顆粒狀的(例如，電子透射顯微照片中所見(jiàn)的平板樣形態(tài))。這些顆粒在吸附任何抗原后的典型直徑是0.5-20 iam(例如，約5-10pm)。據(jù)報(bào)道，pH7.4時(shí)，磷酸鋁佐劑的吸附能力在每mg A1—+ 0.7-1.5 mg蛋白質(zhì)之間。
磷酸鋁的零電荷點(diǎn)(PZC)與磷酸根取代羥基的程度成反比，而該取代程度依據(jù)沉淀制備該鹽所用的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度而不同。也可通過(guò)改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通過(guò)添加例如組氨酸緩沖液(使得PZC更具堿性)等緩沖液來(lái)改變PZC。本發(fā)明所用磷酸鋁的PZC通常在4.0-7.0之間，更優(yōu)選在5.0-6.5之間，例如約5.7。
本發(fā)明所用的鋁鹽懸液可含有緩沖液(例如，磷酸或組氨酸或Tris緩沖液)，但不一定。這些懸液優(yōu)選無(wú)菌、無(wú)熱原。懸液可含有游離的水性磷酸根離子，例如濃度在1.0-20 mM之間、優(yōu)選在5-15 mM之間、更優(yōu)選約10 mM。這些懸液也可含有氯化鈉。
本發(fā)明可使用佐劑包含氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。在這種情況中，磷酸鋁可能多于氫氧化鋁，例如重量比至少為2:1，例如2 5:1、 2 6:1、 2 7:1、 2 8:1、
2229:1，等等。
給予患者的組合物中八1+++的濃度優(yōu)選低于10 mg/ml，例如^ 5 mg/ml、 S 4 mg/ml、 ^ 3 mg/ml、 ^ 2 mg/ml、 ^ 1 mg/ml，等等。優(yōu)選的范圍在0.3-1 mg/ml 之間。優(yōu)選最大〈0.85mg/劑。
水包油乳液佐劑
已發(fā)現(xiàn)水包油乳液特別適用于佐劑配制的流感病毒疫苗中。已知各種這樣 的乳液，它們通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，其中一種或多種油 和一種或多種表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳液中的油滴 通常直徑低于5pm，甚至可具有亞微米直徑，用微流化儀可實(shí)現(xiàn)這些小尺寸， 從而能提供穩(wěn)定的乳液。優(yōu)選尺寸小于220 nm的油滴，因?yàn)槟軐?duì)它們進(jìn)行過(guò) 濾滅菌。
本發(fā)明可使用諸如動(dòng)物來(lái)源(例如魚(yú))或植物來(lái)源的油。植物油來(lái)源包括堅(jiān) 果、種子和谷物。堅(jiān)果油的例子是最常購(gòu)得的花生油、大豆油、椰油和橄欖油。 例如，可利用從霍霍巴豆(jojoba bean)獲得的霍霍巴油。種子油包括紅花油、 棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易購(gòu)得的，但其它谷 物如小麥、燕麥、黑麥、大米、畫(huà)眉草(teff)、黑小麥等的油也可利用。通過(guò)水 解、分離和酯化合適的堅(jiān)果和種子油起始物質(zhì)可制備種子油中天然不存在的甘 油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳動(dòng)物乳汁的脂肪和油類(lèi)是可代謝的， 因此可用于實(shí)施本發(fā)明。本領(lǐng)域熟知從動(dòng)物來(lái)源獲得純油所需的分離、純化、 皂化和其它方法。大多數(shù)魚(yú)含有不難回收的可代謝油。例如，本發(fā)明可用的幾 種魚(yú)油的例子是鱈魚(yú)肝油、鯊魚(yú)肝油和鯨油，如鯨蠟。可以5-碳異戊二烯單位 通過(guò)生物化學(xué)方法合成許多支鏈油，這些支鏈油通常稱為類(lèi)萜。鯊魚(yú)肝油含有 稱為角鯊烯(2，6,10,15,19，23-六甲基-2,6,10,14,18，22- 二十四己烯 (tetracosahexaene))的支鏈不飽和類(lèi)萜，這是本發(fā)明特別優(yōu)選的。角鯊?fù)槭墙酋?烯的飽和類(lèi)似物，其也是優(yōu)選的油。包含角鯊烯和角鯊?fù)榈聂~(yú)油不難從商業(yè)來(lái) 源購(gòu)得，或可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法獲得。其它優(yōu)選的油是生育酚(參見(jiàn)下文)。 可利用油的混合物。
可根據(jù)表面活性劑的"HLB"(親水凍油平衡)將其分類(lèi)。優(yōu)選的本發(fā)明表面活性劑的HLB至少為10，優(yōu)選至少15，更優(yōu)選至少16。本發(fā)明可用的表面活
性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特
別是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;環(huán)氧乙垸(EO)、環(huán)氧丙烷(PO)和/或環(huán)氧 丁垸(BO)的共聚物，以DOWFAXTM為商品名出售，例如線形EO/PO嵌段共聚 物；重復(fù)的乙氧基(氧-l,2-乙二基)基團(tuán)數(shù)目可能不同的辛苯聚醇，其中特別感 興趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基) 聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂，例如磷脂酰聚膽堿(卵磷脂)； 壬基苯酚乙氧基化物，例如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂 醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，例如三乙烯乙二醇單月桂 基醚(triethyleneglycol monolauryl ether) (Brij 30);和失水山梨糖醇酯(通常稱為 司盤(pán)(SPAN))，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盤(pán)85)和失水山梨糖醇單月桂酸 酯。優(yōu)選非離子型表面活性劑。乳液中所含的優(yōu)選表面活性劑是吐溫80(聚氧 乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、司盤(pán)85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲 通X-IOO。
可利用表面活性劑的混合物，例如吐溫80/司盤(pán)85混合物。聚氧乙烯失水 山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇，例如 叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也適用。另一有用的混合物 包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
表面活性劑的優(yōu)選用量(重量％)是聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐溫 80)0.01-1%，特別是約0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100或 曲通系列的其它洗滌劑)0.001-0.1%，特別是0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(例如 月桂醇聚醚9) 0.1-20%，優(yōu)選0.1-10%，特別是0.1-1%或約0.5%。
本發(fā)明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于
角鯊烯、吐溫80和司盤(pán)85的亞微米乳液。以體積計(jì)，所述乳液的組成 可以是約5%角鯊烯，約0.5%聚山梨醇酯80和約0.5%司盤(pán)85。以重量計(jì)，這 些比例可以是4.3%角鯊烯，0.5%聚山梨醇酯80和0.48%司盤(pán)85。該佐劑稱為 "MF59"[8-10]，如參考文獻(xiàn)11的第10章和參考文獻(xiàn)12的第12章所詳述的。 MF59乳液優(yōu)選包含擰檬酸離子，例如lOmM檸檬酸鈉緩沖液。
24 角鯊烯、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸緩沖鹽水。其還可
包含司盤(pán)85(例如，1%)和/或卵磷脂。這些乳液可具有2-10%角鯊烯、2-10%生 育酚和0.3-3%吐溫80，角鯊烯:生育酚的重量比優(yōu)選S1，因?yàn)檫@能提供更穩(wěn)定 的乳液。角鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5: 2?？蓪⑼聹?0溶解于PBS中 獲得2%的溶液，然后將90 ml該溶液與(5 g DL-a-生育酚和5 ml角鯊烯)的混 合物混合，隨后微流化該混合物來(lái)制備這樣一種乳液。得到的乳液可具有亞微 米油滴，例如平均直徑在100-250 nm之間，優(yōu)選約180nm。
角鯊烯、生育酚和曲通洗滌劑(例如，曲通X-100)的乳液。該乳液還可包 含3d-MPL(見(jiàn)下文)。該乳液可包含磷酸緩沖液。
含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗滌劑(例如，曲通X-IOO) 和生育酚(例如，a-生育酚琥珀酸酯)的乳液。該乳液所包含的這三種組分的質(zhì) 量比約為75: 11: IO(例如，750嗎/ml聚山梨醇酯80， 110 pg/ml曲通X-IOO和 100 |ig/ml a-生育酚琥珀酸酯)，這些濃度應(yīng)包括這些組分與抗原的任何比例。 該乳液還可包含角鯊烯。該乳液還可包含3d-MPL(見(jiàn)下文)。水相可含有磷酸 緩沖液。
角鯊?fù)?、聚山梨醇?0和泊洛沙姆401("PluronicTML121")的乳液?？梢?用磷酸緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載 體，己與用"SAF-I"佐劑(0.05-1% Thr-MDP、 5%角鯊烯烷、2.5% Pluronic L121 和0.2%聚山梨醇酯80)配制的蘇氨酰-MDP聯(lián)用[133]。也可不與Thr-MDP聯(lián)用， 例如用"AF'佐劑(5。/。角鯊?fù)椤?.25% Pluronic L121和0.2%聚山梨醇酯80)配制 [134]。優(yōu)選微流體化。
包含角鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯垸基醚親水性非離子型表面活性劑(例 如聚氧乙烯(12)鯨蠟基/硬脂基醚)和疏水性非離子型表面活性劑(例如失水山 梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇單油酸酯或'司盤(pán)80，)的乳液。乳液 優(yōu)選是熱致可逆的和/或至少90%油滴(按體積計(jì))的大小小于200 nm [135]。乳 液中還可包含以下一種或多種醛醇；冷凍保護(hù)劑(例如糖，如十二烷基麥芽 苷和/或蔗糖)；和/或垸基聚糖苷。這種乳液可被凍干。
乳液可具有0.5-50%的油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子表面活性劑。如參考文獻(xiàn)15所述，優(yōu)選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲 氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優(yōu)選亞微米液滴 大小。
不可代謝的油(例如，輕質(zhì)礦物油)和至少一種表面活性劑(例如，卵磷脂、
吐溫80或司盤(pán)80)的亞微米水包油乳液?？砂砑觿?，例如QuilA皂苷、膽 固醇、皂苷-親脂偶聯(lián)物(例如，參考文獻(xiàn)137所述的GPI-OIOO，通過(guò)將脂族胺 通過(guò)葡糖醛酸的羧基加成到脫?；碥丈现苽?、二甲基二(十八垸基)溴化銨和 域N,N-二(十A垸基)-N,N-二(2-羥乙基)丙二胺。
其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，膽固醇)結(jié)合成螺旋狀膠 束的乳液[138〗。
包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑 (例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[139]。
包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑 (例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[139]。
這些乳液優(yōu)選在遞送之時(shí)與抗原臨時(shí)混合。因此，在包裝或分發(fā)的疫苗中， 佐劑和抗原通常分開(kāi)存放，最后在使用時(shí)即時(shí)配制?？乖话愦嬖谒孕问?， 從而最終可通過(guò)混合兩種液體來(lái)制備疫苗。用于混合的兩種液體的體積比可以 不同(例如，在5:1禾b l:5之間)，但通常是約1:1。
抗原和佐劑混合后，血凝素抗原通常維持在水溶液中，但其自身可能分配 在油/水界面附近。進(jìn)入乳液的油相的血凝素通常極少(如果有的話)。
如果組合物包含生育酚，a、卩、y、 S、 e或《生育酚均可用，但優(yōu)選a-生育 酚。生育酚可采取幾種形式，例如不同的鹽和/或異構(gòu)體。鹽包括有機(jī)鹽，例如 琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等等。D-a-生育酚和DL-a-生育酚均可用。老年患 者(例如，60歲或更大)所用的疫苗中優(yōu)選包含生育酚，因?yàn)閾?jù)報(bào)道維生素E在 該患者組中對(duì)免疫應(yīng)答有正面影響[140]。它們還具有抗氧化特性，從而有助于 穩(wěn)定溶液[141]。優(yōu)選的a-生育酚是DL-a-生育酚，該生育酚的優(yōu)選鹽是琥珀酸 鹽。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)琥珀酸鹽在體內(nèi)能與TNF-相關(guān)的配體協(xié)作。此外，已知a-生育 酚琥珀酸鹽與流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐劑[io]。免疫刺激性寡核苷酸
免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修飾/類(lèi)似物，如硫代磷酸酯修飾，可以
是雙鏈或(除了 dsRNA)單鏈。參考文獻(xiàn)142、 143和144披露了可能的類(lèi)似取 代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥(niǎo)苷取代鳥(niǎo)苷。參考文獻(xiàn)145-150進(jìn)一步討論了 CpG 寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或 TTCGTT[151]。 CpG序列可特異性誘導(dǎo)Thl免疫應(yīng)答，例如CpG-AODN(寡聚 脫氧核苷酸)，或更特異地誘導(dǎo)B細(xì)胞應(yīng)答，例如CpG-B ODN。參考文獻(xiàn)152-154 討論了 CpG-A和CpG-B ODN。 CpG優(yōu)選CpG-AODN。優(yōu)選將CpG寡核苷酸 構(gòu)建為5'端易于為受體識(shí)別。任選將兩條CpG寡核苷酸序列在它們的3'端相 連以形成"免疫聚體"(immunomer)。參見(jiàn)，例如參考文獻(xiàn)151和155-157。有用 的CpG佐劑是CpG7卯9，其也稱為ProMuneTM(格雷藥物有限公司(Coley Pharmaceutical Group ， Inc.))。
除使用CpG序列以外，還可使用TpG序列[158]。這些寡核苷酸可不含未 甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸可以富含嘧啶。例如，其可包含多個(gè)連續(xù)的胸苷核苷 酸(例如，參考文獻(xiàn)158所述的TTTT)，和/或其核苷酸組成可含有>25%的胸苷 (例如，>35%、 >40%、 >50%、 >60%、 >80%，等等)。例如，其可包含多個(gè)連 續(xù)的胞嘧啶核苷酸(例如，參考文獻(xiàn)158所述的CCCC)，和/或其核苷酸組成可 含有>25%的胞嘧啶(例如，>35%、 >40%、 >50%、 >60%、 >80%，等等)。這些 寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。
免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20個(gè)核苷酸。它們可包含少于100個(gè)核 苷酸。
3脫-O-?；瘑瘟柞；|(zhì)A
3dMPL (也稱為3脫-O-酰化單磷?；|(zhì)A或3-0-脫酰基-4'-單磷?；?質(zhì)A)是單磷?；|(zhì)A中還原端葡糖胺的3位被脫?；淖魟?dMPL從明 尼蘇達(dá)沙門(mén)菌(Sa/mo"e〃a m/""^oto)的無(wú)庚糖突變體(heptoseless mutant)制備， 其在化學(xué)上類(lèi)似于脂質(zhì)A但缺乏酸不穩(wěn)定的磷?；蛪A不穩(wěn)定的?；?。它活化 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，刺激幾種細(xì)胞因子釋放，包括IL-1、 IL-12、
27TNF-a和GM-GSF(還可見(jiàn)參考文獻(xiàn)159)。參考文獻(xiàn)160最先描述了 3dMPL的 制備。
3dMPL可采取?；潭炔煌南嚓P(guān)分子混合物的形式(例如，具有長(zhǎng)度可能 不同的3、 4、 5或6條?；?。兩個(gè)葡糖胺(也稱為2-脫氧-2-氨基-葡萄糖)單 糖的2-位碳(即，2和2，位灘N-酰基化，3'位也被0-酰基化。與碳2相連的基 團(tuán)如式-NH-CO-CH2-CR/W所示。與碳2'相連的基團(tuán)如式-NH-CO-CH2-CR2R2' 所示。與碳3'相連的基團(tuán)如式-0-CO-CH2-CI^ie'所示。代表性的結(jié)構(gòu)是
基團(tuán)R1、 ie和RS各自獨(dú)立為-(CH2VCH3。 n值優(yōu)選在8-16之間，更優(yōu)選 在9-12之間，最優(yōu)選10。
基團(tuán)R1,、 112'和R3'各自獨(dú)立為(a) -H; (b) —OH;或(c)國(guó)O-CO-R4，其中 R4是-H或-(CH2、-CH3，其中m值優(yōu)選在8-16之間，更優(yōu)選10、 12或14。在 2位，m優(yōu)選14。在2'位，m優(yōu)選10。在3'位，m優(yōu)選12。因此基團(tuán)R"、 R2' 和RS'優(yōu)選十二垸酸、十四烷酸和十六垸酸的-O-?；?。
當(dāng)R1,、 R"和R '均是-H時(shí)，3d-MPL只有3條?；?2、 2'和3'位上各有 一條)。當(dāng)R"、 R"和W中只有兩個(gè)是-H時(shí)，3d-MPL可具有4條?；?。當(dāng) R: R2'和R3'中只有一個(gè)是-H時(shí)，3d-MPL可具有5條酰基鏈。當(dāng)Rp、 R"和 W中無(wú)一是-H時(shí)，3d-MPL可具有6條酰基鏈。本發(fā)明所用3d-MPL佐劑可以 是具有3_6條酰基鏈的這些形式的混合物，但優(yōu)選混合物中包含具有6條?；?鏈的3d-MPL，特別是要確保以重量計(jì)6?；溞问街辽僬伎?d-MPL的10%， 例如^20%、 230%、 240%、 250%或更高。發(fā)現(xiàn)具有6條?；湹?d-MPL是 最有活性的佐劑形式。
因此，本發(fā)明組合物包含的3dMPL最優(yōu)選形式是當(dāng)采用混合物形式的3dMPL時(shí)，提及本發(fā)明組合物中3dMPL的用量或濃 度指該混合物中混合的3dMPL諸種類(lèi)。
在水性條件下，3dMPL可形成大小不同，例如直徑< 150 nm或> 500 nm的 膠束凝聚物或顆粒。本發(fā)明可使用任一種或二者，通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)可選擇較佳的 顆粒。較小的顆粒因其較佳的活性而優(yōu)選用于本發(fā)明(例如，足夠小從而能得 到3dMPL的透明水性混懸液)[161]。優(yōu)選顆粒的平均直徑小于220 nm，更優(yōu) 選小于200nm或小于150nm或小于120 nm，平均直徑甚至可以小于100 nm。 然而，在大多數(shù)情況中，平均直徑不會(huì)小于50nm。這些顆粒足夠小，從而適 于過(guò)濾滅菌?？赏ㄟ^(guò)動(dòng)態(tài)光散射的常規(guī)技術(shù)評(píng)估顆粒直徑，該技術(shù)能揭示平均 顆粒直徑。當(dāng)說(shuō)到顆粒的直徑為x nm時(shí)，顆粒分布一般在該平均值附近，但 以數(shù)量計(jì)至少50%(例如，260%、 270%、 280%、 290%或更多)的顆粒的直徑在 x士25。/。范圍內(nèi)。
3dMPL與水包油乳液組合使用是有利的。最好基本上所有3dMPL位于乳 液的水相中。
可單獨(dú)使用3dMPL，或與一種或多種其它化合物聯(lián)用。例如，可將3dMPL 與下述物質(zhì)聯(lián)用QS21皂苷[162](包含在乳液中[163])、免疫刺激性寡核苷酸、
29QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸鋁[164]、氫氧化鋁[165]、或者磷酸鋁和氫 氧化鋁。
優(yōu)選的佐劑添加方案
本發(fā)明的給藥方案包括首先施用添加佐劑的流感疫苗。用于這種首次疫苗 的優(yōu)選佐劑是水包油乳液。
兩劑量方案的第二劑量?jī)?yōu)選是未添加佐劑的?；蛘?，它可以是添加佐劑的， 但采用與第一劑量不同的佐劑。當(dāng)?shù)谝粍┝恐刑砑佑兴腿橐鹤鳛樽魟r(shí)， 添加佐劑的第二劑量的優(yōu)選佐劑包括鋁鹽。
藥物組合物
本發(fā)明組合物是藥學(xué)上可接受的且通常為含水形式。除了抗原(以及合適的 佐劑)，它們通常包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。對(duì)這些組分的充分討 論見(jiàn)參考文獻(xiàn)166。
組合物可包含一種或多種防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，這 些疫苗優(yōu)選基本上不含(即，少于5 pg/ml)汞物質(zhì)，例如不含硫柳汞[10,167]。 更優(yōu)選不含汞的疫苗。特別優(yōu)選不含防腐劑的疫苗。
優(yōu)選包含生理鹽，例如鈉鹽以控制張力。優(yōu)選1-20 mg/ml之間的氯化鈉 (NaCl)。可存在的其它鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、脫水磷酸氫二鈉(disodium phosphate dehydrate)、氯化鎂、氯化f丐等。
組合物的重量克分子滲透濃度通常在200 mOsm/kg-400 mOsm/kg之間，優(yōu) 選240-360 mOsm/kg之間，更優(yōu)選處于290-310 mOsm/kg范圍內(nèi)。以前有報(bào)道 說(shuō)重量克分子滲透濃度對(duì)疫苗接種所致的疼痛沒(méi)有影響[168]，但最好將重量克 分子滲透濃度維持在該范圍內(nèi)。
組合物可包含一種或多種緩沖液。典型的緩沖液包括磷酸緩沖液；Tris 緩沖液；硼酸緩沖液；琥珀酸緩沖液；組氨酸緩沖液；或檸檬酸緩沖液。所含 的緩沖液范圍一般是5-20 mM。
組合物的pH通常在5.0-8.1之間，更常見(jiàn)在6.0-8.0之間，例如6.5和7.5 之間，或7.0-7.8之間。因此，本發(fā)明方法可包括先調(diào)節(jié)散裝疫苗的pH再包裝 的步驟。
30組合物優(yōu)選無(wú)菌。組合物優(yōu)選無(wú)熱原，例如每劑量含有<1 EU(內(nèi)毒素單位， 標(biāo)準(zhǔn)量度)，優(yōu)選每劑量〈0.1EU。組合物優(yōu)選無(wú)谷蛋白。
組合物可包含一次免疫的物質(zhì)，或可包含多次免疫的物質(zhì)(即，"多劑量"試 劑盒)。在多劑量配置中，優(yōu)選包含防腐劑。除了在多劑量組合物中包含防腐 劑以外，還可將組合物置于裝有用于轉(zhuǎn)移物質(zhì)的無(wú)菌適配器的容器中。
一般給予的流感疫苗劑量體積是約0.5 ml，但可將半劑量(即，約0.25 ml) 給予兒童(例如36個(gè)月以上的兒童)。
組合物和試劑盒優(yōu)選保存在2t:-8X:之間。不應(yīng)冷凍它們。最好避免有光直射。
本發(fā)明的試劑盒
本發(fā)明包括裝有第一流感疫苗和進(jìn)一步的流感疫苗的試劑盒。 一種試劑盒 組分將是添加佐劑的第一疫苗，而另一種試劑盒組分將是任選添加佐劑的進(jìn)一 步的疫苗。這兩種組分將單獨(dú)放置，從而可在完全不同的時(shí)間將它們給予患者。
試劑盒中的各個(gè)疫苗可以是立即可用的，或者可以在給藥時(shí)臨時(shí)制備。這 種臨時(shí)制備的安排要將佐劑可抗原單獨(dú)存放直到使用，當(dāng)使用水包油乳液佐劑 時(shí)這將特別有利。
當(dāng)疫苗是臨時(shí)制備時(shí)，其組分在試劑盒內(nèi)相互物理隔開(kāi)，且這種分離可通 過(guò)各種途徑實(shí)現(xiàn)。例如，兩個(gè)組分可處于兩個(gè)單獨(dú)容器如小瓶?jī)?nèi)。然后可取出 一個(gè)小瓶的內(nèi)含物并將其加入另一小瓶，或者分別取出兩小瓶的內(nèi)含物并在第 三容器中混合而混合兩小瓶的內(nèi)含物。在優(yōu)選的配置中，試劑盒諸組分之一存 于注射器中，其它組分存于容器，例如小瓶中?？衫米⑸淦?例如，裝有針 頭)將其內(nèi)含物注入第二容器中進(jìn)行混合，然后將混合物抽入該注射器中。隨
后將該注射器中的混合內(nèi)含物給予患者，通常利用新的無(wú)菌針頭。將一種組分 包裝在注射器中無(wú)需利用另一注射器來(lái)給予患者。在另一優(yōu)選配置中，將兩種 試劑盒組分分別保存在同一注射器，例如雙室注射器中，如參考文獻(xiàn)169-176 等所披露的。使用該注射器(例如，給予患者期間)之時(shí)即混合了該兩室中的內(nèi) 含物。該配置在使用時(shí)無(wú)需單獨(dú)的混合步驟。
當(dāng)疫苗是臨時(shí)制備時(shí)，其組分通常處于水性形式。在一些配置中，某組分(一 般是抗原組分而不是佐劑組分)處于干燥形式(例如，凍干的形式)，另一組分處
31于水性形式?？梢曰旌纤鰞煞N組分以再活化干組分，從而獲得給予患者的水 性組合物。凍干組分通常保存于小瓶而不是注射器內(nèi)。干燥的組分可以包含穩(wěn) 定劑，例如乳糖、蔗糖或甘露醇以及它們的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗 糖/甘露醇混合物等。 一種可能的配置將水性乳液組分存于預(yù)填充注射器中，而 將凍干抗原組分存于小瓶中。 組合物或試劑盒組分的包裝
本發(fā)明組合物(或試劑盒組分)的合適容器包括小瓶、注射器(例如， 一次性 注射器)、鼻噴霧器等。這些容器應(yīng)無(wú)菌。
如果將組合物/組分存于小瓶中，所述小瓶?jī)?yōu)選由玻璃或塑料材料制成。優(yōu) 選先將小瓶滅菌再加入組合物。為避免患者對(duì)乳膠過(guò)敏的問(wèn)題，優(yōu)選用無(wú)乳膠 的塞子密封小瓶，所有包裝材料最好均不含乳膠。小瓶可裝有單劑量疫苗，或 可裝有多劑量("多劑量"小瓶)，例如10份劑量。優(yōu)選用無(wú)色玻璃制成小瓶。
小瓶可裝有蓋子(例如，Luer鎖扣)，從而可將預(yù)填充的注射器插入蓋子中，
將注射器的內(nèi)含物推入小瓶中(例如，重建其中的凍干材料)，再將小瓶的內(nèi)含 物抽回注射器中。將注射器從小瓶中取出后，裝上針頭，將組合物給予患者。 優(yōu)選使蓋子位于封口或覆蓋物內(nèi)，從而要先除去封口或覆蓋物再接觸蓋子。小 瓶可具有蓋子，從而能無(wú)菌取出其內(nèi)含物，特別是對(duì)于多劑量小瓶。
如果要將某組分包裝入注射器，注射器可裝有針頭。如果未裝針頭，可隨 注射器提供單獨(dú)的針頭用于裝配和使用。這種針頭可以是有鞘的。優(yōu)選安全針
頭。常見(jiàn)的是1英寸23號(hào)、1英寸25號(hào)和5/8英寸25號(hào)針頭。注射器可裝有 可剝離標(biāo)簽，其上打印了批號(hào)、流感季節(jié)和內(nèi)含物的有效期，從而有助于記錄 保管。注射器的柱塞優(yōu)選具有塞子，從而能防止柱塞在抽吸期間意外掉出。注 射器可裝有乳膠橡膠蓋子和/或柱塞。 一次性注射器可含有單劑量疫苗。在裝上 針頭之前，注射器一般裝有針帽以密封頂端，所述針帽優(yōu)選由丁基橡膠制成。 如果注射器和針頭分開(kāi)包裝，則優(yōu)選給針頭裝有丁基橡膠罩。優(yōu)選的注射器是 以"Tip-Lok"TM為商品名投入市場(chǎng)的那些。
可給容器做上顯示半劑量體積的標(biāo)記，例如以有助于遞送給兒童。例如，
含有0.5 ml劑量的注射器可具有顯示0.25 ml體積的標(biāo)記。如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，則優(yōu)選使用硼硅酸玻璃而不是 鈉鈣玻璃制成的容器。
可隨試劑盒或組合物裝有(例如，裝在同一盒子中)插頁(yè)，該插頁(yè)包括疫苗 的細(xì)節(jié)，例如給藥的使用說(shuō)明書(shū)，疫苗中抗原的細(xì)節(jié)等。使用說(shuō)明書(shū)還可包括 警告，例如準(zhǔn)備腎上腺素溶液以防疫苗接種后的過(guò)敏反應(yīng)，等等。
治療方法和疫苗的施用
本發(fā)明組合物適合給予人類(lèi)患者。按照本發(fā)明引起的免疫應(yīng)答將通常包括 抗體反應(yīng)，優(yōu)選保護(hù)性抗體反應(yīng)。本領(lǐng)域熟知評(píng)估流感病毒疫苗接種后的抗體 應(yīng)答、中和能力和保護(hù)作用的方法。人類(lèi)研究證明針對(duì)人流感病毒血凝素的抗
體滴度與保護(hù)作用有關(guān)(血清樣品血凝反應(yīng)-抑制滴度約30-40時(shí)，對(duì)同源病毒 感染的保護(hù)作用約為50%)[177]。 一般通過(guò)血凝反應(yīng)抑制、微量中和、單輻射 免疫擴(kuò)散(SRID)和/或單向輻射狀溶血(SRH)檢測(cè)抗體應(yīng)答。本領(lǐng)域熟知這些試 驗(yàn)技術(shù)。
可以各種方法給予本發(fā)明組合物。最優(yōu)選的免疫途徑是肌肉內(nèi)注射(例如， 注射入手臂或腿中)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內(nèi)[178-180]、 口服 [181]、真皮內(nèi)[182，183]、透皮、經(jīng)皮[184]等。
本發(fā)明制備的疫苗可用于治療兒童和成年人。流感疫苗目前推薦用于兒科 和成年人免疫接種，年齡自6個(gè)月起。因此，患者可以小于1歲、1-5歲、5-15 歲、15-55歲、或至少55歲。接受疫苗的患者優(yōu)選老年人(例如，2 50歲，2 60 歲，優(yōu)選2 65歲)，年輕人(例如，S5歲)，住院患者，衛(wèi)生保健人員、軍隊(duì)和 軍事人員，懷孕的婦女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗 病毒化合物(例如，奧塞米韋或扎那米韋化合物；例如磷酸奧塞米韋，參見(jiàn)下 文)的患者，和出國(guó)的人。然而，這些疫苗不僅適用于這些團(tuán)體，還可應(yīng)用于 更廣泛的人群中。對(duì)于流行毒株，優(yōu)選給予所有的年齡組。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物滿足效力的CPMP標(biāo)準(zhǔn)的1、2或3條。在成年人(18-60 歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)2 70%血清保護(hù)作用；(2)^40%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3) GMT增加2 2.5-倍。在老年人(>60歲)中，這些標(biāo)準(zhǔn)是(1)2 60%血清保護(hù)作 用；(2)^30%血清轉(zhuǎn)化；和/或(3)GMT增加2 2-倍。這些標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)至少50位患者的標(biāo)簽公開(kāi)研究(open label study)。
治療通過(guò)多劑量方案進(jìn)行。如上所述，不同劑量將通常采用相同的抗原形 式并共享至少一種常見(jiàn)血凝素亞型。優(yōu)選所有劑量都在腸胃外給予或者都通過(guò) 粘膜給予。各劑量通常將通過(guò)相同給藥途徑給予，例如通過(guò)相同的腸胃外途徑， 如肌內(nèi)注射。
多劑量通常可間隔至少一周(例如，約2周、約3周、約4周、約6周、約 8周、約10周、約12周、約16周，等等)給予。
優(yōu)選的本發(fā)明的劑量方案是兩劑量方案。進(jìn)一步的劑量可在隨后的流感季 節(jié)施用，通常采取常規(guī)的單劑量方式，但根據(jù)本發(fā)明， 一個(gè)周期內(nèi)(例如在6 個(gè)月內(nèi)或在12個(gè)月內(nèi))的標(biāo)準(zhǔn)免疫接種將包括2次劑量。由于需要額外的抗原， 因此方案(例如3-劑量或4-劑量方案)中的額外劑量并不優(yōu)選。然而，如果方案 包括第三次劑量，則第三劑量可以是對(duì)第一劑量的重復(fù)，然后是進(jìn)一步的劑量， 或者可以是進(jìn)一步劑量的重復(fù)，例如'添加佐劑的、添加佐劑的、未添加佐劑 的'方案，或'添加佐劑的、未添加佐劑的、添加佐劑的'方案。
可將本發(fā)明疫苗與其它疫苗基本上同時(shí)(例如，可在醫(yī)療保健專(zhuān)家或疫苗 接種中心的同一次用藥咨詢或就診期間)給予患者，例如與以下疫苗基本上同 時(shí)麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風(fēng)疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、 白喉疫苗、破傷風(fēng)疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯(lián)的乙型流感嗜血桿菌疫 苗、滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯(lián)物疫苗(例 如，四價(jià)A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞體病毒疫苗、肺炎球菌偶聯(lián)物疫苗， 等等。與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本上同時(shí)給予在老年患者中特別有用。
類(lèi)似地，可將本發(fā)明疫苗與抗病毒化合物，特別是有效抵御疫流感毒的抗 病毒化合物(例如，奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(shí)(例如，可在醫(yī)療保健 專(zhuān)家的同一次用藥咨詢或就診期間)給予患者。這些抗病毒(化合物)包括神經(jīng)氨 酸酶抑制劑，例如(3R,4R,5S)-4-乙?；被?5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環(huán)己烯 -l-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亞氨基甲萄-氨基]-2,6-脫水-3，4，5-三脫氧-0-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonicacid)，包括它們的酯(例如乙酉旨)和它們的鹽(例如磷酸鹽)。優(yōu)選的抗病毒化合物是(311,411，58)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環(huán)己烯-l-羧酸、乙酉旨、磷酸酯(1:1)，也稱為磷酸奧塞 米韋(TAMIFLUtm)。
概述
術(shù)語(yǔ)"含有"包括"包含"以及"由...組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X 組成或可包含其它物質(zhì)，例如X + Y。
詞語(yǔ)"基本上"不排除"完全"，例如"基本上無(wú)"Y的組合物可完全無(wú)Y。該詞 語(yǔ)"基本上"可視需要從本發(fā)明定義中省去。
與數(shù)值x有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"約，，表示，例如x ± 10%。
除非有專(zhuān)門(mén)表述，包括混合兩種或多種組分的步驟的某方法不要求任何具 體混合順序。因此，可以任何順序混合諸組分。如果有三種組分，則可先將兩 種組分彼此混合，再將該混合物與第三種組分混合，等等。
如果利用動(dòng)物(特別是牛)材料培養(yǎng)細(xì)胞，這些材料應(yīng)從不含可傳染海綿樣 腦病(TSE)，特別是不含牛海綿樣腦病(BSE)的來(lái)源獲得?？傮w上，優(yōu)選在完全 不含動(dòng)物來(lái)源的材料中培養(yǎng)細(xì)胞。
如果將化合物作為組合物的一部分給予身體，或可用合適的前藥替代該化 合物。
如果將細(xì)胞物質(zhì)用于重配或反向遺傳學(xué)方法，優(yōu)選批準(zhǔn)用于人疫苗生產(chǎn)的 細(xì)胞物質(zhì)，例如歐洲藥典概述章節(jié)5.2.3中的。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了用不同流感疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生的抗-HAIgGELISA反應(yīng)。 本發(fā)明的實(shí)施方式
血凝素從H5N1禽流感毒株制備并制成每劑0.2ng(每劑50pl)的肌內(nèi)注射形 式。制備兩種疫苗第一種是未添加佐劑的；第二種以1: 1添加MF59乳液 作為佐劑。在第0和28天將疫苗給予四組8周齡的雌性Balb/c小鼠。在第 14和42天采集小鼠血液并通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)抗-HA免疫應(yīng)答。
結(jié)果如下(同時(shí)見(jiàn)圖1):組ABCD
第o天無(wú)佐劑MF59無(wú)佐劑MF59
第28天無(wú)佐劑無(wú)佐劑MF59MF59
效價(jià)(第14天)133136271
有反應(yīng)的3/1010/103/1010/10
效價(jià)(第42天)71257592242219148831
有反應(yīng)的10/1010/1010/1010/10
因此，佐劑能顯著提高第一次免疫接種后有反應(yīng)小鼠的數(shù)量(比較組A和 B)。 一次或兩次劑量中包含佐劑能使抗-HA特異性抗體反應(yīng)明顯高于兩次未添 加佐劑的疫苗劑量所誘導(dǎo)的反應(yīng)(將組B、 C和D與組A進(jìn)行比較)。此外，用 添加佐劑的疫苗初免的動(dòng)物可用未添加佐劑的疫苗加強(qiáng)免疫，獲得的效價(jià)高于 用未添加佐劑的疫苗初免并用添加佐劑的疫苗加強(qiáng)免疫(比較組B和C)。盡管 組B的絕對(duì)效價(jià)低于組D，但反應(yīng)已經(jīng)足夠了。因此，僅在兩劑量方案的第一 劑量中使用佐劑就能維持佐劑的效力。
應(yīng)理解，僅通過(guò)實(shí)施例描述了本發(fā)明，可對(duì)該實(shí)施例進(jìn)行修改而不超出本 發(fā)明的范圍和精神。
參考文獻(xiàn)(其內(nèi)容通過(guò)引用納入本文) Holmes等(2005) Science 309:989. Guy等(1998) Clin Diagn Lab Immunol 5:732-6. W096/37624. W098/46262. WO02/28422. WO02/067983. WO02/074336. WO01/21151. WO02/097072. Huckriede等(2003) Methods Enzymol 373:74-91. [13] Herlocher等(2004) J Infect Dis l卯(9): 1627-30. [14] Le等(2005) Nature 437(7062): 1108.世界衛(wèi)生組織(2005) Emerging Infectious Diseases 11(10): 1515-21. [16] Hoffmann等(2002) Vaccine 20:3165-3170. [17] Subbarao等(2003) Virology 305:192-200. [18] Liu等(2003) Virology 314:580-5卯.
36》]Ozaki等(2004) J. Virol. 78:1851-1857. )]Webby等(2004) Lancet 363:1099-1103. I] WOOO/60050. 2] WOO 1/04333. 〗]US 6649372.
1] Neumann等(2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:16825-9. 5] WO2006/067211. 5〗WO01/83794.
7] Hoffmann等(2000) Virology 267(2):310-7.
WO97/37000, 》]Brands等(1999) Dev Biol Stand 98:93-100. )]Halperin等(2002) Vaccine 20:1240-7. I] Tree等(2001) Vaccine 19:3444-50. 2〗Kistner (1998) Vaccine 16:960-8. ;]Kistner等(1999) Dev Biol Stand 98:101-110,
Bruhl等(2000) Vaccine 19:1149-58. 5] Pau等(2001) Vaccine 19:2716-21. 5] http:〃www,atcc,org/ 7] http:〃locus. umdnj. edu/ S] WO03/076601. 》]WO2005/042728. )]WO03/043415. I] WO01/85938. 2] WO2006/108846. ;]EP-A-1260581 (WOO 1/64846).
WO2006/071563. 5] WO2005/113758. 5] WO2006/027698. 7] WO97/37000 WO03/023021 )]WO03/023025 )]WO97/37001. I] WO01/22992.
2] Hehme等(2004) Vims Res. 103(1-2): 163-71. ;]Treanor等(1996) J Infect Dis 173:1467-70. 4] Keitel等(1996) Clin Diagn Lab Immunol 3:507-10. 5〗Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197. 5]"工業(yè)指南生物分析方法確認(rèn)"(Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation), 美國(guó)健康和人服務(wù)部食品藥品管理中心獸藥評(píng)估和研究(CDER)中心(CVM) (U.S. D印artment of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM)). 2001年5月. [57] Ji等(2002) Biotechniques . 32:1162-7. ^58; Briggs (1991) JParenter SciTechnol, 45:7-12, [59] Lahijani等(1998) Hum Gene Ther. 9:1173-80. [60] Lokteff等(2001) Biologicals. 29:123-32. 〖61] EP-B-0870508. [62] US 5948410. [63] WO2007/052163. [64]美國(guó)專(zhuān)利6355271. [65] WOOO/23105. [66] US 4,680,338.[67] US 4,988,815.[68] W092/15582. Wu等.(2004) Antiviral Res.64(2):79-83. Vasilakos等，(2000) Cell Immunol.204(l):64-74.美國(guó)專(zhuān)利4689338, 4929624, 5238944， 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640，5395937, 5482936, 5494916, 5525612， 6083505, 6440992, 6627640, 6656938, 6660735， 6660747,6664260, 6664264, 6664265, 6667312, 6670372, 6677347， 6677348, 6677349, 6683088, 6703402,6743920， 6800624, 6809203, 6888000和6924293.
73] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.
74] WO2004/060308.
75] US 6,924,271.
76] US2005/0070556.
77] US 5,658,731.
78] WO2004/064759.
79]美國(guó)專(zhuān)利5,011,828.
80] WO2004/87153.
8lj US 6,605,617.
82] WO02/18383.
83] WO2004/018455.
84] WO03/082272.
85] WO2006細(xì)2422.
86] Johnson等(1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.
87] Evans等(2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.
88] Andrianov等(1998) Biomaterials 19:109-115.
89] Payne等(1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.
90] US 5,057,540.
91] W096/33739.
92] EP-A-0109942.
93〗W096/11711.
94] WO00/07621,
95] Barr等(1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271
96] Sjolanderet等(1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338,
97] Pizza等(2000) Int J Med Microbiol 290:455-461
98] W095/17211.
99] W098/42375.
100] Singh等(2001) J Cont Release 70:267-276.
101] WO99/27960.
102] US 6,0卯,楊
103] US 5,916,588
104] EP-A-0626169.
105] W099/52549.
106] WO01/21207.
107] WO01/21152.
109] Dyakonova等(2004) Int Immunopharmaeol 4(13):1615-23.110] FR-2859633.
Ill] Signorelli和Hadden (2003) Int Immunopharmaeol 3(8): 1177-86.112] WO2004/064715.
113] De Libero等，Nature Reviews Immunology, 2005， 5: 485-496
114]美國(guó)專(zhuān)利5,936,076.
115] Oki等，J. Clin. Investig" 113: 1631-1640
38[116] US2005/0192248
〖117] Yang等，Angew, Chem. Int, Ed" 2004, 43: 3818-3822[118]WO2005/102049 GoS等，J. Am. Chem,, Soc, 2004, 126: 13602-13603[120] WO03/105769 Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6:559-80.[122] WO03/011223. Meraldi等(2003) Vaccine 21:2485-2491.[124] Pajak等(2003) Vaccine 21:836-842.[125] US-6586409. Wong等(2003) J Clin Pharmacol 43(7):735-42.[127] US2005/0215517.[128] WO90/14837. Podda和Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2:197-203.[130] Podda (2001) Vaccine 19: 2673-2680.《疫S設(shè)計(jì)亞單位和佐劑方法》(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach)
(Powell和Newman編)，普萊納姆出版社(Plenum Press) 1995 (ISBN 0-306-44867-X).《疫苗佐劑制4方法和研究方案》(Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research
Protocols)(分子醫(yī)學(xué)叢書(shū)第42巻).ISBN: l-59259-083-7. O，Hagan編. Allison和Byars (1992) Res Immunol 143:519-25. Hariharan等(1995) Cancer Res 55:3486-9. US-2007/014805 WO95/11700.美國(guó)專(zhuān)利6,080,725. WO2005/097181. WO2006/113373. Han等(2005)"維生素E對(duì)老年人的免疫功能和感染性疾病的影響"(Impact of Vitamin Eon Immune Function and Infectious Diseases in the Aged),"營(yíng)養(yǎng)、免疫功能和健康歐洲大會(huì)，，(Nutrition, Immune functions and Health EuroConference)，巴黎，2005年6月9-10日.[141] US- 6630161. Kandimalla等(2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.[143] WO02/26757.[144] W099/62923. Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835, McCluskie (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185. WO98/40100.美國(guó)專(zhuān)利6,207,646.美國(guó)專(zhuān)利6,239,116.美國(guó)專(zhuān)利6，429，199. Kandimalla等(2003) Biochemical Society Transactions 31 (第3部分):654-658. Blackwell等(2003) J Immunol 170:4061-4068. Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65. Kandimalla等(2003) BBRC 306:948-953. Bhagat等(2003) BBRC 300:853-861. WO03/035836. WOO 1/22972. Thompson等(2005) J Leukoc Biol 78:"LPS、MPL⑧佐劑和RC529的低毒性形式是CD4+T細(xì)胞的有效佐劑，，(The low-toxicity versions of LPS, MPL adjuvant and RC529, are efficientadjuvants for CD4+ T cells).[160]UK專(zhuān)利申請(qǐng)GB-A-2220211.
39[161] WO 94/21292.[162] WO94/00153.[163] WO95/17210.[164] W096/26741.[165] WO93/19780, Gennaro (2000)《雷明頓藥學(xué)科學(xué)和實(shí)踐》(Remington: The Science and Practice of
Pharmacy),第20版，ISBN: 0683306472. Banzhoff (2000) Immunology Letters 71:91-96. Nony等(2001) Vaccine 27:3645-51. WO2005/089837.美國(guó)專(zhuān)利6,692,468. WO00/07647.
〖172] WO99/17820.美國(guó)專(zhuān)利5,971,953.美國(guó)專(zhuān)利4,060,082. EP-A-0520618.
fl76] WO98/01174. Potter和Oxford (1979) Br Med Bull 35: 69-75. Zurbriggen等(2003) Expert Rev Vaccines 2:295-304. Piascik (2003) J Am Pharm Assoc (華盛頓特區(qū)).43:728-30. Mann等(2004) Vaccine 22:2425-9. Halperin等(1979) Am J Public Health 69:1247-50. Herbert等(1979) J Infect Dis 140:234-8. Chen等(2003) Vaccine 21:2830-6.
40
權(quán)利要求
1. 一種免疫患者免遭流感病毒感染的方法，該方法包括以下步驟(i)施用與第一佐劑組合的流感病毒疫苗劑量；和(ii)施用不含該佐劑的流感病毒疫苗的進(jìn)一步劑量。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述進(jìn)一步劑量通過(guò)與第一劑 量相同的途徑施用。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述進(jìn)一步劑量是未添加 佐劑的。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述進(jìn)一步劑量添加了不 同于第一佐劑的佐劑。
5. —種試劑盒，其中裝有(i)與第一佐劑組合的第一流感病毒疫苗；和(ii) 不含該佐劑的第二流感病毒疫苗。
6. (i)與第一佐劑組合的第一流感病毒疫苗；和(ii)不含該佐劑的第二流感病 毒疫苗在制造多劑量流感疫苗中的應(yīng)用。
7. —種完全免疫患者免遭流感病毒感染的方法，其中，所述患者之前已接 受與第一佐劑組合的流感病毒疫苗劑量，且其中所述方法包括給患者施用不含 該佐劑的流感病毒疫苗的進(jìn)一步劑量的步驟。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述進(jìn)一步劑量通過(guò)與之前劑量相同的途徑施用。
9. 未添加佐劑的流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流感病毒感染的 藥物中的應(yīng)用，其中，所述患者之前已接受添加佐劑的流感病毒疫苗。
10. 添加佐劑的第二流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流感病毒感染 的藥物中的應(yīng)用，其中，所述患者之前已接受添加佐劑的第一流感病毒疫苗， 其中第一和第二流感病毒的佐劑是不同的。
11. 如上述任一權(quán)利要求所述的方法、試劑盒或應(yīng)用，其特征在于，所述 疫苗所含的血凝素低于15嗎/毒株/疫苗。
12. 如上述任一權(quán)利要求所述的方法、試劑盒或應(yīng)用，其特征在于，所述 流感病毒疫苗包含Hl、 H2、 H3、 H5、 H7或H9甲型流感病毒亞型的流感病毒抗原。
13.如上述任一權(quán)利要求所述的方法、試劑盒或應(yīng)用，其特征在于，所述 第一佐劑包含水包油乳液。
全文摘要
通過(guò)多劑量方案施用的流感疫苗，其中，(i)第一劑量與佐劑一起施用，而(ii)隨后劑量不與佐劑一起或與不同佐劑一起施用。因此，本發(fā)明在無(wú)需加倍提供特定佐劑的情況下便可提供兩次劑量方案的益處。
文檔編號(hào)A61K39/145GK101500603SQ200780027332
公開(kāi)日2009年8月5日 申請(qǐng)日期2007年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者G·德?tīng)柟诺纤? R·曼尼蒂 申請(qǐng)人:諾華有限公司