專利名稱：：一種新型核因子-κBp65亞基拮抗多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種治療用核因子-kb(NF-kB)p65亞基拮抗肽，更具體而言，涉及一種能夠與核因子-icBp65亞基特異結(jié)合并抑制其活性的小分子肽。本發(fā)明還涉及這種核因子-KBp65亞基拮抗肽的制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：NF-kB是普遍存在于幾乎所有細胞胞漿中的一種轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，具有調(diào)控多種參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、病毒復(fù)制、細胞凋亡和增殖以及生長發(fā)育相關(guān)基因表達的功能。NF-KB系由兩種Rel家族蛋白構(gòu)成的二聚體蛋白質(zhì)。根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能和合成方式等方面的差異，可將Rel蛋白家族分成兩類一類是前體蛋白pl05和p100，其C末端含錨蛋白重復(fù)序列(ankinrepeatmotif)，可通過ATP依賴的蛋白水解過程裂解，變?yōu)槌墒斓膒50和p52。該類蛋白缺乏反式激活結(jié)構(gòu)域，無獨立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能；另一類是RelA(p65)、Rel(c-Rel)、v-Rel和RelB，其C末端含有1個或多個反式激活域(transactivationdomain),具有獨立激活基因轉(zhuǎn)錄的功能。當(dāng)細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-kB主要與kB抑制蛋白(IkBs)結(jié)合形成三聚體，以無活性方式存在于細胞質(zhì)中。當(dāng)細胞受到前炎癥細胞因子、病毒、內(nèi)毒素、紫外線、氧化劑和放射線等多種外界信號刺激而啟動細胞第二信使系統(tǒng)時，IkBs在IkB激酵(IKK)的作用下發(fā)生磷酸化并降解，NF-KB失去lKBs的嚴格控制而被激活，并移位進入細胞核內(nèi)，其亞基形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)與靶基因啟動子內(nèi)的特定部位結(jié)合，高效誘導(dǎo)促炎細胞因子(如TNF、GM-CSF、IL-1(3、IL-6、IL-ll、IL一17等)、趨化因子(如IL-8、RANTES、MIP-loc、MCP-2等)、粘附分子(如ICAM-1、VCAM-1、ELAM-1等)、免疫受體(如IL-2R)以及參與炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大的多種酶(如NO合成酶、環(huán)氧化酶等)的表達。NF-KB所誘導(dǎo)的一些蛋白可進一步反轉(zhuǎn)活化NF-KB，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的擴大和延續(xù)?；谏鲜稣J識，許多學(xué)者認為抑制NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性將為炎性相關(guān)疾病的治療開辟新的途徑。另外，NF-KB在細胞凋亡和增殖中也發(fā)揮重要作用，其可通過直接上調(diào)凋亡抑制因子(c-IAPl、c-IAP2、和IXAP)、TNF受體相關(guān)因子(TRAF1和TRAF2)、鋅指蛋白A20、超氧化錳歧化酶、Bcl-2同系物Al/Bfl-1和正X-IL等抗凋亡基因的表達，抑制細胞的凋亡。在腫瘤治療中，化療和放療可使NF-KB活化，致使腫瘤細胞對化療耐藥和對放射線不敏感。因此，抑制NF-KB的轉(zhuǎn)錄活性，降低腫瘤細胞的抗凋亡能力不失為提高抗癌藥物治療功效的良策。由于NF-kB強大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，NF-kB的過度活化在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的作用如(類)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、慢性腎小球性腎炎、幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎、炎癥性腸道疾病等慢性炎性疾病，膿毒癥、膿毒性休克、急性腎小球性腎炎等急性炎性疾病，Alzheimer's病，動脈粥樣硬化，系統(tǒng)性紅斑自狼瘡等身免疫性疾病和癌癥的發(fā)生和發(fā)展均于NF-kB過度或持續(xù)活化密切相關(guān)。另外，NF-kB也參與了鼻病毒、流感病毒、EB病毒、巨細胞病毒、腺病毒、HTL病毒和HIV病毒等在感染細胞中的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，在這些病毒的感染和致病過程中起著重要的作用。鑒于NF-kB在上述疾病的發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用，以NF-kB及其信號傳導(dǎo)通路中的相關(guān)蛋白為靶點，研發(fā)NF-icB相關(guān)疾病的治療藥物已成為本領(lǐng)域中的研究熱點。目前國外有關(guān)以NF-kB為靶點的拮抗治療策略主要包括以下幾個方面(1)抗氧化治療如抗氧化劑——吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidined池iocarbamate，PDTC)非特異抑制NF-kB的轉(zhuǎn)錄活性；(2)抑制IKK的形成及活性應(yīng)用IKKot的反義核酸、表達IKKot顯性失活突變體以及應(yīng)用干擾IKK復(fù)合物形成的干擾肽等抑制IKK的形成及活化；(3)減少IkB的降解某些蛋白酶小體抑制劑如MGIOI、MG115、MG132、PS-341、lactacystin以及近來發(fā)現(xiàn)的epoxomicin等均可通過抑制lKB的降解，達到拮抗NF-kB活性的目的。(4)促進IkB的生成應(yīng)用lKBa的腺病毒表達載體，使JKBa顯型失活突變體過量表達，可明顯抑制NF-kB的核移位及其后續(xù)效應(yīng)；(5)抑制NF-kB的合成設(shè)計P50和P65的反義核酸和siRNA阻滯NF-kB的合成；(6)傳統(tǒng)非甾體類抗炎藥物抑制NF-kb的活化；(7)來源于中藥的姜黃素、黃酮類化合物和白藜蘆醇等化合物非特異地抑制NF-icB信號通路的活化。上述以NF-kB為靶點的治療策略在體外和動物實驗中已表現(xiàn)出不同程度的療效，部分治療策略已進入臨床試用階段，且已通過UnitedStatesPatentandTrademarkO伍ce禾口EuropeanPatentOffice等注冊并受專利保護。但上述部分措施存在特異性欠佳的問題。如蛋白酶小體，它除了可降解IkB外，還具有其他許多重要的功能，因此抑制蛋白酶小體活性將導(dǎo)致潛在的毒副作用?？寡趸瘎┑淖饔梅秶訌V泛，毒副作用更大。靶向IKK、IkB的措施對NF-kB活性的干預(yù)也不完全特異，如干擾IKK復(fù)合物形成的干擾肽已被證實，其不僅可抑制NF-kB的活性，還可抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NFAT的活性。非甾體類抗炎藥物、姜黃素、黃酮類化合物和白藜蘆醇等化合物除了抑制NF-kB信號通路外，還對其它信號通路具有調(diào)控作用。而直接抑制NF-kB的合成策略雖然對于NF-kB是特異性的，但反義核酸和siRNA策略進入臨床應(yīng)用也還存在許多問題，因此抑制NF-kB的合成策略并非最優(yōu)選擇。從NF-kB的整個活化途徑不難看出，NF-kB與DNA順式元件的結(jié)合是特異的，也是NF-kB啟動相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄的必經(jīng)之路。因此，只有對NF-kB與DNA順式元件的結(jié)合實施直接的干預(yù)措施，才能達到真正意義上的特異性。而對NF-kB活化的上游途徑進行干預(yù)則難以達到這一目的。由p50和p65兩亞基形成的異二聚體是NF-kB的典型代表，是NF-kB所有形式中最重要的一種，幾乎存在于體內(nèi)所有細胞，其含量遠高于其它二聚體。此異二聚體的氨基末端可構(gòu)成l個環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，由其介導(dǎo)與DNA堿基特異性結(jié)合。晶體衍射分析顯示，p50/p65異源二聚體與免疫球蛋白k鏈基因增強子kb序列特異性結(jié)合的方式為p50亞單位的Arg-54、Arg-56、Tyr-57、Glu-60、His-64和Lys-241氨基酸殘基與KB序列5'端的S'-G-sG^G^A^C.W堿基系列特異結(jié)合；p65亞單位的Arg-33、Arg-35、Arg-36、Glu-39、禾BArg-187，與kB序列3'端的5'-T+lT+2C+3C+4-3'4個堿基對特異結(jié)合。另外，由NF-kBp50/p65異源二聚體的氨基端和二聚化結(jié)構(gòu)域共同構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，還可非特異地識別DNA核糖磷酸骨架。即由p50和p65N末端共同構(gòu)成的這一環(huán)狀結(jié)構(gòu)域形成了NF-kB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)其與順式作用元件的結(jié)合，值得注意的是，這種結(jié)合為特異性結(jié)合。NF-kB激活耙基因首先需要DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別靶基因啟動子區(qū)域內(nèi)的順式作用元件，并與之結(jié)合，后在p65反式激活域的輔助下，激活靶基因的表達。因此，若我們獲得能夠拮抗p65亞基與其順式作用元件結(jié)合的多肽，則勢必能夠達到拮抗NF-kB轉(zhuǎn)錄活性的效果，最終達到抑制NF-kB調(diào)控靶基因表達及治療急慢性炎癥相關(guān)疾病和腫瘤的目的。隨著20世紀80年代后期崛起的一種研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具——酵母雙雜交技術(shù)的建立、成熟和發(fā)展，對NF-kB拮抗多肽的篩選工作最終成為可能。酵母雙雜交系統(tǒng)具有很高的靈敏度，能檢測微弱而短暫的蛋白質(zhì)間相互作用，且該系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的相互作用發(fā)生于酵母細胞胞內(nèi)和/或核內(nèi)。與原核細胞相比，真核酵母細胞對蛋白質(zhì)的翻譯和加工更加接近哺乳細胞，以其為工程菌研究蛋白質(zhì)的相互作用將更佳接近哺乳細胞的生理狀態(tài)，即保持蛋白質(zhì)天然的折疊狀態(tài)，使蛋白質(zhì)間相互作用更接近哺乳細胞內(nèi)的真實水平。因此，應(yīng)用該系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)間的相互作用已得到愈來愈廣泛的應(yīng)用，特別對胞內(nèi)靶蛋白相互作用蛋白或多肽的篩選，此系統(tǒng)更為首選。NF-kB是核轉(zhuǎn)錄因子，存在于細胞漿中，但于細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。因此，我們選用酵母雙雜交系統(tǒng)，以NF-kBp65DNA結(jié)合域為誘餌蛋白，從隨機肽庫中篩選NF-kB相互作用多肽，并鑒定這些多肽的功能。目前我們已篩選獲得8條具有不同序列的NF-KBp65亞基拮抗肽，這里所列的是其中一條拮抗肽，另外5條分別見專利200510007479.2，200510069451.1。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供能夠與核因子-KBp65亞基專一結(jié)合，并能夠抑制核因子-icB活性及其所調(diào)控基因表達的核因子-KB拮抗肽。本發(fā)明的另一目的是提供此核因子-kB拮抗肽的藥物用途。本發(fā)明的核因子-KBp65亞基拮抗肽氨基酸序列如下ArgLeuArgTrpArg本發(fā)明所述抗核因子-KB的藥物用途是治療炎性免疫相關(guān)疾病的藥物或抗腫瘤的藥物用途。其中所述炎性相關(guān)疾病是膿毒癥、膿毒性休克、(類)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，其中所述腫瘤是肝癌、胃癌、食道癌、乳腺腫瘤、膀胱癌、前列腺腫瘤等。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的多肽的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物，必要時可以含有藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物，可以以任何形式的藥物制劑形式存在。如適合口服的制劑或適合注射的制劑，優(yōu)選是注射劑。最優(yōu)選是冷凍干燥注射劑。本發(fā)明還包括本發(fā)明的多肽的制備方法，所述方法選自常規(guī)的固相合成方法、溶液中合成方法，基因重組方法或化學(xué)合成方法。具有本發(fā)明氨基酸序列結(jié)構(gòu)的多肽可與核因子-KBp65亞基專一結(jié)合，并阻斷核因子-kB與其順式作用元件的結(jié)合,從而抑制核因子-kB的生物學(xué)活性，即核因子-kB調(diào)控各種靶基因表達的活性。此種結(jié)構(gòu)多肽既可以以多肽形式單獨存在，也可與其它蛋白和多肽融和，或被甲基化、乙?；桶被刃揎?，或進行個別氨基酸的突變或替代，或插入蛋白質(zhì)表面的特定部位，如凸環(huán)區(qū)，或與其它物質(zhì)連接。無論以什么形式存在，含此結(jié)構(gòu)多肽的物質(zhì)可能表現(xiàn)出與核因子-KBp65亞基結(jié)合，并抑制核因子-kB活性的作用。本發(fā)明通過酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得與核因子-KBp65亞基新型結(jié)合多肽，并證實了此條多肽具有抑制核因子-KB生物活性的功能，這對于設(shè)計和研制新型抗核因子-KB的藥物具有重要意義。研究結(jié)果表明，本發(fā)明篩選到的多肽不僅能夠競爭性阻斷核因子-KB與其順式作用元件的結(jié)合，也能夠抑制核因子-KB所調(diào)控的靶基因的表達，因而可以成為新的抗核因子-KB藥物或藥物前體，本發(fā)明的多肽可以用于治療各種炎癥或免疫性相關(guān)疾病和腫瘤。另外，本發(fā)明的核因子-kBp65亞基結(jié)合肽作為生物制劑也有著潛在的應(yīng)用價值，如作為配體用于核因子-kB的親和純化、作為探針用于核因子-kb的檢測等等。含此氨基酸序列的物質(zhì)可有各種應(yīng)用方式，主要包括在體外和體內(nèi)抑制核因子-kB的活性，以各種給藥方式實現(xiàn)以抑制核因子-KB活性為目的的疾病治療，以及核因子-KB的檢測或純化等。含本發(fā)明氨基酸序列的物質(zhì)在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用還包括1、通過合成或基因重組的方式，將含此序列的肽段與其它蛋白或肽融合或進行化學(xué)修飾，用于以抑制核因子-kB活性為目的的各種炎性相關(guān)疾病、自身免疫疾病、腫瘤以及其它相關(guān)疾病的治療。2、將其與瓊脂糖偶聯(lián)后，用于核因子-KB的親和分離。3、將其與指示標簽偶聯(lián)后，用于核因子-KB的鑒定。4、本發(fā)明的多肽在一些指標上優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，如進行了p65結(jié)合多肽理化特征常數(shù)分析對比分析，證明比先前開發(fā)的幾種多肽更加優(yōu)越，具體表現(xiàn)為本發(fā)明的多肽序列最短，便于合成，且具有較強的親水性，便于制劑的制備。見表l。_表1p65結(jié)合多肽理化特征常數(shù)分析結(jié)果_結(jié)合肽分子量PI疏水性a電荷量長度PT1787Da12.78-0.05正電荷5PT24055Da10.985-5.9正電荷37PT31049Da3.2257,83負電荷9PT41652Da3.2256.12負電荷15PT51636Da3.2254.41負電荷15PT61987Da4.2552.63,負屯荷16注a疏水值越高疏水性越強，越低則親水性越強。PT1:ArgLeuArgTrpArgPT2:GluGlyGlyValThrArgThrGlnGlyPheArgTipValValSerlieArgAsnSer--TyrArgAsnGluSerAlaSerAsnGlyArgCysLeuLeuLeuAlaAlaGinGlyPT3:ValValMetlieGluValValPheLeuPT4:LeuAlaMetValGluValThrValValLeuSerTrpGlyPheThrPT5:ProAlaMetValGluValThrValValLeuSerTrpGlyPheThrPT6:GinThrGinMetGluValThrTrpArgValGluCysCysLeuPheLeu圖1為多肽疏水性分析結(jié)果。圖2為核因子-KBp65亞基與多肽分子對接后的復(fù)合物3D結(jié)構(gòu)。圖3為ELISA方法檢測多肽對核因子-KBp65亞基與核因子-KB順式作用元件結(jié)合的競7爭抑制實驗的結(jié)果曲線。圖4為熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測多肽對核因子-KB反應(yīng)性熒光素酶報告基因表達的抑制效應(yīng)。A、B、C、D、E、F、G、H、I分別為U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+9.375/xmol/L、U937+LPS+p4-kB-Luc+18.75/xmol/L多肽、U937+LPS十p4-kB-Luc+37.5]tmiol/L多肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+75jLimol/L多肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+150/wnol/L多肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+150/imol/L陰性肽。圖5為多肽對L0V0細胞體外增殖的抑制實驗結(jié)果。圖6為多肽對五氟尿嘧啶抑制L0V0細胞體外增殖的增敏實驗結(jié)果。圖7為多肽對五氟尿嘧啶抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的體內(nèi)增敏實驗結(jié)果。具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1、應(yīng)用ANTHPROTV5.0軟件分析p65結(jié)合多肽的理化性質(zhì)將多肽分子的氨基酸序列按ANTHPROTV5.0軟件所要求的格式輸入，后計算多肽分子的各種理化特征常數(shù)。結(jié)果見表2、圖1_表2p65結(jié)合多肽理化特征常數(shù)分析結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例2、分子對接預(yù)測D65結(jié)合多肽與D65間的結(jié)合使用Biopolymer和Discover軟件模塊構(gòu)建和優(yōu)化小肽分子的3D結(jié)構(gòu)。通過標準的最陡下降法和共軛梯度法以能量最小化計算法則對多肽的3D結(jié)構(gòu)進行能量最小化處理。為了模擬小分子多肽與NF-icB的相互作用，應(yīng)用分子對接技術(shù)，即應(yīng)用Docking軟件將多肽分子的3D結(jié)構(gòu)與人p65的3D結(jié)構(gòu)進行柔性化的分子對接。在CVFF力場下對相應(yīng)的原子賦予對應(yīng)電荷。應(yīng)用Discover模塊軟件進行能量最小化處理，使p65-多肽復(fù)合體的能量構(gòu)像處于最優(yōu)化。為了消除溶劑效應(yīng)，以10A的分子半徑將球形TIP3P水分子溶劑填充于p65-多肽復(fù)合體的3D結(jié)構(gòu)中。為了進一步闡述p65-多肽間的相互作用強度和結(jié)合部位，應(yīng)用InsightII分子模建程序包中的Dephi模塊調(diào)查NF-KB表面特性。Delphi模塊是一個計算分子靜電特征(包括溶劑體積效應(yīng)和離子強度效應(yīng))的程序，其可為配體-受體間特異性的結(jié)合提供關(guān)鍵的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，多肽與p65間有一定的結(jié)合能力，由此提示多肽可能具有抑制NF-KBDNA結(jié)合活性的能力，結(jié)果見圖2。實施例3、elisa方法檢測多肽對核因子-kbp65亞基與核因子-kb順式作用元件結(jié)合的競爭抑制實驗多肽序列的合成由上海華大天源生物科技有限公司合成，純度>95%。于包被了核因子-kB順式作用元件的96孔酶聯(lián)板(購自美國Clontech公司的MercuryTransfactorp65kits)中加入150^1/孔轉(zhuǎn)錄因子封閉液，室溫孵育15min;棄轉(zhuǎn)錄因子封閉液后加入50pl/孔用轉(zhuǎn)錄因子封閉液稀釋的檢測樣品，樣品分別為含lOng/pl的p65標準蛋白作為陽性對照、含lOng/pl的p65標準蛋白同時加入系列濃度多肽、含lOng/pl的p65標準蛋白同時加入相同系列濃度陰性肽，室溫孵育lh，空白對照為加入轉(zhuǎn)錄因子封閉液；加入轉(zhuǎn)錄因子封閉液150pl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉(zhuǎn)錄因子封閉液以1:500稀釋的p65抗體100^1/孔，室溫孵育lh;加入轉(zhuǎn)錄因子封閉液150pl/孔洗滌3次，每次4min，去除洗滌液；加入用轉(zhuǎn)錄因子封閉液以1:1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗100pl/L，室溫孵育30min;加入轉(zhuǎn)錄因子緩沖液250nl/孔洗漆4次，每次4min，去除洗滌液；加入TMB底物，室溫孵育10min，待液體變藍后，用100nl/孔的終止液終止反應(yīng)；于450nm和630nm雙波長檢測OD值。p65結(jié)合肽對p65與其順式作用元件結(jié)合的抑制百分數(shù)計算公式為(p65標準蛋白陽性對照孔OD-多肽孔OD)/p65標準蛋白陽性對照孔OD。結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽可特異性抑制p65與其順式作用元件的結(jié)合，而這種抑制效應(yīng)具有量效關(guān)系，即抑制作用隨著肽濃度的升高而增加，而陰性肽則不影響p65與其順式作用元件的結(jié)合，如圖3所示。實施例4、多肽對核因子-kb反應(yīng)性報告基因表達的抑制實驗。1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U937細胞，轉(zhuǎn)染前一天將細胞密度調(diào)整為0.52.5xl()s個/mL，過夜培養(yǎng)；取1mL過夜培養(yǎng)細胞或以0.5"05個細胞/孔細胞量加入24孔培養(yǎng)板；取3pLGeneMce轉(zhuǎn)染試劑加入100/iL無血清1640培養(yǎng)基中，旋渦混勻，室溫放置5min;取l昭p4kB-Luc質(zhì)粒加入GeneJuice/1640培養(yǎng)基混合物中，輕輕吹打混勻，室溫放置5-15min;將上述混合物逐滴加入完全培養(yǎng)基中，輕輕震蕩，使混合物和細胞充分混勻；37°C，5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染5h后，用完全培養(yǎng)基進行換液培養(yǎng)lh后用PBS洗細胞3次，最后將細胞重懸于IOOmL的無血清1640培養(yǎng)基中；用pbs將多肽稀釋成6個不同濃度(加入培養(yǎng)基后的終濃度分別為O、9.375、18.75、37.5、75、150/xmol/L)，體積為的多肽液，同時用PBS將Chariot轉(zhuǎn)染試劑稀釋成50ML，將不同濃度的多肽與Chariot轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕吹打混勻，室溫放置30min。將100/aL多肽/Chariot轉(zhuǎn)染試劑混合液逐滴加入上述100/iL無血清1640培養(yǎng)基重懸的U937細胞培養(yǎng)液中，輕輕震蕩，使混合物和細胞充分混勻；37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)lh;除去轉(zhuǎn)染液，將培養(yǎng)基換成完全培養(yǎng)基，同時加入終濃度為lMg/mL的LPS進行刺激，培養(yǎng)2h后吸取細胞500g離心5min，PBS洗滌細胞一次，除盡PBS上清；以100m1/孔加入1XCCLR細胞裂解緩沖液；渦旋EP管10-15s，4°C，12000rpm離心2min，取上清，-701保存或直接檢測熒光素酶的活性；于96孔檢測板中加入100/iL/孔熒光素酶檢測試劑后，再加入100ML/孔細胞裂解液后立刻讀數(shù)，并打印或記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽對核因子-kb反應(yīng)性熒光素酶報告基因的表達具有抑制作用，且這種抑制作用具有量效關(guān)系，即抑制作用隨著蛋白濃度的升高而增加，而陰性多肽則不具有這種抑制作用，如圖4所示。由此說明，我們篩選獲得的p65結(jié)合肽具有抑制核因子-kb轉(zhuǎn)錄活性的功能，即具有抑制核因子-kB調(diào)控炎癥介質(zhì)等基因表達的功能。實施例5、多肽對LOVO細胞體外增殖的抑制實驗。本實驗中多肽合成時，在N端增加了穿膜序歹ij(TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg)，全長序列的合成由上海華大天源生物科技有限公司合成，純度>95%。以含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞株——LOVO細胞，取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后計數(shù)，以2.5X10"ml的細胞濃度接種在96孔板中，每孔接種10(^1，使細胞接種量分別為2.5X103/L。待細胞培養(yǎng)貼壁4小時后，按分組的不同分別加入系列濃度的陽性多肽、陰性多肽100nl，終濃度分別為75nM、37.5pM、18.75|iM、9.375|aM，同時設(shè)不加多肽的對照組(加1640培養(yǎng)液100|al)，待細胞培養(yǎng)72小時后以MTT法測定細胞增殖，采用多功能讀板機在波長570nrn下測量各孔OD值。結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽可抑制LOVO細胞在體外的增殖反應(yīng)，且該抑制效應(yīng)具有量效關(guān)系，即抑制作用隨多肽濃度的升高而增強，而陰性肽則對LOVO細胞在體外的增殖反應(yīng)無明顯影響，如圖5所示。實施例6、多肽對五氟尿嘧啶抑制LOVO細胞體外增殖的增敏實驗。本實驗中多肽與實施例5相同。五氟尿嘧啶(5-Fu)購于上海旭東海普藥業(yè)有限公司(10ml:0.25g/支)。以含10。/。小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)結(jié)腸癌細胞株——LOVO細胞，取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后計數(shù)，以2.5X10"ml的細胞濃度接種在96孔板中，每孔接種100nl，使細胞接種量分別為2.5X10V孔。待細胞培養(yǎng)貼壁4小時后，按如下分組加樣5-Fu組、5-Fu+陽性肽組、5-Fu+陰性肽組，同時設(shè)不加5-Fu、只加陽性肽、只加陰性肽對照組，5-Fu終濃度分別為10/ig/ml、5/ig/ml、2.5]Ug/ml、1.25|Ug/ml，陽性多肽、陰性多肽終濃度均為37.5nM,待細胞培養(yǎng)72小時后以MTT法測定細胞增殖，采用多功能讀板機在波長570nm下測量各孔OD值。結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽在37.5pM濃度時，對5-Fu抑制LOVO細胞體外增殖具有明顯的增敏作用，增敏比為132.50%,而陰性肽則無增敏作用，如圖6所示。實施例7、多肽對五氟尿嘧啶抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的體內(nèi)增敏實驗。本實驗中多肽與實施例5相同。裸鼠(BALB/C品系，46周齡，重量1820g，雌雄各半)購于北京維通利華公司。詞養(yǎng)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物室SPF條件下的超凈層流室中。取處于對數(shù)生長期的LOVO細胞，以0.25%胰酶消化，生理鹽水調(diào)整細胞濃度至IX107/ml，按每只0.1ml接種于裸鼠右側(cè)季肋皮下。待局部腫瘤長至150200mr^時，按以下分組給藥溶劑對照組、5-Fu+陽性肽組、5-Fu+陰性肽組。其中溶劑對照組只給予不含多肽的溶劑lOOpl瘤內(nèi)注射，隔日1次；5-Fu+陽性肽組與5-Fu+陰性肽組，腹腔注射5-Fu30mg/kg，隔日1次，同時分別取15(^M的陽性肽、陰性肽100pl作瘤內(nèi)注射，于給藥第6次后次日處死動物，解剖瘤塊稱重，按下列公式計算抑瘤率。抑瘤率(％)=(對照組瘤平均質(zhì)量-用藥組瘤平均質(zhì)量)/對照組瘤平均質(zhì)量X100%結(jié)果表明，本發(fā)明的多肽在瘤內(nèi)注射時，對5-Fu抑制荷瘤小鼠腫瘤生長具有明顯的增敏作用，以陰性肽組為對照，陽性肽組的抑瘤率為63.54%，如圖7所示。實施例8、ArgLeuArgTrpArg制備方法的操作步驟。固相多肽合成的主要操作步驟如下1、樹脂溶漲將Wang-Resin樹脂放入反應(yīng)管中，加DMF(15ml/g),30min。2、脫保護去掉DMF,力Q20%哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20n/。哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。3、檢測抽掉哌啶溶液，取十幾粒樹脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105。C110。C加熱5min，變深藍色為陽性反應(yīng)。4、洗滌DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次。5、縮合加入保護氨基酸三倍過量，活化劑HBTU三倍過量，均用盡量少DMF溶解，加入反應(yīng)管，立刻加入NMM十倍過量，反應(yīng)30min。6、洗滌DMF(10ml/g)—次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次。7、重復(fù)二至六操作依次連接氨基酸(從C端到N端順序Arg、Trp、Arg、Leu、Arg)，最后一次洗滌DMF(10ml/g)兩次，甲醇(10ml/g)兩次，DMF(10ml/g)兩次，DCM(10ml/g)兩次。9、裂解配制裂解液(10ml/g)——TFA94.5%;7_K2.5%;EDT2.5%;TIS1%，120min。10、吹干洗滌將裂解液用氮氣盡量吹干，用乙醚洗六次，然后常溫揮干。11、HPLC純化以水和乙腈做流動相，在流動相中加入0.1%的TFA，梯度從5%—85%，使用C18反相柱。權(quán)利要求1.一種特異性地與核因子-κBp65亞基結(jié)合，并特異性地拮抗核因子-κB活性的多肽，氨基酸序列如下ArgLeuArgTrpArg2.權(quán)利要求1的多肽在制備抗核因子-icB的藥物中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求2的應(yīng)用，所述抗核因子-kB的藥物是治療炎性免疫相關(guān)疾病的藥物或抗腫瘤的藥物。4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述炎性相關(guān)疾病是膿毒癥、膿毒性休克、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急慢性腎小球性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，其中所述腫瘤是肝癌、胃癌、食道癌、乳腺腫瘤、膀胱癌、前列腺腫瘤等。5.含有權(quán)利要求1的多肽的藥物組合物。6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中含有藥物可接受的載體。7.權(quán)利要求5的藥物組合物，以任何形式的藥物制劑形式存在。8.權(quán)利要求5的藥物組合物，是注射劑。9.權(quán)利要求5的藥物組合物，是冷凍干燥注射劑。10.權(quán)利要求1的多肽的制備方法，其特征在于，所述方法選自常規(guī)的固相合成方法、溶液中合成方法，基因重組方法或化學(xué)合成方法。全文摘要本發(fā)明涉及一種新型核因子-κBp65亞基拮抗多肽，特別是涉及一種治療用核因子-κBp65亞基拮抗肽，更具體而言，涉及一種能夠與核因子-κBp65亞基特異結(jié)合并抑制其活性的小分子肽ArgLeuArgTrpArg，本發(fā)明還涉及這種核因子-κBp65亞基拮抗肽的制備和應(yīng)用。文檔編號A61K9/08GK101307094SQ200810085139公開日2008年11月19日申請日期2008年3月21日優(yōu)先權(quán)日2008年3月21日發(fā)明者梁華平申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院