專(zhuān)利名稱(chēng)：：抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗及它們的制備方法。
背景技術(shù)：
：豬圓環(huán)病毒病(Porcinecircovirusdisease,PCVD)是由II型圓環(huán)病毒所弓l起的，臨床上以仔豬先天性震顫、斷奶仔豬衰竭及皮炎為主要特征的一種傳染病，各種日齡的豬均可感染和發(fā)病，已給世界養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒(PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)，圓環(huán)病毒屬(Circovirus),是圓環(huán)病毒中最小的病毒，該病毒粒子直徑為17-25nm，是一種二十面體對(duì)稱(chēng)、無(wú)囊膜、單股環(huán)狀的DNA病毒。根據(jù)PCV的抗原性和基因組成不同，將其分為兩種基因型(或稱(chēng)血清型)，即PCV1和PCV2。PCV1無(wú)致病性，廣泛存在于豬體內(nèi)及豬源傳代細(xì)胞系；PCV2具有致病性，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,P麗S)的主要病原之一。前者基因組為1759bp，后者基因組為1768bp或1767bp。對(duì)PCV-2的基因組分析發(fā)現(xiàn)，所有PCV-2分離株的基因組同源性都在95%以上，但與PCV-l的同源性卻小于80%，兩者差異表現(xiàn)在核苷酸鏈上的幾個(gè)部位存在堿基缺失現(xiàn)象。PCV有兩個(gè)主要的閱讀框0RF1和0RF2，二者長(zhǎng)度都大于600bp。0RF1是最大的閱讀框，編碼病毒的復(fù)制蛋白(R印)，約230-231個(gè)氨基酸，其分子量為37kD，與病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)；位于負(fù)鏈上的0RF2變異性相對(duì)較大，編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(C即，核衣殼蛋白)，約234個(gè)氨基酸，該結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性具有型特異性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PCV2C即蛋白的抗原表位主要位于6587，113147，157183和193207位氨基酸殘基，明確了PCV2的C即蛋白上存在有PCV2的中和表位和非中和表位，至于具體的表位則有待進(jìn)一步研究。通過(guò)使用接種過(guò)豬圓環(huán)病毒PCV2分離株產(chǎn)生的抗血清做ELISA實(shí)驗(yàn)，來(lái)識(shí)別PCV2的0RF2編碼蛋白的免疫相關(guān)線性B細(xì)胞表位。兩個(gè)PCV2特異性的抗原表位位于69-83和117-131位氨基酸殘基。SPF豬對(duì)抗原表位117-131(即B-133)的血清抗體效價(jià)在感染后6周時(shí)是22%，在感染后ll周達(dá)到100%。而從患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬上分離的野毒株血清，8-10周豬產(chǎn)生針對(duì)抗原B-133表位的抗體比例為5%，13-14周豬產(chǎn)生針對(duì)抗原B-133表位的抗體比例為38%，16-19周豬產(chǎn)生針對(duì)抗原B-133表位的抗體比例為62%，20-25周豬產(chǎn)生針對(duì)抗原B-133表位的抗體比例為56%，26-31周豬產(chǎn)生針對(duì)抗原B-133表位的抗體比例為45%。所有數(shù)據(jù)證實(shí)，抗原表位B-133是PCV2抗體應(yīng)答一個(gè)重要表位。自1991年首次在加拿大發(fā)生斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(P麗S)以來(lái)，在全世界大多數(shù)養(yǎng)豬國(guó)家均有發(fā)生該病的報(bào)道(AllanandEllis，2000a)。由PCV2感染引起的P麗S于2002年在我國(guó)各地呈暴發(fā)流行(王忠田等，2002)，給國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，已成為我國(guó)規(guī)?；i場(chǎng)危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一(楊漢春，2004)。因此，加強(qiáng)對(duì)PCV2感染的控制具有十分重要的實(shí)踐意義。目前，對(duì)PCV2的控制主要靠加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和生物安全措施，而關(guān)于免疫防治的研究報(bào)道的比較少，生產(chǎn)上更沒(méi)有可用的疫苗。但是從豬的發(fā)病年齡來(lái)看，是在仔豬斷奶而血中母源抗體水平降低之時(shí)，機(jī)體低水平的PCV2特異性抗體使仔豬處于易感狀態(tài)，如果能夠通過(guò)接種疫苗的方式，誘導(dǎo)機(jī)體在母源抗體水平降低而使機(jī)體處于易感之前就產(chǎn)生免疫，預(yù)防此病則成為可能。由于該病毒是一種DNA病毒，病毒的變異率低，在世界范圍內(nèi)的致病只有PCV2—型，且該病毒自身有很好的抗原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體和對(duì)該病提供保護(hù)作用。但是，由于該病毒分離困難、鑒定困難、加上體外培養(yǎng)PCV2比較困難且病毒滴度較低，所以研究開(kāi)發(fā)安全有效的新型疫苗不失為一條可取的策略。已有研究表明，表達(dá)PCV2CP(c即sidprotein核衣殼蛋白)的重組質(zhì)粒能夠激發(fā)小鼠的特異性抗體反應(yīng)(Kamstrupetal.，2004)，這為PCV2DNA疫苗的研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。Blanchard等(2003)比較了重組PCV2CP與表達(dá)CP的重組質(zhì)粒在SPF豬體內(nèi)的免疫保護(hù)效果，結(jié)果顯示重組蛋白疫苗和質(zhì)粒DNA疫苗都能夠提供很好的保護(hù)性，但重組CP的保護(hù)效果比重組質(zhì)粒更好，同時(shí)還表明PCV20RF1編碼的蛋白免疫原性很弱，不足以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性，并且已知重組蛋白疫苗只能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，而不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。相比之下，合成肽疫苗具有安全不散毒，能激發(fā)機(jī)體全面免疫反應(yīng)(包括體液和細(xì)胞免疫反應(yīng))、制備工藝簡(jiǎn)單、儲(chǔ)存運(yùn)輸方便、不受母源抗體干擾等優(yōu)勢(shì)，是當(dāng)今疫苗研究的新方向。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于，提供用于抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗的多肽或其多肽聚合物，以及含有該多肽或其多肽聚合物的疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種上述多肽或其多肽聚合物以及上述疫苗的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案—方面，本發(fā)明所提供的一種用于抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列為SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。該P(yáng)CV2合成肽的設(shè)計(jì)過(guò)程如下通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)PCV2流行毒株的序列測(cè)定，研究PCV2主要抗原位點(diǎn)的變異情況，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助方法進(jìn)行PCV2抗原位點(diǎn)的分析預(yù)測(cè)，對(duì)可能的抗原位點(diǎn)肽段進(jìn)行化學(xué)合成，進(jìn)而經(jīng)過(guò)大量的動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)候選多肽抗原進(jìn)行篩選，得到免疫反應(yīng)水平高，可以很好地保護(hù)動(dòng)物免受PCV2流行毒株攻擊的多肽抗原。另一方面，本發(fā)明提供一種豬圓環(huán)病毒病合成肽疫苗，其中包括一種或多種上述的多肽或其多肽聚合物；優(yōu)選地，所述疫苗包含佐劑。此外，本發(fā)明還提供了上述多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護(hù)反應(yīng)在15%-30%(體積/體積)的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-2『C條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除樹(shù)脂氨基上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)，氮?dú)獯蹈?，N-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個(gè)氨基酸與1-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-1-羥基苯丙三唑酯；(3)縮合反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹(shù)脂以及二異丙基碳二亞胺自動(dòng)加至反應(yīng)器中，在20-28t:條件下反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，N-甲基吡咯烷酮洗滌樹(shù)脂；(4)乙?；磻?yīng)使用1.5%-4%(重量/體積)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹(shù)脂在20-2『C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮?dú)獯蹈?，甲醇洗滌?shù)脂；(5)合成過(guò)程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1)-(4)，反應(yīng)完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹(shù)脂；(6)多肽與樹(shù)脂的分離向干燥的多肽樹(shù)脂中加入裂解試劑，勻速攪拌1-4小時(shí)后置于ot:下反應(yīng)IO分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過(guò)濾得多肽溶液；(7)超濾純化多肽及無(wú)菌處理使用膜包在20-28t:條件下超濾多肽，使用0.22微米在線濾器除菌保存。在上述制備方法中，所述裂解試劑的組成具體為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:i。本發(fā)明還提供了上述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將多肽稀釋至50iig/ml;(2)在20-2『C條件下，按照多肽溶液佐劑=1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，90-150轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘；(3)緩慢加入含有多肽溶液，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。在上述制備方法中，所述高速攪拌為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘。本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述的多肽或疫苗在制備治療和/或預(yù)防豬圓環(huán)病毒病的藥物中的用途。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在預(yù)防PCV2方面的不足，本發(fā)明人在研究我國(guó)PCV2病毒序列變異規(guī)律的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)分析設(shè)計(jì)并合成了本發(fā)明的多肽，并對(duì)這些多肽進(jìn)行了疫苗安全性和免疫應(yīng)答試驗(yàn)。結(jié)果表明，該疫苗可以有效激發(fā)豬的免疫應(yīng)答，也不存在生物安全性問(wèn)題，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1為免疫和攻毒后血清特異性抗體動(dòng)態(tài)圖。圖2為第三次免疫后四周血清中和抗體效價(jià)結(jié)果圖。圖3為ConA剌激后外周血液淋巴細(xì)胞的增殖能力結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。^MLl:合成肽疫苗多肽抗原的固相合成本實(shí)施例為本發(fā)明所提供的合成肽疫苗的多肽抗原的固相合成。本發(fā)明的多肽抗原可以通過(guò)ABI433A全自動(dòng)多肽合成儀，利用Merrifield固相合成法制備，其中采用了9-芴甲氧羰基(Fmoc)修飾的氨基酸，固相載體為RinkAmideMBHA樹(shù)脂。生產(chǎn)過(guò)程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。1、合成原料的準(zhǔn)備合成肽疫苗多肽抗原序列分別為SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQINNO.3所示的氨基酸序列以及(SEQIDN0.2)廠K-eK-C0NH2所示氨基酸序列的聚合肽，其中K表示賴(lài)氨酸，e代表在e氨基有Fmoc保護(hù)的賴(lài)氨酸。依據(jù)上述多肽抗原序列以及l(fā)mmol的合成規(guī)模準(zhǔn)備合適的Fmoc修飾的氨基酸，加入相應(yīng)的Cartridge(裝氨基酸的小瓶)中。同樣按要求稱(chēng)量RinkAmideMBHA樹(shù)脂，放入反應(yīng)腔中，將上下蓋子擰緊，貼標(biāo)簽，記錄所合成的肽的名稱(chēng)，批號(hào)，反應(yīng)腔的皮重以及所稱(chēng)取樹(shù)脂的重量。將反應(yīng)腔裝入合成儀。配制合成試劑包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、已酰咪唑(AIM)、哌啶(PIP)、甲醇等并放置到對(duì)應(yīng)的試劑瓶中。2、合成儀狀態(tài)的檢測(cè)檢查433A多肽合成儀器是否正常運(yùn)行，開(kāi)機(jī)后，運(yùn)行RunSelfTest程序，儀器自檢各項(xiàng)指標(biāo)是否正常。另外檢查K是否充足，系統(tǒng)表壓是否正常。合成前應(yīng)對(duì)儀器的性能有所了解，所以要對(duì)每種合成試劑的流速進(jìn)行測(cè)定。433A合成儀發(fā)送FlowRatel-18至l恰成儀，選擇MainMe皿-ModuleTest-按Prer或next找ModuleA、ModuleD、Modulel、Modulel、ModuleA)-按Start-按more進(jìn)行測(cè)量或觀察，若流量不合適，則調(diào)節(jié)下閥門(mén)壓力，直至達(dá)到要求。3、合成肽疫苗多肽抗原的制備(1)去保護(hù)反應(yīng)在15%-30%(體積/體積)的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-2『C條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除樹(shù)脂氨基上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)，氮?dú)獯蹈?，N-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個(gè)氨基酸與1-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-1-羥基苯丙三唑酯；(3)縮合反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹(shù)脂以及二異丙基碳二亞胺自動(dòng)加至反應(yīng)器中，在20-28t:條件下反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈桑琋-甲基吡咯烷酮洗滌樹(shù)脂；(4)乙?；磻?yīng)使用1.5%-4%(重量/體積)的乙酰咪唑N-甲基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹(shù)脂在20-2『C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮?dú)獯蹈?，甲醇洗滌?shù)脂；(5)合成過(guò)程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1)-(4)，反應(yīng)完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹(shù)脂；(6)多肽與樹(shù)脂的分離向干燥的多肽樹(shù)脂中加入裂解試劑(各組分的體積比為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:i)，勻速攪拌l-4小時(shí)后置于ot:下反應(yīng)io分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過(guò)濾得多肽溶液；(7)超濾純化多肽及無(wú)菌處理使用膜包在20-28t:條件下超濾多肽，使用0.22微米在線濾器除菌保存。實(shí)施例2:合成肽疫苗的配制本實(shí)施例為本發(fā)明所提供的合成肽疫苗的配制。用注射用水將多肽溶液分別稀釋到50iig/ml，制成抗原水相；將SEPPICMONTANIDEISA50V油佐劑經(jīng)121°C，30分鐘滅菌，備用作為油相。在22。C條件下，按照抗原水相與滅菌的油相50V為i:i的體積比，先將油相加入乳化罐內(nèi)，ioo轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌2分鐘，緩慢加入水相，加完后攪拌30分鐘，再高速9000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌20分鐘，然后靜置5分鐘，分裝后即得抗豬圓環(huán)病毒的合成肽疫苗，即具有SEQIDNO.l所示氨基酸序列的合成肽疫苗、具有SEQIDN0.2所示氨基酸序列的合成肽疫苗，具有SEQIDNO.3所示氨基酸序列的合成肽疫苗，以及(SEQIDNO.2)2-K-eK_C0NH2所示氨基酸序列的合成肽疫苗。實(shí)施例3:合成肽疫苗的效力試驗(yàn)本實(shí)施例通過(guò)以下不同方法對(duì)本發(fā)明所提供的合成肽疫苗進(jìn)行效力評(píng)價(jià)。將7日齡健康仔豬分成5組，分組情況見(jiàn)表l，每組3頭，于左右頸側(cè)部肌肉各注射lml合成肽疫苗，共肌肉注射3次，每次間隔兩周，第3次免疫后4周通過(guò)口腔和鼻腔途徑感染10622TCID5。/ml的PCV2組織毒(BJ-HB株)(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng))，每頭接種5ml。表1試驗(yàn)動(dòng)物的分組情況及免疫攻毒劑量分組注射疫苗試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)(頭)免疫劑量(ml)攻毒劑量(ml)A組空白對(duì)照315B組SEQIDNO.1多肽疫苗315c組SEQIDNO.2多肽疫苗315D組SEQIDNO.3多肽疫苗315E組(SEQIDNO.2)2-K-eK_C0NH2聚合肽疫苗3151)ELISA檢測(cè)血清特異性抗體反應(yīng)為了分析合成肽疫苗免疫和攻毒后各組的抗體反應(yīng)，分別于免疫前、第1次免疫后14天、第2次免疫后14天、第3次免疫后14和28天，以及攻毒后1、2、3、4、5周采集各組豬的前腔靜脈血，分離血清，用ELISA檢測(cè)血清中的PCV2特異性抗體。ELISA檢測(cè)過(guò)程主要為用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋上述合成肽疫苗，至終濃度為70.1iig/ml，包被96孔酶聯(lián)反應(yīng)板，100ii1/孔，37t:作用2小時(shí)后，置4t:過(guò)夜；以PBS(含0.05%Tween-20的PBS)洗滌3次，3分鐘/次；每孔加入100y1封閉液(含5%犢牛血清的PBS)，37t:作用l-2小時(shí)；甩干酶聯(lián)板孔內(nèi)封閉液，加入用封閉液作l:40倍稀釋的待檢豬血清及作相同倍數(shù)稀釋的陰、陽(yáng)性血清，i00ia/L37t:濕盒(購(gòu)自邁晨科技有限公司)內(nèi)作用45分鐘；PBS洗滌3次，3分鐘/次；每孔加入100ii1工作濃度(1:800)的HRP-兔抗豬IgG(購(gòu)自邁晨科技有限公司)，37t:濕盒作用45分鐘后洗滌3次，3分鐘/次；每孔加入100iU四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液(購(gòu)自邁晨科技有限公司)，室溫避光顯色10分鐘；每孔加入50iil2mol/LH2S04終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀(酶標(biāo)儀BIO-RADmodel680)測(cè)定0D45Qnm光密度值，當(dāng)待檢血清樣品值0D45Qnm值>0.3時(shí)，判定為陽(yáng)性。ELISA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，表明合成肽疫苗能夠剌激機(jī)體產(chǎn)生PCV2特異性抗體。2)血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定分別于第3次免疫后4周、攻毒后1周和4周，采取各組豬前腔靜脈血，分離血清，以微量平板血清中和試驗(yàn)，結(jié)合免疫過(guò)氧化物酶單層試驗(yàn)(IPMA)來(lái)測(cè)定血清中和抗體效價(jià)。具體過(guò)程為取適量待測(cè)血清樣品于56t:條件下作用，以滅活補(bǔ)體；將血清作1:21:64倍比稀釋后，與等量的PCV2BJ-HB株病毒液(含200TCID50)混合，于37。C孵育1小時(shí)；將不同稀釋度的血清_病毒混合液加至呈40%_50%融合狀態(tài)的？1(15細(xì)胞(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng))表面(生長(zhǎng)旺盛的PK15細(xì)胞于24小時(shí)前培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔內(nèi))，100iiL/孔，每個(gè)稀釋度重復(fù)3L同時(shí)設(shè)立不接種病毒的細(xì)胞陰性對(duì)照和接種病毒的陽(yáng)性對(duì)照；37°C5%C02條件下吸附1小時(shí)后，加入含2%犢牛血清的RPMI-1640維持液(購(gòu)自INVITROGEN公司)，于37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-72小時(shí)；取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用PBS洗滌3次，3分鐘/次，用含40%丙酮和0.2%BSA的PBS于室溫固定10-15分鐘；PBS洗滌3次，3分鐘/次；將細(xì)胞培養(yǎng)板置37t:或于室溫干燥30分鐘，加入30%H202和甲醇的混合液(1:50)，室溫作用30分鐘；用含0.05%的Tween-20的PBS(PBST)洗滌3次；加入用含0.05%Tween-20和1%BSA的PBS作1:20倍稀釋的豬抗PCV2陽(yáng)性血清，于37t:作用1小時(shí)；PBST洗滌3次，3分鐘/次，加入用含0.05%Tween-20和1%BSA的PBS作1:100倍稀釋的HRP-SPA，于37t:作用1小時(shí)；以PBS洗滌3次，加入適量氨乙基咔唑(AEC)顯色試劑盒(購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司)顯色2-15分鐘，于顯微鏡下檢查并記錄紅色陽(yáng)性信號(hào)，然后按Reed-Muench法(動(dòng)物免疫學(xué)[M]，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，348-349頁(yè))計(jì)算血清中和效價(jià)。第3次免疫后4周，應(yīng)用中和試驗(yàn)測(cè)定了血清中和抗體效價(jià)，結(jié)果如圖2所示。B、C、D、E組的血清中和抗體效價(jià)分別為10—°8(1:6.7)、10—15(1:29.3)、10—14(1:26.7)和10—:20.2)，而在A組(空白對(duì)照)全部豬血清中沒(méi)有檢測(cè)到中和抗體，表明合成肽疫苗均能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。3)外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)分別于第3次免疫后28天，以及攻毒后7、14、21、28和35天采取前腔靜脈血，以四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞增殖性反應(yīng)。具體過(guò)程如下將待測(cè)血清樣品置于肝素抗凝管中，按l:2的比例小心疊加于孵育至室溫的淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自邁晨科技有限公司)表面，以1500-1800r/分鐘水平離心20-30分鐘；收集血漿層與淋巴細(xì)胞分離液層之間的淋巴細(xì)胞層，置于含2%犢牛血清的PRMI-1640試管中，混勻后，以1000r/分鐘離心10分鐘；棄去上清液，細(xì)胞沉淀以含2%犢牛血清的PRMI-1640離心洗滌2次，棄上清液，收集細(xì)胞沉淀，加適量含10%犢牛血清的PRMI-1640完全培養(yǎng)液；以1%的臺(tái)盼藍(lán)染色檢查細(xì)胞活性，并計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5X107ml;取細(xì)胞懸液加到96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，100yl/孔，每個(gè)樣品重復(fù)3孔；加入100iig/ml的刀豆素ConA(購(gòu)自Sigma公司)至終濃度為10yg/ml，同時(shí)設(shè)立不加ConA剌激的陰性對(duì)照，均重復(fù)3孔；混勻后，于37°C5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)；每孔加入10iilMTT(5mg/ml)，繼續(xù)于37。C培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)；每孔中加入10010%SDS-0.Olmol/1鹽酸，混勻后于37t:條件下作用30分鐘，使紫黑色結(jié)晶完全溶解；消除各孔內(nèi)氣泡，測(cè)定OD570nm光密度值，分析各組外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力，以實(shí)驗(yàn)孔OD值減去不加ConA剌激的陰性對(duì)照孔OD值的平均值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。應(yīng)用MTT法分別檢測(cè)了第3次免疫后4周及攻毒后1、2、3、4、5周各組豬外周血淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的剌激反應(yīng)能力，結(jié)果如圖3所示，與A組相比，合成肽疫苗免疫組的淋巴細(xì)胞對(duì)ConA剌激反應(yīng)在攻毒后7-14天即達(dá)到高峰值，并且反應(yīng)強(qiáng)度高于A組。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，合成肽疫苗能激發(fā)豬的免疫應(yīng)答和保護(hù)性免疫反應(yīng)。實(shí)施例4:合成肽疫苗的安全性試驗(yàn)本實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所提供的合成肽疫苗進(jìn)行了安全性實(shí)驗(yàn)，具體詳述如下。1)疫苗與試驗(yàn)動(dòng)物四批PCV2合成肽疫苗加上空白對(duì)照一共設(shè)為五組，試驗(yàn)動(dòng)物為7日齡哺乳仔豬25頭、30日齡哺乳仔豬50頭，具體分組情況見(jiàn)表2。表2疫苗分組情況分組注射疫苗試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)(頭)A組空白對(duì)照15B組SEQIDNO.1多肽疫苗15c組SEQIDNO.2多肽疫苗15D組SEQIDNO.3多肽疫苗15E組(SEQIDNO.2)2-K-eK_C0NH2聚合肽疫苗152)最小免疫日齡仔豬一次單劑量接種取7日齡哺乳仔豬25頭，分為5組，每組5頭，B、C、D、E組肌肉注射四個(gè)批次疫苗，接種劑量2ml/頭；A組為空白對(duì)照組，剪耳號(hào)并稱(chēng)體重后隔離飼養(yǎng)30天，觀察仔豬有無(wú)臨床癥狀。接種后l-7天每天測(cè)量直腸溫度。3)仔豬單劑量重復(fù)接種取30日齡哺乳仔豬25頭，分為5組，每組5頭，B、C、D、E組肌肉注射疫苗，接種劑9量2ml/頭，接種后2周，再用相同劑量免疫一次；A組為空白對(duì)照組。剪耳號(hào)并稱(chēng)體重后，隔離飼養(yǎng)30天，觀察仔豬有無(wú)臨床癥狀。接種后l-7天每天測(cè)量直腸溫度。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)體重。4)仔豬一次超劑量接種取30日齡哺乳仔豬25頭，分為5組，每組5頭，B、C、D、E組肌肉注射疫苗，接種劑量4ml/頭；A組為空白對(duì)照組，剪耳號(hào)并稱(chēng)體重后隔離飼養(yǎng)30天，觀察仔豬有無(wú)臨床癥狀。接種后l-7天每天測(cè)量直腸溫度。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)體重。5)試驗(yàn)結(jié)果注射4批疫苗后動(dòng)物的精神狀態(tài)及食欲良好，均無(wú)臨床異常反應(yīng)，體溫正常。試驗(yàn)組仔豬體重與對(duì)照組仔豬體重?zé)o差異，結(jié)果如表3所示。表3安全性試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表3中可以看出，四批合成肽疫苗與空白對(duì)照組一樣，在單劑量、超劑量、多次接種情況下對(duì)豬都是安全的。序列表〈110〉中牧實(shí)業(yè)股份有限公司〈120〉抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗及其制備方法〈130>DIC09110086〈160>3〈170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211>59〈212>PRT〈213〉PCV抗原〈400>1lieSerlieThrGlulieGlyLysVallieValLysThrlieGluGly151015lieLeuPheLysProSerTrpAlaValAspMetMetArgPheAsnlie202530AsnAspPheLeuProProGlyGlyGlySerAsnLysValAspHisVal[o川]35GlyLeuGlyThrAla40PheGluAsn45SerlieTyr5055〈210>2〈211>45〈212>PRT〈213>PCV抗原〈400>2lieSerlieThrGlulieGlyLysVallieValLysThrlieGluGly151015lieLeuPheLysGinGlyAspArgGlyValGlySerSerAlaVallie202530LeuAspAspAsnPheValThrLysAlaThrAlaLeuThr354045〈210>3〈211>47〈212>PRT〈213〉PCV抗原〈400>3lieSerlieThrGlulieGlyLysVallieValLysThrlieGluGly151015lieLeuPheLysHisSerArgTyrPheThrProLysProValLeuAsp202530SerThrlieAspTyrPheGinProAsnAsnLysArgAsnGinLeu3540451權(quán)利要求一種用于抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列為SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。2.—種抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗，其中包括一種或多種權(quán)利要求1所述的多肽或其多肽聚合物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗包含佐劑。4.一種權(quán)利要求1所述多肽的制備方法，其中包括以下步驟(1)去保護(hù)反應(yīng)在體積比為15%_30%的六氫吡啶的^甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28t:條件下反應(yīng)25-40分鐘，脫除樹(shù)脂氨基上的9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)，氮?dú)獯蹈桑琋-甲基吡咯烷酮洗滌；(2)氨基酸的活化將合成用的帶有9-芴甲氧羰基保護(hù)基團(tuán)的各個(gè)氨基酸與l-羥基苯丙三唑反應(yīng)合成氨基酸-1-羥基苯丙三唑酯；(3)縮合反應(yīng)使用多肽合成儀將上述各種氨基酸和樹(shù)脂以及二異丙基碳二亞胺自動(dòng)加至反應(yīng)器中，在20-28t:條件下反應(yīng)0.5-2.5小時(shí)，氮?dú)獯蹈?，N_甲基吡咯烷酮洗滌樹(shù)脂；(4)乙?；磻?yīng)使用重量體積比為1.5%_4%的乙酰咪唑的^甲基吡咯烷酮溶液與步驟(3)中獲得的樹(shù)脂在20-2『C條件下反應(yīng)20-40分鐘，氮?dú)獯蹈?，甲醇洗滌?shù)脂；(5)合成過(guò)程由C端至N端，依照氨基酸序列不斷的重復(fù)步驟(1)(4)，反應(yīng)完成后，用N-甲基吡咯烷酮清洗，得到干燥的多肽樹(shù)脂；(6)多肽與樹(shù)脂的分離向干燥的多肽樹(shù)脂中加入裂解試劑，勻速攪拌l-4小時(shí)后置于(TC下反應(yīng)IO分鐘，恢復(fù)至室溫，揮去三氟乙酸，將叔丁基甲醚及二乙醚加入多肽溶液，攪拌洗滌，過(guò)濾得多肽溶液；(7)超濾純化多肽及無(wú)菌處理使用膜包在20-28t:條件下超濾多肽，使用0.22微米在線濾器除菌保存。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述裂解試劑的組分體積比為三氟乙酸三異丙基硅烷乙二硫醇苯酚水=85:8:3:3:i。6.—種權(quán)利要求2或3所述疫苗的制備方法，其中包括以下步驟(1)用注射用水將多肽稀釋至200i！g/ml制得抗原水相；(2)在20-2『c條件下，按照抗原水相佐劑=i:i的體積比，先將佐劑加入乳化罐內(nèi)，90-150轉(zhuǎn)/分鐘慢速攪拌1.5-3分鐘；(3)緩慢加入抗原水相，攪拌20-30分鐘；(4)高速攪拌15-30分鐘后靜置5分鐘，分裝后即得。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述高速攪拌為8000-10000轉(zhuǎn)/分鐘。8.權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2或3所述的疫苗在制備治療和/或預(yù)防豬圓環(huán)病毒病的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了一種抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗及其制備方法，具體涉及用于抗豬圓環(huán)病毒合成肽疫苗的多肽或其聚合物，以及含有該多肽的疫苗及它們的制備方法。所述多肽的氨基酸序列為SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。由該多肽制成的疫苗可以有效應(yīng)對(duì)豬圓環(huán)病毒的抗原變異，也不存在生物安全性問(wèn)題，易于大規(guī)模合成，具有良好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A61K39/12GK101709080SQ200910237270公開(kāi)日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月9日優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日發(fā)明者宋芳,巴利民,肖進(jìn),郭麗清,齊鵬申請(qǐng)人:中牧實(shí)業(yè)股份有限公司