鞭毛蛋白的缺失突變體以及使用方法
【專利摘要】可以將包含Toll-樣受體5促效劑以及至少一種流感抗原的至少一個部分的多種組合物用于在一位受試者體內(nèi)刺激一種免疫應答、具體地說在一位受試者體內(nèi)刺激一種保護性免疫應答的多種方法中??梢允菇M合物與顆粒相締合并且以相對低的劑量用于這些方法中以提供對病毒感染的保護性免疫應答。
【專利說明】鞭毛蛋白的缺失突變體以及使用方法
[0001]相關申請
[0002]本申請要求于2008年4月18日提交的美國臨時申請?zhí)?1/124,617 ;于2008年4月18日提交的61/124,604 ;于2008年4月18日提交的61/124,670 ;于2008年4月25日提交的61/125,660 ;于2008年5月8日提交的61/126,993 ;于2008年5月8日提交的61/126,978 ;于2008年6月20日提交的61/132,594 ;于2008年8月4日提交的61/137,840 ;于2008年11月19日提交的61/199,793 ;以及于2008年11月26日提交的61/200, 354的權(quán)益。以上申請的全部傳授內(nèi)容都通過引用結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景
[0004]病毒感染可能導致疾病并且在某些情況下導致死亡。預防以及處理與病毒感染(例如流感病毒感染)相關的疾病的策略包括使用熱滅活的病毒或流感抗原與佐劑相組合的藥物以及組合物。被批準用于人類的流感疫苗的唯一的佐劑是礬,它是一種基于鋁的組合物。總體而言,流感疫苗組合物可以包括多種濃度的抗原,這些抗原與礬相結(jié)合在人類中可以具有不同的副作用,例如疼痛、炎癥以及療效不足。此外,目前的制造流感疫苗的方法總體上不足以滿足日益增長的季節(jié)性需求并且不能滿足改變流感病毒從而預防由流感感染引起的疾病。因此,對于開發(fā)在預防和處理與病毒感染(特別是流感病毒感染)相關或由其引起的疾病的方法中使用的新的、改進的并且有效的組合物存在一種需要。
[0005]發(fā)明概述
[0006]本發(fā)明涉及組合物,例如刺激一種保護性免疫應答的組合物,以及制備蛋白的方法,這些蛋白在受試者內(nèi)刺激一種保護性免疫應答。
[0007]在一個實施方案中,本發(fā)明是具有與如SEQ ID NO:29(—種R3構(gòu)建體)中列出的、包括對于SEQ ID NO:29的任何插入或缺失的一種鄰近氨基酸序列至少約50.0%—致性的一種氨基酸序列,其中該分離的氨基酸序列激活了一種Toll-樣受體5。
[0008]在另一個實施方案中,本發(fā)明是具有與如SEQ ID NO:30(—種R3D0構(gòu)建體)中列出的、包括對于SEQ ID NO:30的任何插入或缺失的一種鄰近氨基酸序列至少約50.0% —致性的一種氨基酸序列,其中該分離的氨基酸序列激活了一種Toll-樣受體5。
[0009]在一個進一步的實施方案中,本發(fā)明是具有與如SEQ ID NO:31(—種D3N構(gòu)建體)中列出的、包括對于SEQ ID NO:31的任何插入或缺失的一種鄰近氨基酸序列至少約60.0%—致性的一種氨基酸序列,其中該分離的氨基酸序列激活了一種Toll-樣受體5。
[0010]本發(fā)明的一個另外的實施方案是具有與如SEQ ID NO:32(—種D3NCs構(gòu)建體)中列出的、包括對于SEQ ID NO:32的任何插入或缺失的一種鄰近氨基酸序列至少約60.0%一致性的一種氨基酸序列,其中該分離的氨基酸序列激活了一種Toll-樣受體5。
[0011 ] 在仍另一個實施方案中,本發(fā)明是如在選自下組的至少一個成員中所列出的一種氨基酸序列,該組構(gòu)成為:SEQ ID NO:29(—種R3構(gòu)建體)、SEQ ID NO:30 (—種R3D0構(gòu)建體)、SEQ ID NO:31( 一種 D3N 構(gòu)建體)、SEQ ID NO:32( 一種 D3NCs 構(gòu)建體)以及 SEQ IDNO:33(—種Dl構(gòu)建體)。
[0012] 本發(fā)明的另一個實施方案是一種融合蛋白,在序列中包含如SEQ ID NO:28(—種RO構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一部分,其中選自由
39、46、50、378以及382組成的組的SEQ ID NO:28的至少一個氨基酸殘基被一個丙氨酸殘基取代,并且其中該融合蛋白激活了一種Toll-樣受體5。
[0013]—個另外的實施方案,本發(fā)明是一種融合蛋白,包含如SEQ ID NO:29(—種R3構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一部分,其中該抗原在SEQID NO:29的氨基酸殘基190與191之間,并且其中該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0014]本發(fā)明的另一個實施方案是一種融合蛋白,在序列中包含如SEQ ID NO:29(—種D3構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一部分,其中該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0015]在仍另一個實施方案中,本發(fā)明是一種融合蛋白,包含如SEQ ID NO:30(—種R3D0構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一部分,其中該抗原在SEQ ID NO:30的氨基酸殘基145與146之間,并且該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0016]本發(fā)明的又一個實施方案是一種融合蛋白,包含如SEQ ID NO:30( —種R03構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少兩種抗原的至少一部分,其中一種抗原在SEQID NO:30的氨基酸殘基145與146之間,并且至少一種其他抗原被融合到SEQ ID NO:30的氨基酸殘基318上,其中該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0017]本發(fā)明的一個另外的實施方案是一種融合蛋白,包含如SEQ ID NO:29(—種R3_2xAg構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少兩種抗原的至少一部分,其中至少一種抗原在SEQ ID NO:29的氨基酸殘基190與191之間,并且至少一種其他抗原被融合到SEQ ID NO:29的氨基酸殘基405上,并且其中該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0018]在又另一個實施方案中,本發(fā)明是一種融合蛋白,在序列中包含如SEQ ID NO:31 (一種D3N構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一部分,其中該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0019]本發(fā)明的另一個實施方案是一種融合蛋白,在序列中包含如SEQ IDNO:32(—種D3NCs構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一部分,其中該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0020]在仍另一個實施方案中,本發(fā)明是一種融合蛋白,在序列中包含如SEQ ID NO:33 (—種Dl構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一部分,其中該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0021]本發(fā)明的一個另外的實施方案是在一個人體內(nèi)刺激一種免疫應答的方法,該方法包括向該人施用一種組合物的步驟,該組合物包含選自下組的至少一種融合蛋白,該組的組成為:SEQ ID NOs:451-453、455、457、460、463-465、468、470-474、500-506、511-518、660、664、703、705、707、709、711、713、715、717、719、721、723、725、729、731、733、735、737、739、741、743、745、747、749、751、753、755、757、759、761、763 以及 801-812,其中以選自下組的至少一個劑量向該人施用該融合蛋白,該組的組成為:約一個10.0yg劑量、約一個
5.0yg劑量、約一個3.0 μ g劑量、約一個2.5 μ g劑量、約一個1.0 μ g劑量、約一個0.5 μ g劑量、約一個0.3 μ g劑量、約一個0.25 μ g劑量、約一個0.1 μ g劑量、約一個0.05 μ g劑量、約一個0.025 μ g劑量以及約一個0.01 μ g劑量。
[0022]在一個進一步的實施方案中,本發(fā)明是對活化Toll樣受體5促效劑的一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(一種RO構(gòu)建體、一種R3構(gòu)建體、一種R3D0構(gòu)建體、一種R3_2xAg構(gòu)建體、一種D3N構(gòu)建體、一種D3NCs構(gòu)建體以及一種Dl構(gòu)建體)的一種氨基酸序列進行編碼的一種分離的核酸序列。
[0023]在又另一個實施方案中,本發(fā)明是對一種融合蛋白進行編碼的一種分離的核酸序列,該融合蛋白包括一種流感抗原以及一種鞭毛蛋白構(gòu)建體,該融合蛋白激活了一種Toll樣受體5。
[0024]在另一個實施方案中,本發(fā)明是包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分的一種組合物,其中該部分在序列中包括一種氨基-結(jié)構(gòu)域O、一種氨基-結(jié)構(gòu)域1、一種氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O ( —種R3、一種D3、一種 R3-2xAg 構(gòu)建體)。
[0025]本發(fā)明的一個另外的實施方案是一種組合物,該組合物包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I ( 一種R3D0構(gòu)建體;一種R03構(gòu)建體)。
[0026]在仍另一個實施方案中,本發(fā)明是包含一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分的一種組合物,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2,一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O ( —種D3N構(gòu)建體)。
[0027]本發(fā)明的另一個實施方案是包含一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分的一種組合物,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2,一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O ( —種D3NCs構(gòu)建體)的至少一部分。
[0028]本發(fā)明的又一個實施方案是包含一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分的一種組合物,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2,以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I并且其中該天然發(fā)生的鞭毛蛋白的部分缺少一個羧基-結(jié)構(gòu)域O ( —種D3NCs構(gòu)建體)的一部分。
[0029]在又另一個實施方案中,本發(fā)明是包含一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分的一種組合物,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I ( 一種Dl構(gòu)建體)。
[0030]本發(fā)明的一個另外的實施方案是制備一種Toll樣受體5促效劑的一種方法,該方法包括以下步驟:從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離出一種蛋白的一個部分從而形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域O、一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O ( —種R3構(gòu)建體、一種D3構(gòu)建體、一種R3-2xAg構(gòu)建體);將編碼該蛋白部分的一種核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且培養(yǎng)該宿主細胞從而制備該Toll樣受體5促效劑。
[0031]在仍另一個實施方案中,本發(fā)明是制備一種Toll樣受體5促效劑的一種方法,包括以下步驟:從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離出一種蛋白的一個部分從而形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I ( 一種R3D0構(gòu)建體、一種R03構(gòu)建體);將編碼該蛋白部分的一種核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且培養(yǎng)該宿主細胞從而制備該Toll樣受體5促效劑。
[0032]在又另一個實施方案中,本發(fā)明是制備一種Toll樣受體5促效劑的一種方法,該包括以下步驟:從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離出一種蛋白的一個部分從而形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O ( —種D3N構(gòu)建體);將編碼該蛋白部分的一種核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且培養(yǎng)該宿主細胞從而制備該Toll樣受體5促效劑。
[0033]本發(fā)明的另一個實施方案是制備一種Toll樣受體5促效劑的一種方法,包括以下步驟:從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離出一種蛋白的一個部分從而形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域
2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I并且其中該蛋白部分缺少一個羧基-結(jié)構(gòu)域O ( —種D3NCs構(gòu)建體)的一部分;將編碼該蛋白部分的一種核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且培養(yǎng)該宿主細胞從而制備該Toll樣受體5促效劑。
[0034]在一個進一步的實施方案中,本發(fā)明是制備一種Toll樣受體5促效劑的一種方法,包括以下步驟:從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離出一種蛋白的一個部分從而形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I ( 一種Dl構(gòu)建體);將編碼該蛋白部分的一種核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且培養(yǎng)該宿主細胞從而制備該Toll樣受體5促效劑。
[0035]本發(fā)明的另一個實施方案是包含至少一種納米顆粒的一種組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體促效劑的至少一部分以及至少一種抗原的至少一部分,其中該Toll樣受體促效劑以及該抗原與該納米顆粒相締合并且該Toll樣受體促效劑與該抗原的摩爾比不大于約I。
[0036]在仍另一個實施方案中,本發(fā)明是包含至少一種納米顆粒的一種組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體7促效劑、至少一種Toll樣受體5促效劑以及至少一種抗原,其中該Toll樣受體7促效劑以及該抗原包含在該納米顆粒中并且該Toll樣受體5促效劑與該納米顆粒的外表面連接。
[0037]在另一個實施方案中,本發(fā)明是包含至少一種顆粒的一種組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體5促效劑的至少一部分、至少一種抗原的至少一部分、以及選自下組的至少一種另外的Toll樣受體促效劑的至少一部分,該組的組成為:一種Toll-樣受體7促效劑、一種Toll-樣受體8促效劑以及一種Toll-樣受體9促效劑,其中該另外的Toll-樣受體促效劑以及可任選地該抗原包含在該顆粒中并且該Toll-樣受體5促效劑與該顆粒的外表面連接。
[0038]本發(fā)明的一個另外的實施方案是制備一種納米顆粒組合物的一種方法,包括以下步驟:將至少一種Toll樣受體促效劑的至少一部分與至少一種納米顆粒的至少一部分結(jié)合從而在該Toll樣受體促效劑與該納米顆粒之間形成一種締合;并且將至少一種抗原的至少一部分與該連接該納米顆粒的Toll樣受體促效劑相結(jié)合,其中該Toll樣受體促效劑與該抗原的摩爾比不大于約1,從而形成該納米顆粒組合物。
[0039]在又另一個實施方案中,本發(fā)明是制備一種納米顆粒組合物的一種方法,包括以下步驟:將至少一種Toll樣受體5促效劑的至少一部分與一種納米顆粒相締合;使選自下組的至少一種Toll樣受體促效劑的至少一部分包含在該納米顆粒中,該組的組成為:一種Toll-樣受體7促效劑、一種Toll-樣受體8促效劑以及一種Toll-樣受體9促效劑;并且將含有該Toll樣受體促效劑的納米顆粒與至少一種抗原的至少一部分相結(jié)合,從而形成該納米顆粒組合物。
[0040]本發(fā)明的一個進一步的實施方案是在一名受試者中刺激一種免疫應答的一種方法,包括以下步驟:向該受試者施用包含至少一種納米顆粒的一種組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體促效劑的至少一部分以及至少一種抗原的至少一部分,其中該Toll樣受體促效劑以及該抗原與該納米顆粒相締合并且該Toll樣受體促效劑與該抗原的摩爾比不大于約I。
[0041]本發(fā)明的一個另外的實施方案是在一名受試者中刺激一種免疫應答的一種方法,包括以下步驟:向該受試者施用包含至少一種納米顆粒的一種組合物,該組合物包含至少一種Toll樣受體7促效劑的至少一部分、至少一種Toll樣受體5促效劑的至少一部分以及至少一種抗原的至少一部分,其中該Toll樣受體7促效劑以及該抗原包含在該納米顆粒中并且該Toll樣受體5促效劑與該納米顆粒的外表面相締合。
[0042]本發(fā)明的另一個實施方案是在一名受試者中刺激一種免疫應答的一種方法,包括以下步驟:向該受試者施用一種包含至少一種納米顆粒的組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體5促效劑的至少一部分、至少一種抗原的至少一部分、以及選自下組的至少一種另外的Toll樣受體促效劑的至少一部分,該組的組成為:一種Toll-樣受體7促效劑、一種Toll-樣受體8促效劑以及一種Toll-樣受體9促效劑,其中該另外的Toll-樣受體促效劑以及可任選地該抗原包含在該顆粒中并且該Toll-樣受體5促效劑與該顆粒的外表面相締合。
[0043]本發(fā)明的方法以及組合物可以用于刺激一種免疫應答,特別是在受試者中的一種保護性免疫應答。所提出權(quán)利要求的發(fā)明的優(yōu)點包括成本有效的方法以及組合物,這些組合物能以相對大的量生產(chǎn)并且以相對低的劑量使用,這樣,使免疫原性應答增到最大并且使副作用減少到最小,而無需使用佐劑。提出權(quán)利要求的組合物以及方法可以被用來預防、治療以及處理與病毒感染相關的或是由其造成的疾病,并且由此避免由流感感染或接觸所造成的嚴重的疾病以及死亡。
[0044]附圖簡要說明
[0045]圖1描繪了 STF2.HA1-2融合蛋白的一幅示意圖。
[0046]圖2描繪了 HA球形頭部的可替代的布局。在每一個鞭毛蛋白構(gòu)建體中用圓圈畫出了該球形頭部。
[0047]圖3描繪了不同Viet Nam(VN)構(gòu)建體的相對抗原性。用指示的摩爾濃度的不同蛋白來包被ELISA板。用雪貂恢復期血清(I: 1000)來探查這些板描繪了多個復制孔的平均吸光度。
[0048]圖4描繪了單克隆抗體抗可替代的VN構(gòu)建體的相對反應性。用二重的約4 μ g/ml的每種蛋白包被ELISA板過夜,在室溫下(每塊板一種抗體)用每種單克隆抗體的1: 5000的稀釋體封閉并且孵育2小時,隨后用HRP-山羊抗小鼠IgG的1: 10,000的稀釋體進行30分鐘的孵育持續(xù)30分鐘并且用TMB顯影。描繪了多個復制孔的平均吸光度。
[0049]圖5描繪了在用不同的VN構(gòu)建體免疫的小鼠中血清HAI抗體的誘導作用。以2周間隔免疫3次(3X)或者以3周的間隔免疫2次(2X)對BALB/c小鼠進行免疫。在第二次(2nd)或第三次(3nd)追加劑量之后12天所收集的小鼠血清樣品(n = 10-15)用RDE進行處理、進行熱滅活,并且用流感A/Vietnam/1203/04 (Η5Ν1)病毒進行HAI測試。用GMT (水平的線)以及95% Cl (橫條)分別繪制HAI滴度。虛線表示超出基線4倍的HAI滴度。括號的橫條表示在統(tǒng)計分析中進行比較的組。*,P < 0.05,在Kruskal-Wal I is/Dunns測試中顯著;**,P < 0.01,非常顯著;***, P < 0.001,極其顯著。
[0050]圖6A以及6B描繪了在一個3 μ g的三或二劑量方案之后,不同球形頭部構(gòu)建體的療效。在激發(fā)免疫反應之前用指出的構(gòu)建體對六周齡的雌性BALB/c小鼠進行3或2次免疫皮下接種。在第O天,用流感A/Vietnam/1203/04 (VN04)以6.8X104TCID50/小鼠對小鼠進行鼻內(nèi)感染。從第O天到第21天以規(guī)律的間隔來監(jiān)測對疾病發(fā)展以及死亡率的臨床觀察。存活者的百分比示于(圖6A)中,并且離開第O天的基線的體重改變百分比示于(圖6B)。圖例關鍵詞:STF2.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO:451) ;STF2R0.HA1-2 (VN) (SEQ ID NO:453);STF2R3.HA1-2(VN)(SEQ ID NO:452)。
[0051]圖7描繪了在雪貂的鼻洗物中測量到的病毒滴度。在感染之后第3天以及第5天從用僅緩沖劑(安慰劑)、STF2R3.HA1-2 VN(R3.HA1-2VN) (SEQ ID NO:452 或 STF2R3.2χ.ΗΑ1-2 VN(R3.2xHAl-2 VN) (SEQ ID NO:455)免疫的動物中收集鼻洗物樣品。描繪了組平均滴度土SE。
[0052]圖8A和8B描繪了用STF2.4xM2e免疫后的體溫以及食物消耗量。圖8A描繪了在研究的第O天用指定劑量的STF2.4xM2e (SEQ ID NO:457)免疫之后2小時測量的體溫。描繪了對于每一個6只兔子的組而言平均值土SD的增加。從接受僅有緩沖劑的組獲取基線溫度并且是102.5 T。圖SB描繪了從第O天到第I天監(jiān)測到的食物消耗量。數(shù)據(jù)表示為每組6只兔子的平均食物消耗量土標準偏差。
[0053]圖9描繪了對兔子進行接種后的C反應蛋白(CRP)水平。在第O天使用指定劑量的STF2.4xM2e (SEQ ID NO:457)對多個6只兔子的組進行肌內(nèi)注射。接種之后約24小時對兔子進行取血,制備血清并且測量C反應蛋白(Immunology Consultants Laboratory,Newberg,0R)。數(shù)據(jù)表示為組平均CRP±SD。
[0054]圖 10A-10H描繪了 STF2.HA1_2(SEQ ID NO:451)、STF2R3.HA1_2(SEQ ID NO:452)以及STF2R3.2x.HAl-2 VN(SEQ ID NO:455)構(gòu)建體的相對反應原性。使用指定劑量的STF2.HA1-2 VN(天然)(SEQ ID NO:451)、STF2R3.HA1-2 VN(R3) (SEQ ID NO:452)、STF2R3.2χ.HA1-2VN(R3 2x) (SEQ ID NO:455)蛋白或僅僅配制品緩沖劑對多個6只新西蘭白兔子的組進行免疫接種。初次免疫接種后的21天,收獲血清并且通過ELISA評估HA特異性IgG。IgG滴度以μ g/ml IgG報告,并且描繪于圖10A中。顯示的滴度是對于單個血清的,組平均值用條帶表示。為了允許與該“天然”構(gòu)建體進行比較,在圖10A-10D中將食物消耗量、體溫以及 CRP 水平的組平均值 ±3SD 對 STF2.HA1-2 (SEQ ID NO:451)和 STF2R3.HA1-2 (SEQID NO:452)的 IgG 水平進行作圖,并且在圖 10E-10H 中對 STF2.HA1-2 (SEQ ID NO:451)和STF2R3.2x.HA1-2 (SEQ ID NO:455)進行作圖。圖 11A-11C 描繪了 STF2.HA1-2 PR8(在圖例中稱作天然的)(SEQ ID NO:460)與STF2R3.HA1-2 PR8 (在圖例中稱作R3) (SEQ ID NO:464)反應原性曲線的一個比較。使用指定劑量的疫苗對多個6只兔子的組肌內(nèi)地進行免疫接種。從免疫接種的當天直到I天以后對食物消耗量進行測量(圖11A)。在免疫接種后的10小時經(jīng)直腸地對體溫進行測定(圖11B)。在免疫接種后的24小時對血清的C反應蛋白(CRP)進行測量(圖11C)。數(shù)據(jù)點表示單獨的動物的結(jié)果而橫條表示平均值。圖12描繪了對抗由 STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO:460)和 STF2R3.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO:464)造成的病毒攻擊的保護。在第O天和第14天使用指定劑量的或者STF2.HA1-2或者STF2R3.HA1-2PR8免疫接種Balb/c小鼠(每組10只)。在第42天使用100TtnD50的流感HlNl PR/34/8鼻內(nèi)地攻擊小鼠。每天監(jiān)測小鼠的體重減輕以及存活率。按照實驗方案,如果小鼠減少約^ 20%的體重則將它們安樂處死。
[0055]圖 13A 和 13B 描繪了 STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO:463)和 STF2R3.HA1-2 SI (SEQID NO:465)反應原性曲線的一個比較。使用指定劑量的連接了 STF2的疫苗對兔子(每組6只)肌內(nèi)地進行免疫接種。在免疫接種后的6小時,經(jīng)直腸地對體溫進行記錄(圖13A)。從免疫接種的當天到免疫接種后的I天對食物消耗量進行記錄(圖13B)。將數(shù)據(jù)作為組平均值來繪圖,其中通過誤差棒表示標準偏差。
[0056]圖 14A 和 14B 描繪了對 STF2R3.HA1-2 B FLA (R3) (SEQ ID NO:470)和 STF2R3.HA1-2 B FLA(R3.2x) (SEQ ID NO:471)反應原性曲線的評估。使用指定劑量的疫苗對多個6只兔子的組進行肌內(nèi)地免疫接種。從免疫接種的當天直到之后的I天對食物消耗量進行測量(圖14A)。在免疫接種后24小時對血清的C反應蛋白(CRP)進行測量(圖14B)。數(shù)據(jù)點表示單獨的動物的結(jié)果而橫條表示平均值。
[0057]圖 15 描繪了對 STF2R3.HA1-2 B FLA (R3) (SEQ ID NO:470)和 STF2R3.2χ.ΗΑ1-2B FLA(R3.2x) (SEQ ID NO:471)免疫原性的評估。使用指定劑量的疫苗對多個6只兔子的組肌內(nèi)地進行兩次免疫接種。加強劑量后的7天收獲血清并且通過ELISA評估病毒特異性IgG。數(shù)據(jù)點表示單獨的動物的結(jié)果而橫條表示平均值。
[0058]圖 16A和 16B 描繪了 STF2.4xM2e (SEQ ID NO:457)、STF2D2D3L.4xM2e (SEQ ID NO:472)、STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO:463)、STF2D2D3L.HA1-2 SI (SEQ ID NO:473)的 TLR5 活性的一個比較。通過測量誘導的TNF產(chǎn)量對融合蛋白的TLR5-比活性進行評估。在96孔微量滴定板中將RAW/h5細胞培養(yǎng)過夜。使用指定濃度的蛋白將這些細胞處理5小時。收獲上清液并且通過ELISA對TNF表達進行評估。讀取吸光度并且與標準參考曲線進行比較。數(shù)據(jù)以ng/ml報告。
[0059]圖 17A 和 17B 描繪了用 STF2.4xM2e (SEQ ID NO:457)或 STF2D2D3L.4xM2e (SEQ IDNO:472)免疫接種后的食物消耗量以及CRP水平。圖17A描繪了從第O天到第I天監(jiān)測的食物消耗量。數(shù)據(jù)表示為對于每組6只兔子的平均食物消耗量土標準偏差。圖17B描繪了免疫接種之后24小時測量的CRP水平。數(shù)據(jù)表示為對于每組6只兔子的平均CRP水平土標準偏差。
[0060]圖 18A 和 18B 描繪了 STF2.4xM2e (SEQ ID NO:457)和 STF2D2D3L.4xM2e (SEQ IDNO:472)的免疫原性以及療效。在第O天和第14天使用指定劑量的STF2.4xM2e (SEQ IDNO:457)或 STF2D2D3L.4xM2e (或 STF2 Δ.4xM2e) (SEQ ID NO:472)對多個 BALB/c 小鼠(n=10)的組進行免疫接種。加強劑量之后7天,收集血清并且通過ELISA檢測M2e特異性IgG0在第28天使用lxLD90的PR8病毒對小鼠進行攻擊。攻擊后監(jiān)測小鼠的存活率,持續(xù)21 天(圖 18B)。
[0061]圖 19A 和 19B 描繪了使用 STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO:463)對比 STF2D2D3L.HA1-2SI (SEQ ID NO:473)免疫接種后的CRP以及食物消耗量。圖19A描繪了免疫接種之后24小時測量的CRP水平。數(shù)據(jù)表示為對于每組6只兔子的平均CRP水平土標準偏差。圖19B描繪了從第O天到第I天監(jiān)測的食物消耗量。數(shù)據(jù)表示為對于每組6只兔子的平均食物消耗量土標準偏差。
[0062]圖 20 描繪了使用 STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO:463)對比 STF2D2D3.HA1-2 SI (SEQID NO:473)免疫接種后Solomon Islands HA特異性IgG應答。免疫接種之后24小時對CRP水平進行測量。數(shù)據(jù)表示為對于每組6只兔子的平均CRP水平土標準偏差。
[0063]圖 21 描繪了 STF2R0.HA1-2 PR8 TLR5 活性。將融合蛋白 STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQID NO:474)和STF2.HA1-2 SI (SEQ ID NO:463)(空心圓)稀釋到指定濃度并且與HEK293細胞進行混合。24小時后收集上清液并且使用ELISA(BD Pharmingen)對IL-8進行分析。
[0064]圖 22A-22C 描繪了與 STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO:460)相 STF2R0.HA1-2PR8 (SEQ ID NO:474)的反應原性。在第O天使用指定的劑量當量肌內(nèi)地對兔子(每組6只)進行免疫接種。圖22A描繪了體溫(在第O天免疫接種之后6小時測量的,°F )。圖22B描繪了在第O天和第I天之間測量的食物消耗量(g)。圖22C描繪了在24小時處血清中的C反應蛋白(μ g/mL)。顯示的所有數(shù)據(jù)都是組平均值土標準偏差。
[0065]圖 23 描繪了與 STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO:460)相比用 STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQID NO:474)免疫接種后的PR8-特異性IgG。在第O天使用指定的劑量當量肌內(nèi)地對兔子(每組6只)進行免疫接種。在第21天對它們進行取血并且分析血清對PR8病毒的IgG。使用病毒(205HAU/mL)連同一個多克隆IgG的標準曲線將酶標板進行包被。使用與一個4參數(shù)邏輯方程擬合的一種標準曲線計算病毒-特異性IgG。數(shù)據(jù)表示為組平均IgG ( μ g/mL) 土標準偏差。
[0066]圖 24A-24C 描繪了 STF2R0.HA1-2 PR8 (RO) (SEQ ID NO:474)對比 STF2.HA1-2PR8 (全長)(SEQ ID NO:460)的反應原性/免疫原性比率。將PR8-特異性IgG (X-軸)對反應原性測量值作圖。圖24A描繪了特異性IgG對比體溫。圖24B描繪了特異性IgG對比食物消耗量。Figure 24C描繪了特異性IgG對比C反應蛋白(CRP)。所有結(jié)果都作為組平均值土標準偏差不出。
[0067]圖25描繪了變成A/PR/8/34病毒后已接種的小鼠的存活率。在第O天和第14天在指定劑量下使用 STF2.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO:460) ,STF2R0.HA1-2 PR8 (SEQ ID NO:474)或F147緩沖劑皮下免疫接種10只BALB/c小鼠的多個組,并且在第34天使用LD90的A/PR/8/34進行1.n.(鼻內(nèi)地)攻擊。每天觀察這些動物的體重減輕以及死亡率,持續(xù)21天。
[0068]圖26描繪了用STF2.HAl SI免疫的小鼠的血清的中和抗體滴度。結(jié)果顯示,每組15個單獨的血清的幾何平均值±95% Cl (橫條)連同單獨的小鼠的結(jié)果。
[0069]圖27描繪了用STF2.HA1 SI免疫的小鼠的加強后血清的中和抗體滴度。收獲血清并且使用微量中和測定對中和滴度進行評估。結(jié)果顯示了每組15個單獨的血清的幾何平均值。橫條上的星號表明與使用ANOVA/Tukey檢驗幼稚組相比顯著的應答。由括號所連接的組也通過ANOVA/Tukey檢驗進行比較并且發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)計上有差異。星號表明了顯著水平,其中在 ANOVA 中 * = P < 0.05 ;** = P < 0.01 ;并且 *** = p < 0.001。
[0070]圖28A和28B描繪了在兔子中對STF2.HAl SI的SI HA-特異性IgG應答。在第O天和第21天以指定的劑量使用STF2.HAl SI對每組六只兔子進行兩次免疫接種。在第_1天(取血前),第21天(初次免疫后,頂部的圖)以及第28天(加強后7天,底部的圖)收集血清。將血清結(jié)合到用HAl-1 (SI)(桿狀病毒,I μ g/mL)以范圍從1: 25到1: 39,0625的稀釋度包被的孔板上。使用一個用4參數(shù)邏輯曲線(Softmax Pro 5.2,Molecular Devices)擬合的多克隆IgG的標準曲線將HA-特異性IgG的OD值轉(zhuǎn)化成μ g/ml。從每個組減去取血前的值。顯示的數(shù)據(jù)是每組6只兔子的平均值+/_標準偏差。
[0071]圖29 描繪了來自用 STF2.HAl SI (也稱為為 STF2.HA1-2 (SI))或 Fluvirirr?免疫的兔子的加強后血清的中和抗體滴度。在第O天以及第21天以指定的劑量使用STF2.HAl SI或Fluvirin?對每組六只兔子肌內(nèi)地進行兩次免疫接種。該加強劑量后的7天收獲血清并且使用微量中和測定對中和滴度進行評估。結(jié)果顯示為每組6個單獨的血清的幾何平均值。橫條上的星號指示了使用ANOVA/Tukey檢驗與幼稚組相比顯著的應答。由括號連接的組也通過相同的檢驗進行比較并且發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)計上有差異。星號表明顯著水平,其中在 ANOVA/Tukey 檢驗中 * = p < 0.05 ;** = p < 0.01 ;并且 *** = p < 0.001。包括了從CDC得到的雪貂參照抗血清作為一種陽性對照并且在該圖的底部給出了滴度。
[0072]圖30描繪了在兔子中STF2.HAl SI對食物消耗量的影響。在第O天使用指定劑量的STF2.HAl SI (也稱作STF2.HA1_2(SI))對多個6只兔子的組進行肌內(nèi)注射。從第O天到第I天監(jiān)測食物消耗量。數(shù)據(jù)表示為組平均食物消耗量土SD。
[0073]圖31描繪了在兔子中STF2.HAl SI對CRP水平的影響。在第O天使用指定劑量的STF2.HAl SI (也稱為STF2.HA1_2(SI))對多個6只兔子的組進行肌內(nèi)注射。接種后的24小時對兔子取血,制備血清并且測量CRP (Immunology Consultants Laboratory, Newberg,OR)。數(shù)據(jù)表示為組平均值CRP±SD。
[0074]圖32描繪了在兔子中STF2.HAl SI對體溫的影響。使用指定劑量的STF2.HAl SI對多個6只兔子的組進行肌內(nèi)注射。接種后的2小時對體溫進行監(jiān)測。數(shù)據(jù)表示為平均體溫土標準偏差。從接受僅僅緩沖劑的組獲取基線溫度并且是約102.5 T。
[0075]圖33描繪了用STF2.HAl SI免疫后隨時間推移的體溫增加。使用F147緩沖劑或者150 μ g的STF2.HAl SI對兔子進行肌內(nèi)免疫接種。使用一種皮下芯片系統(tǒng)在指定的點處測量溫度。結(jié)果表示為6只動物的組平均值。
[0076]圖34描繪了 STF2.HAl SI對體溫的影響。使用指定劑量的STF2.HAlSI對兔子進行肌內(nèi)地免疫接種。F147緩沖劑表示為O。在免疫接種后的6小時經(jīng)直腸地對體溫進行測量。數(shù)據(jù)顯示為組平均值+標準偏差。
[0077]圖35描繪了使用兔的連續(xù)稀釋的加強后免疫血清對A/Solomon Islands/3/06進行的中和,將RDE處理的血清樣品與A/Solomon Islands/3/2006病毒共同孵化,然后與MDCK細胞共同孵化,并且使用抗-流感A NP抗體經(jīng)受ELISA。中和抗體滴度被定義為稀釋度的倒數(shù),該稀釋度在從陰性以及陽性對照的OD值計算出的特異性信號之上。數(shù)據(jù)表示為天然log(LN,中和滴度)的平均值土 SD,其上是應答者的比率(N = 6)。
[0078]圖36描繪了對于VAX125臨床血清的微量中和滴度。將血清樣品與SolomonIslands病毒進行混合并且然后加入MDCK細胞中。孵化20小時后,通過將細胞溶解并且對核蛋白(NP)的表達進行染色對病毒復制進行定量。將微量中和滴度確定為使病毒復制減少> 50%的最高稀釋度。結(jié)果表示為單獨的受試者滴度,其中橫條表示該組的幾何平均值。
[0079]圖37A和37B通過ELISA描繪了 HA-和鞭毛蛋白特異性IgG。將血清稀釋并且在用重組的HAl-1或者STF2包被的孔板上進行孵化。使用抗-人HRP和TMB檢測抗原-特異性IgG。使用一種4參數(shù)邏輯方程式從一個標準曲線計算特異性IgG。數(shù)據(jù)表示為組平均值,其中誤差棒表示平均標準誤差(SEM)。圖38A和38B描繪了以0.3yg劑量和l.0yg劑量在單獨的受試者中肌內(nèi)施用VAX102或安慰劑后的M2e-特異性IgG。
[0080]圖39描繪了在第O天和第28天給予的兩次劑量的VAX102后在第42天測量到的幾何平均滴度(GMT)所定義的M2e抗體曲線。圖40描繪了跨過多種服用量和給藥途徑的M2e-特異性 IgG GMT。
[0081]圖41A-41C描繪了以不同的給藥途徑以及劑量得到的M2e_特異性IgG (組平均值)。1.d.=皮內(nèi)、s.c.=皮下、1.m.=肌內(nèi)。
[0082]圖42A-42C描繪了在免疫原性研究#2中對STF2 Δ.RSVG融合蛋白的IgG抗體應答。圖 42A-用對照免疫的小鼠。Figure 42B-用 STF2 Λ.RSVG130-230 (SEQ ID NO:621)免疫的小鼠。Figure 42C-用STF2A.RSVG130-230(SEQ ID NO:621)免疫的小鼠。將酶標板用 RSVG 肽 HPEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRI (SEQ ID NO:627)進行包被。
[0083]圖43A-43B描繪了使用全細胞RSV ELISA測定在研究#2中對STF2 Δ.RSVG融合蛋白的IgG抗體應答。圖43A-用STF2A.RSVG130-230(SEQ ID NO:621)對小鼠進行免疫接種,圖43B-用STF2 Δ.RSVG66-298 (SEQ ID NO:571)對小鼠進行免疫接種。
[0084]圖44A-44B描繪了在全細胞ELISA測定中在免疫原性研究#3中對RSVF.STF2His6(SEQ ID NO:615)的 IgG 抗體應答。
[0085]圖45描繪了在RSV病毒中和測定法中RSVF.STF2His6(SEQ ID NO:615)的免疫原性。
[0086] 圖46A-46D描繪了在免疫原性研究#1中由STF2 Δ.RSVM2 (SEQ ID NO:625)誘導的T細胞應答,如通過ELISP0T測定法所測定。圖46A-1FN(初次)。圖46B-1L-4 (初次)。圖 46C-1FN (加強)。圖 46D-1L-5 (加強)。
[0087]圖47A到47D描繪了在用STF2Λ.DEN(l-4)EIII+蛋白 (SEQ ID NO:628)、(SEQ IDNO:630)、(SEQ ID NO:632)和(SEQ ID NO:634)免疫接種后在小鼠體內(nèi)引出的血清IgG應答,如使用 DEN 80% HlisBv 蛋白(SEQ ID NO:636)、(SEQ ID NO:638)、(SEQ ID NO:640)和(SEQ ID NO:642)通過 ELISA 所測定。
[0088]圖48A到48D描繪了與異源DEN 80% HlisBv蛋白的免疫血清IgG交叉反應性,如通過ELISA所測定。
[0089]圖 49A、49B、50A 和 50B 描繪了用 STF2A.DEN(1-4)EIII+蛋白(SEQ ID NO:628)、(SEQ ID NO:630)、(SEQ ID NO:632)和(SEQ ID NO:634)單獨地(單價配制品)或以四價配制品的組合的形式進彳丁免疫接種后在小鼠體內(nèi)引出的血清IgG應答。使用DEN 80%EHisBv 蛋白(SEQ ID NO:636)、(SEQ ID NO:638)、(SEQ ID NO:640)和(SEQ ID NO:642)通過ELISA進行測定。
[0090]圖51描繪了用STF2A.DEN2EIII+蛋白(SEQ ID NO:630)進行免疫接種后引出的登革熱中和抗體。如通過PRNT測定法所測定。
[0091]圖52A和52B描繪了使用IFN1-陽性細胞(圖52A)和IL-5-陽性細胞(圖52B)的ELISP0T測定法,用STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO:679)進行單獨一次免疫接種之后小鼠體內(nèi)的HPV16 E6抗原-特異性T細胞應答。
[0092]圖53A和53B描繪了使用IFN- Y -陽性細胞(圖52A)和IL-5-陽性細胞(圖52B)的ELISP0T測定法,用STF2.HPV16 E6 (SEQ ID NO:679)進行兩次免疫接種之后小鼠體內(nèi)的HPV16 E6抗原-特異性T細胞應答。
[0093]圖54描繪了全長鞭毛蛋白(FL)的結(jié)構(gòu)域(D0、D1、D2、D3)以及一種融合蛋白,該融合蛋白包含結(jié)構(gòu)域0、1、2和3以及融合到該鞭毛蛋白的羧基-末端上的一個抗原(Ag)(Yonekura, et al.,Nature 424:643-650(2003))。
[0094]圖55描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:28)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括融合到一個抗原(Ag)上的鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域3、羧基-結(jié)構(gòu)域2以及羧基-結(jié)構(gòu)域I。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“RO構(gòu)建體”。
[0095]圖56描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:29)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域O、氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域I以及羧基-結(jié)構(gòu)域O。該抗原(Ag)被插入到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)域2的氨基-末端和羧基-末端之間。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“R3構(gòu)建體”。SEQ ID NO:29是一種R3構(gòu)建體和一種D3構(gòu)建體的氨基酸序列,這兩種構(gòu)建體的不同之處在于該融合的抗原的位置。
[0096]圖57描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:29)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括融合到一個抗原(Ag)上的鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域O、氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域I以及羧基-結(jié)構(gòu)域O。一種抗原(Ag)被融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的羧基-結(jié)構(gòu)域O的末端氨基酸上。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“D3構(gòu)建體”。
[0097]圖58描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:30)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域2以及羧基-結(jié)構(gòu)域I。將一個抗原(Ag)融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的氨基-結(jié)構(gòu)域2和羧基-結(jié)構(gòu)域2之間。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“R3D0構(gòu)建體”。
[0098]圖59描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:30)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域2以及羧基-結(jié)構(gòu)域I。兩個抗原(Ag)在SEQ ID NO:30中所描繪的融合蛋白中。一個抗原被融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的氨基-結(jié)構(gòu)域2和羧基-結(jié)構(gòu)域2之間并且另一個抗原被融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的羧基-結(jié)構(gòu)域I上。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“R03構(gòu)建體”。
[0099]圖60描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:29)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括該鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域O、氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域I以及羧基-結(jié)構(gòu)域O。兩個抗原(Ag)在該融合蛋白中。一個抗原融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的氨基-結(jié)構(gòu)域2和羧基-結(jié)構(gòu)域2之間。另一個抗原被融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)域O的羧基-末端氨基酸上。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“R3-2xAg構(gòu)建體”。
[0100]圖61描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:31)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括融合到一個抗原(Ag)上的鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域I以及羧基-結(jié)構(gòu)域O。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“D3N構(gòu)建體”。
[0101]圖62描繪了一種鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:32)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域1、氨基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域2、羧基-結(jié)構(gòu)域I。該鞭毛蛋白構(gòu)建體缺少一個羧基-結(jié)構(gòu)域O的一個部分,例如氨基酸序列VPQNVLSLLA(SEQ ID NO:693)。一個抗原被融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的羧基末端氨基酸上。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“D3NCs構(gòu)建體”。
[0102]圖63描繪了鞭毛蛋白構(gòu)建體(SEQ ID NO:33)的結(jié)構(gòu)域(DO、DU D2、D3)和一種融合蛋白,該融合蛋白在序列中包括融合到一個抗原(Ag)上的鞭毛蛋白的氨基-結(jié)構(gòu)域I以及羧基-結(jié)構(gòu)域I。該抗原被融合到該鞭毛蛋白構(gòu)建體的羧基-結(jié)構(gòu)域I的羧基-末端氨基酸上。該鞭毛蛋白構(gòu)建體在此稱為“D0D2D3構(gòu)建體”或“D1構(gòu)建體”。
[0103]圖64描繪了融合蛋白,該融合蛋白包含鞭毛蛋白以及RSV F蛋白的多個部分。
[0104]圖65 描繪了 RSV F 蛋白中的二硫鍵(Smith, et al., Prot.Eng.15:365-371(2001))。
[0105]圖66 描繪了一個 RSV G 蛋白(SEQ ID NO:544)。
[0106]圖67描繪了 HPV16基因組。
[0107]圖68描繪了 HPV基因組、mRNA以及蛋白。
[0108]發(fā)明詳細說明
[0109]現(xiàn)在將更具體地描述本發(fā)明的特征以及其他細節(jié)(或者作為本發(fā)明的步驟或者作為本發(fā)明的多個部分的組合)并且在權(quán)利要求中指出。應當理解的是本發(fā)明的具體實施方案是通過說明的方式示出而不作為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的主要特征在不偏離本發(fā)明的范圍時可以在多種不同的實施方案中使用。
[0110]本發(fā)明總體上是針對多種組合物,這些組合物包含病毒抗原,例如流感病毒抗原(例如,血球凝集素(HA)蛋白、基質(zhì)2(M2)蛋白、神經(jīng)氨酸苷酶)、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原(例如,融合蛋白、粘附糖蛋白)、乳頭瘤病毒抗原(例如,人乳頭瘤病毒(HPV),例如E6蛋白、E7蛋白、LI蛋白、L2蛋白)以及黃病毒抗原(例如,登革熱病毒抗原、西尼羅病毒抗原)、包含病毒抗原的融合蛋白以及使用在此描述的組合物在受試者體內(nèi)刺激一種免疫應答的方法,例如一種保護性免疫應答。
[0111]在一個實施方案中,本發(fā)明是具有與如SEQ ID NO:29(—種R3構(gòu)建體)中列出的一種連續(xù)氨基酸序列至少約50.0%—致性的一種氨基酸序列,包括SEQ ID N0:29的任何插入或缺失,其中該分離的氨基酸序列激活了一種Toll-樣受體5(TLR5)。具有例如與SEQID NO:29至少約50.0 %、至少約60.0 %、至少約70.0%、至少約80.0 %、至少約85.0%、至少約88.0%、至少約90.0%、至少約95.0%、至少約98.0%或至少約99.0%—致性的氨基酸序列可以用于本發(fā)明的組合物、融合蛋白以及方法中。與SEQ ID N0:29具有至少約50.0%—致性的示例性的氨基酸序列包括SEQ ID N0s:770-775。
[0112]SEQ ID NO:29的選自下組的至少一個氨基酸殘基可以用天然發(fā)生的氨基酸以外的一種氨基酸(例如,選自下組的至少一個成員,該組的組成為:丙氨酸、絲氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、以及賴氨酸)取代,該組的組成為:84、91、95、322和326。人們認為在描述于此的鞭毛蛋白構(gòu)建體中取代的氨基酸涉及與TLR5的相互作用(例如,結(jié)合)。
[0113]如在此使用的,提及在此描述的與激活Toll-樣受體5的氨基酸序列(例如,SEQID NO:29、30、31、32和33)具有一致性的氨基酸序列時“連續(xù)的”是指在共有百分比一致性的氨基酸序列的任何一個部分中不具有任何插入或缺失的一個氨基酸序列。例如,當與SEQ ID NO:29進行比較時,具有與SEQ ID NO:29至少50% —致性的一個氨基酸序列將不會在氨基酸序列中具有一個缺口(例如,一個缺失),當與SEQ ID NO:29進行比較時,該氨基酸序列也將不具有額外的氨基酸(例如,一個插入)。
[0114]當涉及一種氨基酸序列或一種融合蛋白時,“激活”是指該氨基酸序列、融合蛋白或該融合蛋白的組分(例如,一個氨基酸序列)刺激與TLR 5相關的一種應答,例如宿主炎癥應答(Smith, K.D.,et al.,Nature Immunology4:1247-1253 (2003)),例如白細胞介素-8(IL-8)的生成、腫瘤壞死因子(TNF)的生成以及ΝΚ-κ B的活化,如在此所描述。
[0115]R3構(gòu)建體可以融合到在此所描述的至少一個抗原上。融合到例如一個流感病毒HA抗原(SEQ ID NO:499)上的示例性的R3構(gòu)建體(在此也稱為“R3鞭毛蛋白構(gòu)建體”或“鞭毛蛋白的R3形式”)如下所示。HA抗原序列加有劃線。
【權(quán)利要求】
1.一種氨基酸序列,該序列具有與如SEQ ID NO:29(R3)中列出的、包括對于SEQ IDNO:29的任何插入或缺失的一種連續(xù)的氨基酸序列至少約50.0%的一致性,其中該分離的氨基酸序列激活一種Toll-樣受體5。
2.如權(quán)利要求1所述的氨基酸序列,其中SEQID NO:29的至少一個氨基酸殘基被一個丙氨酸殘基取代,該氨基酸殘基是選自下組,其組成為:84,91,95,322以及326。
3.一種氨基酸序列,該序列具有與如SEQ ID NO:30(R3D0)中列出的、包括對于SEQ IDNO:30的任何插入或缺失的一種連續(xù)的氨基酸序列至少約50.0%的一致性,其中該分離的氨基酸序列激活一種Toll-樣受體5。
4.如權(quán)利要求3所述的氨基酸序列,其中SEQID NO:30的至少一個氨基酸殘基被一個丙氨酸殘基取代,該氨基酸殘基是選自下組,其組成為:39,46,50,277以及281。
5.一種氨基酸序列,該序列具有與如SEQ ID NO:31(D3N)中列出的、包括對于SEQ IDNO:31的任何插入或缺失的一種連續(xù)的氨基酸序列至少約60.0 %的一致性,其中該分離的氨基酸序列激活一種Toll-樣受體5。
6.如權(quán)利要求5所述的氨基酸序列,其中SEQID NO:31的至少一個氨基酸殘基被一個丙氨酸殘基取代,該氨基酸殘基是選自下組,其組成為:39,46,50,277以及281。
7.一種氨基酸序列,該序列具有與如SEQ ID NO:32(D3NCs)中列出的、包括對于SEQ IDNO:32的任何插入或缺失的一種連續(xù)的氨基酸序列至少約60.0%的一致性,其中該分離的氨基酸序列激活一種Toll-樣受體5。
8.如權(quán)利要求7所述的氨基酸序列,其中SEQID NO:32的至少一個氨基酸殘基被一個丙氨酸殘基取代,該氨基酸殘基是選自下組,其組成為:39,46,50,277以及281。
9.如在選自下組的至少一個成員中列出的一種氨基酸序列,該組的組成為:SEQIDNO:29(R3)、SEQ ID NO:30 (R3D0)、SEQ ID NO:31 (D3N)、SEQ ID NO:32(D3NCs)以及 SEQ IDNO:33 (Dl)。
10.一種融合蛋白,在序列中包括如SEQ ID N0:28(R0構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一個部分,其中SEQ ID NO:28的至少一個氨基酸殘基被一個丙氨酸殘基取代,該氨基酸殘基是選自下組,其組成為:39、46、50、378以及382 ;并且其中該融合蛋白激活一種Toll-樣受體5。
11.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白,其中該抗原是一種病毒蛋白抗原。
12.如權(quán)利要求10所述的融合蛋白,其中該病毒蛋白抗原是一種流感病毒蛋白抗原。
13.如權(quán)利要求12所述的融合蛋白,其中該流感抗原包括至少一種膜內(nèi)在蛋白抗原。
14.如權(quán)利要求13所述的融合蛋白,其中該膜內(nèi)在蛋白抗原括選自下組的至少一個成員的至少一個部分,該組的組成為:一種血細胞凝集素膜蛋白、一種神經(jīng)氨酸苷酶膜蛋白以及一種基質(zhì)2 ?吳蛋白。
15.如權(quán)利要求14所述的融合蛋白,其中該膜內(nèi)在蛋白包括至少一種血細胞凝集素膜蛋白的至少一個部分。
16.如權(quán)利要求15所述的融合蛋白,其中該血細胞凝集素膜蛋白包括選自下組的至少一個成員,該組的組成為:SEQ ID NO:228-281、283-295、456、481、499、662、665、813 以及826-831。
17.如權(quán)利要求14所述的融合蛋白,其中該膜內(nèi)在蛋白包括至少一種基質(zhì)2膜蛋白的至少一個部分。
18.如權(quán)利要求17所述的融合蛋白,其中該膜內(nèi)在蛋白包括至少四種基質(zhì)2膜蛋白。
19.如權(quán)利要求17所述的融合蛋白,其中該基質(zhì)2膜蛋白是選自下組的至少一個成員,該組的組成為:SEQ ID NO:296、298、300-321、323-336、485、507 以及 666。
20.一種融合蛋白,包括如SEQ ID NO:29(R3構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該抗原是在SEQ ID NO:29的氨基酸殘基190與191之間,并且其中該融合蛋白激活一種Toll-樣受體5。
21.一種融合蛋白,在序列中包括如SEQ ID N0:29(D3構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該融合蛋白激活一種Toll樣受體5。
22.一種融合蛋白,包括如SEQ ID N0:30(R3D0構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該抗原是在SEQ ID NO:30的氨基酸殘基145與146之間,并且該融合蛋白激活一種Toll-樣受體5。
23.一種融合蛋白,包括如SEQ ID N0:30(R03構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少兩種抗原的至少一個部分,其中至少一種抗原是在SEQ ID N0:30的氨基酸殘基145與146之間,并且至少一種其他抗原被融合到SEQ ID NO:30的氨基酸殘基318上,其中該融合蛋白激活一種Toll-樣受體5。
24.如權(quán)利要求23所述的融合蛋白,其中這些抗原是不同的抗原。
25.如權(quán)利要求23 所述的融合蛋白,其中這些抗原是相似的抗原。
26.一種融合蛋白,包括如SEQ ID NO:29(R3-2xAg構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少兩種抗原的至少一個部分,其中至少一種抗原是在SEQ ID N0:29的氨基酸殘基190與191之間,并且至少一種其他抗原被融合到SEQ ID NO:29的氨基酸殘基405上,并且其中該融合蛋白激活一種Toll-樣受體5。
27.如權(quán)利要求26所述的融合蛋白,其中這些抗原是不同的抗原。
28.如權(quán)利要求26所述的融合蛋白,其中這些抗原是相似的抗原。
29.一種融合蛋白,在序列中包括如SEQ ID NO:31(D3N構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該融合蛋白激活一種Toll樣受體5。
30.一種融合蛋白,在序列中包括如SEQ ID NO:32(D3NCs構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該融合蛋白激活一種Toll樣受體5。
31.一種融合蛋白,在序列中包括如SEQ ID N0:33(D1構(gòu)建體)中列出的至少一種氨基酸序列以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該融合蛋白激活一種Toll樣受體5。
32.在一個人體內(nèi)刺激一種免疫應答的一種方法,該方法包括以下步驟:向該人施用一種組合物,該組合物包括一種融合蛋白SEQ ID NO:451-453、455、457、460、463-465、468、470-474、500-506、511-518、660以及664,其中以選自下組的至少一種劑量向該人施用該融合蛋白,該組的組成為:約10.0yg的劑量、約5.0y g的劑量、約3.0y g的劑量、約2.5 μ g的劑量、約l.0yg的劑量、約0.5 μ g的劑量、約0.3 μ g的劑量、約0.25 μ g的劑量、約0.1 μ g的劑量、約0.05 μ g的劑量、約0.025 μ g的劑量、以及約0.01 μ g的劑量。
33.如權(quán)利要求32所述的方法,其中向該人員施用該組合物提供了對一種感染的保護性免疫,該感染是由于將該人暴露于該抗原的一個來源而引起的。
34.一種組合物,包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域O、一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O (R3,D3,R3-2xAg)。
35.如權(quán)利要求34所述的組合物,進一步包括至少一種抗原的至少一個部分。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物,其中該天然發(fā)生的鞭毛蛋白的該部分以及該抗原是一種融合蛋白的組分。
37.如權(quán)利要求36所述的組合物,其中該抗原被融合到該天然發(fā)生的鞭毛蛋白的該部分的氨基-結(jié)構(gòu)域2與羧基-結(jié)構(gòu)域2 (R3)之間。
38.如權(quán)利要求36所述的組合物,其中該抗原被融合到該天然發(fā)生的鞭毛蛋白(D3)的該部分的羧基-結(jié)構(gòu)域O上。
39.如權(quán)利要求37所述的組合物,進一步包括被融合到該天然發(fā)生的鞭毛蛋白(R3-2XAg)的該部分的羧基-結(jié)構(gòu)域O上的至少一種另外的抗原的至少一個部分。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物,其中該抗原與該另外的抗原是相似的。
41.如權(quán)利要求39所述的組合物,其中該抗原與該另外的抗原是不同的。
42.一種組合物,包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I(R3D0 ;R03
43.如權(quán)利要求42所述的組合物,進一步包括至少一種抗原的至少一個部分。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物,其中該天然發(fā)生的鞭毛蛋白的該部分以及該抗原是一種融合蛋白的組分。
45.如權(quán)利要求44所述的組合物,其中該抗原被融合到該天然發(fā)生的鞭毛蛋白的該部分上的氨基-結(jié)構(gòu)域2與羧基-結(jié)構(gòu)域2 (R3D0)之間。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物,進一步包括融合到該天然發(fā)生的鞭毛蛋白(R03)的該部分的羧基-結(jié)構(gòu)域I上的至少一種另外的抗原的至少一個部分。
47.一種組合物,包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I (D3N)。
48.如權(quán)利要求47所述的組合物,進一步包括將至少一種抗原的至少一個部分融合到該天然發(fā)生的鞭毛蛋白的該部分的羧基-結(jié)構(gòu)域O上。
49.一種組合物,包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域1、以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I (D3NCs)的至少一個部分。
50.如權(quán)利要求49所述的組合物,進一步包括融合到該羧基-結(jié)構(gòu)域O的該部分上的至少一種抗原的至少一個部分。
51.一種組合物,包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域1,并且其中該天然發(fā)生的鞭毛蛋白的該部分缺少一個羧基-結(jié)構(gòu)域0(D3NCs)的一個部分。
52.一種組合物,包括一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白的一個部分,其中該部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I (Dl)。
53.如權(quán)利要求52所述的組合物,進一步包括融合到該羧基-結(jié)構(gòu)域I上的至少一種抗原的至少一個部分。
54.一種制備一種Toll-樣受體5促效劑的方法,該方法包括以下步驟: a)從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離一種蛋白的一個部分以由此形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域O、一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O (R3,D3,R3-2xAg); b)將對該蛋白部分進行編碼的一種核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且 c)培養(yǎng)該宿主細胞以由此制備該Toll-樣受體5促效劑。
55.如權(quán)利要求54所述的方法,其中該宿主細胞是一種原核宿主細胞。
56.如權(quán)利要求54所述的方法,其中該宿主細胞是一種真核宿主細胞。
57.如權(quán)利要求54所述的方法,進一步包括將對至少一種抗原進行編碼的一個第二核酸序列可操作地連接到對該蛋白部分進行編碼的核酸序列上的步驟。
58.如權(quán)利要求57所述的方法,其中將該第二核酸序列連接到對該蛋白部分(D3)進行編碼的核酸序列的3’末端上。
59.如權(quán)利要求57所述的方法,進一步包括將包含至少一種抗原的一個第二核酸序列可操作地連接到對該蛋白部分(R3)進行編碼的核酸序列的氨基-結(jié)構(gòu)域2與羧基-結(jié)構(gòu)域2之間的步驟。
60.如權(quán)利要求54所述的方法,進一步包括以下步驟: a)將對至少一種抗原進行編碼的一個第二核酸序列可操作地連接到對該蛋白部分進行編碼的核酸的氨基-結(jié)構(gòu)域2與羧基-結(jié)構(gòu)域2之間,以由此形成一個第二蛋白部分;并且 b)將對至少一種另外的抗原進行編碼的一個第三核酸序列可操作地連接到對該第二蛋白部分(R3-2xAg)進行編碼的核酸序列的3’末端上。
61.如權(quán)利要求60所述的方法,其中由該第三核酸序列編碼的該另外的抗原與由該第二核酸序列編碼的抗原相似。
62.如權(quán)利要求60所述的方法,其中由該第三核酸序列編碼的該另外的抗原與由該第二核酸序列編碼的抗原是不同的。
63.如權(quán)利要求54所述的方法,其中該抗原是一種流感抗原。
64.如權(quán)利要求63所述的方法,其中該流感抗原是一種血細胞凝集素流感病毒抗原。
65.如權(quán)利要求63所述的方法,其中該流感抗原是一種基質(zhì)2流感病毒抗原。
66.一種制備一種Toll-樣受體5促效劑的方法,該方法包括以下步驟: a)從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離一種蛋白的一個部分以由此形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I (R3D0,R03); b)將對該蛋白部分進行編碼的一個核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且 c)培養(yǎng)該宿主細胞以由此形成該Toll-樣受體5促效劑。
67.如權(quán)利要求66所述的方法,進一步包括將對至少一種抗原進行編碼的一個第二核酸序列的步驟可操作地連接至對該蛋白部分(R3D0)進行編碼的核酸的氨基-結(jié)構(gòu)域2與羧基-結(jié)構(gòu)域2之間的步驟。
68.如權(quán)利要求67所述的方法,進一步包括將對至少一種另外的抗原進行編碼的一個第三核酸序列可操作地連接至對該蛋白部分(R03)進行編碼的核酸序列的3’末端的步驟。
69.如權(quán)利要求68所述的方法,其中由該第三核酸序列編碼的該另外的抗原與由該第二核酸序列編碼的抗原是相似的。
70.如權(quán)利要求68所述的方法,其中由該第三核酸序列編碼的該另外的抗原與由該第二核酸序列編碼的抗原是不同的。
71.一種制備一種Toll-樣受體5促效劑的方法,包括以下步驟: a)從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離一種蛋白的一個部分以由此形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域O (D3N); b)將對該蛋白部分進行編碼的一個核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且 c)培養(yǎng)該宿主細胞以由此形成該Toll-樣受體5促效劑。
72.如權(quán)利要求71所述的方法,進一步包括將對至少一種抗原進行編碼的一個第二核酸序列可操作地連接到對該蛋白部分進行編碼的核酸序列上的步驟。
73.一種制備一種Toll-樣受體5促效劑的方法,包括以下步驟:a)從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離一種蛋白的一個部分以由此形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域1、一個氨基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域2、一個羧基-結(jié)構(gòu)域1,并且其中該蛋白部分缺少一個羧基-結(jié)構(gòu)域0(D3NCs)的一個部分; b)將對該蛋白部分進行編碼的一種核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且 c)培養(yǎng)該宿主細胞以由此形成該Toll-樣受體5促效劑。
74.如權(quán)利要求73所述的方法,其中該蛋白部分所缺少的該羧基-結(jié)構(gòu)域O的部分是VPNVLSLLA(SEQ ID NO:693)。
75.如權(quán)利要求73所述的方法,進一步包括將對至少一種抗原進行編碼的一個第二核酸序列可操作地連接至對該蛋白部分進行編碼的該核酸序列上的步驟。
76.一種制備一種Toll-樣受體5促效劑的方法,包括以下步驟: a)從一種天然發(fā)生的鞭毛蛋白分離一種蛋白的一個部分以由此形成一個蛋白部分,其中該蛋白部分在序列中包括一個氨基-結(jié)構(gòu)域I以及一個羧基-結(jié)構(gòu)域I (Dl); b)將對該蛋白部分進行編碼的一個核酸序列轉(zhuǎn)化到一種宿主細胞中;并且 c)培養(yǎng)該宿主細胞以由此形成該Toll-樣受體5促效劑。
77.如權(quán)利要求76所述的方法,進一步包括將對至少一種抗原進行編碼的一個第二核酸序列可操作地連接到對該蛋白部分進行編碼的核酸序列上的步驟。
78.一種包含至少一種納米顆粒的組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體促效劑的至少一個部分以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該Toll樣受體促效劑以及該抗原與該納米顆粒相締合并且該Toll樣受體促效劑與該抗原的摩爾比是不大于約I。
79.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該摩爾比是選自下組,其組成為:約0.5、約0.1、約0.05、約0.01、約0.005、約0.001、約0.0005、約0.0001、約0.00005 以及約0.00001。
80.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該Toll-樣受體促效劑與該納米顆粒的一個外表面相締合。
81.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該抗原與該納米顆粒的一個內(nèi)表面相締合。
82.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該Toll-樣受體促效劑與該納米顆粒的一個外表面相締合并且該抗原與該納米顆粒的一個內(nèi)表面相締合。
83.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該納米顆粒的平均直徑是選自下組的至少一個成員,該組的組成為:約20納米、約25納米、約30納米、約40納米、約50納米、約75納米、約100納米、約125納米、約150納米、約175納米以及約200納米。
84.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該納米顆粒包括選自下組的至少一個成員,該組的組成為:聚乙丙交酯以及雙酰氧基丙基半胱氨酸。
85.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該Toll-樣受體促效劑是選自下組的至少一個成員,該組的組成為:Toll-樣受體2促效劑、Toll-樣受體4促效劑、Toll-樣受體5促效劑、Toll-樣受體7促效劑、Toll-樣受體8促效劑以及Toll-樣受體9促效劑。
86.如權(quán)利要求85所述的組合物,其中該Toll-樣受體促效劑是一種Toll-樣受體5促效劑。
87.如權(quán)利要求86所述的組合物,其中該Toll-樣受體5促效劑是一種鞭毛蛋白。
88.如權(quán)利要求87所述的組合物,其中該鞭毛蛋白包括選自下組的至少一個成員,該組的組成為:鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白、大腸桿菌鞭毛蛋白、慕尼黑沙門氏菌鞭毛蛋白、耶爾森菌鞭毛蛋白、綠膿假單胞菌鞭毛蛋白、以及單核細胞增生李斯特菌鞭毛蛋白。
89.如權(quán)利要求87所述的組合物,其中該鞭毛蛋白缺少一個鉸鏈區(qū)的至少一個部分。
90.如權(quán)利要求7 8所述的組合物,其中該Toll-樣受體促效劑以及該抗原與該納米顆粒的締合是一種共價鍵。
91.如權(quán)利要求90所述的組合物,其中該共價鍵是一種非極性鍵。
92.如權(quán)利要求90所述的組合物,其中該共價鍵是一種極性鍵。
93.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該Toll-樣受體促效劑以及該抗原與該納米顆粒的締合是一種非共價鍵。
94.如權(quán)利要求93所述的組合物,其中該非共價鍵是選自下組的至少一個成員,該組的組成為:氫鍵、范德瓦耳斯相互作用、離子鍵、疏水性相互作用以及偶極-偶極相互作用。
95.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該納米顆粒具有一個足夠的大小從而允許該Toll-樣受體促效劑結(jié)合在一個細胞上的一種Toll-樣受體。
96.如權(quán)利要求95所述的組合物,其中該納米顆粒的大小允許進入到該細胞中。
97.如權(quán)利要求95所述的組合物,其中該顆粒的大小允許部分地進入到該細胞中。
98.如權(quán)利要求97所述的組合物,其中與該抗原相締合的該顆粒的一個部分保留在該細胞的一個細胞外表面上。
99.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該抗原是一種蛋白抗原。
100.如權(quán)利要求99所述的組合物,其中該蛋白抗原是選自下組的至少一個成員,該組的組成為:一種細菌蛋白抗原、一種病毒蛋白抗原、一種寄生物蛋白抗原、一種支原體蛋白抗原、一種腫瘤蛋白抗原、以及一種變態(tài)原蛋白抗原。
101.如權(quán)利要求100所述的組合物,其中該蛋白抗原是一種病毒蛋白抗原。
102.如權(quán)利要求101所述的組合物,其中該病毒蛋白抗原是選自下組的至少一個成員,該組的組成為:流感病毒蛋白抗原、呼吸道合胞病毒蛋白抗原、以及黃病毒蛋白抗原。
103.如權(quán)利要求102所述的組合物,其中該病毒蛋白抗原是流感病毒蛋白抗原。
104.如權(quán)利要求103所述的組合物,其中該流感抗原包含至少一種膜內(nèi)在蛋白抗原。
105.如權(quán)利要求104所述的組合物,其中該膜內(nèi)在蛋白抗原包括選自下組的至少一個成員的至少一個部分,該組的組成為:一種血細胞凝集素膜蛋白、一種神經(jīng)氨酸苷酶膜蛋白以及一種基質(zhì)2 ?吳蛋白。
106.如權(quán)利要求105所述的組合物,其中該膜內(nèi)在蛋白包括至少一種血細胞凝集素膜蛋白的至少一個部分。
107.如權(quán)利要求106所述的組合物,其中三種血細胞凝集素膜蛋白的至少一個部分與該顆粒相締合。
108.如權(quán)利要求105所述的組合物,其中該膜內(nèi)在蛋白包括至少一種基質(zhì)2膜蛋白的至少一個部分。
109.如權(quán)利要求108所述的組合物,其中該膜內(nèi)在蛋白包括至少四種基質(zhì)2膜蛋白。
110.如權(quán)利要求78所述的組合物,其中該納米顆粒是生物可降解的。
111.一種包含至少一種納米顆粒的組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體7促效劑、至少一種Toll樣受體5促效劑以及至少一種抗原,其中該Toll樣受體7促效劑以及該抗原包含在該納米顆粒中并且該Toll樣受體5促效劑與該納米顆粒的一個外表面相締合。
112.如權(quán)利要求111所述的組合物,進一步包括選自下組的至少一種另外的Tol-樣受體促效劑,該組的組成為:一種Toll-樣受體8促效劑以及一種Toll-樣受體9促效劑。
113.如權(quán)利要求111所述的組合物,其中該納米顆粒具有一種足夠的大小從而允許該Toll-樣受體促效劑結(jié)合在一個細胞上的一種Toll-樣受體。
114.如權(quán)利要求113所述的組合物,其中該納米顆粒的大小允許該納米顆粒進入到該細胞中。
115.如權(quán)利要求114所述的組合物,其中該細胞內(nèi)的一個pH相對于一個細胞外的pH的一個改變使至少一種另外的Toll-樣受體促效劑與該納米顆粒分離。
116.如權(quán)利要求111所述的組合物,其中由該Toll-樣受體7促效劑和該Toll-樣受體5促效劑的一個摩爾濃度的總和與一個抗原摩爾濃度所構(gòu)成的摩爾比是不大于約I。
117.—種包含至少一種顆粒的組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體5促效劑的至少一個部分、至少一種抗原的至少一個部分、以及選自下組的至少一種另外的Toll樣受體促效劑的至少一個部分,該組的組成為=Toll-樣受體7促效劑、Toll-樣受體8促效劑以及Toll-樣受體9促效劑,其中該另外的Toll-樣受體促效劑,以及可任選地,該抗原,包含在該顆粒中并且該Toll-樣受體5促效劑與該顆粒的一個外表面相締合。
118.如權(quán)利要求117所述的組合物,其中該顆粒是選自下組的至少一個成員,該組的組成為:一種納米顆粒、一種脂質(zhì)體、一種病毒顆粒、一種真菌顆粒、一種衍生的多糖以及一種衍生的蛋白。
119.一種制備一種納米顆粒組合物的方法,包括以下步驟: a)將至少一種Toll-樣受體促效劑的至少一個部分與至少一種納米顆粒的至少一個部分進行結(jié)合以在該Toll-樣受體促效劑與該納米顆粒之間形成一種締合;并且 b)將至少一種 抗原的至少一個部分與同該納米顆粒相締合的該Toll-樣受體促效劑相結(jié)合,其中該Toll-樣受體促效劑與該抗原的一個摩爾比是不大于約1,由此形成該納米顆粒組合物。
120.一種制備一種納米顆粒組合物的方法,包括以下步驟:a)將至少一種Toll-樣受體5促效劑的至少一個部分與一種納米顆粒進行締合; b)將選自下組的至少一種Toll-樣受體促效劑的至少一個部分包含到該納米顆粒中,該組的組成為:一種Toll-樣受體7促效劑、一種Toll-樣受體8促效劑以及一種Toll-樣受體9促效劑;并且 c)將含有該Toll-樣受體促效劑的該納米顆粒與至少一種抗原的至少一個部分進行結(jié)合,由此形成該納米顆粒組合物。
121.—種在一位受試者體內(nèi)刺激一種免疫應答的方法,包括以下步驟:向該受試者施用包含至少一種納米顆粒的一種組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體促效劑的至少一個部分以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該Toll樣受體促效劑以及該抗原與該納米顆粒相締合并且該Toll樣受體促效劑與該抗原的摩爾比是不大于約I。
122.—種在一位受試者體內(nèi)刺激一種免疫應答的方法,包括以下步驟:向該受試者施用包含至少一種納米顆粒的一種,該組合物包括至少一種Toll樣受體7促效劑的至少一個部分、至少一種Toll樣受體5促效劑的至少一個部分以及至少一種抗原的至少一個部分,其中該Toll樣受體7促效劑以及該抗原包含在該納米顆粒中并且該Toll樣受體5促效劑與該納米顆粒的一個外表面相締合。
123.如權(quán)利要求122所述的方法,其中該納米顆粒進一步包括選自下組的至少一種另外的Tol-樣受體促效劑的至少一個部分,該組的組成為=Toll-樣受體8促效劑以及一種Toll-樣受體9促效劑。
124.—種在一位受試者體內(nèi)刺激一種免疫應答的方法,包括以下步驟:向該受試者施用包含至少一種顆粒的 一種組合物,該組合物包括至少一種Toll樣受體5促效劑的至少一個部分、至少一種抗原的至少一個部分、以及選自下組的至少一種另外的Toll樣受體促效劑的至少一個部分,該組的組成為:一種Toll-樣受體7促效劑、一種Toll-樣受體8促效劑以及一種Toll-樣受體9促效劑,其中該另外的Toll-樣受體促效劑以及可任選地該抗原包含在該納米顆粒中并且該Toll-樣受體5促效劑與該納米顆粒的一個外表面相締合。
125.如權(quán)利要求124所述的方法,其中該抗原以及該Toll-樣受體5促效劑與該納米顆粒的一個外表面相締合。
【文檔編號】A61K39/02GK104080475SQ200980122596
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2009年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2008年4月18日
【發(fā)明者】朗秋·尚, 琳達·G·塔西, 亞倫·R·蕭, 羅伯特·S·貝克爾, 張毅, 史考特·W·烏勞夫, 大衛(wèi)·N·泰勒, 劉歌, 馬克·D·葉格爾, 湯瑪斯·J·普威爾 申請人:法克斯因內(nèi)特公司