本發(fā)明涉及一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑及其制備方法。屬獸藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，日益增長的精神需求引發(fā)了寵物熱。寵物不僅給人類平淡的生活帶來了諸多樂趣，也有不少人將寵物作為一種情感依托來排解孤獨與苦悶、疏解心理壓力。但是，寵物與外界環(huán)境的接觸不免感染某些寄生蟲，而人們在與寵物的共同生活中又難免與寵物近距離接觸，增加了人畜共患寄生蟲病的可能性。寄生蟲可傳播多種疾病，給寵物和人類的健康造成危害，嚴重時可致死亡。
吡蟲啉（imidacloprid）是由德國拜耳和日本農(nóng)藥公司于1984年共同開發(fā)推向市場的新煙堿類殺蟲劑，又稱新型硝基亞甲基類殺蟲劑，是該類殺蟲劑中殺蟲效果比較高的品種之一。吡蟲啉是硝基亞甲基雜環(huán)結(jié)構(gòu)和煙堿的組合，作用于煙堿型乙酰膽堿受體，破壞蟲體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導(dǎo)，導(dǎo)致蟲體的神經(jīng)被破壞，最終使之死亡；目前較多應(yīng)用于農(nóng)藥。吡蟲啉對寄生蟲也具有較強的神經(jīng)毒性；但由于其較為獨特的作用機制，吡蟲啉對多數(shù)哺乳動物則呈現(xiàn)較低的毒性，對人和寵物具有較高的安全性。
本發(fā)明復(fù)方吡蟲啉組合物處方中，包含了多拉菌素（doramectin）組方。多拉菌素為20世紀90年代研制開發(fā)的新一代大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥，是以環(huán)已烷羧酸為前體，通過基因重組的阿維鏈霉菌新菌株發(fā)酵而成的一種阿維菌素類抗生素。多拉菌素的驅(qū)蟲機制是通過加強γ-氨基丁酸的作用來實現(xiàn)，使得蟲體神經(jīng)難以將刺激傳遞給肌肉，使肌肉不能收縮，導(dǎo)致寄生蟲麻痹而被驅(qū)除。被認為是目前阿維菌素族中最優(yōu)秀的抗寄生蟲藥物之一，為內(nèi)外兼殺劑，對多種寄生蟲均有良好的驅(qū)殺效果。
專利cn103003758a公開了一種中西藥復(fù)方透皮溶液及制備方法，該透皮溶液組成成分和各組成成分的重量比為：多拉菌素0.1-5%，桉葉油10-50%，氮酮2-3%，穩(wěn)定劑0.1-2%，稀釋溶劑40-85%，可用于治療寵物皮癬。但其用藥需每天早晚各1次，依從性較差。
專利cn101401782a公開了一種多拉菌素澆潑劑及其制備方法，該澆潑劑由多拉菌素、丙二醇、無水乙醇、氮酮、吐溫-80和2,6-二叔丁基對甲酚組成，主要用于驅(qū)殺動物的體內(nèi)線蟲和體外寄生蟲。其抗寄生蟲機制單一，劑型也單一，應(yīng)用范圍較窄。
專利cn102552304a公開了一種治療寵物螨蟲感染的外用藥劑，該藥劑由多拉菌素0.005-0.01g，冰片1-5g，丙二醇20-50ml，無水乙醇40-70ml組成，主要用于對患有螨蟲感染的動物進行治療。但其用藥需每天1次，較為費時費力，且劑型單一。
專利cn104546885a公開了一種治療皮膚病的藥物組合物及其制備方法，該組合物為多拉菌素1份，特比萘芬1-2份。
本發(fā)明復(fù)方吡蟲啉組合物處方中，包含了擬除蟲菊酯類殺蟲劑組方。擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用機制在于擾亂目標蟲體神經(jīng)的正常生理，使之由興奮、痙攣到麻痹而死亡。擬除蟲菊酯對哺乳動物具有高效低毒、低殘留的特點。其中，氰戊菊酯，化學(xué)名稱α-氰基-3-苯氧基芐基(r,s)-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸酯，是目前我國應(yīng)用量最大的擬除蟲菊酯類殺蟲劑，其大鼠急性經(jīng)皮ld50>5000mg/kg；濃度較高時，擬除蟲菊酯對兔皮膚僅有輕微刺激，對眼僅有輕微刺激。因而，擬除蟲菊酯類殺蟲劑在低濃度應(yīng)用時，是一種較為優(yōu)良的、安全的動物抑虱防蚤驅(qū)蚊化合物，適用于寵物體。
專利cn1501773a公開了一種可應(yīng)用于皮膚的、用于抑制動物體上寄生蟲的液體制劑，其組成和組分重量百分比分別為：芐氯菊酯35-60%，吡蟲啉或吡蟲啉類似物2.5-12.5%，n-甲基吡咯烷酮27.5-62.5%，水0-5%，酚類抗氧化劑0-0.5%和有機酸0-0.5%，還含有助溶劑2.5-10%，用于抑制包括狗和貓在內(nèi)的溫血動物體上壁虱和/或跳蚤。但處方中的芐氯菊酯的含量很高，對眼睛的刺激作用較為明顯。
本發(fā)明將上述三種不同作用機制的優(yōu)秀抗寄生蟲防蚊驅(qū)蚤藥物組成復(fù)方，三者協(xié)同，使得本發(fā)明制劑具有更加廣譜的驅(qū)蟲殺蟲作用，同時對體內(nèi)、外寄生蟲具有更加有效的驅(qū)殺作用。
綜上所述，目前市場上，絕大部分寵物所用的抗寄生蟲藥為片劑和注射劑，寵物依從性均不佳；而外用制劑或劑型或應(yīng)用或抗寄生蟲機制較為單一，應(yīng)用受到局限，加之給藥次數(shù)較為頻繁，依從性不佳。
透皮制劑作為一種較為新型的給藥系統(tǒng)，可避免藥物的肝首過效應(yīng)，使有效成分具有較高的生物利用度；同時還能避免藥物與胃腸道的相互作用，避免藥物對寵物胃腸道的損傷；同時，其可在寵物體內(nèi)達到相對平穩(wěn)且可控的血藥濃度，有效地降低了藥物的毒副作用。同時作為一個溶液劑，在實際使用中，方便調(diào)整用量和給藥部位，可實現(xiàn)局部重點給藥。
目前，尚沒有一種同時包括吡蟲啉、多拉菌素和擬除蟲菊酯類化合物，且給藥方便、長時有效的寵物用廣譜抗寄生蟲透皮制劑。
至此，為了豐富寵物藥市場、為寵物的臨床用藥提供新的選擇，本發(fā)明開發(fā)并公開一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑及其制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑及其制備方法。
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑。
本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑的制備方法。
本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑在寵物抗寄生蟲中的應(yīng)用。
為解決上述第一個技術(shù)問題，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是。
本發(fā)明提供了一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑，其特征在于，包含吡蟲啉、多拉菌素、擬除蟲菊酯類化合物、溶劑、滲透促進劑、抗氧化劑和輔劑。
本發(fā)明提供了一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑，其特征在于，它是由下列組分組成，按重量份數(shù)計：吡蟲啉500,000-5,000,000份，多拉菌素1,000-500,000份，擬除蟲菊酯類化合物100-20,000份，溶劑2,000,000-8,000,000份，滲透促進劑100,000-2,000,000份，抗氧化劑1-10份，輔劑500,000-5,000,000份。
所述擬除蟲菊酯類化合物的質(zhì)量百分比不超過5%。
所述擬除蟲菊酯類化合物選自氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯中的一種或幾種組合。
所述溶劑選自苯甲醇、丙二醇、異丙醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯中的一種或幾種組合。
所述溶劑優(yōu)選為苯甲醇。
所述滲透促進劑選自氮酮（簡稱為：azone）、二甲基亞砜（簡稱為：dmso）、二甲基甲酰胺（簡稱為：dmf）、二甲基乙酰胺（簡稱為：dmac）、癸基甲基亞砜（簡稱為：dcms）、α-硝基萘（簡稱為：簡稱為α-np）、1-甲基-α-吡咯酮（簡稱為：1-nmp）、1,5-二甲基-α-吡咯酮（簡稱為：1,5-nmp）、1-乙基-α-吡咯酮（簡稱為：1-nep）、5-羧基-α-吡咯酮（簡稱為：5-ncp）、1-十二烷基-α-吡咯酮（簡稱為：1-ndop）中的一種或幾種組合。
所述抗氧化劑選自2,6-叔丁基對甲酚、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、叔丁基對苯二酚、沒食子酸丙酯中的一種或幾種組合。
所述輔劑選自乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇中的一種或幾種組合。
為解決上述第二個技術(shù)問題，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案是。
本發(fā)明提供了一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑的制備方法，具體包括如下步驟：取處方量的吡蟲啉用適量溶劑溶解，制成溶液a；取處方量的多拉菌素用適量溶劑溶解，制成溶液b；取處方量的氰戊菊酯用適量溶劑溶解，制成溶液c；將溶液a、溶液b和溶液c混合，補足處方量的溶劑，加入處方量的滲透促進劑和抗氧化劑，用輔劑定容；將得到的溶液用微孔濾膜過濾，澄明度合格后灌裝為一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑。
本發(fā)明體外透皮實驗應(yīng)用改進的franz擴散池進行豬皮透皮實驗。結(jié)果顯示，復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑（含吡蟲啉12.5%；多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為4473.32μg，多拉菌素為82.21μg，氰戊菊酯為10.33μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為29.82μg/(cm2h)，多拉菌素為0.548μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.768μg/(cm2h)。上述體外實驗結(jié)果說明，應(yīng)用本發(fā)明所制備的一種復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑具有良好的透皮吸收作用。吡蟲啉動物組織的有效抗蟲濃度為2.5μg/kg，8kg體重動物平均組織共計需給藥20μg，給藥1ml（12.5mg），涂布1cm2，每小時透過的吡蟲啉將超過20μg；而吡蟲啉在犬、貓、鼠、兔、豬等動物體內(nèi)的消除半衰期長于8.7d（8.7-30.6d）；因而藥物進入體內(nèi)的消除量相對透皮吸收可忽略不計，吡蟲啉1h透過量即可達到抗蟲的有效劑量。另外，按以上標準給藥，藥物完全透過皮膚需要超過20d，該制劑也具有較好的緩釋效果。多拉菌素動物組織的有效抗蟲濃度為1μg/kg，8kg體重動物平均組織共計需給藥8μg；給藥1ml（0.25mg），涂布15cm2，每小時透過的多拉菌素將超過8μg，而多拉菌素在犬、貓、鼠、兔、豬等動物體內(nèi)的消除半衰期長于3.3d（3.3-14.4d），因而藥物進入體內(nèi)的消除量相對透皮吸收可忽略不計，多拉菌素1h透過量即可達到抗蟲的有效劑量。氰戊菊酯動物組織的有效作用濃度為9ng/kg，8kg體重動物平均組織共計需給藥72ng；給藥1ml（50μg），涂布15cm2，每小時透過的氰戊菊酯將超過8μg，可達到抗蟲的有效劑量。綜上所述，該制劑皮膚給藥可達到有效驅(qū)蟲的血藥濃度，可作為動物驅(qū)蟲的透皮組合物制劑用于寵物抗寄生蟲的治療與預(yù)防。
體外透皮對比實驗顯示，溶劑為苯甲醇時，所制備的一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物具有更顯著的透皮吸收。結(jié)果顯示，復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑（含吡蟲啉12.5%；多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%；溶劑為苯甲醇，輔劑為乙醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為4473.32μg，多拉菌素為82.21μg，氰戊菊酯為10.33μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為29.82μg/(cm2h)，多拉菌素為0.548μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.768μg/(cm2h)。而復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑對比制劑1（含吡蟲啉12.5%；多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%；溶劑為丙二醇，輔劑為乙醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為2332.13μg，多拉菌素為37.86μg，氰戊菊酯為4.38μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為15.55μg/(cm2h)，多拉菌素為0.252μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.326μg/(cm2h)。復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑對比制劑2（含吡蟲啉12.5%；多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%；溶劑為異丙醇，輔劑為乙醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為2018.45μg，多拉菌素為27.73μg，氰戊菊酯為3.37μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為13.46μg/(cm2h)，多拉菌素為0.186μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.251μg/(cm2h)。復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑對比制劑3（含吡蟲啉12.5%；多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%；溶劑為正丁醇，輔劑為乙醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為3301.45μg，多拉菌素為36.64μg，氰戊菊酯為6.01μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為22.01μg/(cm2h)，多拉菌素為0.244μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.447μg/(cm2h)。
可見，溶劑選用苯甲醇時，制備的復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑具有更好的透皮吸收。
為解決上述第三個技術(shù)問題，本發(fā)明對所述的一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑進行了犬的抗寄生蟲實驗。實驗選用30只感染蠕蟲的beagle犬，飼養(yǎng)于蚊蟲跳蚤滋養(yǎng)的環(huán)境中，隨機分為5組，第1、2、3、4組分別按體重用0.1、0.2、0.5、1ml/kg劑量的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）進行耳根部皮膚涂擦給藥，第5組為生理鹽水涂擦對照組。實驗結(jié)果表明，用藥后3d，第1組和第2組中大部分感染蠕蟲的beagle犬的寄生蟲癥狀減輕，痂皮部分脫落；beagle犬同時出現(xiàn)被蚊蟲跳蚤叮咬的現(xiàn)象，毛發(fā)中可見跳蚤活動；其中第2組情況略好于第1組；第3組和第4組的癥狀基本消失，寄生蟲所引起的皮膚炎癥減輕，痂皮幾乎全部脫落，毛發(fā)中鮮見跳蚤活動，且鮮見動物體及周圍蚊蟲活動，動物情緒穩(wěn)定，不再蹭欄。用藥后7天，第1組仍有部分beagle犬有瘙癢癥狀，毛發(fā)中仍見跳蚤活動，鏡檢仍有少量活蠕蟲和蟲卵存在；第2組beagle犬的蹭欄現(xiàn)象基本消失，毛發(fā)中鮮見跳蚤活動，鏡檢不見活蠕蟲但有蟲卵存在；第3組和第4組癥狀完全消失，皮膚恢復(fù)光澤和彈性，毛發(fā)中鮮見跳蚤活動，鏡檢未檢出蠕蟲和蟲卵；而第5組，生理鹽水對照組中的beagle犬的癥狀并未改善，且有加重趨勢。該復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑各劑量的治愈率分別為50%、83%、100%、100%，因此，該透皮組合制劑涂擦給藥時，對beagle犬的有效質(zhì)量劑量為0.5ml/kg體重。
為解決上述第三個技術(shù)問題，本發(fā)明還對所述的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑進行了倉鼠的抗寄生蟲實驗。實驗選用40只感染蠕蟲的金黃倉鼠，飼養(yǎng)于蚊蟲跳蚤滋生的環(huán)境中，隨機分為4組，第1、2、3組分別按體重用2、5、10ml/kg劑量的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）進行全身澆潑給藥，第4組為生理鹽水澆潑給藥對照組。實驗結(jié)果表明，用藥后2d，第1組中大部分感染蠕蟲的倉鼠的寄生蟲癥狀減輕，毛發(fā)中仍有明顯的跳蚤活動，周邊蚊蟲飛舞，痂皮部分脫落，但有輕微打斗行為；第2組和第3組的癥狀基本消失，痂皮幾乎全部脫落，毛發(fā)中鮮見跳蚤，動物體及周圍鮮見蚊蟲活動，且動物情緒穩(wěn)定。用藥后5天，第1組仍有部分倉鼠癥狀未完全消失，鏡檢仍有少量活蠕蟲和蟲卵存在；第2組和第3組癥狀完全消失，皮膚恢復(fù)光澤和彈性，鏡檢未檢出蠕蟲和蟲卵；同時，第4組，生理鹽水對照組中的倉鼠的癥狀并未改善，且有加重趨勢。該復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑各劑量的治愈率分別為70%、100%、100%，因此，該透皮組合制劑澆潑給藥時，對金黃倉鼠的有效質(zhì)量劑量為5ml/kg體重。
本發(fā)明制備的復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）是可經(jīng)過皮膚吸收進入動物體內(nèi)達到驅(qū)殺動物體內(nèi)外寄生蟲的效果，藥物經(jīng)皮膚吸收入血的過程可持續(xù)較長時間，而不經(jīng)過肝臟“首過效應(yīng)”和胃腸道的破壞，提高了藥物的生物利用度，同時降低了藥物口服給藥的副作用，并可有效地延長藥物的吸收過程和作用時間，減少給藥頻率。
本發(fā)明制備的復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%），與藥物組合物中單一成分應(yīng)用時相較，可顯著提高藥物的利用度；也可顯著降低藥物組合物中單一成分應(yīng)用時的毒副作用。本發(fā)明所制備的藥物組合物制劑可克服吡蟲啉單獨應(yīng)用時動物給藥部位（如beagle犬的耳根處）反應(yīng)靈敏度的降低（麻木），可克服多拉菌素單獨應(yīng)用時透皮吸收效果的不理想，還可克服氰戊菊酯單獨應(yīng)用時由于劑量較高而引起的明顯的眼部刺激作用。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于。
1.在獸藥領(lǐng)域，首次提供了一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑。
2.在獸藥領(lǐng)域，首次提供了一種寵物用廣譜抗寄生蟲的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑的制備方法。
3.本發(fā)明首次將吡蟲啉、多拉菌素和擬除蟲菊酯類化合物組成復(fù)方，其抗寄生蟲防蚊驅(qū)蚤機制不同，可實現(xiàn)一次給藥多重防治的抗寄生蟲防蚊驅(qū)蚤作用。
4.本發(fā)明首次將吡蟲啉、多拉菌素和擬除蟲菊酯類化合物組成復(fù)方，可顯著降低各組合物中單組分應(yīng)用的毒副作用。
5.目前諸多抗寄生蟲溶液劑只考慮到藥物的噴灑，而忽略了可采用一定的制劑手段使藥物達到透皮吸收的目的，從而獲得更深入的抗寄生蟲效果。本發(fā)明通過對動物的局部給藥，通過皮膚滲透吸收，對寄生蟲有良好的治療效果。
6.本發(fā)明通過選用適宜、適量的溶劑，解決了吡蟲啉在溶液劑中溶解度較低的問題。
7.本發(fā)明通過選用適宜的輔劑，與溶劑共同克服了吡蟲啉在溶液劑中溶解度較低的問題。
8.本發(fā)明通過加入適宜、適量的滲透促進劑，解決了吡蟲啉、多拉菌素和擬除蟲菊酯類化合物由于分子量大和熔點高而帶來的透皮滲透性較低的問題，透皮實驗結(jié)果顯示該透皮組合制劑具有良好的透皮吸收性。
9.本發(fā)明通過制備為不同劑型，不拘泥于單一給藥方式，可采用涂、擦、噴、滴、澆潑等多種給藥形式。
具體實施方式
實施例1-12。
表1.實施例1-12處方。
制備方法包括以下步驟：取處方量的吡蟲啉用適量的溶劑溶解，制成溶液a；取處方量的多拉菌素用適量的溶劑溶解，制成溶液b；取處方量的氰戊菊酯用適量的溶劑溶解，制成溶液c；將溶液a、溶液b和溶液c混合，補足處方量的溶劑，加入處方量的滲透促進劑和抗氧化劑，用輔劑定容；將得到的溶液用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，澄明度合格后灌裝。
實驗例1。
實施例1的復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）的體外透皮實驗。
1.實驗方法。
1.1.試藥與儀器。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑，為實施例1制備所得，含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%。
franz擴散池（四川大學(xué)）、bp211d電子天平（sartorius公司，德國）、ja3003電子天平（上海分析儀器廠）、df-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、hl-2型恒流蠕動泵（上海青浦滬西儀器廠）、qzx-c型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠）。
1.2.體外透皮實驗方法。
1.2.1.離體皮膚的制備：取實驗用乳豬（1月齡）脖背處取一定大小的皮膚一塊（2.5cm×2.5cm），去除毛和皮下脂肪，用生理鹽水清洗三次后即使用。
1.2.2.體外透皮實驗：將離體皮膚固定與擴散室和接收室之間，角質(zhì)層朝向擴散室，接收室及其系統(tǒng)內(nèi)加入25ml接收液（含0.1%雙乙酸鈉的0.01mpbs溶液，ph6.5），開啟恒流泵驅(qū)除氣泡，使接收液與皮膚充分接觸。系統(tǒng)溫度為37±1℃，恒流泵流速為2ml/min，接收室置于磁力攪拌器，磁力攪拌器轉(zhuǎn)速為150rpm。待系統(tǒng)穩(wěn)定0.5h后，擴散室內(nèi)加入復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑5ml，實驗開始后，于0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、16、20、24h從接收液中取樣0.5ml，再補入等量新鮮接收液。
1.3.藥物測定方法。
1.3.1.吡蟲啉的含量測定。
色譜條件：hpzorbaxxdbc18色譜柱（5μm，4.6mm×150mm），流動相為0.2%（v/v）乙酸水溶液-乙腈（80:20，v/v），柱溫25℃，流速2ml/min，進樣量5μl。紫外檢測器波長設(shè)定為270nm。
標準溶液的制備：精密稱取吡蟲啉標準品10mg溶于100ml容量瓶，用乙腈定容，作為儲備液（100μg/ml），密封保存于4℃。將儲備液用乙腈稀釋為系列濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg/ml的標準溶液。
標準曲線的建立：取上述標準溶液5μl進樣，記錄峰面積。以吡蟲啉濃度為x，吡蟲啉峰面積為y，繪制標準曲線；得到的線性回歸方程為：y=400.34x+10.334,r2=0.9997。線性范圍為0.1-10μg/ml。線性結(jié)果良好，符合含量測定要求。
1.3.2.多拉菌素的含量測定。
色譜條件：hpzorbaxxdbc18色譜柱（5μm，4.6mm×150mm），流動相為乙腈-甲醇-水（45:45:20，v/v/v），柱溫25℃，流速2ml/min，進樣量5μl。紫外檢測器波長設(shè)定為246nm。
標準溶液的制備：精密稱取多拉菌素標準品10mg溶于100ml容量瓶，用甲醇定容，作為儲備液（100μg/ml），密封保存于4℃。將儲備液用甲醇稀釋為系列濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg/ml的標準溶液。
標準曲線的建立：取上述標準溶液5μl進樣，記錄峰面積。以多拉菌素濃度為x，多拉菌素峰面積為y，繪制標準曲線；得到的線性回歸方程為：y=995.36x+33.479,r2=0.9996。線性范圍為0.05-5μg/ml。線性結(jié)果良好，符合含量測定要求。
1.3.3.氰戊菊酯的含量測定。
色譜條件：hpzorbaxxdbc18色譜柱（5μm，4.6mm×150mm），流動相為甲醇-水（80:20，v/v），柱溫25℃，流速2ml/min，進樣量5μl。紫外檢測器波長設(shè)定為220nm。
標準溶液的制備：精密稱取氰戊菊酯標準品1mg溶于100ml容量瓶，用甲醇定容，作為儲備液（10μg/ml），密封保存于4℃。將儲備液用甲醇稀釋為系列濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2μg/ml的標準溶液。
標準曲線的建立：取上述標準溶液5μl進樣，記錄峰面積。以氰戊菊酯濃度為x，氰戊菊酯峰面積為y，繪制標準曲線；得到的線性回歸方程為：y=367.08x+66.883,r2=0.9997。線性范圍為0.02-2μg/ml。線性結(jié)果良好，符合含量測定要求。
.4.數(shù)據(jù)處理。
由于每次取樣后都要補液，對藥物的通透產(chǎn)生了稀釋作用，因而藥物的積累通透量trcum（μg/ml）可由以下公式校正。
其中an為第n個樣品通透量的測定值；vsn為第n個樣品的采樣體積；vr為接收池的體積。
透皮速率可由以下公式計算。
k=trcum/tn
其中trcum（μg/ml）為第n次取樣的積累通透量，tn（h）為第n次取樣時間。
2.結(jié)果與討論。
結(jié)果顯示，所采用的復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%）24h單位滲透量為吡蟲啉為4473.32μg，多拉菌素為82.21μg，氰戊菊酯為10.33μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為29.82μg/(cm2h)，多拉菌素為0.548μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.768μg/(cm2h)，說明該透皮組合制劑具有良好的透皮吸收作用。吡蟲啉動物組織的有效抗蟲濃度為2.5μg/kg，8kg體重動物平均組織共計需給藥20μg，給藥1ml（12.5mg），涂布1cm2，每小時透過的吡蟲啉將超過20μg；而吡蟲啉在犬、貓、鼠、兔、豬等動物體內(nèi)的消除半衰期長于8.7d（8.7-30.6d）；因而藥物進入體內(nèi)的消除量相對透皮吸收可忽略不計，多拉菌素1h透過量即可達到抗蟲的有效劑量。另外，按以上標準給藥，藥物完全透過皮膚需要超過20d，該制劑也具有較好的緩釋效果。多拉菌素動物組織的有效抗蟲濃度為1μg/kg，8kg體重動物平均組織共計需給藥8μg；給藥1ml（0.25mg），涂布15cm2，每小時透過的多拉菌素將超過8μg，而多拉菌素在犬、貓、鼠、兔、豬等動物體內(nèi)的消除半衰期長于3.3d（3.3-14.4d），因而藥物進入體內(nèi)的消除量相對透皮吸收可忽略不計，多拉菌素1h透過量即可達到抗蟲的有效劑量。氰戊菊酯動物組織的有效作用濃度為9ng/kg，8kg體重動物平均組織共計需給藥72ng；給藥1ml（50μg），涂布15cm2，每小時透過的氰戊菊酯將超過8μg，可達到抗蟲的有效劑量。綜上所述，該制劑皮膚給藥可達到有效驅(qū)蟲的血藥濃度，可作為動物驅(qū)蟲的透皮組合物制劑用于寵物抗寄生蟲的治療與預(yù)防。
實驗例2。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑的透皮優(yōu)越性比較。
1.實驗方法。
1.1.試藥與儀器。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑1，為實施例1制備所得，含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%；溶劑為苯甲醇，輔劑為乙醇。復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑對比制劑1、對比制劑2和對比制劑3，分別為對比例1、對比例2和對比例3制備所得，溶劑分別為丙二醇、異丙醇和正丁醇，輔劑為乙醇。
儀器同實施例13中1.1項。
1.2.體外透皮實驗方法。
同實施例13中1.2項。
1.3.藥物測定方法。
同實施例13中1.3項。
1.4.數(shù)據(jù)處理。
同實施例13中1.4項。
2.結(jié)果與討論。
結(jié)果顯示，復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑（溶劑為苯甲醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為4473.32μg，多拉菌素為82.21μg，氰戊菊酯為10.33μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為29.82μg/(cm2h)，多拉菌素為0.548μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.768μg/(cm2h)。而復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑對比制劑1（溶劑為丙二醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為2332.13μg，多拉菌素為37.86μg，氰戊菊酯為4.38μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為15.55μg/(cm2h)，多拉菌素為0.252μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.326μg/(cm2h)。復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑對比制劑2（溶劑為異丙醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為2018.45μg，多拉菌素為27.73μg，氰戊菊酯為3.37μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為13.46μg/(cm2h)，多拉菌素為0.186μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.251μg/(cm2h)。復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑對比制劑3（溶劑為正丁醇）24h單位累計滲透量，吡蟲啉為3301.45μg，多拉菌素為36.64μg，氰戊菊酯為6.01μg；pbs接受液中的單位滲透速率常數(shù)（k），吡蟲啉為22.01μg/(cm2h)，多拉菌素為0.244μg/(cm2h)，氰戊菊酯為0.447μg/(cm2h)。綜上所述，溶劑選用苯甲醇時，制備的復(fù)方吡蟲啉透皮澆潑劑具有更好的透皮吸收。
實驗例3。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）的犬抗寄生蟲實驗。
1.實驗方法。
1.1.藥物。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑，為實施例1制備所得，含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%。
1.2.實驗動物。
選用30只感染蠕蟲的beagle犬，雌雄各半，約1年齡，體重7-9kg，臨床表現(xiàn)為瘙癢，飼養(yǎng)于跳蚤蚊蟲滋生的環(huán)境中。感染蠕蟲的beagle在飼養(yǎng)環(huán)境中在可接觸的各種物體（如鐵籠、飼槽、水壺固定裝置等）及地面上不斷蹭癢，用力摩擦。在感染蠕蟲的beagle犬的頭部、面頰、耳部、頸部、肩背部、腹部、軀干兩側(cè)劑四肢出現(xiàn)皮膚炎癥，表現(xiàn)為被毛脫落、皮屑、皮膚潮紅，甚至有炎性液體浸出、出血、節(jié)結(jié)痂；皮質(zhì)增厚、粗糙變硬，甚至皸裂。鏡檢可見或蠕蟲及蟲卵。動物毛發(fā)中可見跳蚤活動，動物體蚊蟲圍繞。
1.3.感染蠕蟲beagle犬的分組與治療。
1.3.1.實驗分組及給藥：實驗選用30只自然感染蠕蟲的beagle犬，雌雄各半隨機分為5組，第1、2、3、4組分別按體重用0.1、0.2、0.5、1ml/kg劑量的復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑（含吡蟲啉12.5%；多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）進行耳根部皮膚涂擦給藥，第5組為生理鹽水涂擦對照組。給藥時，用10ml注射器吸取藥液，制劑涂擦于beagle犬右耳耳根皮膚處，以藥液不流失為準。分組情況參見表1。
表2.實驗感染蠕蟲beagle犬分組劑給藥。
1.3.2.癥狀觀察與判斷：每天觀察感染蠕蟲的beagle犬的臨床表現(xiàn)，查看瘙癢癥狀和皮膚病變是否好轉(zhuǎn)和恢復(fù)；查看動物毛發(fā)中跳蚤的活動情況及蚊蟲。7d后，刮取病變部位與健康皮膚交界處的皮膚組織，置培養(yǎng)皿內(nèi)，采用加濕法檢查蠕蟲及蟲卵情況。
2.結(jié)果與討論。
每天定時觀察和記錄實驗beagle犬的相關(guān)臨床癥狀。用藥后3d，第1組和第2組中大部分感染蠕蟲的beagle犬的癥狀減輕，痂皮部分脫落，beagle犬同時出現(xiàn)被蚊蟲跳蚤叮咬的現(xiàn)象，毛發(fā)中可見跳蚤活動；其中第2組情況略好于第1組；第3組和第4組的癥狀基本消失，寄生蟲所引起的皮膚炎癥減輕，痂皮幾乎全部脫落，毛發(fā)中鮮見跳蚤活動，且鮮見動物體及周圍蚊蟲活動，動物情緒穩(wěn)定，不再蹭欄。用藥后7天，第1組仍有部分beagle犬有瘙癢癥狀，毛發(fā)中仍見跳蚤活動，鏡檢仍有少量活蠕蟲和蟲卵存在；第2組beagle犬的蹭欄現(xiàn)象消失，毛發(fā)中鮮見跳蚤活動，鏡檢不見活蠕蟲但有蟲卵存在；第3組和第4組癥狀完全消失，皮膚恢復(fù)光澤和彈性，毛發(fā)中鮮見跳蚤活動，鏡檢未檢出蠕蟲和蟲卵；而第5組，生理鹽水對照組中的beagle犬的癥狀并未改善，且有加重趨勢。具體實驗結(jié)果參見表2。
3.復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑對beagle犬蠕蟲的臨床療效。
由表2可知，該復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑各劑量的治愈率分別為50%、83%、100%、100%，因此，該透皮組合制劑對beagle犬的有效質(zhì)量劑量為0.5ml/kg體重。
3.小結(jié)。
在實驗過程中，給藥各組未見明顯的藥物不良反應(yīng)，飲食正常、排泄正常。從治愈率來看，給藥劑量0.5ml/kg和1ml/kg組的治愈率均為100%，0.1ml/kg和0.2ml/kg劑量組中，個別beagle犬的驅(qū)蟲效果不理想，原因可能在于劑量不足。
實驗例4。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）的鼠抗寄生蟲實驗。
1.實驗方法。
1.1.藥物。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑，為實施例1制備所得，含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%。
1.2.實驗動物。
選用40只感染蠕蟲的金黃倉鼠，雌雄各半，5-12月齡，體重220-300g，臨床表現(xiàn)為瘙癢，飼養(yǎng)于跳蚤蚊蟲滋生的環(huán)境中。感染蠕蟲的倉鼠性情較為暴躁，在飼養(yǎng)環(huán)境中不斷翻滾、用力摩擦。在感染蠕蟲的倉鼠的頭部、面頰、耳部、頸部、肩背部、腹部、軀干兩側(cè)劑四肢出現(xiàn)皮膚炎癥，表現(xiàn)為被毛脫落、皮屑、皮膚潮紅，甚至有炎性液體浸出、出血、節(jié)結(jié)痂；皮質(zhì)增厚、粗糙變硬，甚至皸裂。鏡檢可見或蠕蟲及蟲卵。動物毛發(fā)中可見跳蚤活動，動物體蚊蟲圍繞。
1.3.感染蠕蟲倉鼠的分組與治療。
1.3.1.實驗分組及給藥：實驗選用40只自然感染蠕蟲的倉鼠，雌雄各半隨機分為4組，第1、2、3組分別按體重用2、5、10ml/kg劑量的復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）進行全身澆潑給藥，第4組為生理鹽水澆潑對照組。給藥時，用5ml注射器吸取藥液，倉鼠置于瓷質(zhì)托盤上，制劑全身澆潑于倉鼠身體。分組情況參見表3。
表4.實驗感染蠕蟲金黃倉鼠分組劑給藥。
1.3.2.癥狀觀察與判斷：每天觀察感染蠕蟲的倉鼠的臨床表現(xiàn)，查看瘙癢癥狀和皮膚病變是否好轉(zhuǎn)和恢復(fù)；查看動物毛發(fā)中跳蚤的活動情況及蚊蟲。。5d后，刮取病變部位與健康皮膚交界處的皮膚組織，置培養(yǎng)皿內(nèi)，采用加濕法檢查蠕蟲及蟲卵情況。
2.結(jié)果與討論。
每天定時觀察和記錄實驗倉鼠的相關(guān)臨床癥狀。用藥后2d，第1組中大部分感染蠕蟲的倉鼠的癥狀減輕，毛發(fā)中仍明顯的跳蚤活動，周邊蚊蟲飛舞，痂皮部分脫落，但有輕微打斗行為；第2組和第3組的癥狀基本消失，痂皮幾乎全部脫落，毛發(fā)中鮮見跳蚤，動物體及周圍鮮見蚊蟲活動，且動物情緒穩(wěn)定。用藥后5天，第1組仍有部分倉鼠癥狀未完全消失，鏡檢仍有少量活蠕蟲和蟲卵存在；第2組和第3組癥狀完全消失，皮膚恢復(fù)光澤和彈性，鏡檢未檢出蠕蟲和蟲卵；同時，第5組，生理鹽水對照組中的倉鼠的癥狀并未改善，且有加重趨勢。具體實驗結(jié)果參見表4。
表5.復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑對金黃倉鼠蠕蟲的臨床療效。
由表4可知，該復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑各劑量的治愈率分別為70%、100%、100%，因此，該透皮組合制劑對倉鼠的有效質(zhì)量劑量為5ml/kg體重。
3.小結(jié)。
在實驗過程中，給藥各組未見明顯的藥物不良反應(yīng)，飲食正常、排泄正常。從治愈率來看，給藥劑量5ml/kg和10ml/kg組的治愈率均為100%，2ml/kg劑量組對個別倉鼠的驅(qū)蟲效果不理想，原因可能在于劑量不足。
實驗例5。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合物制劑（含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%）的beagle犬給藥部位靈敏度實驗。
1.實驗方法。
1.1.藥物。
復(fù)方吡蟲啉透皮組合制劑，為實施例1制備所得，含吡蟲啉12.5%，多拉菌素0.25%，氰戊菊酯0.005%。吡蟲啉單方溶液，不含多拉菌素和氰戊菊酯，其余均同實施例1所制得，含吡蟲啉12.5%。
1.2.實驗方法。
選用18只健康beagle犬，雌雄各半，約1年齡，體重8-9kg，隨機分為兩組。（a）組于耳根處按0.5ml/kg涂布生理鹽水，（b）組于耳根處按0.5ml/kg涂布復(fù)方吡蟲啉組合物制劑，（c）組于耳根處按0.5ml/kg涂布吡蟲啉單方溶液；待溶液充分接觸耳根皮膚2-3min后，用小棍刺激beagle犬耳根部皮膚，觀察動物反應(yīng)。
2.實驗結(jié)果。
（a）組beagle犬耳根部受到小棍刺激后有較強的反應(yīng)，表現(xiàn)為甩耳、頭部的快速回轉(zhuǎn)、張嘴犬吠并示威；（b）組beagle犬受到刺激后，皆表現(xiàn)出甩耳和回頭，犬吠聲勢略弱；而（c）組beagle犬受到刺激后，幾乎沒有反應(yīng)，偶有回頭。
3.小結(jié)。
本部分實驗結(jié)果表明，將吡蟲啉與多拉菌素和氰戊菊酯組成藥物組合物后，可克服吡蟲啉單獨應(yīng)用時所引起的給藥部位反應(yīng)遲鈍（麻木）的副作用。
本發(fā)明的上述實施例僅是為了較為清楚地說明本發(fā)明而作的舉例，并非是對本發(fā)明實施方式的限定。對于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在上述說明和舉例的基礎(chǔ)上還可以做出其他各種形式的調(diào)整和變動。本說明書無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的調(diào)整和變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。