一種藥物組合物及其制備方法、應(yīng)用與流程

本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種藥物組合物及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚老化是機(jī)體衰老的外在表現(xiàn)，是一個(gè)復(fù)雜的、多因素綜合作用的過(guò)程，可導(dǎo)致皮膚組織學(xué)和功能性損傷。皮膚衰老通常分為內(nèi)源性衰老和外源性老化，前者即自然衰老，是由遺傳因素等引起的不可逆過(guò)程，后者是指由于環(huán)境因素如紫外線輻射、吸煙、風(fēng)吹日曬或接觸有毒有害化學(xué)物質(zhì)等引起的皮膚老化。

皮膚光老化的主要臨床表現(xiàn)為皮膚松弛、結(jié)節(jié)、皮革樣外觀、明顯干燥和脫屑，光老化部位皮膚呈黃色或灰黃色、較粗糙、用力伸展時(shí)皺紋不會(huì)消失，久之則出現(xiàn)色素斑點(diǎn)或類似老年斑等色素沉著異常，甚至表現(xiàn)為深淺不均的色素失調(diào)現(xiàn)象。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種藥物組合物及其制備方法、應(yīng)用，其旨在減緩或者改善皮膚光老化的問(wèn)題。

本發(fā)明提供一種技術(shù)方案：

一種藥物組合物，該藥物組合物的原料包括按重量份數(shù)計(jì)的以下組分：

玫瑰5-15份、甘草30-100份、珍珠露水草1-5份、廣藿香10-40份。

進(jìn)一步地，上述玫瑰8-10份、甘草60-65份、珍珠露水草2-3份、廣藿香24-28份。

上述的藥物組合物的制備方法，其包括：將粉碎的藥物組合物的原料進(jìn)行萃??；萃取為co2超臨界萃取、微波輔助萃取或者超聲波輔助提取中的一種。

進(jìn)一步地，上述原料采用co2超臨界萃取，包括：

將裝有粉碎的原料的萃取釜在co2超臨界流體內(nèi)浸泡，控制萃取釜中壓力為24-30mpa；然后將浸泡后的物質(zhì)分離釜中進(jìn)行分離，控制分離釜中壓力為5-7.5mpa，加溫至35-42℃，分離時(shí)間為1-5小時(shí)；去除co2得到有效成分。

進(jìn)一步地，上述原料采用微波輔助萃取，包括：

將混合有原料與乙醇的混合物置于微波萃取儀中，萃取2-4次，每次萃取時(shí)間為20-30s，向萃取液中加入硫酸鈉或硫酸鎂，去除有機(jī)溶劑，得到有效成分。

進(jìn)一步地，上述乙醇與原料的比例為3-5ml/g。

進(jìn)一步地，上述原料采用超聲波輔助提取，包括：

將混合有原料與乙醚的混合物進(jìn)行超聲提取20-40min，超聲的頻率為80-120hz，提取2-4次，回收提取液中的乙醚，得到有效成分。

進(jìn)一步地，上述乙醚與原料的比例為8-12ml/g。

進(jìn)一步地，上述制備方法還包括混合中鏈脂肪酸甘油酯nct、辛普高效增溶劑sf-410以及有效成分。

進(jìn)一步地，上述藥物組合物在制備抗皮膚衰老藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明實(shí)施例提供的一種藥物組合物及其制備方法、應(yīng)用的有益效果是：

本發(fā)明提供的乳液、藥物組合物能顯著改善紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚宏觀損傷和組織病理學(xué)病變，并能顯著提高皮膚組織中抗氧化酶的活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物mda的含量，抑制炎癥因子的過(guò)度表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，維持彈性纖維、膠原纖維結(jié)構(gòu)的完整性，從而保護(hù)皮膚免受紫外線輻射的損害。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1示出了對(duì)小鼠宏觀觀察統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)；

圖2示出了實(shí)驗(yàn)期間各組皮膚厚度(n＝9)；

圖3示出了小鼠皮膚膠原纖維光密度值和膠原含量；

圖4示出了小鼠皮膚組織中cat(a)、gsh-px(b)和sod(c)活力以及mda(d)含量的測(cè)定結(jié)果；

圖5示出了小鼠皮膚組織中炎性因子il-1β(a)、il-6(b)、tnf-a(c)、cox-2(d)以及pge2(e)含量的測(cè)定結(jié)果；

圖6示出了小鼠皮膚組織中mmp-1(a)及mmp-3(b)含量的測(cè)定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的一種藥物組合物及其制備方法、應(yīng)用進(jìn)行具體說(shuō)明。

一種藥物組合物，該藥物組合物的原料包括按重量份數(shù)計(jì)的以下組分：

玫瑰5-15份、甘草30-100份、珍珠露水草1-5份、廣藿香10-40份。

本發(fā)明的原料中，玫瑰為薔薇科的灌木玫瑰的花；甘草為豆科植物甘草的根和根狀莖；珍珠露水草為鴨跖草科植物蛛絲毛藍(lán)耳草的根；廣藿香為唇形科植物廣藿香的干燥地上部分。

玫瑰具有理氣解郁、活血散淤的功效，能夠溫養(yǎng)人的心肝血脈，舒發(fā)體內(nèi)郁氣，從而達(dá)到去除黑斑，防皺紋的目的。

廣藿香的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、黃酮和生物堿三大類。其中,揮發(fā)油是其主要的活性成分，主要成分為廣藿香醇、廣藿香酮以及廣藿香烯。廣藿香及其揮發(fā)油具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗過(guò)敏、抗菌、止嘔、胃腸道調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)等藥效。

從甘草中提取的甘草次酸對(duì)氧自由基具有清除作用。

從珍珠露水草中提取的蛻皮激素具有很強(qiáng)的滲透性，在液態(tài)狀態(tài)下能快速被皮膚吸收，增強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝及活化，具有良好的去角質(zhì)、去斑增白以及修復(fù)面部黃褐斑、外傷性黑斑、雀斑、黑色素沉著等作用，還能有效促進(jìn)膠原蛋白的合成。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用按重量份數(shù)計(jì)的5-15份的玫瑰、30-100份的甘草、1-5份的珍珠露水草以及10-40份的廣藿香可以有效預(yù)防皮膚衰老，可以治療或者預(yù)防皮膚松弛、結(jié)節(jié)，老化部位呈黃色或灰黃色、較粗糙、用力伸展時(shí)皺紋不會(huì)消失，產(chǎn)生各種斑點(diǎn)等問(wèn)題。

進(jìn)一步地，上述的原料包括按重量份數(shù)計(jì)的：玫瑰8-10份、甘草60-65份、珍珠露水草2-3份以及廣藿香24-28份。具體地，在本實(shí)施例中，玫瑰9.5份、甘草62份、珍珠露水草2.5份、廣藿香26份。

本發(fā)明還提供一種上述的藥物組合物的制備方法，其包括：將粉碎的藥物組合物的原料進(jìn)行提?。辉撎崛》椒檩腿閏o2超臨界萃取、微波輔助萃取以及超聲波輔助提取中的一種。

具體地，將上述的藥物粉碎，粉碎后采用對(duì)原料中的有效組分進(jìn)行提取，萃取的方法為：co2超臨界萃取、微波輔助萃取或者超聲波輔助提取中的一種。

進(jìn)一步地，采用co2超臨界萃取，具體方法如下：將原料粉碎至粒徑為10-16目，將粉碎后的原料裝入萃取釜內(nèi)，將萃取釜在co2超臨界流體內(nèi)浸泡2小時(shí)，控制萃取釜中壓力為24-30mpa。

然后將浸泡后的物質(zhì)置于分離釜中進(jìn)行分離，控制分離釜中壓力為5-7.5mpa，加溫至35-42℃，分離時(shí)間為1-5小時(shí)；去除co2得到有效成分。

此外，如果采用微波輔助萃取法對(duì)原料進(jìn)行提取，具體操作步驟如下：

將原料粉碎至30-50目，混合原料將混合有原料與乙醇的混合物置于微波萃取儀中，在300w的功率下萃取2-4次，每次萃取時(shí)間為20-30s，合并、過(guò)濾得到萃取液并靜置使其分層，去掉水層后加入適量的無(wú)水硫酸鈉或者無(wú)水硫酸鎂，旋蒸去除有機(jī)溶劑，得到有效成分。

進(jìn)一步地，上述乙醇與原料的比例為3-5ml/g；具體地，乙醇與原料的比例為4ml/g。

在其他實(shí)施例中，采用超聲波輔助提取原料，具體操作步驟如下：

將原料粉碎至20-30目，將混合有原料與乙醚的混合物進(jìn)行超聲提取20-40min，超聲的頻率為80-120hz，提取2-4次，去除提取液中的乙醚，得到有效成分。

進(jìn)一步地，上述乙醚與原料的比例為8-12ml/g。具體地乙醚與原料的比例為10ml/g。

進(jìn)一步地，上述制備方法好包括混合中鏈脂肪酸甘油酯nct、辛普高效增溶劑sf-410以及有效成分。

具體地，將中鏈脂肪酸甘油酯nct、辛普高效增溶劑sf-410以及上述的有效成分與水混合均勻，即可封裝。

本發(fā)明還提供一種方案，藥物組合物在制備抗皮膚衰老藥物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，也可將上述的藥物組合物制備為面膜等其他護(hù)膚品。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：玫瑰50g、甘草300g、珍珠露水草10g以及廣藿香100g，混合上述原料后粉碎至10目，將粉碎后的原料裝入萃取釜內(nèi)，將萃取釜在co2超臨界流體內(nèi)浸泡2小時(shí)，控制萃取釜中壓力在24-30mpa的范圍內(nèi)。然后將浸泡后的物質(zhì)置于分離釜中進(jìn)行分離，控制分離釜中壓力為5-7.5mpa，加溫至35℃，分離釜中分離時(shí)間為1小時(shí)；去除co2得到有效成分。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：玫瑰500g、甘草3333g、珍珠露水草135g以及廣藿香1390g。

混合上述原料后粉碎至14目，將粉碎后的原料裝入萃取釜內(nèi)，將萃取釜在co2超臨界流體內(nèi)浸泡2小時(shí)，控制萃取釜中壓力在24-30mpa的范圍內(nèi)。然后將浸泡后的物質(zhì)置于分離釜中進(jìn)行分離，控制分離釜中壓力為5-7.5mpa，加溫至42℃，分離釜中分離時(shí)間為5小時(shí)；去除co2得到有效成分。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：稱量玫瑰150g、甘草1000g、珍珠露水草50g以及廣藿香400g。

混合上述原料后粉碎至30目，將粉碎后的原料與4800ml的乙醇裝入燒瓶中，將燒瓶置于微波萃取儀中，在300w的功率下萃取3次，每次萃取時(shí)間為25s；將3次的萃取液合并、過(guò)濾并靜置使其分層，去掉水層后加入適量無(wú)水硫酸鈉靜置過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得揮發(fā)油有效成分。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：稱量玫瑰80g、甘草600g、珍珠露水草20g以及廣藿香240g。

混合上述原料后粉碎至30目，將粉碎后的原料與3760ml的乙醇裝入燒瓶中，將燒瓶置于微波萃取儀中，在300w的功率下萃取2次，每次萃取時(shí)間為30s；將2次的萃取液合并、過(guò)濾并靜置使其分層，去掉水層后加入適量無(wú)水硫酸鎂靜置過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得揮發(fā)油有效成分。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：玫瑰500g、甘草3333g、珍珠露水草135g、廣藿香1390g?；旌仙鲜鲈虾蠓鬯橹?0目，將原料以及21432ml無(wú)水乙醇裝入燒瓶中，將燒瓶置于微波萃取儀中，在300w的功率下3次，每次萃取時(shí)間為25s；將3次的萃取液合并、過(guò)濾并靜置使其分層，去掉水層后加入適量無(wú)水硫酸鎂靜置過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得揮發(fā)油有效成分。

實(shí)施例6

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：玫瑰8g、甘草60g、珍珠露水草2g以及廣藿香24g?；旌仙鲜鲈虾蠓鬯橹?0目，將原料以及940ml乙醚裝入萃取瓶中，進(jìn)行超聲提取20min，超聲的頻率為80hz，提取2次，收集、合并提取液后去除提取液中的乙醚，得到有效成分。

實(shí)施例7

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：玫瑰10g、甘草65g、珍珠露水草3g以及廣藿香28g?；旌仙鲜鲈虾蠓鬯橹?0目，將原料以及848ml乙醚裝入萃取瓶中，進(jìn)行超聲提取40min，超聲的頻率為120hz，提取4次，收集、合并提取液后去除提取液中的乙醚，得到有效成分。

實(shí)施例8

本實(shí)施例提供了一種藥物組合物，該藥物組合物主要由以下步驟制得：

稱量原料：玫瑰95g、甘草62g、珍珠露水草25g、廣藿香26g。混合上述原料后粉碎至20目，將原料以及1080ml乙醚裝入萃取瓶中，進(jìn)行超聲提取40min，超聲的頻率為100hz，提取2次，收集、合并提取液后去除提取液中的乙醚，得到有效成分。

試驗(yàn)例

將實(shí)施例1制得的藥物組合物抗小鼠皮膚光老化作用實(shí)驗(yàn)。

將實(shí)施例1制得的有效成分溶于丙二醇-乙醇(8:2，vol/vol)的溶劑中，配制成濃度分別為4，8，16mg/ml的藥物組合物。

實(shí)驗(yàn)小鼠：km小鼠，體重約18～22g，雌性，spf級(jí)，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為：scxk(粵)2013-0020。

雌性km小鼠63只，動(dòng)物在溫度為23±2℃、濕度為55±10％和光暗周期12h的spf級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，正常飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)平均分成7組，分別為：正常對(duì)照組(naivecontrol，nc)、脫毛對(duì)照組(shamcontrol，sc)、模型對(duì)照組(modelcontrol，mc)、溶媒對(duì)照組(vehiclecontrol，vc)、藥物組合物低劑量組(藥物-l)、藥物組合物中劑量組(藥物-m)、藥物組合物高劑量組(藥物-h)，實(shí)驗(yàn)周期為十周。對(duì)上述km小鼠的分組與給藥情況如表1所示。表中：uv照射是指紫外線照射。

表1實(shí)驗(yàn)小鼠分組處理與給藥情況

對(duì)上述實(shí)驗(yàn)組每周五次(周三，周日除外)進(jìn)行給藥，給藥情況如表1。

皮膚光老化動(dòng)物模型的制備如下：

將3根uva燈管(波長(zhǎng)：320-400nm，峰值：365nm)和7根uvb燈管(波長(zhǎng)：285-350nm，峰值：310-315nm)并列穿插安裝于自制的紫外線輻射箱中，作為輻射光源。造模前，uv燈管預(yù)熱10min，并隔一定時(shí)間用紫外輻射儀(waldmannuv800,germany)進(jìn)行紫外輻射強(qiáng)度測(cè)定，待光源穩(wěn)定后，再將相應(yīng)組別小鼠分別放入自制的不銹鋼鼠籠內(nèi)，鼠籠與箱內(nèi)uv燈管相距30cm進(jìn)行照射。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)參考文獻(xiàn)表明，最小紅斑量(med)為100mj/cm²。因此，uva聯(lián)合uvb的輻射劑量第一周按一個(gè)med(100mj/cm²)進(jìn)行照射，每周照射5次，往后每周照射劑量比前一周遞增一個(gè)med，直至第四周4個(gè)med為止，之后保持4個(gè)med直至第十周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，紫外輻照總劑量達(dá)17j/cm2。

實(shí)施例1制得的藥物組合物抗小鼠皮膚光老化進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程以及檢測(cè)結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：

1.皮膚宏觀評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)期間，每周六對(duì)小鼠背部皮膚與光老化相關(guān)的宏觀特征(彈性、皺紋、增厚、粗糙、紅斑等)進(jìn)行觀察評(píng)價(jià)。用乙醚將小鼠麻醉后對(duì)其背部正中皮膚進(jìn)行拍照，并根據(jù)表2所示皮膚光老化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其皮膚進(jìn)行宏觀評(píng)分(0-正常皮膚，6-嚴(yán)重受損皮膚)，共檢查十周。

表2皮膚光老化評(píng)價(jià)準(zhǔn)則

2.皮膚彈性測(cè)試(提皮測(cè)試)

根據(jù)tsukahara等人建立的提皮測(cè)試方法對(duì)小鼠皮膚彈性進(jìn)行評(píng)價(jià)，用乙醚將小鼠輕度麻醉后，將小鼠背部皮膚沿其正中線靠后的位置用拇指和食指輕輕提起(以小鼠四肢不懸空為度，后立即放開(kāi)，并記錄皮膚恢復(fù)至初始狀態(tài)的時(shí)間)，共檢查十周。

3.皮膚厚度測(cè)量

用乙醚將小鼠輕度麻醉后，用同樣方法將小鼠背部皮膚輕輕提起，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠皮膚厚度(mm)，記錄。每周進(jìn)行皮膚厚度測(cè)量，共檢查十周。

檢測(cè)以及測(cè)試結(jié)果如下：

1.藥物組合物對(duì)光老化小鼠背部皮膚宏觀表現(xiàn)的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，sc組小鼠呈現(xiàn)正常的皮膚紋理，皮膚細(xì)膩、紅潤(rùn)、有光澤，未見(jiàn)皺紋及松弛現(xiàn)象，提示脫毛操作對(duì)小鼠皮膚的宏觀表現(xiàn)無(wú)影響。紫外線輻射造模四周后，mc組和vc組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)粗深皺紋、紅斑、水腫、不規(guī)則增厚以及皮革樣等典型的皮膚光老化宏觀損傷，提示皮膚光老化模型建立成功且溶媒丙二醇-乙醇對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚光老化無(wú)保護(hù)作用。在第十周末，藥物-h組小鼠背部皮膚呈現(xiàn)健康的光滑狀態(tài)，伴隨少量細(xì)小皺紋；藥物-m組小鼠未見(jiàn)肉色皮損現(xiàn)象，但可見(jiàn)少量淺皺紋；雖然藥物-l組小鼠仍出現(xiàn)深皺紋和輕微紅斑等光老化現(xiàn)象，但較vc組有明顯的好轉(zhuǎn)。造模四周后，mc組與vc組的皮膚宏觀評(píng)分較sc組顯著升高(p<0.05)，而mc組與vc組之間的宏觀評(píng)分無(wú)顯著差異(p>0.05)，與sc組比較，從第六周開(kāi)始，藥物治療組的宏觀評(píng)分顯著降低(p<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，藥物對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚宏觀損傷有抑制作用。

2.藥物組合物對(duì)光老化小鼠皮膚彈性的影響

圖1示出了對(duì)小鼠宏觀觀察統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)，具體地，圖1中，a表示實(shí)驗(yàn)期間各組宏觀表現(xiàn)評(píng)分；b表示實(shí)驗(yàn)期間各組提皮恢復(fù)時(shí)間。#p<0.05vs.sc組；*p<0.05vs.vc組(x±s，n＝9)。

由圖1可知，皮膚彈性測(cè)試結(jié)果提示，從第四周開(kāi)始，mc組與vc組的提皮恢復(fù)時(shí)間較sc組顯著延長(zhǎng)(p<0.05)，皮膚彈性顯著降低，而mc組與vc組的提皮恢復(fù)時(shí)間相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。從第六周開(kāi)始，實(shí)施例1的藥物組合物給藥后，提皮恢復(fù)時(shí)間均較vc組顯著降低(p<0.05)，皮膚彈性顯著升高，其中以中高劑量組更為顯著。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，局部給予實(shí)施例1的藥物組合物治療可顯著對(duì)抗紫外線誘導(dǎo)光老化小鼠的皮膚彈性下降。

3.藥物組合物對(duì)光老化小鼠皮膚厚度的影響

圖2示出了實(shí)驗(yàn)期間各組皮膚厚度(n＝9)，由圖2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，小鼠皮膚厚度測(cè)量結(jié)果顯示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠皮膚逐漸增厚，其中以mc組及vc組小鼠皮膚增厚最為嚴(yán)重，兩組無(wú)顯著性差異(p>0.05)，提示本實(shí)驗(yàn)造模成功且溶媒丙二醇-乙醇治療對(duì)紫外線誘導(dǎo)的皮膚異常增厚無(wú)對(duì)抗作用。從第五周開(kāi)始mc組與vc組的小鼠皮膚厚度均較sc組顯著增厚(p<0.05)。從第七周開(kāi)始，與vc組相比較，局部涂敷實(shí)施例1提供的藥物組合物能顯著抑制紫外線輻射引起的皮膚增厚(p<0.05)，其中以藥物-h組治療效果最好。

4.藥物組合物對(duì)光老化小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)紫外線輻射誘導(dǎo)的光老化小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)行觀察。nc與sc組小鼠呈現(xiàn)出清晰完整的健康皮膚組織結(jié)構(gòu)，表皮層較薄且厚度均勻，角質(zhì)層正常無(wú)過(guò)度角質(zhì)化現(xiàn)象；表皮與真皮間呈現(xiàn)波浪狀連接，明顯可見(jiàn)表皮突與真皮乳頭；真皮處可見(jiàn)排列規(guī)則且結(jié)構(gòu)完整的毛囊與皮脂腺，未見(jiàn)出血及炎性浸潤(rùn)。相比之下，mc組與vc組小鼠呈現(xiàn)典型的皮膚光老化組織結(jié)構(gòu)特征，紫外線輻射引起角質(zhì)層角化過(guò)度，表皮不規(guī)則增厚；表皮層與真皮層間的波浪狀連接趨于平緩，表皮突與真皮乳頭消失；此外，真皮層出現(xiàn)出血及大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。藥物-l組的皮膚組織結(jié)構(gòu)情況較mc組與vc組有一定程度的改善，角質(zhì)層角化程度有所減輕，表皮層厚度有所下降，毛囊、皮脂腺結(jié)構(gòu)較為完整，未見(jiàn)出血現(xiàn)象但可見(jiàn)少量炎性浸潤(rùn)。藥物-m與藥物-h組呈現(xiàn)出相對(duì)完整的皮膚組織結(jié)構(gòu)，表皮層厚度顯著下降，角質(zhì)層厚度亦恢復(fù)正常；表皮與真皮連接處趨于波浪狀，可見(jiàn)表皮突與真皮乳頭；真皮層中毛囊與皮脂腺排列規(guī)則，且未見(jiàn)出血與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。上述病理學(xué)檢查結(jié)果表明，本實(shí)施例提供的藥物組合物對(duì)皮膚光老化小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。

5.藥物組合物對(duì)光老化小鼠皮膚彈性纖維的影響

彈性纖維賦予皮膚彈性，具有支撐、抗?fàn)坷淖饔茫?duì)外界機(jī)械損傷有防護(hù)作用。彈性纖維的數(shù)量與分布情況都將直接影響皮膚的外觀。nc組與sc組可見(jiàn)清晰的彈性纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，排列整齊有序，提示脫毛操作對(duì)彈性纖維的結(jié)構(gòu)無(wú)破壞作用。而施加長(zhǎng)期慢性紫外線輻射后，mc組與vc組的皮膚彈性纖維均出現(xiàn)增粗、扭曲、斷裂、變性、排列紊亂無(wú)規(guī)則等典型皮膚光老化特征，部分甚至降解成顆粒狀或無(wú)定形團(tuán)塊。藥物-l組小鼠皮膚彈性纖維較vc組有所好轉(zhuǎn)，呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)狀態(tài)且排列較有序；藥物-m組可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)且排列有序的彈性纖維，部分呈交織狀；藥物-h組小鼠的皮膚彈性纖維有明顯的改善，其數(shù)量顯著上升，且呈細(xì)長(zhǎng)交織狀，排列整齊有序，部分已恢復(fù)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果提示，實(shí)施例1提供的藥物組合物能抵御紫外線輻射引起的彈性纖維損傷，維持其正常的生理結(jié)構(gòu)形態(tài)。

6.藥物組合物對(duì)光老化小鼠皮膚膠原纖維的影響

膠原纖維主要由膠原蛋白構(gòu)成，賦予皮膚張力和韌性，維持皮膚的充盈程度。nc組與sc組真皮膠原纖維呈波浪狀，排列整齊有規(guī)則，分布均勻，相互交錯(cuò)，疏密有致。而經(jīng)十周的紫外線輻射后，mc與vc組真皮膠原纖維含量減少，排列紊亂無(wú)規(guī)則，分布不均，斷裂稀疏。經(jīng)實(shí)施例1提供的藥物組合物治療后，光老化小鼠真皮膠原纖維均有一定程度的恢復(fù)。藥物-l組皮膚切片可見(jiàn)波浪狀膠原纖維，排列均勻有序，但分布稍稀疏；藥物-m組與藥物-h組真皮膠原纖維呈波浪狀，排列整齊有序，分布均勻，其致密程度雖不及nc組與sc組，但亦比mc組vc組有顯著的上升。

圖3示出了小鼠皮膚膠原纖維光密度值和膠原含量，進(jìn)一步地，圖3a示出了masson染色切片膠原纖維光密度值(od)結(jié)果，masson染色切片膠原纖維光密度值(od)結(jié)果如圖3a所示，nc組與sc的膠原纖維od值無(wú)顯著性差異(p>0.05)，提示脫毛操作對(duì)膠原纖維的密度無(wú)顯著影響。mc組與sc組比較，真皮膠原纖維od值顯著降低(p<0.05)；而mc組與vc組比較，二者的膠原纖維od值無(wú)顯著性差異(p>0.05)，提示皮膚光老化模型建立成功，及溶媒對(duì)膠原纖維的密度無(wú)明顯影響。與vc組比較，實(shí)施例1的藥物組合物治療能顯著增加真皮膠原纖維的od值，其中以高劑量的效果最佳，接近正常水平。上述結(jié)果表明，實(shí)施例1得到的藥物組合物具有保護(hù)膠原纖維免受紫外線輻射損傷的作用。

圖3b示出了膠原含量結(jié)果，nc組與sc組比較，二者的膠原含量無(wú)顯著性意義(p>0.05)，同時(shí)，mc組與vc組比較，二者的膠原含量差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，提示脫毛操作及溶媒對(duì)膠原含量均無(wú)明顯影響。但與sc組相比較，mc組的膠原含量大約下降20％，而與vc組比較，藥物-m組與藥物-h組的膠原含量分別提高16.65％和17.90％。試劑盒測(cè)定膠原含量結(jié)果與上述的膠原纖維染色的觀察結(jié)果基本一致，所以，實(shí)施例1的藥物組合物可促進(jìn)膠原的合成或抑制膠原的降解。

7.藥物組合物提高光老化小鼠皮膚組織中抗氧化酶的活性

圖4示出了小鼠皮膚組織中cat(a)、gsh-px(b)和sod(c)活力以及mda(d)含量的測(cè)定結(jié)果。其中：#p<0.05vs.sc組；*p<0.05vs.vc組(x±s，n＝9)。

抗氧化酶(cat、gsh-px和sod)的活性是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。由圖4可知，nc組與sc組比較，二者抗氧化酶(cat、gsh-px和sod)的活性無(wú)明顯差異(p>0.05)，同時(shí)，mc組與vc組比較，二者抗氧化酶的活性亦無(wú)明顯差異(p>0.05)，提示脫毛操作與溶媒均不引起抗氧化酶活性的顯著變化。而與sc組比較，長(zhǎng)期紫外線輻射導(dǎo)致mc組的cat、gsh-px和sod活力分別下降了38.76％，23.81％和22.50％(p<0.05)，提示mc組小鼠機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激壓力顯著上升，皮膚光老化模型建立成功。與vc組比較，皮膚涂布給予藥物組合物治療可顯著增加抗氧化酶(cat、gsh-px和sod)的活力。尤其以藥物-h組的治療效果最佳，使cat活性提高63.01％，gsh-px活性提高38.21％及sod活性提高16.41％(與vc組比較，p<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，本發(fā)明提供的藥物組合物能顯著提升皮膚組織中抗氧化酶的活性，從而對(duì)抗紫外線輻射誘導(dǎo)的體內(nèi)氧化應(yīng)激壓力的顯著上升。

8.藥物組合物降低光老化小鼠皮膚組織中mda的含量

mda是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)。如圖4d所示，nc組與sc組比較，二者間mda含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，同時(shí)，mc組與vc組比較，二者間mda含量的差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，提示脫毛操作與溶媒對(duì)mda的含量均無(wú)明顯影響。與sc組比較，mc組與vc組的mda含量升高了約1倍(p<0.05)，提示紫外線輻射誘導(dǎo)較為嚴(yán)重的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，本實(shí)驗(yàn)造模成功。相反，與vc組比較，藥物組合物能顯著降低mda的含量，結(jié)果呈劑量依賴關(guān)系。其中以中高劑量藥物組合物的治療效果較優(yōu)(p<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物組合物治療能顯著減輕紫外線輻射誘導(dǎo)的皮膚脂質(zhì)過(guò)氧化程度。

9.藥物組合物抑制光老化小鼠皮膚組織中炎癥介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)

圖5示出了小鼠皮膚組織中炎性因子il-1β(a)、il-6(b)、tnf-a(c)、cox-2(d)以及pge2(e)含量的測(cè)定結(jié)果。其中，#p<0.05vs.sc組；*p<0.05vs.vc組(x±s，n＝9)。

如圖5所示，nc組與sc組之間或mc組與vc組之間的炎癥因子(il-1β，il-6，tnf-α，cox-2以及pge2)含量水平相近，均無(wú)顯著性差異(p>0.05)，提示脫毛操作與溶媒對(duì)炎癥因子的含量均無(wú)顯著影響。與sc組比較，紫外線輻射可引起mc組與vc組各類炎癥因子含量的顯著增加(p<0.05)。而藥物組合物治療可降低il-1β、il-6、tnf-α、cox-2以及pge2等各種炎癥因子的異常表達(dá)，其中以中高劑量的效果較好(與vc組比較，p<0.05)。上述結(jié)果提示，藥物組合物能抑制與皮膚光老化相關(guān)的炎癥因子的過(guò)度表達(dá)。

10.藥物組合物抑制光老化小鼠皮膚組mmp-1與mmp-3的異常分泌mmps

圖6示出了小鼠皮膚組織中mmp-1(a)及mmp-3(b)含量的測(cè)定結(jié)果。其中，#p<0.05vs.sc組；*p<0.05vs.vc組(x±s，n＝9)。

mmp-1與mmp-3，是降解膠原的主要酶類，可引起皮膚的松弛和皺紋。如圖6示，nc組與sc組之間或mc組與vc組之間mmp-1與mmp-3的水平均相近，均無(wú)顯著性差異(p>0.05)，而與sc組比較，mc組小鼠皮膚組織中mmp-1與mmp-3的含量分別升高21.88％和30.70％(p<0.05)。上述結(jié)果提示，脫毛操作與溶媒對(duì)mmps含量均無(wú)顯著影響，且本實(shí)驗(yàn)皮膚光老化模型建立成功。相反，與vc組比較，雖然藥物-l組mmp-1含量沒(méi)有明顯下降，但藥物-m組與藥物-h組mmp-1含量則呈顯著的下降趨勢(shì)(與vc組比較，p<0.05)；而藥物組合物三個(gè)劑量組均可顯著抑制紫外線輻射誘導(dǎo)的mmp-3異常分泌(與vc組比較，p<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物組合物能顯著降低紫外線輻射誘導(dǎo)的mmps的異常分泌，從而抑制膠原的過(guò)度降解。

需要說(shuō)明的是，上述試驗(yàn)例以實(shí)施例1制得的藥物組合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，相應(yīng)的，發(fā)明人就實(shí)施例1-8制得的藥物組合物也進(jìn)行了上述的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了實(shí)施例1-8的藥物組合物也具有緩解或者抵抗小鼠皮膚老化的作用。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。