專利名稱：血細(xì)胞生成蛋白及其制造材料和方法
相關(guān)申請的交互參見本申請是案號為08/215,203的申請(1994年3月21日申請)的部分后續(xù)申請，后者是案號為08/203197的申請(1994年2月25日申請)的部分后續(xù)申請，08/203,197號申請又是案號為08/196,025的申請(1994年2月14日申請)的部分后續(xù)申請，這些申請是未決申請，本文一并參考。
背景技術(shù)：
血細(xì)胞生成(Hematopoiesis)是一個(gè)使血細(xì)胞從骨髓中多能性干細(xì)胞發(fā)育并分化的過程。該過程涉及通過靶細(xì)胞上膜結(jié)合受體起作用的多肽生長因子(細(xì)胞因子)的復(fù)合物相互作用。細(xì)胞因子的作用導(dǎo)致細(xì)胞增生和分化，對一個(gè)特別的細(xì)胞因子的反應(yīng)通常為譜系特異性的和階段特異性的。一個(gè)單細(xì)胞型(如血小板)從干細(xì)胞的發(fā)育可能需要多種細(xì)胞因子以合適的次序的協(xié)同作用。
已知的細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素(如IL-1，IL-2，IL-3，IL-6，IL-8，等等)和集落刺激因子(如G-CSF、M-CSF，GM-CSF，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，等等)。一般來說，白細(xì)胞介素充當(dāng)免疫和炎癥反應(yīng)介體的作用。集落刺激因子刺激骨髓來源細(xì)胞的增生，激活成熟白細(xì)胞，并且另外形成對炎癥、侵染和免疫激發(fā)的寄生反應(yīng)的一個(gè)組成部分。
各種細(xì)胞因子已開發(fā)為治療劑。例如，促紅細(xì)胞生成素，它可刺激紅細(xì)胞的發(fā)育，用來治療腎衰竭引起的貧血。幾種集落刺激因子與癌癥的化學(xué)療法一起已被用于加速病人免疫系統(tǒng)的康復(fù)。白細(xì)胞介素一乙，α-干擾素和β-干擾素用于療某些癌癥。在患血小板減少癥的動物體液中，已鑒別出一種可刺激巨核細(xì)胞生成和血小板生成的活性，在文獻(xiàn)中被稱之為“血小板生成素(thrombopoietin)”(McDonald最近的綜述，Exp.Hematol.16201-205，1988和McDonald，Am.J.Ped.Hematol.Oncol.148-21，1992)。雖然有三十多年的研究，但尚未確定對產(chǎn)生這種活性起決定作用的某個(gè)特定因子或多種因子的特征，部分原因是由于缺乏好的材料來源，缺乏好的試驗(yàn)方法和缺乏像產(chǎn)生位點(diǎn)方面的知識。
與血小板機(jī)能失調(diào)相關(guān)的溫和出血失調(diào)癥，相對較為常見(Bachmann，Seminars in Hematology 17292-305，1980)，它是一些血小板功能的光天性失調(diào)，包括Bernard-Soulier綜合癥(缺乏血小板GpIb)格蘭茨曼血小板機(jī)能不全病(缺乏GpIIb和GpIIIa)和先天性無纖維蛋白原血癥(血漿和血小板中纖維蛋白原的減少或缺乏)以及灰色血小板綜合癥(缺少α-顆粒)。此外，還有一些與血小板分泌，貯藏庫(storage pool)缺損，血小板花生四烯酸途徑畸變，血小板環(huán)加氧酶和凝血惡烷合成酶的缺損及血小板激活的缺損有關(guān)的失調(diào)癥(reviewed by Rao and Holmsen，Seminars in Hematology 23102-118，1986)。目前，尚未闡明大部分這些缺損的分子基礎(chǔ)。
血小板蛋白的分離和特征描述對許多血小板機(jī)能失調(diào)的缺陷基礎(chǔ)的闡明提供了非常寶貴的工具。對詳細(xì)的分子分析的一個(gè)主要限制步驟在于很難從血小板或其前體巨核細(xì)胞中獲得mRNA，以便分析和cDNA文庫構(gòu)建。血小板缺乏細(xì)胞核和轉(zhuǎn)錄作用。仍然與血小板相聯(lián)的微量的mRNA很難分離并常常易于降解。血小板cDNA文庫的構(gòu)建至今為止需要大量的血小板，典型地需要來自25至250個(gè)單位全血的血小板(Izumiet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 877477-7481，1990；Wicki et al.，Thrombosis and Haemostasis 61448-453，1989；and Wenger et al.，Blood 731498-1503，1989)或來自具有實(shí)質(zhì)性血小板增多引起的升高的血小板計(jì)數(shù)的病人的Pheresis的血小板(Roth.et al，Biochem.Biophys.Res.Comm.160705-710，1989)。分離出血小板特異性cDNA的地方，mRNA很可能是最穩(wěn)定的或總mRNA種類豐富的，并且很可能只代表一個(gè)部分總的血小板編碼庫。
獲得一個(gè)血小板cDNA文庫的另一途徑是由巨核細(xì)胞(即血小板的直接細(xì)胞前體)分離的mRNA的分離和文庫的構(gòu)建。巨核細(xì)胞為多倍體細(xì)胞，預(yù)期包含編碼全套血小板和巨核細(xì)胞蛋白質(zhì)的mRNA。然而，現(xiàn)已證明很難分離出足夠數(shù)量和純度的巨核細(xì)胞。
分子生物學(xué)的最近進(jìn)展大大地增加了我們對血細(xì)胞生成的理解， 但同時(shí)已表明它是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。盡管對許多細(xì)胞因子已確定特征，并且有些已證實(shí)有臨床用途，但本領(lǐng)域尚需要一些其它藥劑，刺激髓樣和淋巴樣前體的增生和分化以及成熟血細(xì)胞的產(chǎn)生。尤其需要刺激巨核細(xì)胞譜系的細(xì)胞(包括血小板)發(fā)育和增生的藥劑。本領(lǐng)域還需要可用于治療血細(xì)胞減少癥(包括血小板減少，即循環(huán)的血小板數(shù)量低得反常的狀況(約不到1×105血小板/mm3)，及其他血小板失調(diào)癥)的藥劑。本發(fā)明可滿足這些需要并提供其他相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有血細(xì)胞生成(hematopoietic)活性的分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)具有血細(xì)胞生成活性的蛋白質(zhì)的方法及該方法中使用的DNA分子，載體和細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一些可結(jié)合血細(xì)胞生成蛋白(hematopoietic protein)上的抗原決定族的抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在包括人在內(nèi)的哺乳動物中刺激巨核細(xì)胞，血小板和嗜中性白細(xì)胞產(chǎn)生的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于骨髓細(xì)胞發(fā)育、分化和增生研究和骨髓細(xì)胞發(fā)育，分分和增生過程中以畸變?yōu)樘卣鞯募膊z測的各種工具。
一方面，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自(a)包含SEQ ID No2的第45個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)包含SEQ ID No2的第45個(gè)氨基酸殘基到第206個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(c)包含SEQ ID No19的第22個(gè)氨基酸殘基到第173個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(d)包含SEQ ID No19的第22個(gè)氨基酸殘基到第175個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(e)(a)、(b)、(c)、(d)的等位變異體；和(f)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)的種類同系物，其中所述蛋白質(zhì)刺激髓樣和淋巴前體(precursor)的增生和分化。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID No2的第45個(gè)氨基酸殘基至第379個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列或包含SEQ ID No2的第22個(gè)氨基酸殘基至第353個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
在相關(guān)的一方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的分離的多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸分子為一個(gè)DNA分子，該DNA分子包含一個(gè)編碼鏈，所述編碼鏈包含SEQ ID No1的第237個(gè)核苷酸至第692個(gè)核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No18的第64個(gè)核苷酸至第519個(gè)核苷酸的核苷酸序列。在其他實(shí)施方案中，該分子包含SEQ IDNo1的237-1241，174-1241，105-1241，105-722，174-722或237-722位核苷酸或SEQ ID No18的相應(yīng)區(qū)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了這些分子和編碼血細(xì)胞生成蛋白的DNA分子的等位變異體，所述分子編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列上與由SEQ ID No1或SEQ ID No18的以上敘述的任一部分編碼的蛋白質(zhì)至少有80％的同源性。本發(fā)明也提供了與這些序列互補(bǔ)的分子。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的DNA分子，該分子選自(a)質(zhì)粒pZGmpL-1081(ATCC 69566)的EcoRI-XhoI插入片段，(b)(a)的等位變異體，和(c)編碼氨基酸序列與(a)或(b)編碼的蛋白質(zhì)至少有80％的同源性的蛋白質(zhì)的DNA分子，其中，分離的DNA分子編碼具有血細(xì)胞生成活性的蛋白質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，該載體包含下列可操作連接的元件(element)一個(gè)轉(zhuǎn)錄起動子；一個(gè)DNA區(qū)段(segment)，該區(qū)段選自(a)編碼血細(xì)胞生成蛋白并包含SEQ ID No1中所示的第237至第692個(gè)核苷酸的核酸序列的DNA區(qū)段，(b)編碼血細(xì)胞生成蛋白質(zhì)并包含SEQ ID No18中所示的第64至第519個(gè)核苷酸的核酸序列的DNA區(qū)段，(c)(a)和(b)的等位變異體，以及(d)編碼氨基酸序列與(a)、(b)或(c)編碼的蛋白質(zhì)至少有80％的同源性的血細(xì)胞生成蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段；和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。
另一方面，本發(fā)明提供了一種已導(dǎo)入上述表達(dá)載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中，細(xì)胞表達(dá)被所述DNA區(qū)段編碼的血細(xì)胞生成蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為真菌細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了一種已向某種系導(dǎo)入編碼上述血細(xì)胞生成蛋白質(zhì)的異源DNA分子的非人體哺乳動物，其中，哺乳動物產(chǎn)生由所述DNA區(qū)段編碼的血細(xì)胞生成蛋白質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明提供了在哺乳動物中刺激血小板產(chǎn)生的方法。這些方法包括給哺乳動物施用治療有效量的血細(xì)胞生成蛋白，該血細(xì)胞生成蛋白，選自(a)包含SEQ ID No2的第45個(gè)氨基酸殘基至第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)包含SEQ ID No19的第22個(gè)氨基酸殘基至173個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(c)(a)和(b)的等位變異體；和(d)(a)、(b)或(c)的物種同系物(Species homologs)，其中，所述的蛋白質(zhì)與藥理上可接受的載體一起刺激髓樣或淋巴樣前體的增生或分化。
參考下面詳細(xì)的描述及附圖，本發(fā)明的這些方面及其他方面將顯得十分清楚明了。
附圖簡要說明

圖1為載體pDX的部分限制性酶切圖譜。使用的證號SV40，Ori，表示SV40的復(fù)制起點(diǎn)；SV40E，為SV40增強(qiáng)子；MLP，為腺病毒主要晚期啟動子；L1-3，為腺病毒三聯(lián)體前導(dǎo)區(qū)；SS，為拼接信號；pA，為多聚腺苷酸位點(diǎn)。
圖2表示質(zhì)粒pBJ3的構(gòu)建過程。使用的記號TPIp，為TPI1啟動子；TPIt，為TPI1終止子；AAT，為α-1抗胰蛋白酶cDNAα，為α-) 因子前導(dǎo)區(qū)；mTPO，為鼠TPO編碼序列。
發(fā)明的詳細(xì)說明在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，對本文使用的某些術(shù)語下定義將是有幫助的。
等位變異體另外一種形式的經(jīng)突變而產(chǎn)生的基因，或突變基因編碼的改變的多肽。基因突變可以是沉默的(編碼的多肽沒有改變)或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。
cDNA互補(bǔ)DNA，由信使RNA模板通過逆(反)轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生，或者是這種分子的克隆或擴(kuò)增拷貝?；パa(bǔ)DNA可以是單鏈的或者雙鏈的。
表達(dá)載體一種DNA分子，為線狀或環(huán)狀，包含編碼多肽的區(qū)段。該區(qū)段與一些可提供其轉(zhuǎn)錄的附加區(qū)段可操作連接。這些附加區(qū)段包括啟動子和終止子序列，也可包括一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記，一個(gè)增強(qiáng)子，一個(gè)多聚腺苷酸化信號，等等。表達(dá)載體一般地來源于質(zhì)?；虿《綝NA，或含有這兩種因子。術(shù)語“可操作連接”是指編排所述區(qū)段，以便它們?yōu)槠漕A(yù)期的目的協(xié)同作用，如在啟動子區(qū)開始轉(zhuǎn)錄和從編碼區(qū)段到終止子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
基因編碼多肽鏈的一個(gè)染色體DNA區(qū)段。一個(gè)基因包括編碼氨基酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(在某些情況下，這些區(qū)域可被一些非編碼的“間插序列”(“內(nèi)含子”)間隔開)以及提供編碼序列轉(zhuǎn)錄的側(cè)翼非編碼區(qū)。
與之互補(bǔ)的分子與一個(gè)參照序列相比，具有互補(bǔ)的堿基序列和顛倒的方向的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG 3’與序列5’CCCGTGCAT 3’互補(bǔ)。
啟動子基因的一部分，RNA聚合酶與其結(jié)合，mRNA的合成在其上開始。
如上述所指明的，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)具有血細(xì)胞生成活性的蛋白質(zhì)的材料和方法。如本文中所使用的，術(shù)語“血細(xì)胞生成”表示按標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法測定的刺激髓樣或淋巴樣前體增生和/或分化的能力。參見例如Metcalf，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 775327-5330，1980；Metcalf et al.，J.Cell.Physiol.116198-206，1983；和Metcalf et al.，Exp.Hematol.15288-295，1987。典型地，在一個(gè)試驗(yàn)樣品和一個(gè)對照樣品存在時(shí)，對骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。然后根據(jù)視覺檢查和/或染色對培養(yǎng)物的細(xì)胞增生和分化進(jìn)行計(jì)數(shù)。一個(gè)特別優(yōu)選的測定法是Mosman(J.Immunol.Meth.6555-63，1983；在此一并參考)的MTT比色測定法，在下面的例子中將被更詳細(xì)地說明。
本發(fā)明部分基于發(fā)現(xiàn)了一種通過MPL受體刺激細(xì)胞生長的活性。在此發(fā)現(xiàn)之前，這種受體(Souyri et al.，Cell 631137-1147，1990)，為一種“孤子”受體，其自然配體尚不清楚。通過隨后實(shí)施例中詳細(xì)描述的克隆和突變方法，發(fā)明者培育了一種細(xì)胞系，它依賴于其生存和生長的MPL受體一連結(jié)途徑的刺激作用，且它是能夠受體自泌刺激的。研究發(fā)現(xiàn)這些不依賴于白細(xì)胞介素-3(IL-3)的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能支持表達(dá)MPL受體并且還依賴于IL-3的細(xì)胞生長?？贵w中和實(shí)驗(yàn)表明，這種活性并非由于IL-3或IL-4的作用，并且這種活性可被一種可溶形式的MPL受體中和。然后從不依賴于IL-3的細(xì)胞系中制備一個(gè)cDNA文庫。用DNA轉(zhuǎn)染小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞，從所述轉(zhuǎn)染體得到的培養(yǎng)介質(zhì)用于試驗(yàn)刺激MPL依賴細(xì)胞增生的能力。分離到一個(gè)陽性克隆，并產(chǎn)生重組的MPL配體。研究發(fā)現(xiàn)，重組蛋白刺激廣譜髓樣和淋巴樣前體的增生，并且尤其是刺激骨髓中祖細(xì)胞來源的巨核細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的產(chǎn)生。此外，還發(fā)現(xiàn)重組蛋白刺激試驗(yàn)動物血小板的產(chǎn)生。鑒于這性活性(作用)，該蛋白被指定為血小板生成素(TPO)。
本發(fā)明提供了編碼血小板生成素的分離的多聚核苷酸分子。在這點(diǎn)上，有用的多聚核苷酸分子包括mRNA，基因組DNA，cDNA，合成的DNA和不同來源的片段連接產(chǎn)生的DNA分子。對重組TPO的生產(chǎn)來說，在多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)中最好使用缺乏內(nèi)含子的DNA分子?！胺蛛x”的意思是指從其自然的遺傳背景中移出這些分子。因此，本發(fā)明提供了不含其他通常與其相關(guān)的基因的DNA分子。這些分子尤其不含外來的或不需要的編碼序列，適用于遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。
編碼代表性的小鼠和人的TPO蛋白的cDNA克隆的序列分別在SEQ ID No1和SEQ ID No2中表示出來，相應(yīng)的氨基酸序列分別在SEQID No2和SEQ ID No19中表示出來。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將識別出SEQID Nos1，2，18和19中所示序列以及SEQ ID Nos28和29中所示的基因組序列，這些序列與鼠或人的基因的單個(gè)等位基因相對應(yīng)，并預(yù)期有等位變異存在。SEQ ID No1，SEQ ID No18和SEQ ID No28中所示的DNA序列的等位變異體(包括含沉默突變的那些以及那些導(dǎo)致氨基酸序列變化的突變的那些)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，SEQ ID No2和SEQ ID No19的等位變異體的蛋白質(zhì)也一樣。也很顯然的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用可變密碼子創(chuàng)造有利于核酸序列操作的一些位點(diǎn)。
本文中公開的小鼠和人的序列對從其他動物種類(“物種同系物”)制備編碼TPO蛋白的分離的多聚核苷酸分子是有用的工具。優(yōu)選的這些物種同系物包括哺乳動物同系物(如牛的、犬的、豬的、綿羊的、馬的、尤其是靈長類的蛋白質(zhì))。在本領(lǐng)域中熟知一些用第一物種的序列信息克隆第二物種相應(yīng)的多核苷酸序列的方法。參見例如，Ausubel etal.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987。本發(fā)明的編碼TPO的DNA分子在序列上與SEQ ID No1和SEQ ID No18及其等位變異體一般至少有60％，優(yōu)選地至少有80％，和可能有90-95％或更高的同源性。血小板生長素分子的特征是它們能夠與同種來源的MPL受體特異性地結(jié)合和刺激活體中血小板的產(chǎn)生。在正常的試驗(yàn)動物中，在開始每天給動物施藥的十天內(nèi)，TPO可100％或更多地增加血小板水平。
對mRNA分布的分析表明，編碼TPO的mRNA存在于人和鼠的幾種組織中，在肺，肝，心臟，骨骼肌和腎臟中，mRNA的豐度更高。因此，為了從其他物種中分離同系物，最好是從已發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)高水平mRNA的一種組織中制備cDNA文庫。本技術(shù)領(lǐng)域已熟知一些制備cDNA文庫的方法。參見例如，Sambtook et al.，eds.，Mokcular CloningALaboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989及其中引用的參考文獻(xiàn)。為了檢測編碼TPO的一些分子，用本文公開的小鼠或人的cDNA或用其片段或用一種或多種更小的基于已詳細(xì)描述序列的探針探測所述文庫。一些特別實(shí)用的探針包含一個(gè)寡聚核苷酸，其長度至少為14個(gè)或更多的核苷酸，并且可多達(dá)25個(gè)或更多的核苷酸，它們與SEQ ID No1，SEQ ID No18，SEQ ID No28中的相同長度的部分或其互補(bǔ)序列至少有80％的同源性。最好在一個(gè)較低的雜交嚴(yán)緊度下，即約2×SSC和約50℃的雜交溫度下用標(biāo)記的探針探測文庫。用標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法檢測與探針雜交的分子。通過序列分析和活性檢測確認(rèn)陽性克隆，如檢測與同源的MPL受體結(jié)合的能力(即從同種來源的MPL受體作為cDNA)或刺激同源骨髓細(xì)胞的血細(xì)胞生成能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，可以利用其他的一些克隆方法。
通過從產(chǎn)生MPL配體和顯示自泌生長刺激作用的細(xì)胞系克隆也可分離一些編碼TPO的多核苷酸分子(包括等位變異體和本文公開的物種同系物)。簡單地說，對因子依賴性細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以表達(dá)MPL受體(Vigon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895640-5644，1992；Skoda et al.，EMBO J.122645-2653，1993；和SEQ ID No17)，然后進(jìn)行誘變處理，選擇一些非因子依賴性細(xì)胞。然后這些細(xì)胞可用作TPOmRNA的來源。一些穩(wěn)定的因子依賴性細(xì)胞系包括IL-3依賴性BaF3細(xì)胞系(Palacios and Steinmetz，Cell41727-734，1985；Mathey-Prevot et al.，Mol.Cell.Biol.64133-4135，1986)，F(xiàn)DC-P1(Hapel etal.，Blood 64786-790，1984)，和MO7e(Kiss et al.，Leukemia 7235-240，1993)。按照已發(fā)表的一些方法(例如Greenberger et al.，Leukemia Res.8363-375，1984；Dexter et al.，in Baum et al.，Eds.，Experimental Hematology Today，8th Ann.Mtg.Int.Soc.Exp.Hematol.1979，145-156，1980)，可建立生長因子依賴性細(xì)胞系。在一個(gè)典型的方法中，從興趣組織中移出細(xì)胞(如骨髓，脾臟，胎兒肝臟)，并在一個(gè)常規(guī)的，補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如補(bǔ)充有10％胎兒牛血清(FBS)，15％馬血清，和10-6M氫化可的松的RPMI 1640的培養(yǎng)基中培養(yǎng)間隔一至二周后，收獲非粘著細(xì)胞，并給這些培養(yǎng)物飼喂新鮮培養(yǎng)基。沖洗收獲的非粘著細(xì)胞，并在添加有一種生長因子源(例如，RPMI 1640+10％FBS+5-20％WEHI-3的條件培養(yǎng)基作為IL-3的來源)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔一至二周給這些細(xì)胞飼喂新鮮培養(yǎng)基，隨著培養(yǎng)物的生長，這些細(xì)胞也擴(kuò)展開來。幾周到幾個(gè)月以后，通過把這些細(xì)胞涂布于半固體培養(yǎng)基(如含有甲基纖維素的培養(yǎng)基)上或通過限制性稀釋的方法分離一些單獨(dú)的克隆。通過在不存在生長因子的條件下培養(yǎng)這些單獨(dú)的克隆為確認(rèn)這些克隆的因子依賴性。用逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染或化學(xué)誘變可高頻率地獲得生長因子-依賴性細(xì)胞。轉(zhuǎn)染因子依賴性細(xì)胞，以表達(dá)MPL受體，然后作誘變處理，如通過化學(xué)處理，暴露于紫外線下，暴露于X-射線下或逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變。突變的細(xì)胞然后在細(xì)胞生存依賴于自泌生長因子產(chǎn)生，即在母細(xì)胞需要的外來生長因子不存在的條件下培養(yǎng)。通過篩選，如通過檢驗(yàn)表達(dá)和不表達(dá)MPL受體的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或檢驗(yàn)在可溶性MPL受體或與已知細(xì)胞因子結(jié)合的抗體存在時(shí)的條件培養(yǎng)基的活性，確認(rèn)TPO的產(chǎn)生。
本發(fā)明也提供了一些分離的蛋白質(zhì)，它們實(shí)質(zhì)上與SEQ ID No2或SEQ ID No19的蛋白質(zhì)和其物種同系物具有同源性。“分離的”的意思是指一種蛋白質(zhì)在一種非原來的自然環(huán)境中(如除去了血和動物組織)的條件下發(fā)現(xiàn)的。分離的蛋白質(zhì)一種優(yōu)選的形式是實(shí)質(zhì)上不含其他蛋白質(zhì)，尤其是不含其來源動物的其他蛋白質(zhì)。最好是提供高度純化形式的一些蛋白質(zhì)，如純度大于95％，純度最好大于99％。術(shù)語“實(shí)質(zhì)上同源的”此處用來表示這些蛋白質(zhì)與SEQ ID No2或SEQ ID No19或其物種同系物的氨基酸序列具有50％，更好為60％，最好至少具有80％的同源性。這些蛋白質(zhì)與SEQ ID No2或SEQ ID No19或其同系物更好至少具有90％，最好具有95％或更高的同源性。序列同源性的百分率是通過常規(guī)的方法測定的。參見，如，Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48603-616，1986和Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919，1992。簡單地說，用缺口開放障礙(gapopening penalty)10，缺口延伸障礙(gap extension penalty)1，和表1(用標(biāo)準(zhǔn)單字母碼表示氨基酸)所示的Henikoff和Henikoff(同上)“評分矩陣對比兩個(gè)氨基酸序列，使得序列對比評分最適當(dāng)。然后按下式計(jì)算百分同源性 表1ARNDCQEGHILKMFPSTWYVA 4R -15N -206D -2 -216C 0 -3 -3 -39Q -1100 -35E -1002 -425G 0 -20 -1 -3 -2 -26H -201 -1 -300 -28I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4實(shí)質(zhì)上同源的蛋白質(zhì)的特征是具有一個(gè)或更多氨基酸替換，缺失或增加。這些變化最好只是性質(zhì)上較微小的，即只是一些保守的氨基酸替換，對蛋白質(zhì)的折疊或活性并無重大影響(見表2)；小的缺失，典型地缺失掉一到大約三十個(gè)氨基酸；小的氨基-或羧基-末端的延伸(如一個(gè)氨基末端甲硫氨酸殘基，一個(gè)達(dá)約20-25個(gè)殘基的小接頭肽)，或有利于純化的一個(gè)小的(氨基酸)延伸(如一個(gè)多一組氨酸束，一個(gè)抗原決定簇或一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。一般性的情況參見，F(xiàn)ord et al.，Protein Expression and Purification295-107，1991，該文獻(xiàn)本文一并參考。
表2保守氨基酸替換堿性的精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的谷氨酸天冬氨酸極性的 谷氨酰氨天冬酰氨疏水性亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸按照本領(lǐng)域中已知的一些方法，如定點(diǎn)突變或丙氨酸一掃描突變(Cunningham and Wells，Science 244，1081-1085，1989)，可鑒定TPO中的一些必需氨基酸。在后面一種技術(shù)中，對分子的每個(gè)殘基引入單個(gè)丙氨酸突變，并檢測產(chǎn)生的突變體分子的生物活性(如，受體結(jié)合，體外和體內(nèi)增生活性)，以鑒定對分子活性起關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。也可以通過諸如核磁共振，晶體學(xué)或光親和性標(biāo)記等技術(shù)測定的晶體結(jié)構(gòu)的分析，測定配體一受體相互作用的一些位點(diǎn)。參見，例如，de Vos et al.，Science 255306-312，1992；Smith et al.，F(xiàn)EBS Lett.309 59-64，1992。
一般地，細(xì)胞因子預(yù)測有一個(gè)4-α螺旋結(jié)構(gòu)，第一個(gè)和第四個(gè)螺旋在配體一受體相互作用中具有極為重要的作用，在其家族成員間具有更加高度的保守性。查看SEQ ID No19中所示的人體TPO氨基酸序列，細(xì)胞因子序列的排列表明這些螺旋分別由氨基酸殘基29和53，80和89，108和130及144和168形成分界面(分界面為±個(gè)殘基)。通過與人的序列對比，可測定鼠及其他的非人的TPOs的螺旋分界面。TPO其他重要的結(jié)構(gòu)方面包括SEQID No2中的第51，73，129和195個(gè)位置上的半胱氨酸殘基(相當(dāng)于SEQ ID No19中的28，50，106和172位點(diǎn))。
此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)(或其多肽片段)可連接到其他的生物活性分子上(尤其是其他的細(xì)胞因子)。提供一些多功能性的分子。例如，血小板生成素的C-端結(jié)構(gòu)域可與其他的細(xì)胞因子連接，以提高其生物效能或生產(chǎn)效率。血小板生成素似乎由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。大約150個(gè)氨基酸的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域(氨基末端)在大小和結(jié)構(gòu)方面與紅細(xì)胞生成素和幾種其他的血細(xì)胞生成激動素相似。在第一個(gè)結(jié)構(gòu)域之后是約180個(gè)氨基酸的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域，其結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)庫中已知的任何一種蛋白質(zhì)沒有明顯的相似之處。此第二個(gè)結(jié)構(gòu)域富含與N鍵結(jié)合的糖基化位點(diǎn)和富含絲氨酸，脯氨酸及蘇氨酸殘基，這些氨基酸殘基是與O鍵結(jié)合的糖基化位點(diǎn)的稱志。這種明顯較高含量的碳水化合物表明該結(jié)構(gòu)域在使第一個(gè)疏水性的結(jié)構(gòu)域變?yōu)橄鄬Ω鼮榭扇苄苑矫嫫鹬撤N作用。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，與第二個(gè)結(jié)構(gòu)域相關(guān)的碳水化合物參與了正當(dāng)?shù)募?xì)胞間裝配和其生物合成期間蛋白質(zhì)的分泌。第二個(gè)結(jié)構(gòu)域在穩(wěn)定第一個(gè)結(jié)構(gòu)域抗蛋白質(zhì)水解的降解作用和延長該分子在活體中的半衰期方面也可能起著某種作用，并且可能增強(qiáng)生物信號傳遞或蛋白質(zhì)的特異活性。
本發(fā)明因而提供了一系列新型的雜種分子，其中TPO的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域與第二個(gè)細(xì)胞因子相連。TPO的C-端結(jié)構(gòu)域與該第二種細(xì)胞因子的C-端相連是優(yōu)選的。連接最好是在DNA水平上通過拼接完成，以便讓這些嵌合分子在重組生產(chǎn)系統(tǒng)中表達(dá)。然后對所形成的分子進(jìn)行檢測，如提高的可溶性，增加的穩(wěn)定性，延長的清除半衰期的，或提高的表達(dá)和分泌水平，和藥效學(xué)等方面的檢測。這些嵌合細(xì)胞因子的具體例子包括其中TPO的第二結(jié)構(gòu)域與EPO，G-CSF，GM-CSF，IL-6，IL-3或IL-11的C端相結(jié)合那些。如上面所指出的，這可通過DNA融合方便地完成。然后，將融合的cDNA按照常規(guī)的方法亞克隆到一個(gè)合適的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到寄生細(xì)胞或有機(jī)體中。用常規(guī)的色譜純化技術(shù)(如色譜技術(shù))純化產(chǎn)生的融合蛋白，比較它們與那些天然的、非融合的母體細(xì)胞因子的一些性質(zhì)。這些雜合分子在其組成蛋白或多肽之間可以還包括一些附加的氨基酸殘基(如多肽接頭)。
除以上所述的血細(xì)胞生成蛋白外，本發(fā)明還包括這些蛋白質(zhì)的一些片段和編碼這些片段的分離的多核苷酸分子。是與MPL受體結(jié)合的長度至少為10個(gè)氨基酸的片段，和編碼這些多肽的長度至少為30個(gè)核苷酸的多核苷酸分子。通過已知的篩選方法，如通過消化完整的蛋白質(zhì)或合成較小的重疊多肽或多核苷酸(和表達(dá)后者)，選擇性地與以上描述的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)相結(jié)合的方法鑒定這種類型的多肽。然后測定這些產(chǎn)生的多肽特異地結(jié)合MPL受體和通過MPL受體刺激細(xì)胞增生的能力。通過常規(guī)的方法測定結(jié)合能力，如Klotz公開的方法(Science 2171247，1982(“Scatchard analysis”))。簡單地講，在增加濃度的未標(biāo)記的TPO存在下，把放射性標(biāo)記的試驗(yàn)多肽與帶有MPL受體的細(xì)胞一起培養(yǎng)。用通過鄰苯二甲酸酯油狀物的離心方法把與細(xì)胞結(jié)合的，標(biāo)記的多肽與未標(biāo)記的多肽分離開來。根據(jù)縱座稱上結(jié)合未標(biāo)記物對橫座標(biāo)上結(jié)合標(biāo)記物的比率作圖，測定試驗(yàn)多肽的結(jié)合親和力。通過與細(xì)胞因子(而不是TPO)的競爭測定結(jié)合特異性。通過由MPL受體(或其結(jié)合配體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)沉淀試驗(yàn)化合物也可測定受體結(jié)合。簡單地講，將受體或它的一部分固定于一種不溶性的支持物上。例如，就一個(gè)重組的試驗(yàn)化合物而言，通過代謝標(biāo)記寄生細(xì)胞或通過常規(guī)的體外標(biāo)記方法(例如放射性碘化作用)，對試驗(yàn)化合物進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記的化合物再與固定化受體相結(jié)合，去掉未結(jié)合的物質(zhì)，檢測結(jié)合的標(biāo)記化合物。本領(lǐng)域中已知檢測種種標(biāo)記物的方法。用帶有MPL受體的細(xì)胞用MTT比色試驗(yàn)法常規(guī)測定細(xì)胞增生的刺激作用。在各種濃度下，典型地在一個(gè)從1nm至1nm的范圍內(nèi)測定多肽的活性。
(本發(fā)明)也提供了多達(dá)50個(gè)或更多個(gè)殘基、優(yōu)選地100個(gè)或更多個(gè)殘基，更優(yōu)選地約140個(gè)或更多個(gè)殘基以及多達(dá)整個(gè)成熟蛋白質(zhì)大小的多肽。例如，對SEQ ID No2中所示的從第51個(gè)至第195個(gè)殘基(這兩個(gè)氨基酸殘基也包括在內(nèi))的氨基酸序列和SEQ ID No19中所示的從第28個(gè)至第172個(gè)殘基(這兩個(gè)氨基酸殘基也包括在內(nèi))的氨基酸序列的分析和模型建立表明所述分子的這些部分是類似于細(xì)胞因子一樣的可自我裝配的結(jié)構(gòu)域。含有這種核心的類似于細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)域加上最初翻譯產(chǎn)物的一個(gè)或更多個(gè)區(qū)段或結(jié)構(gòu)域的這些分子也是重要的。因此，重要的其他多肽包括表3中所示的那些多肽分子。
表3小鼠TPO (SEQ ID NO2)Cys (殘基51 )--Val(殘基196)Cys (51)-- Pro(206)
Cys (51) --Thr (379)Ser (45) --Cys (195)Ser (45) --Val (196)Ser (45) --Pro (206)Ser (45) --Thr (379)Met (24) --Cys (195)Met (24) --Val (196)Met (24) --Pro (206)Met (24) --Thr (379)Met (1) --Cys (195)Met (1) --Val (196)Met (1) --Pro (206)Met (1) --Thr (379)人TPO (SEQ ID NO19)Cys (28) --Val (173)Cys (28) --Arg (175)Cys (28) --Gly (353)Ser (22) --Cys (172)Ser (22) --Val (173)Ser (22) --Arg (175)Ser (22) --Gly (353)Met (1) --Cys (172)Met (1) --Val (173)Met (1) --Arg (175)Met (1) --Gly (353)本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到這些分子的中間形式(如具有SEQID No2中的第196和206殘基之間的C-末端的或具有SEQ IDNo19中的第22和28個(gè)殘基之間的N-末端的那些分子)也是重要的，以上所述的具有一個(gè)或更多氨基酸替換，缺失，插入，或N-端或C-端延伸的那些多肽同樣如此。因此，本發(fā)明提供的血細(xì)胞生成多肽長度至少為10個(gè)氨基酸殘基，較好的是至少為50個(gè)殘基，更好的是至少為100個(gè)殘基，最好的是至少為約140個(gè)殘基，其中所述多肽與SEQ ID No2或SEQ ID No19中的類似大小的多肽實(shí)質(zhì)上是同源的。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在遺傳工程的寄生細(xì)胞中通過常規(guī)的技術(shù)產(chǎn)生。穩(wěn)定的寄生細(xì)胞是那些可以被外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染及能人工培養(yǎng)的細(xì)胞類型，包括細(xì)菌，真菌細(xì)胞和培養(yǎng)的高等真核細(xì)胞。操作克隆的DNA分子和向各種寄生細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)由Sambrook et al.，Mokcular CloningA Laboratory Manual，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，和Ausubel et al.，同上公開，這些文獻(xiàn)本文一并參考。
一般來說，編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA序列在操作上可與表達(dá)載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子相連結(jié)。載體一般包含一個(gè)或更多個(gè)選擇標(biāo)記和一個(gè)或更多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，盡管本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到在某些系統(tǒng)內(nèi)，選擇標(biāo)記可以提供于各個(gè)單獨(dú)的載體上，并且通過整合到寄生細(xì)胞基因組中可以提供外源DNA的復(fù)制。啟動子、終止子、選擇標(biāo)記、載體和其他因子的選擇是日常設(shè)計(jì)的事情，都在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的水平之內(nèi)。許多這種因子在文獻(xiàn)中已有描述，并可通過商業(yè)供應(yīng)商獲得。
為了把本發(fā)明的蛋白質(zhì)導(dǎo)入到一些寄生細(xì)胞的分泌途徑中，在表達(dá)載體中提供了一種分泌信號序列(也稱前導(dǎo)序列，前置序列或前序列)。分泌信號序列以正確的閱讀框架與編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的DNA序列相連。分泌信號序列一般地位于編碼興趣蛋白質(zhì)的DNA序列的5’端，雖然某些信號序列可以位于興趣DNA序列的其他地方(參見，例如，Welch et al.，美國專利5,037，743；Holl andet al，美國專利5,143,830)。分泌信號序列可能是與本發(fā)明的蛋白質(zhì)通常相有關(guān)的序列，或可從編碼其他分泌蛋白的基因而來。
酵母細(xì)胞(尤其是糖酵母屬的細(xì)胞)是本發(fā)明內(nèi)使用的一種優(yōu)選寄生。用外源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞及從中產(chǎn)生重組蛋白的一些方法已有描述，例如，Kawasaki，U.S.Patent No.4,599,311；Kawasaki et al.，美國專利4,931,373；Brake，美國專利4,870,008；Welch et al.，美國專利5,037,743；and Murray et al.，美國專利4,845,075，這些文獻(xiàn)本文一并參考。根據(jù)選擇性標(biāo)記(一般為藥物抗性或在缺乏某種特定營養(yǎng)因子(如亮氨酸)的條件下生長的能力)測定的表現(xiàn)型選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在酵母中，一個(gè)優(yōu)選使用的載體系統(tǒng)是Kawasaki等(美國專利4,931,373)詳細(xì)描述的POT1載體系統(tǒng)，它允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞在含葡萄糖的培養(yǎng)基中選擇性生長。酵母中使用的一種優(yōu)選分泌信號序列是S.Cerevisiae MFα1基因序列(Brake，ibid；Kurjan et al.，美國專利4,546,082)。適合于酵母中使用的一些啟動子和終止子包括那些來源于酵解酶的基因的那些(參見，例如，Kawasaki，美國專利4,599,311；Kingsman et al.，美國專利4,615,974；and Bitter，美國專利4,977,092，本文一并參考)和酒精脫氫酶基因的那些。也參見美國專利4,990,446；5,063,154；5,139,936 and 4,661,454，這些文獻(xiàn)本文一并參考。供其他酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括本領(lǐng)域中已知的多形漢遜氏酵母、粟酒裂殖糖酵母、乳克魯維氏酵母、脆壁克魯紙氏酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德畢赤氏酵母、季也蒙氏畢赤氏酵母和麥芽糖假絲酵母。參看，例如，Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol 1323459-3465，1986和Cregg，美國專利4,882,279。
其他的真菌細(xì)胞也適合作為寄生細(xì)胞。例如，可按照Mcknight等美國專利4,935,349 本文一并參考)公開的方法使用。曲霉屬細(xì)胞。轉(zhuǎn)化Acremonium Chrysogenum的方法已由Sumino等，美國專利5,162,228公開。
培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞也是本發(fā)明內(nèi)的優(yōu)選寄生。外源DNA導(dǎo)入哺乳動物寄生細(xì)胞的方法包括磷酸鈣一介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler etal.，Cell 14725，1978；Corsaro and Pearson，Somatic CellGenetics 7603，1981Graham and Van der Eb，Eb，Virology52456，1973)，電擊穿(Neumann et al.，EMBO J.1841-845，1982)和DEAE-葡萄糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiky and Sons，Inc.，NY，1987)，這些方法本文一并參考，培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生已被公開，例如，被Levinson et al.，美國專利4,713,339；Hagen et al.，美國專利4,784,950；Palmiter et al.，美國專利4,656,134(本文在此一并參考)公開。優(yōu)選培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞包括COS-1(ATCC No.CRL1650)，COS-7(ATCCNo.CRL1651)，BHK (ATCC No.CRL1632)，BHK570 (ATCCN.CRL10314)，293(ATCC No.CRL1573；Graham et al.，J.Gen.Virol.3659-72，1977)和中國倉鼠卵巢(例如CHO-K1；ATCC No.CCL61)細(xì)胞系。另外合適的細(xì)胞系在本領(lǐng)域中已公知，并可從一些公共菌種保藏中心(如American Type CultureCollection，Rockville，Maryland)得到。一般來說，較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄起動子是優(yōu)選的，如SV-40或涎腺病毒的啟動子。參見，例如，美國專利4,956,288。其他合適的啟動子包括那些金屬硫蛋白基因來源的啟動子(美國專利4,579,821和4,601,978，在此一并參考)和腺病毒主要晚期啟動子。
藥物抗性一般用來選擇已插入外源DNA的人工培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。這些細(xì)胞一般被稱為“轉(zhuǎn)染子”。在選擇性因子存在下能被培養(yǎng)且能把興趣基因傳遞給其后代的細(xì)胞被稱之為“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子”。一個(gè)優(yōu)選的選擇標(biāo)志是編碼抗新霉素抗生素的基因。在一種新霉素類藥物，(如G-418或其類似藥物)存在的情況下進(jìn)行選擇。選擇系統(tǒng)也可被用來增加興趣基因的表達(dá)水平(被稱之為“擴(kuò)增”的過程)。擴(kuò)增的實(shí)施是通過在低水平的選擇因子存在下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子，然后增加選擇因子的劑量以選擇那些產(chǎn)生高水平的導(dǎo)入基因產(chǎn)物的細(xì)胞。一種優(yōu)選的擴(kuò)增選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶，它可賦予氨甲蝶吟抗性。也可用其他的藥物抗性基因(例如，潮霉素抗性，多藥物抗性，嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。
其他的高等真核細(xì)胞也可被用作寄主細(xì)胞，這些細(xì)胞包括昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞和鳥類細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和其中外源蛋白的產(chǎn)生已被公開(Guarino et al.，美國專利5,162,222；Bang et al.，U.S.美國專利4,775,624；和WIPO出版物 WO 94/06463，本文一并參考)。使用發(fā)根病土壤桿菌作為植物細(xì)胞基因表達(dá)的一種載體已由Sinkar 等評述(Sinkar et al.，J.Biosci.(Bangalore)1147-58,1987)。
在實(shí)施本發(fā)明中，盡管芽孢桿菌屬和其他一些屬的細(xì)菌也有用處，但優(yōu)選使用的原核寄主細(xì)胞為細(xì)菌大腸桿菌的一些菌株。在本領(lǐng)域中已熟知轉(zhuǎn)化這些寄主和表達(dá)在其中已克隆的外源DNA序列的一些方法(參看，例，Sambrook et al.，同上)。當(dāng)在象大腸桿菌細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)一般作為不溶性顆粒保持在細(xì)胞質(zhì)中，或通過一種細(xì)菌分泌序列指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌至外周胞質(zhì)空間中。在前一種情形下，裂解細(xì)胞，回收這些顆粒并使用例如異硫氰酸胍進(jìn)行變性。通過稀釋變性劑，然后使變性的蛋白質(zhì)重新折疊。在后一種情形下，通過破碎細(xì)胞(如通過超聲波或滲壓震擾)以釋放外周胞質(zhì)的內(nèi)含物和回收蛋白質(zhì)的方法，可從外周胞質(zhì)中回收可溶性和功能形式的蛋白質(zhì)。
按照常規(guī)方法，在含有營養(yǎng)素和選擇的寄主細(xì)胞生長所必需的其他成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的寄主細(xì)胞。本領(lǐng)域中已公知一些合適的培養(yǎng)基，包括限定培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基，一般包括碳源，氮源，必需氨基酸，維生素和礦物質(zhì)。若需要的話，培養(yǎng)基也含有一些象生長因子或血清一類的成分。例如，含有外源添加的DNA的細(xì)胞的生長培養(yǎng)基一般通過藥物選擇或必需營養(yǎng)物缺乏未選擇，該營養(yǎng)物缺乏可通過表達(dá)載體上攜帶的或共轉(zhuǎn)染到寄主細(xì)胞的選擇標(biāo)記補(bǔ)充。
在本發(fā)明中，可使用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)生產(chǎn)TPO。最好產(chǎn)生雌性哺乳動物寄主乳腺內(nèi)的一些蛋白質(zhì)。在乳腺中的表達(dá)和興趣蛋白隨后向奶中的分泌可克服在從其他來源分離蛋白質(zhì)過程中遇到的許多困難。奶易于收集，可大量獲得，并且可很好地作生化特性分析。而且，主要的奶蛋白高濃度地存在于奶中(約1至15g/L)從商業(yè)觀點(diǎn)來看，很顯然最好是使用具有高產(chǎn)量奶的寄主物種。盡管可使用一些象小鼠和大鼠一類的小動物(和最好是在proof-of-concept階段)，但在本發(fā)明內(nèi)，最優(yōu)選使用的牲畜動物包括但不限于豬、山羊、綿羊和牛。綿羊?yàn)樘貏e優(yōu)選的動物，這是由于這種動物已有轉(zhuǎn)基因的先前歷史，奶的產(chǎn)量，和很容易得到收集羊奶的設(shè)備等因素。為比較影響寄生物種選擇的一些因素?？蓞⒁奧IPO出版物WO 88/00239。一般較理想的是選擇一種為生產(chǎn)奶而飼養(yǎng)的寄主動物，如East Friesland山羊，或在較晚的時(shí)期通過繁育轉(zhuǎn)基因品系采用供奶家畜。無論如何，應(yīng)該使用已知的健康狀況良好的動物。
為了在乳腺中表達(dá)，可使用來源于奶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄起動子。奶蛋白基因包括那些編碼酪蛋白(參見美國專利5,304,489，本文一并參考)、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和乳清酸性蛋白的基因。就綿羊的β-乳球蛋白基因來說，一般使用至少近406bp的5’側(cè)翼序列的區(qū)域(盡管優(yōu)選使用5’側(cè)翼序列的多達(dá)約5Kbp的較大部分)，如包含β-乳球蛋白基因的5’側(cè)翼啟動子和非編碼部分的一個(gè)4.25Kbp DNA區(qū)段。參看Whitelew et al.，Biochem J.28631-39，1992。源于其他動物種類啟動子DNA的類似片段也是合適的。
如同欲實(shí)現(xiàn)表達(dá)的基因的基因組區(qū)域一樣，β-乳球蛋白基因的其它區(qū)域也可結(jié)合于構(gòu)建載體中。本領(lǐng)域一般認(rèn)為，缺少內(nèi)含子的構(gòu)建體當(dāng)與那些含有這些DNA序列的構(gòu)建體相比較時(shí)，其表達(dá)水平很低(參見Brinster et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85836-840，1988；Palmiter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88478-482，1991；Whitelaw，et al.，Transgenic Res.13-13，1991；WO 89/01343；WO 91/02318)。在這一點(diǎn)上，可能的情況下一般優(yōu)選使用含編碼興趣蛋白或多肽的基因的所有或某些天然內(nèi)含子的基因組序列，因此，優(yōu)選的是進(jìn)一步包括如β-乳球蛋白基因的至少某些內(nèi)含子。一種這樣的區(qū)域是一個(gè)DNA片段，該DNA片段從綿羊的β-乳球蛋白基因的3’非編碼區(qū)提供內(nèi)含子的拼接和RNA聚腺酸化。當(dāng)用一個(gè)基因天然的3’非編碼序列代替時(shí)，該綿羊的β-乳球蛋白片段可以增加和穩(wěn)定所述興趣蛋白或多肽的表達(dá)水平。在其他的實(shí)施方案中，TPO序列起始ATG周圍的區(qū)域被一個(gè)特定奶蛋白基因的相應(yīng)序列替換。這種替換提供了一種推定的組織特異性的起始環(huán)境，以增強(qiáng)表達(dá)。雖然可以替換較小的區(qū)域，但較便利的是用那些如BLG基因的一些序列代替完整的TPO前(pre-pro)和5’非編碼序列。
為了在轉(zhuǎn)基因動物中表達(dá)TPO，將編碼TPO的DNA區(qū)段操作連接到其表達(dá)產(chǎn)生表達(dá)單位所必需的附加DNA區(qū)段上。這些附加片段包括上述提到的啟動子以及提供轉(zhuǎn)錄終止和mRNA聚腺苷酸化的序列。表達(dá)單位還包括編碼分泌信號序列的DNA片段，該分泌倍號序列可操作地與編碼TPO的片段相連結(jié)。分泌信號序列可以是天然的TPO分泌信號序列或者是另一蛋白(如奶蛋白)的分泌信號序列。參見，例如，Von Heinje，Nuc.Acids.Res.144683-4690，1986；and Meade et al.，U.S.Patent No.4,873,316(本文一并參考)。
供轉(zhuǎn)基因動物中使用的表達(dá)單位的構(gòu)建可很方便地通過向質(zhì)?；蚝郊覦NA區(qū)段的噬菌體載體中插入TPO序列得以完成(盡管本質(zhì)上通過任何連接的序列可以構(gòu)建表達(dá)單位)。尤為方便的是提供一種含編碼奶蛋白的DNA區(qū)段的載體和用TPO多肽的編碼序列代替此奶蛋白的編碼序列，由此創(chuàng)造包括此奶蛋白基因的表達(dá)控制序列的基因融合。無論如何，在質(zhì)?；蚱渌妮d體中克隆表達(dá)單位使TPO序列的擴(kuò)增很便利。在細(xì)菌(如大腸桿菌)寄主細(xì)胞中可方便地實(shí)施擴(kuò)增，因此，載體一般地包括在細(xì)菌寄主細(xì)胞中發(fā)揮功能的一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)選擇標(biāo)記。
然后將表達(dá)單位導(dǎo)入選擇的寄主動物種的受精卵(包括早期胚胎)中。異源DNA的導(dǎo)入由幾種路徑之一完成，包括顯微注射(例，美國專利4,873,191)，逆轉(zhuǎn)錄侵染(Jaenisch，Science2401468-1474，1988)或用胚胎干(ES)細(xì)胞的點(diǎn)指導(dǎo)整合(reviewed by Bradley et al.，Bio/Technology 10534-539，1992)。然后將這些受精卵種植于假孕性動物的輸卵管或子宮中，并讓其發(fā)育至分娩期。在其種系中攜帶導(dǎo)入DNA的后代可按正常的孟德爾規(guī)律把DNA傳遞給子代，并讓轉(zhuǎn)基因獸群發(fā)育。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的一般步驟在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如，Hogan et al.，Manipulating the mouse EmbryoA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1986；Simons et al.，Bio/technology 6179-183，1988；Wall et al，Biol.Reprod.32645-651，1985；Buhler et al.，Bio/Technology 8140-143，1990；Ebert et al.，Bio/Technology 9835-838，1991；Krimpenfort et al.，Bio/Technology 9844-847，1991；Wall et al，J.Cell. Biochem.49113-120，1992；美國專利4,873,191 and 4,873,316；WIPO出版物WO 88/00239，WO 90/05188，WO 92/11757；and GB 87/00458，這些文獻(xiàn)本文一并參考。向哺乳動物或其種系中導(dǎo)入外源DNA序列的技術(shù)最早是在小鼠上建立的。參見，例如，Gordon and Ruddle，Science 214l244-1246， 1981；Palmiter and Brinster，Cell41343-345，1985；Brinster et al.， Proc. Natl. Acad. Sci.USA824438-4442，1985；和Hogan et al.(同上)。后來這些技術(shù)被用于一些較大的動物，包括家畜物種(參看，例WIPO出版物 WO，Bio/Technology 6179-183，1988)?？傊?，在至今使用的最有效的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠或家畜的途徑中，按照本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，已有幾百種興趣線性DNA分子被注射到受精卵的前核酸中。DNA也可以注射到合子中。
也可利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)。表達(dá)可在整個(gè)植物或特定的器官(如塊莖)中進(jìn)行。參見，Hiatt，Nature 344469-479，1990；Edelbaum et al.，J.Interferon Res. 12449-453，1992；Sijmons etal.，Bio/Technology 8217-221，1990；和歐洲專利局出版物EP255,378。
按照本發(fā)明的方法制備的TPO一般用本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行提純，如根據(jù)蛋白質(zhì)的大小、電荷和可溶性和其他性質(zhì)的親和純化和分離。當(dāng)在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中生產(chǎn)時(shí)，優(yōu)選在無血清培養(yǎng)其中培養(yǎng)，以限制污染蛋白質(zhì)的量。收獲培基并對其進(jìn)行分級分離，優(yōu)選對分級分離的方法包括伴刀豆蛋白A和其他凝聚素上的親和層析，從而利用存在于蛋白質(zhì)上的碳水化合物。利用固定化的MPL受體蛋白或其配體結(jié)合部分或利用親和標(biāo)記(如多聚組氨酸，物質(zhì)P或可獲得其抗體或其他特異性結(jié)合因子的其他多肽或蛋白質(zhì))，也可純化蛋白質(zhì)。在興趣蛋白質(zhì)和親和標(biāo)記之間可提供一個(gè)特異的切割位點(diǎn)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于治療學(xué)上，無論用于什么地方，它們對增加骨髓細(xì)胞的增生都是理想的，如在治療白細(xì)胞減少癥(如由再生障礙性貧血、髓樣發(fā)育不全綜合癥、化學(xué)療法或先生性白細(xì)胞減少引起的)中；骨髓移植病人中；周圍血干細(xì)胞移植病人中；和在治療引起骨髓衰竭疾病(如骨髓發(fā)育不良綜合癥)。這些蛋白質(zhì)對增加血小板的產(chǎn)生也是有用的，如在治療血小板減少癥中。血小板減少癥與多種多樣的疾病和臨床癥狀有關(guān)，這些疾病或臨床癥狀可單獨(dú)或協(xié)同作用產(chǎn)生這種狀況(即血小板減少)。例如，較低的血小板計(jì)數(shù)可能由例如血小板產(chǎn)生缺陷(由于例如，先天失調(diào)，如Fanconi綜合癥、血小板減少綜合癥、Wiskott Aldrich、MayHegglin異常、Bernard-Soulier綜合癥，Menneapolis綜合癥，Epstein綜合癥、Montreal血小板綜合癥和Eckstein綜合癥)、血小板異常分布、因大量輸血引起的稀釋損失、血小板的異常破壞或脾機(jī)能亢進(jìn)病人的脾臟中血小板的異常分離(sequestration)(由于例如，肝硬變或充血性的心臟衰竭)引起。例如，癌癥治療中使用的化療藥物可抑制骨髓中血小板先祖細(xì)胞的發(fā)育，由此產(chǎn)生的血小板減少限制了化學(xué)治療且必須為病人輸血。此外，某些惡性腫瘤可損害血小板的產(chǎn)生和血小板分布。用于殺死惡性細(xì)胞的輔射療法也可殺死血小板先祖細(xì)胞。血小板減少癥也可由各種血小板自身免疫失調(diào)(藥物、新生的異源免疫、血小板輸血異源免疫和病毒(包括HIV)侵染引起的)引起。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可減少或排除對輸血的需要。并由此減少血小板異源免疫的發(fā)生。血小板的異常破壞可因下列原因造成(1)血管移植或創(chuàng)傷組織的增加的血小板消耗；或(2)與例如藥物誘導(dǎo)的血小板減少、自發(fā)性血小板減少的紫癜病(ITP)、自身免疫疾病、血液失調(diào)癥(例如與骨髓有關(guān)的白血病、淋巴細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性癌癥)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的其他適應(yīng)癥包括再生障礙性貧血和藥物引起的骨髓抑制(例如，因化療或用AZT治療HIV感染而造成的)。
血小板減少癥表現(xiàn)為增加出血，如鼻一口區(qū)域或腸胃道的出血或傷口、潰瘍或注射位點(diǎn)的血的滲出。
為了藥學(xué)用途，除本發(fā)明的蛋白質(zhì)按常規(guī)的方法配制成供腸胃外的(尤其是靜脈或皮下)釋放的制劑。靜脈施藥典型地以一至幾個(gè)小時(shí)的期限通過藥團(tuán)(bolus)注射或灌輸?？傊?，藥物配方將包括與藥理學(xué)上可接受的載體(如鹽溶液，緩沖鹽溶液，溶于水的5％的葡聚糖或類似物)相結(jié)合的血細(xì)胞生成蛋白。配方可另外包括一種或幾種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑、白蛋白等等，以防止小藥瓶表面上蛋白質(zhì)的損失。此外，本發(fā)明的血細(xì)胞生成蛋白也可與其他的細(xì)胞因子組合，尤其是早期作用的細(xì)胞因子，如干細(xì)胞因子、IL-3、II-6、IL-11或GM-CSF。當(dāng)利用這樣一種組合療法時(shí)，細(xì)胞因子可以在一種單獨(dú)的配方中組合，或在不同的配方中施用。配方的配制方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，ed.，MackPublishing Co.，Easton PA，1990(本文一并參考)中公開。治療劑量一般在每天每kg病人體重0.1-100μg的范圍內(nèi)，優(yōu)選劑量為每天每公斤0.5-20μg，準(zhǔn)確的劑量由臨床醫(yī)師按接受的標(biāo)準(zhǔn)，考慮到治療病情的性質(zhì)和嚴(yán)重度，病人的特點(diǎn)等等確定。劑量的確定在本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的水平范圍之內(nèi)。所述蛋白質(zhì)一般在化療或骨髓移植后達(dá)28天的時(shí)間期限內(nèi)或直到血小板數(shù)量大于20,000/m3、優(yōu)選大于50,000/m3時(shí)施用。更普遍地是所述蛋白質(zhì)在一周或更短(常常在一到三天期限內(nèi))施用?？傊?，TPO治療有效量為足以在臨床上顯著增加淋巴樣或髓樣先祖細(xì)胞的增生和(或)分化的量，其表現(xiàn)為成熟細(xì)胞(如血小板或嗜中性白細(xì)胞)的循環(huán)水平的增加。由此，將血小板失調(diào)的治療繼續(xù)至血小板數(shù)量至少達(dá)到20,000/m3，最好達(dá)到50,000/m3。本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可與其他的細(xì)胞因子(如IL-3、-6和-11；干細(xì)胞因子；紅細(xì)胞生成素；G-CSF和GM-CSF)結(jié)合施藥。在結(jié)合療法的方式內(nèi)，其他細(xì)胞因子的日劑量一般為EPO，≤150u/kg；GM-CSF，5-15μs/kg；IL-3，1-5μg/kg；和G-CSF，1-25μg/kg。例如，具有低水平EPO的貧血患者需要用EPO的結(jié)合療法。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也是體外研究造血細(xì)胞的分化和發(fā)育(如闡明細(xì)胞分化的機(jī)制和測定成熟細(xì)胞的譜系)的寶貴工具；也可以找到在細(xì)胞培養(yǎng)中作為增生因子的用途。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可體外使用。如自體骨髓培養(yǎng)中。簡單地說，在化療之前從患者體中取出骨髓，用TPO處理，可與可不與一種或更多的其他細(xì)胞因子結(jié)合處理。處理的骨髓在化療之后再放回患者體中，以加快骨髓的恢復(fù)。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)也可用于骨髓或外周血先祖細(xì)胞(PBPC)的體外擴(kuò)增研究。在化療處理之前，用于細(xì)胞因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，讓早期先祖細(xì)胞釋放至外周循環(huán)中。從外周血液中收集和濃縮這些先祖細(xì)胞，然后用TPO培養(yǎng)處理，可與可不與一種或更多的其他細(xì)胞因子(包括但不限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11)結(jié)合處理，分化和增生至高密度的巨核細(xì)胞培養(yǎng)物，在高劑量的化療之后再把它放回患者體內(nèi)。
本發(fā)明也提供了結(jié)合蛋白質(zhì)上抗原決定簇的一些抗體。這些抗體可通過本領(lǐng)域中已知的各種方法產(chǎn)生。非人體的單克隆抗體的產(chǎn)生方法是熟知的，例如，通過用重組或合成的TPO或其選擇的多肽片段免疫動物(如小鼠、大鼠、兔子、山羊、綿羊或豚鼠)來完成。優(yōu)選用一種高度純化的蛋白質(zhì)或多肽片段免疫動物。為增強(qiáng)免疫反應(yīng)，用佐劑(如福氏佐劑)與蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合免疫動物也是優(yōu)選的。雖然一次注射抗原足以誘導(dǎo)動物體內(nèi)抗體的產(chǎn)生，但一般優(yōu)選開始大量注射一次后，緊接著在幾周到幾個(gè)月期間通過一次或多次加強(qiáng)注射免疫動物。參見，例如Hurrell，ed.，MonoclonalHybridoma AntibodiesTechniques and Applications，CRC PressInc.，Boca Raton，F(xiàn)L，1982 (在此一并參考)。從動物體中取血，使血液凝結(jié)成塊后，用常規(guī)的技術(shù)(如鹽析、離子交換層析、親和層析或高效液相色譜)從血清中分離抗體。
單克隆抗體的使用一般優(yōu)于多克隆抗體。單克隆抗體具有易于生產(chǎn)，特異性和可再生性的優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域中產(chǎn)生單克隆抗體的方法已熟知并已被公開(例如Kohler and Milstein，Nature 256495，1975.and Eur.J.Immunol.6511-519，1976)。也參見Hurrell，同上，和Hart，美國專利5,094,941(本文一并參考)。簡言之，使從免疫動物體內(nèi)獲得的產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞長期不斷地維持增殖狀態(tài)并篩選，或?yàn)榱伺cTPO結(jié)合的抗體的產(chǎn)生首先進(jìn)行篩選。通過用骨髓瘤細(xì)胞融合使陽性細(xì)胞存活。非人的抗體可以按已知的技術(shù)“人抗體化”。參見，例如美國專利4,816,397；歐洲專利局出版物173,494和239,400；和WIPO出版物WO 87/02671和WO90/00616，這些文獻(xiàn)本文在此一并參考。簡單地說，人的恒定區(qū)基因與合適的人的或非人的可變區(qū)基因相連。例如，代表母體(非人的)單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(CDRs或互補(bǔ)性一決定區(qū))的氨基酸序列與DNA水平上可被嫁接到人的可變區(qū)框架序列中。本領(lǐng)域中該技術(shù)的一些方法已熟知并已被公開(例如，Jones et al.，Nature 326522-525，1986；Richmann et al.Nature 322323-327，1988 and Queen et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033，1989)。然后用連接的基因轉(zhuǎn)染寄主細(xì)胞，再按常規(guī)的方法培養(yǎng)這些寄主細(xì)胞。或者，用克隆的人恒定區(qū)基因和同源重組產(chǎn)生的嵌合抗體基因轉(zhuǎn)染單克隆抗體產(chǎn)生細(xì)胞。因此，可能組裝成具有人的單克隆抗體重要部分結(jié)構(gòu)的單克隆抗體，由此提供更適合于用多種施藥方法施用給患者的抗體。
通過重組的，一般由可變區(qū)的輕鏈序列典型地通過接頭多肽與可變區(qū)的重鏈序列相連的多肽的表達(dá)產(chǎn)生單鏈抗體。產(chǎn)生單鏈抗體的方法在本領(lǐng)域中已公知，并由Davies等公開(Davies et al.Biotechnology 9165-169，1991)。
與TPO抗原決定簇結(jié)合的抗體是有用的，例如，在以血小板，巨核細(xì)胞或其他血細(xì)胞或先祖細(xì)胞的減少為特征的疾病診斷中，這些疾病與先祖細(xì)胞的增生或分化的缺乏癥有關(guān)。一般用常規(guī)的免疫試驗(yàn)方法(如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或輔射免疫試驗(yàn))通過測定血液或血漿實(shí)施這種診斷。這些類型的試驗(yàn)方法在本領(lǐng)域中已公知。參見，例如，Hart et al.，Biochem.29166-172，1990；Maet al.，British Journal of Hematology 80431-436，1992；and Andreet al.，Clin.Chem.38/5758-763，1992。TPO活性的診斷試驗(yàn)對鑒定最有可能受益于TPO治療的患者群體是有用處的。TPO的抗體在TPO的純化方面也有用處，如通過把抗體結(jié)合于固體支持物上(如包裝于柱子中的顆粒基質(zhì))，和用含蛋白質(zhì)的溶液過程。然后用合適的緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白?？傊鞍踪|(zhì)在較低離子強(qiáng)度和近中性pH的生理?xiàng)l件下結(jié)合于柱子上，然后用洗滌柱子，以洗脫未結(jié)合的污染物。結(jié)合蛋白的洗脫通過改變離子強(qiáng)度或pH值(如用3M KSCN(分批或梯度)或低pH的檸檬酸緩沖液)進(jìn)行。一般應(yīng)避免低于約2.5的pH值。
本發(fā)明也提供了一些產(chǎn)生大量的巨核細(xì)胞和血小板的方法，這些巨核細(xì)胞和血小板可用于制備cDNA文庫。由于血小板被導(dǎo)引到一些受傷位點(diǎn)，它們被認(rèn)為是傷口愈合的媒介，在某些情況下，為致病過程的媒介。因此，對血小板和巨核細(xì)胞分子生物學(xué)的詳細(xì)理解將洞察體內(nèi)平衡和血小板功能的臨床上有關(guān)的失調(diào)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)提供了一種改進(jìn)的產(chǎn)生巨核細(xì)胞或血小板cDNA文庫的方法。
將重組血小板生成素施用于動物或應(yīng)用于培養(yǎng)的脾或骨髓細(xì)胞時(shí)可引起來自前體細(xì)胞的巨核細(xì)胞的增生。在施用TPO后，巨核細(xì)胞和其前體的擴(kuò)增及巨核細(xì)胞成熟使高純度的和可供mRNA分離及cDNA文庫構(gòu)建的充足數(shù)量的巨核細(xì)胞的分離成為可能。通過調(diào)整TPO的劑量和施藥方式，可從原初脾或骨髓細(xì)胞選擇性地?cái)U(kuò)大早期或完全成熟的巨核細(xì)胞以及那些主動脫去血小板的巨核細(xì)胞。相應(yīng)地，按照巨核細(xì)胞生成早期、中期或晚期構(gòu)建代表性的cDNA文庫。
產(chǎn)生的cDNA文庫有許多用途。例如，這些文庫可用于在各種血小板功能失調(diào)中起作用的低豐度蛋白質(zhì)的鑒定和克隆。通過毫不費(fèi)力地對患者的巨核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和對其mRNA進(jìn)行分離分析，大大地幫助了對這些疾病的分子分析。這些文庫也是新型生長因子和具有潛在治療效用的蛋白質(zhì)的克隆來源。已克隆的有用的血小板蛋白包括從血小板來源的生長因子(Ross et al.，Cell 26155-169，1986)；轉(zhuǎn)化的生長因子(Miletich et al，Blood 541015-1023，1979；Roberts and Sporn，Growth Factors 81-9，1993)；血小板來源的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Miletich et al.，Blood 541015-1023，1979)和PF-4(Doi et al.，Mol Cell.Biol.7898-904，1987；Poncz et al.，Blood 69219-223，1987)。新型生長因子可通過表達(dá)cDNA文庫的功能篩選或用已知的生長因子探針在較低的嚴(yán)緊度下雜交篩選進(jìn)行鑒定。新型生長因子的分離通過利用與已知生長因子保守區(qū)域相對應(yīng)的簡并引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)完成。此外，對文庫系統(tǒng)和完整的DNA序列分析提供了巨核細(xì)胞cDNA序列的數(shù)據(jù)庫。這種數(shù)據(jù)庫可用于通過各種基于計(jì)算機(jī)的檢索規(guī)則系統(tǒng)挖掘一些有用序列。
根據(jù)上面描述制備的巨核細(xì)胞也可用于制備蛋白質(zhì)文庫。該蛋白質(zhì)文庫與其cDNA文庫互補(bǔ)。由蛋白質(zhì)文庫獲得的氨基酸序列信息使迅速分離編碼興趣蛋白cDNA成為可能。使用蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)DNA分離的引物可排除在常規(guī)的文庫制備方法中因相對的mRNA豐度引起的一些問題。蛋白質(zhì)和cDNA文庫的結(jié)合也推進(jìn)了特定興趣序列的目標(biāo)克隆。
通過從巨核細(xì)胞中按已知的方法提取蛋白質(zhì)，然后通過雙向凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，制備蛋白質(zhì)文庫。分離的蛋白質(zhì)然后經(jīng)過原位胰蛋白酶消化，接著通過微孔HPLC分離。然后分離的片段通過質(zhì)譜儀分析。通過與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫對比，對形成的質(zhì)量構(gòu)成進(jìn)行檢索，推導(dǎo)蛋白質(zhì)的同源性。未鑒定的肽通過Edman降解進(jìn)行序列分析。
cDNA和蛋白質(zhì)文庫是一些新的蛋白質(zhì)及編碼這些蛋白質(zhì)的寶貴來源。血小板被認(rèn)為是傷口愈合和在某些情況下發(fā)病的重要媒介。已對許多重要的血小板蛋白進(jìn)行了鑒定和特征描述，所述蛋白包括血小板來源的生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子-β，血小板來源的內(nèi)皮生長因子和血小板因子4。對其他血小板蛋白的鑒定和特征描述將非常有助于闡明傷口愈合和發(fā)病的基本過程，并預(yù)期產(chǎn)生一些重要的治療因子和策略。
正如下面將更加詳細(xì)描述的，人的TPO基因已被定位于染色體3q26上。這一信息與人TPO基因序列(SEQ ID No28)結(jié)合起來，通過遺傳篩選，可直接診斷TPO基因中的遺傳失調(diào)或其表達(dá)調(diào)節(jié)。這些失調(diào)包括導(dǎo)致表達(dá)水平上的增加或減少的啟動子序列的改變，編碼或非編碼區(qū)的染色體易位和TPO位點(diǎn)上的新的調(diào)節(jié)序列的并置?？蓱?yīng)用的診斷方法在本領(lǐng)域中已公知。例如，從基因組序列中可設(shè)計(jì)至少為5個(gè)核苷酸，優(yōu)選為15-30個(gè)或更多核苷酸長度的引物或雜交探針，用于檢測染色體畸變或測定mRNA水平。各種合適的檢測和測定方法在本領(lǐng)域中已公知，這些方法包括“Southern”印跡，聚合酶鏈反應(yīng)(Mullis，美國專利4,683,202)，和連接酶鏈反應(yīng)(Barany，PCR Methods and Applications 15-16，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1991)。例如，用一種或多種限制性酶消化患者DNA并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，產(chǎn)生Southern印跡。再用探針探查印跡，檢測因限制性位點(diǎn)識別序列突變產(chǎn)生的片段大小的總的變化。在另一種方法中，對異?；蛐蛄械姆治黾罢：彤惓Ｐ蛄械谋容^可設(shè)計(jì)用于鑒定異?；?如斷裂的或易位的)的引物。通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增患者DNA，檢測表示正?；蛱卣鞯幕蛱囟ɑ蛑嘏诺臄U(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明通過下面非限制性的實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例I.人MPL受體cDNAs的分離利用設(shè)計(jì)的與已發(fā)表的編碼受體的氨基和羧基末端序列(Vigon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895640-5644)相對應(yīng)的引物，通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從人的紅細(xì)胞白血病細(xì)胞(HEL)(Martin and Papayannopoulu，Science 2161233-1235，1982)中分離人MPL-P和MPL-K受體同種型編碼cDNA。利用引物ZC5499(SEQ ID No3)從polyd(T)-選擇的poly(A)+RNA合成模板HEL細(xì)胞cDNA。濃度為1μg/ml的13μl的HEL細(xì)胞poly(A)+RNA與3μl的20pm/μl第一條鏈引物ZC5499(SEQ ID No3)混合，混合物在65℃下加熱4分鐘，置于冰上冷卻。
通過加入8μl的第一條鏈緩沖液(250mM Tris-HCl，pH8.3，375mMKCl，15mM MgCl2)(5×SUPERSCRIPTTM緩沖液；GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)，4μl的100mM二硫蘇糖醇和3μl的一種雙脫氧核苷酸三磷酸溶液(各含10mM的dATP，dGTP，dTTP和5-甲基-dCTP)(Pharmacia LKBBiotechnology Inc.，Piscataway，NJ)開始第一條鏈的合成。反應(yīng)混合物在45℃下溫育4分鐘后，加入10μl的200U/μl的RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(SUPERSCRIPTTM逆轉(zhuǎn)錄酶，GIBCO BRL)至RNA-引物混合物中。反應(yīng)液再于45℃下溫育1小時(shí)，接著在50℃下溫育15分鐘。加入60μl的TE(10mM TrisHCl，pH8.0，1mMEDTA)至反應(yīng)液中，再在400孔徑大小的凝膠過濾柱子(CHROMA SPIN+ TE-400TM；Clontech Laboratories Inc.Palo Alto，CA)上通過層析去除多余的引物。
利用與編碼受體蛋白的氨基和羧基末端區(qū)域(Vigon et al.，同上)相對應(yīng)的引物，用第一條鏈HEL細(xì)胞的cDNA作為模板，擴(kuò)增人的MPL-P受體cDNA。每個(gè)引物中各包含一個(gè)不同的限制性酶切割位點(diǎn)，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的定向克隆(ZC5746，SEQ IDNo4，含有一個(gè)EcoRI位點(diǎn)；ZC5762，SEQ ID No5，含有一個(gè)XhoI位點(diǎn))。準(zhǔn)備一種100μl的反應(yīng)混合液，其中含10mg的模板cDNA，50pM的每種引物；200μM的各種脫氧核苷酸三磷酸(Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.)；1μl的10×PCR緩沖液(Promega Corp.Madison，WI)；和10個(gè)單位的Taq聚合酶(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)。聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(95℃1分鐘，60℃1分鐘和72℃2分鐘為一個(gè)循環(huán)，在每個(gè)連續(xù)循環(huán)再加1秒鐘)，然后于72℃下溫育10分鐘。
通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增從HEL細(xì)胞cDNA中分離人的MPL-K受體cDNA，其分離方式與以上描述的MPL-P受體cDNA相同，只是用引物ZC5742(SEQ ID No6)代替引物ZC5762。PCR引物ZC5742為人的MPL-K cDNA的3′端所特有，并結(jié)合有一個(gè)便于克隆的XhoI位點(diǎn)。
反應(yīng)產(chǎn)物用苯酚/氯仿(1∶1)抽提兩次，然后用氯仿再抽提一次和乙醇沉淀。產(chǎn)物用EcoRI和XhoI消化之后，在0.8％的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(SEA PLAQUE GTGTM低熔點(diǎn)瓊脂糖；FMCCorp.，Rockland，ME)上分級分離。通過用β-瓊脂糖酶(NewEngland Biolabs，Inc.，Beverly，MA)消化凝膠基質(zhì)，從切下的凝膠帶中回收相當(dāng)于人MPL-P受體cDNA的一個(gè)1.9kb的擴(kuò)增產(chǎn)物和相當(dāng)于人MPL-k受體cDNA的一個(gè)1.7kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，再用乙醇沉淀。將上述分離的cDNAs再亞克隆到pBluescriptSK+(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)載體上，通過序列分析予以證實(shí)。
實(shí)施例II.小鼠MPL受體cDNA的分離從C57BL/KsJ-db/db小鼠體內(nèi)取出脾臟，立即置于液氮中。用異硫氰酸胍(Chirgwin et al.，Bioistry 1852-94，1979)處理脾臟組織，接著通過一個(gè)CsCl梯度離心步驟，從脾臟組織中制備總RNA。用Oligo-d(T)纖維素層析(Aviv and Leder，Proe.Natl.Acad.Sci.U.S.A 691408-1412，1972)分離脾臟的poly(A)+RNA。
濃度為1.7μg/ml的7.5μl的poly d (T)-選擇的poly(A)+小鼠脾RNA與含有一個(gè)Not限制性位點(diǎn)的3μl的20pM/μl第一鏈引物ZC6091(SEQ ID No7)混合?；旌衔镉?5℃下加熱4分鐘，然后置于冰上冷卻。通過向RNA一引物混合物中加入8μl的250mM Tris-HCl，pH8.3，375mM KCl，15mM MgCl2(5×S UPERSCIPTTM緩沖液；GIBCO BRL)，4μl的100mM的二硫蘇糖醇和3μl的各含有dATP、dGTPdTTP和5-甲基-dCTP(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)的脫氧核苷酸三磷酸溶液開始第一鏈cDNA的合成。反應(yīng)混合物于45℃下溫育4分鐘，再加10μl的200U/μl Rnase H-逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL)。在一個(gè)平行反應(yīng)中，通過向一個(gè)10μl反應(yīng)混合物等分樣中加入10μCi的32p-αdCTP以標(biāo)記反應(yīng)，分析第一鏈合成的效率。反應(yīng)液于45℃下溫育1小時(shí)，再于50℃下溫育15分鐘。在一個(gè)400孔徑大小的凝膠過濾柱(CHROMA SPIN+TE-400TM；ClontechLaboratories Inc.)中通過層析去除標(biāo)記反應(yīng)中未接合的32p-αd CTP。在8μg的糖原載體，2.5M的醋酸銨和2.5倍體積的乙醇存在時(shí)通過二次沉淀除去掉未標(biāo)記的第一鏈反應(yīng)中未結(jié)合的核苷酸。將未標(biāo)記的cDNA重新懸浮于50μl的水中，用于第二鏈的合成。通過瓊脂糖凝膠電泳測定標(biāo)記的第一鏈cDNA的長度。
在啟動的第一鏈指導(dǎo)第二鏈合成產(chǎn)生DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的條件下，據(jù)第一鏈進(jìn)行第二鏈的合成。在室溫下和由50μl未標(biāo)記的第一鏈cDNA，16.5μl的水，20μl的5×聚合酶I緩沖液(100mMTrisi Hcl，pH7.4，500mMKCl，25mM MgCl2，50mM(NH4)2SO4)，1μl的100mM的二硫蘇糖醇，2μl的含有各種脫氧核苷酸三磷酸的溶液，3μl的5mM β-NAD，15μl的3U/μl的大腸桿菌DNA連接酶(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)和5μl的10U/μl的大腸桿菌DNA聚合酶I(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)組成的混合物中組裝反應(yīng)混合物。反應(yīng)液于室溫于溫育5分鐘，再加入1.5μl的2U/μl Rnase H (GIBCO BRL)，通過向10μl第二鏈合成混合物等分樣中加入10μCi的32p-αdCTP標(biāo)記平行反應(yīng)，以檢測第二鏈合成的效率。反應(yīng)液于15℃下溫育2小時(shí)，緊接著在室溫下溫育15分鐘。經(jīng)一個(gè)400孔徑大小的凝膠過濾柱(ClontechLaboratories，Inc)通過層析去除標(biāo)記反應(yīng)中未結(jié)合的32p-αdCTP，之后再通過瓊脂糖凝膠電泳分析。通過用苯酚/氯仿抽提二次和用氯仿抽提一次后，在2.5M醋酸銨存在時(shí)用乙醇沉淀來終止未標(biāo)記的反應(yīng)。
用綠豆核酸酶切剖具發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA。反應(yīng)混合物含100μl的第二鏈cDNA，20μl的10x的綠豆核酸酶緩沖液(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)，16μl的100mM的二硫蘇糖醇，51.5μl的水和12.5μl的以綠豆核酸酶稀釋緩沖液以1∶10稀釋的綠豆核酸酶(Promegc Corp；終濃度為10.5U/μl)。反應(yīng)于37℃下溫育15分鐘，通過加入20μl的1M TrisiHCl，pH8.0，再通過如上所述的相繼用苯酚/氯仿和氯仿抽提的方法終止反應(yīng)。抽提之后，用乙醇沉淀DNA并重新懸浮于水中。
重新懸浮的cDNA用T4DNA聚合酶補(bǔ)平。重新懸浮于190μl水中的cDNA與50μl5x的T4DNA聚合酶緩沖液(250mMTrisHCl，pH8.0，250mM Kcl，25mM MgCl2)，3μl 0.1的二硫蘇糖醇，3μl的含10M的各種脫氧核苷酸三磷酸的溶液和4μl的1U/μl的T4DNA聚合酶(Boehringer Mannheim Corp.，Indianapolis，IN)混合。在10℃下溫育1小時(shí)后，通過加入10μl的0.5M EDTA，接著用與上述描述相同的幾次苯酚/氯仿和氯仿抽提終止該反應(yīng)。通過一個(gè)400孔徑大小的凝膠過濾柱(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA)對DNA作層析處理，以除去微量蛋白質(zhì)和不倒400bp長度的較低的cDNAs。在12μg糖原和2.5M醋酸銨存在時(shí)用乙醇沉淀DNA，再重新懸浮于10μl的水中。根據(jù)滲入的32p-αdCTP，估計(jì)由12.5μg的起始mRNA模板合成的cDNA產(chǎn)量為～2μg。
在cDNA的5’末端連接EcoRI接頭，使之能夠克隆到入噬菌載體中。10μl等份的cDNA(約2μg)和10μl的65pM/μl的EcoRI接頭(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)與2.5μl 10x連接酶緩沖液(Promega Corp.)，1μl的10mM ATP和2μl的15U/μl T4DNA連接酶(Promega Corp.)混合，該反應(yīng)物于0℃-18℃的溫度范圍內(nèi)過夜(0℃-18℃)溫育，該反應(yīng)物再于12℃下溫育過夜。通過加入75μl的水和10μl的3M醛酸鈉，再于65℃下溫育30分鐘終止該反應(yīng)。溫育之后，cDNA用上述描述的苯酸/氯仿和氯仿抽提，用2.5M醛酸銨和1.2倍體積的異戊醇沉淀cDNA。離心之后，cDNA沉淀物用70％乙醇洗滌，空氣干燥，重新懸浮于89μl的水中。
為了便于cDNA向入噬菌體的定向克隆，用NotI消化cDNA，產(chǎn)生5’具有EcoRI和3’具有NotI的粘性末端的cDNA。cDNA3’端的NotI限制性位點(diǎn)已事先通過引物ZG6091(SEQ ID No7)引入。限制性酶的消化是在含有以上描述的89μl的cDNA，10μl的6mM TrisHCl，6mM MgCl2，150mM NaCl，1mM DTT(10x緩沖液D；Promega Corp.，Madison，WI)和1μl的12U/μl的NotI(Promega Corp.)的反應(yīng)物中進(jìn)行的。消化于37℃下進(jìn)行1小時(shí)。通過連續(xù)的苯酚/氯仿和氯仿抽提終止該反應(yīng)。cDNA經(jīng)乙醇沉淀，70％淀乙醇洗滌，空氣干燥，重新懸浮于20μl的1x含凝膠的緩沖液中(10nM TrisHCl，pH8.0，1mM DETA，5％甘油和0.125％的溴酚蘭)。
重新懸浮的cDNA加熱至65℃持續(xù)5分鐘，冰上冷卻，再于0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(SEA，PLAQUE GTGTM低熔點(diǎn)瓊脂糖；FMC Corp.)上電泳。從膠上切下來結(jié)合的接頭和低于1.6Kb長的cDNA。再把電極逆轉(zhuǎn)，電泳直至cDNA濃縮至泳道起點(diǎn)。切下含濃縮cDNA的凝膠部分，置于一個(gè)微量離心管中，測定膠條的大致體積。加入約為凝膠體積的三倍的水等分樣，再把瓊脂糖加熱至65℃持續(xù)15分鐘。當(dāng)樣品平衡至42℃時(shí)，加10μl的1U/μl的瓊脂酶I(New England Biolabs，Inc.)，混合物溫育90分鐘以消化瓊脂糖。溫育之后，加入40μl的3M醋酸鈉至樣品中，混合物再于冰上溫育15分鐘。以14,000g于室溫下離心樣品15分鐘，去除未消化的瓊脂糖。上清液中的cDNA經(jīng)乙醇沉淀，70％的乙醇洗滌，空氣干燥后，重新懸浮于37μl的水中，用于激酶反應(yīng)，使連接的EcoRI接頭磷酸化。
向上面描述的37μl cDNA溶液中加入10μl 10x連接酶緩沖液(Stratagene Cloning Systems)，再把反應(yīng)混合物加熱至65℃，持續(xù)5分鐘。于冰上冷卻該混合物，加入5μl的10mM ATP和3μl的10U/μl的T4多聚核苷酸激酶(Stratagene Cloning Systems)。反應(yīng)于37℃下溫育45分鐘， 通過加熱至65℃持續(xù)10分鐘，再用一連續(xù)的苯酚/氯仿和氯仿抽提終止該反應(yīng)。磷酸化的cDNA在2.5M醋酸存在時(shí)經(jīng)乙醇沉淀，用70％乙醇洗滌，空氣干燥和用12.5μl的水重新懸浮。經(jīng)估測，磷酸化的cDNA濃度約為40fmol/μl。
產(chǎn)生的cDNA克隆至購買的預(yù)先用EcoRI和NotI消化和在磷酸化的入噬菌體載體入ExCellTM(Pharmacia LKBBiotechnology Inc.)上。cDNA與載體的連接在包含2μl的20fmol/μl制備的入ExCellTM噬菌體臂，4μl的水，1μl 10x連接酶緩沖液(Promega Corp.)，2μl的40fmol/μl cDNA和1μl的15U/μlT4DNA連接酶反應(yīng)物中進(jìn)行，于4℃下連接48小時(shí)。按照銷售商提供的說明書，用GIGAPACKII Gold包裝提取物(StrategeneCloning Systems)，將約50％的連接混合物包裝至噬菌體中。產(chǎn)生的cDNA文庫含有超過1.5×107獨(dú)立的重組體，具有不到1.5％的非插入性的噬菌體的背景水平。
一個(gè)32p-標(biāo)記的人MPL-K受體cDNA探針用來從小鼠脾cDNA噬菌體文庫中分離小鼠MPL受體cDNA。cDNA文庫涂布于大腸桿菌的SURE細(xì)胞中(Stratagene Cloning Systems)，密度為每150mm直徑的平板40,000至50,000PFU。三十三個(gè)平板的噬菌斑轉(zhuǎn)移至尼龍膜上(Hybond NTM；Amersham Corp.，Arlington Heights，IL) 并按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行處理。處理的濾膜在真空爐中于80℃下烘烤2小時(shí)，再于洗滌緩沖液(0.25×SSC，0.25％SDS，1mM EDTA)中洗滌幾次，于雜交溶液(5×SSC，5×Dennhardt’s溶液，0.1％SDS，1mM EDTA和100μg/ml熱變性鮭魚精DNA)中在雜交箱(model HB-2；Techne Inc.，Princeton，NJ)中預(yù)雜交過夜。預(yù)雜交之后，棄去雜交溶液，用含有利用商業(yè)上提供的標(biāo)記試劑盒(MEGAPRIMETM試劑盒；Amersham Corp.，Arlington Heights，IL制備的約2×106cpm/ml的32p-標(biāo)記的人MPL-K cDNA的新鮮雜交溶液替換，探針加到雜交溶液之前于98℃下變性5分鐘，于65℃下雜交過夜。濾膜用洗滌緩沖液(0.25×SSC，0.25％SDS，1mMEDTA)于55℃下洗滌，在-70℃下，置于XAR-5膠片(KodakInc.，Rochester，NY)上用增感屏放射自顯影4天。用放射自顯影圖作為模板，從對應(yīng)于初級信號的平板區(qū)域中收獲瓊脂塞，浸泡于SM(0.1M NaCl；50mM TrisHCl，pH7.5，0.02％明膠) 中洗提噬菌體，以提純噬斑。七個(gè)經(jīng)噬菌斑提純的噬菌體被分離出來，它們攜帶的插入片段可與人MPL-K受體探針雜交。按照廠商提供的說明書。用體內(nèi)的重組系統(tǒng)收獲入ExCellTM噬菌體中含有的噬菌粒，通過DNA序列分析證實(shí)cDNA插入的同源性。
分離的克隆編碼的蛋白質(zhì)表現(xiàn)與人MPL-P受體和最近報(bào)道的小鼠MPL受體(Skoda et al.，EMBOJ.122645-2653，1993)的一種較高程度的序列同源性。七個(gè)克隆分為兩類，彼此互為不同，三個(gè)克隆缺失掉編碼近N-端的60個(gè)氨基酸殘基的序列，編碼沒有缺失的蛋白質(zhì)的cDNA稱為小鼠類型I受體cDNA。類型II受體cDNA缺乏編碼SEQ ID No17中的第131至190的氨基酸殘基的序列。此外，類型I和類型II受體不同于報(bào)道的小鼠MPL受體序列(Skoda et al.，ibid)，在于這兩類受體中存在一個(gè)編碼插入于第222個(gè)氨基酸殘基后的氨基酸殘基Val-Ary-Thr-Ser-Pro-Ala-Gly-Glu(SEQ ID No9)的序列，和在第241個(gè)位置上(位置指類型I小鼠受體)甘氨酸殘基被絲氨酸取代。
為了在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，把類型I和類型II小鼠MPL受體cDNAs亞克隆至質(zhì)粒載體pHZ-1上。質(zhì)粒pHZ-1為一種表達(dá)載體，它可用未在哺乳動物細(xì)胞中或蛙卵母細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中由體外轉(zhuǎn)錄的mRNA表達(dá)蛋白質(zhì)。PHZ-1表達(dá)單元由小鼠金屬硫蛋白-1啟動子，噬菌體T7啟動子(其兩側(cè)由含有供插入克隆序列的單一限制性位點(diǎn)的多克隆區(qū))，人生長激素終止子和噬菌體T7終止子。此外，pHZ-1還含有一個(gè)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)；一個(gè)細(xì)菌的β-內(nèi)酰酶基因；一個(gè)包含SV40啟動子和起點(diǎn)的哺乳動物可選擇標(biāo)記表達(dá)單位、一個(gè)新霉素抗性基因和SV40轉(zhuǎn)錄終止子。為了便于定向克隆至PHZ-1，使用合適的引物，用聚合酶鏈反應(yīng)分別在翻譯起始密碼子的上游和翻譯終止密碼子的下游創(chuàng)造一個(gè)EcoRI位點(diǎn)和一個(gè)XhoI位點(diǎn)。聚合酶鏈反應(yīng)在一種混合物中進(jìn)行，該混合物含有10μl 10x的ULTMATMDNA聚合酶緩沖液(Roche MolecularSystems，Inc.，Brainchburg，NJ)，6μl的25mM MgCl2，0.2μl的含各10mM的dATP、dGTP、dGTTP和dCTP(PharmaciaLKB Biotechnology Inc.)的脫氧核菌酸三磷酸溶液，2.5μl的20pmol/ml引物ZC6603(SEQ ID No8)，2.5μl的20pmol/μl引物ZC5762(SEQ ID No5)，32.8μl的水，1μl的含類型I或類型II小鼠MPL受體質(zhì)粒的較早的對數(shù)期的細(xì)菌培養(yǎng)物，1μl的6 U/μl DNA聚合酶(ULTMATM聚合酶；Roche MolecularSystems，Inc.，Branchburg，NJ.)。在反應(yīng)中按廠商的說明使用AmpliwaxTM(Roche Molecular Systems，InC.)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行25個(gè)循環(huán)(95℃1分鐘，55℃1分鐘和72℃3分鐘)，緊接著于72℃下溫育10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用苯酸/氯仿和氯仿連續(xù)抽提，然后在6μg的糖原載體和2.5M醋酸銨存在時(shí)用乙醇沉淀。沉淀帶重新懸浮于87μl的水中，再向水中加入10μl的10x緩沖液H(Boehringer Mannhein Corp.)，2μl的10U/μlEcoRI(BoehringerMannheim)和1μl的40U/μl XhoI (Boehringer MannheimCorp.)。消化于37℃下進(jìn)行1小時(shí)。通過加熱至65℃，持續(xù)15分鐘終止反應(yīng)，并通過400孔徑大小的凝膠過濾柱子(CHROMASPIN+TE-400TM；Clontech Laboratories Inc.)進(jìn)行層析。
按上面描述分離的受體插入片段連接至EcoRI和XhoI消化和脫磷酸化的pHZ-1受體上。連接反應(yīng)含有1μl的50ng/μl的制備的pHZ-1載體，5μl的5mg/μl cDNA插入片段，2μl的10x連接酶緩沖液(Promega Corp.)，11.75μl的水和0.25μl的4U/μl T4DNA連接酶(Stratagene Cloning Systems)。于10℃下過夜進(jìn)行連接。用連接的DNAs按廠商的說明轉(zhuǎn)染大腸桿菌(MAX EFFICIENCYDH10BTM感受態(tài)細(xì)胞；GIBCO BRL)。通過DNA序列分析證實(shí)pHZ-1中的類型I和類型II小鼠和人MPL-P受體插入片段的正確性。產(chǎn)生的質(zhì)粒pSLmpl-8和pSLmpl-q分別攜帶小鼠類型II和類型I受體cDNAs。質(zhì)粒pSLmpl-44攜帶人MPL-PcDNA插入片段。
實(shí)施例III，表達(dá)MPL受體的BaF3細(xì)胞系的構(gòu)建將依賴于白細(xì)胞介素-3的來源于鼠骨髓的前淋巴樣細(xì)胞系BaF3(Palacios and Steinmetz，Cell 41727-734，1985；Mathey-Prevot et al.，Mol.Cell.Biol.64133-4135，1986)保存于完全培養(yǎng)基CRPMI1640培養(yǎng)基(JRH Bioscience Inc.，Lexexa KS)中，并補(bǔ)允10％的熱鈍化小牛胎兒血清，4％的來源于培養(yǎng)的WEHI-3細(xì)胞(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)的條件培養(yǎng)基，2mM L-谷氨酰胺，2-疏基乙醇(1∶280,000終濃度)和PSN抗體(GIBCO BRL)。在電擊穿至BaF3細(xì)胞中之前，使用氯化銫抽提的質(zhì)粒pSLmpl-8，pSLmpl-9和pSLmpl-44在NdeI位點(diǎn)線性化。供電擊穿的BaF3細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基中洗滌一次，并重新懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中，細(xì)胞密度為107細(xì)胞/毫升。1ml重新懸浮的BaF3細(xì)胞與各30μg的線性化質(zhì)粒DNAs混合并轉(zhuǎn)移至分隔的可自由使用的電擊穿室(GIBCO BRL)中。室溫下溫育15分鐘后，細(xì)胞受到電擊穿裝置(CELL-PORATORTM；GIBCO BRL)提供的連續(xù)電擊(800μFad/300v；1180μFad/300v)。經(jīng)過5分鐘的恢復(fù)之后，經(jīng)電擊穿的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10ml的完全培養(yǎng)基上，并置于培養(yǎng)箱中15-24小時(shí)(37℃，5％CO2)。細(xì)胞經(jīng)離心，重新懸浮于10ml的含1600μg/ml G418的完全培養(yǎng)基中，以有限的稀釋度涂布于96-孔的組織培養(yǎng)皿中，分離抗G418的克隆。通過Northern印跡分析BaF3mRNA中MPL受體轉(zhuǎn)錄物的存在推導(dǎo)抗G418的BaF3克隆中MPL受體的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)一個(gè)指定為BaF3/MPLR1.1的細(xì)胞系可表達(dá)高水平的類型I小鼠MPL受體mRNA，該細(xì)胞系用于條件培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染BHK570細(xì)胞MPL配體活性的后續(xù)檢測。表達(dá)類型II的受體mRNA的一個(gè)細(xì)胞系被指定為BaF3/MPLR2。
實(shí)施例IV.可溶性小鼠MPL受體的產(chǎn)生通過把pSLmpl-9(一個(gè)含有以上描述的編碼全長小鼠類型I的MPL受體cDNA的哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒)中的DNA區(qū)段與pSLmpl-26(一個(gè)構(gòu)建的在細(xì)菌中產(chǎn)生可溶性小鼠類型I的MPL受體的表達(dá)質(zhì)粒)相連結(jié)，產(chǎn)生編碼可溶性小鼠類型I MPL受體的哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒。
以全長受體質(zhì)粒pSLmpl-9為模板，利用引物ZC6704(SEQID No10)和引物ZC6703(SEQ ID No11)通過PCR分離編碼小鼠類型I的MPL可溶性受體cDNA區(qū)段。為了便于定向克隆，在引物ZC6704和ZC6703各自的5’端分別引入EcoRI和XhoI位點(diǎn)。引物ZC6703也編碼一個(gè)蛋白質(zhì)激酶的框架內(nèi)的共有靶序列，使得用32pγ-ATP可以在體外標(biāo)記提純的可溶性受體(Li et al，Proc Natl.Acad.Sci.USA.86558-562，1989)。在一種混合物中進(jìn)行PCR，該混合物含10μl的10x ULTMATMDNA聚合酶緩沖液(Roche Molecular Systems，Inc.)，6μl的25mM MgCl2，0.2μl的各含10mM的dATP，dGTP，dTTP和dCTPC PharmaciaLKB Biotechnology Inc.)的脫氧核苷酸三磷酸溶液，11μl的4.55pmol/μl引物ZC6704 (SEQ ID No10)，21μl的2.43pmol/μl引物ZC6703 (SEQ ID No11)，50.3μl的水，1μl的50ng/μl的Hind IV和XbaI消化的pSLmpl-9和1μl的6U/μl ULTMATMDNA聚合酶(Roche Moleoular Systems，Inc.)。按廠商的說明在反應(yīng)中使用AmpliWaxTM(Roche Molecular Systems，Inc.)。聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行三個(gè)循環(huán)(95℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘)后，再在增加雜交嚴(yán)緊度時(shí)進(jìn)行11個(gè)循環(huán)(95℃1分鐘，55℃ 30秒，72℃ 2分鐘)，然后于72℃下溫育10分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)一系列苯酚/氯仿和氯仿抽提后，通過一個(gè)400孔徑大小的凝膠過濾柱(Clontech Laboratories，Inc.)層析。PCR產(chǎn)物在20μg糖原載體和2.5M醋酸銨存在時(shí)用乙醇沉淀。沉淀帶重新懸浮于32μl的水中。向16μl的重新懸浮的PCR產(chǎn)物中加入2μl 10x的緩沖液H(Boehringer Mannheim Corp)，1μl的10U/μl EcoRI(Boehringer Mannheim Corp.)和1μl的40U/μl XhoI(Boehringer Mannheim Corp.)消化于37℃下進(jìn)行1小時(shí)。通過加熱至65℃，持續(xù)15分鐘終止消化，再于0.7％的低一熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上純化消化的PCR產(chǎn)物。通過用β-瓊脂酶I(NewEngland Biolabs)消化膠基質(zhì)，從低熔點(diǎn)凝膠中回收片段。
產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物編碼小鼠類型IMPL受體的N-端胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No17)的第27至480個(gè)殘基)。在缺乏推定的受體跨膜結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No17第483至504個(gè)殘基)時(shí)，表達(dá)的蛋白質(zhì)預(yù)期在一種合適的信號肽存在下分泌。除了用pSLmpl-8作為模板外，用上面描述的PCR條件，獲得一個(gè)小鼠類型II可溶性MPL的受體編碼cDNA。兩種受體片段經(jīng)DNA序列測定進(jìn)行驗(yàn)證。
可溶性小鼠類型I和類型IIMPL受體編碼DNA片段克隆于EcoRI和XhoI消化的載體pOmpA2-5中，分別產(chǎn)生pSLmpl-26和pSLmpl-27。質(zhì)粒pOmpA2-5由pOmpA2改變而來(Gbrayabet al.，EMBO.J 32437-2442，1984)，pOmpA2為一種設(shè)計(jì)的把重組蛋白引入胞外周質(zhì)中的細(xì)菌表達(dá)載體。通過用一個(gè)合成的42bp序列代替pOmpA2的EcoRI和BamHI位點(diǎn)間的一個(gè)13bp的序列，完成pOmpA2-5的構(gòu)建。通過兩個(gè)42個(gè)核苷酸互補(bǔ)的容聚核苷酸(ZC6707，SEQ ID No12；ZC6706，SEQ ID No13)退火產(chǎn)生所述序列，當(dāng)堿基配對形成EcoRI和BamHI粘性末端時(shí)，該序列有利于定向克隆至EcoRI和BamHI消化的pOmpA2上。在該插入序列內(nèi)，是一個(gè)有關(guān)細(xì)菌前導(dǎo)序列和以上描述的小鼠MPL可溶性受體編碼cDNA讀碼框架內(nèi)的XhoI位點(diǎn)以及位于Xho 3’端的讀碼框架內(nèi)的6個(gè)組氨酸密碼子束(該密碼子束可通過金屬螯合作用親合層析(Houchuli et al.，Bio/Fechnol.61321-1325，1988)提純重組蛋白)。在編碼組氨酸束的序列之后是一個(gè)框架內(nèi)的終止密碼子。pOmpA2-5，pSLmpl-26和pSLmpl-27的確實(shí)性由DNA序列測定來證實(shí)。
pLDmpl-53為一種產(chǎn)生可溶性小鼠類型IMPL受體的哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒，其構(gòu)建是通過把pSLmpl-9和pSLmpl-26的DNA區(qū)段連接至表達(dá)載體pHZ-200(pHZ-1中，用一個(gè)二氫葉酸不原酶序列代替新霉素粘性基因)中而完成的。在細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒pSLmpl1-26的構(gòu)建中，1164bp的EcoRI/BamNI cDNA片段代替缺失的哺乳動物信號序列。pSLmpl-26的416bp-BamHI片段為可溶性MPL受體的羧基末端，激酶標(biāo)記結(jié)構(gòu)域，多聚組氨酸束和翻譯終止子提供了編碼序列。這兩個(gè)片段經(jīng)凝膠純化，再克隆至pBlueseriptKSt(Stratagene Cloning Systems)的EcoRI/BamHI的位點(diǎn)上，產(chǎn)生質(zhì)粒pBS8.76LD-5。就pBS8.76LD-5中的1164bp的pSLmpl-9來源的EcoRI/BamHI片段而論416bp的pSLmpl-26來源的BamHI片段的正確方向用引物ZC66603(SEQ ID No8)和引物ZC6703(SEQ ID No11)通過PCR未測定。PBS8.76LD-5中的多接頭序列中的XbaI位點(diǎn)可以使重組的受體cDNA切割成一個(gè)1.5Kb EcoRI/XbaI片段；在用EcoRI和XbaI消化載體之后，該1.5Kb的片段可克隆至pHZ-200載體中。大量制備產(chǎn)生的哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒pLDmpl-53，以轉(zhuǎn)染至BHK細(xì)胞中。
用磷酸鈣沉淀法，把20μg提純的pLDmpl-53質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK570細(xì)胞中。5小時(shí)之后，細(xì)胞用15％的甘油刺激3分鐘，以利于DNA的吸收。加入新鮮的培養(yǎng)基過夜。第二天把細(xì)胞分成各種稀釋度，然后加入含1μM的氨甲喋呤的選擇培養(yǎng)基。大約2周之后，可以看見不連續(xù)的(即分散的)抗氨甲喋呤的菌落?？剐跃浠蛘弑皇占饋恚蛘咦鳛椴煌目寺”４嫫饋?。對來源于已收集菌落的耗盡營養(yǎng)的培養(yǎng)基立即檢測可溶性MPL受體蛋白的存在。
通過蛋白質(zhì)羧基末端存在的多聚組氨酸來與含有固定的Ni2+(HIS-BINDTM；Novagen，Madison，WI)的金屬螯合樹脂的相互作用分離可溶性MPL受體蛋白。將pLDmpl-53庫來源的無血清的營養(yǎng)耗盡的培養(yǎng)基通過此樹脂，用1M的咪唑洗提結(jié)合的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE分析顯示在大約67KDa處有一條單一帶。該蛋白再進(jìn)行N-末端的氨基酸序列分析，并證實(shí)為小鼠MPL受體。
可溶性小鼠MPL受體由BHK轉(zhuǎn)染子庫中提純而來，該轉(zhuǎn)染子庫已用可溶性小鼠類型I MPL受體表達(dá)質(zhì)粒pLDmpl-53轉(zhuǎn)染過。純化的可溶性受體基本上按照廠商說明固定于CNBr-活化的SEPHAROSETM4B(Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.)基質(zhì)上，并用于24-11-5細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中的MPL活性的親和提純。親和基質(zhì)包裝于XK16柱子(Pharmacia LKBBiotechnology Inc.)中。細(xì)胞24-11-5的條件培養(yǎng)基在10KD剪下的空心纖維膜(A/G Tology Corp.，Needham，MA)上濃縮，并以1ml/分鐘的流速上樣至MPL受體親和柱的底部。用含0.5MNaCl和0.0％疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌柱子。用3M的異硫氰酸鉀(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)以0.5ml/分鐘的流速從柱子中洗提MPL活性。通過透析PBS，去除異硫氰酸鉀。通過MTT增生試驗(yàn)(在實(shí)施例VII中描述的)鑒定活性部分。
實(shí)施例V.MPL受體的配體表達(dá)細(xì)胞系的分離和特征BaF3/MPLR1.1細(xì)胞為依賴于IL-3的細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的類型I小鼠MPL受體。
設(shè)計(jì)突變和選擇方案，經(jīng)突變BaF3/MPLR1.1細(xì)胞和在缺乏外源IL-3時(shí)選擇自泌生長來分離表達(dá)MPL受體的配體細(xì)胞系。大約1.2×106BaF3/MPLR1.1的細(xì)胞經(jīng)沉淀收集，并用GM(RPMI 1640培養(yǎng)基，輔以2-疏基乙醇(1∶240,000的終濃度)，2ml L-谷氨酰胺，110μg/ml丙酮酸鈉，50μg/mL G418和10％的熱鈍化小牛胎兒血清)洗滌。細(xì)胞重新懸浮于2ml的含有0.15％(V/V)的誘變劑甲基磺酸乙酯(EMS)的GM中，并于37℃下溫育2小時(shí)。經(jīng)溫育之后，細(xì)胞用PBS洗滌一次，用GM洗滌一次，然后以大約40,000細(xì)胞/ml的密度涂布于補(bǔ)加有5％作為IL-3來源的WEHI-3條件培養(yǎng)基(Becon，Dickinson Labware，Bedford，MA)的GM中的10cm平板上。在選擇不依賴于IL-3的生長之前，細(xì)胞經(jīng)七天恢復(fù)期(于5％的CO2下，37℃溫育)。溫育期之后，培養(yǎng)物中密布有可生長的細(xì)胞。這些細(xì)胞用GM洗滌，再于缺乏WEHI-3的條件培養(yǎng)基的GM中培養(yǎng)。經(jīng)過11天的選擇之后，可觀察到少量可生長的細(xì)胞。不依賴于IL-3的培養(yǎng)物中的可生長的細(xì)胞密度估計(jì)為250細(xì)胞/毫升。1ml的不依賴于IL-3的培養(yǎng)物涂布于24-孔培養(yǎng)皿中的19個(gè)孔中，以作進(jìn)一步的特性分析。
對上述不依賴于IL-3生長的BaF3/MPLR1.1細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基測定BaF3/MPLR細(xì)胞的增生活性。發(fā)現(xiàn)來源于所有19個(gè)不依賴于IL-3生長的細(xì)胞庫的培養(yǎng)基在MTT增生檢測中具有活性(實(shí)施例VII中描述)。在2μg/ml大鼠抗小鼠IL-3，抗小鼠IL-4或兩種中性抗體(Pharmingen，San Diego，CA)都存在時(shí)對陽性培養(yǎng)基檢測增生活性，以鑒定不依賴于IL-3生長的表達(dá)那些細(xì)胞因子的突變體。(在一個(gè)先前的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)BaF3細(xì)胞與IL-4也有反應(yīng)。)發(fā)現(xiàn)只有從平板#11的細(xì)胞(指定為“24-11”細(xì)胞)來源的條件培養(yǎng)基具有不被IL-3或IL-4抗體中和的活性。
以上描述的突變和選擇方案被應(yīng)用于5種其他的BaF3/MPLR1克隆(BaF3/MPLR1克隆#4，9，12，15和18，分別指定為BaF3/MPLR1·4，·9，·12，·15和·18)。發(fā)現(xiàn)17個(gè)分離物具有刺激BaF3/MPLR1細(xì)胞增生的條件培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)所有培養(yǎng)基的活性可以被抗-IL-3或IL-4抗體單獨(dú)或聯(lián)合中和。這些克隆沒有作進(jìn)一步的特征描述。
對24-11庫來源的條件培養(yǎng)基的增生活性作了詳細(xì)的特征描述。24-11細(xì)胞庫可再分為19個(gè)亞庫，并對其條件培養(yǎng)基再檢測活性。所有19個(gè)亞庫(如24-11-1到24-11-19)在缺乏外源的IL-3時(shí)均可刺激依賴于IL-3生長的細(xì)胞增生。其活性不能被IL-3或IL-4的中和抗體或兩種抗體的聯(lián)合抑制。
實(shí)施兩個(gè)實(shí)驗(yàn)測定24-11活性的特異性。對其條件培養(yǎng)基檢測對不表達(dá)MPL受體的對照BaF3細(xì)胞的培生活性。在缺乏外源IL-3時(shí)，在任何一種19個(gè)24-11細(xì)胞亞庫來源的條件培養(yǎng)基中，沒有觀察到對照BaF3細(xì)胞的增生。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，檢測增生活性被提純的可溶性MPL受體的抑制作用。BaF3/MPLR1細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)加有50％的24-11的條件培養(yǎng)基的GM中。向每個(gè)樣品中加入類型I小鼠可溶性受體，至終濃度為0.0，0.625，1.25，2.5或5.0μg/ml。4天之后通過MTT細(xì)胞增生試驗(yàn)對結(jié)果實(shí)行計(jì)分。在0.625至1.25μg/ml可溶性MPL受體濃度下，24-11條件培養(yǎng)基的增生活性被完全封閉。具完全抑制活性的可溶性受體濃度對BaF3/MPLR1細(xì)胞用IL-3或IL-4刺激沒有影響。結(jié)果表明可溶性受體競爭24-11培養(yǎng)基的刺激活性，并與24-11細(xì)胞表達(dá)MPL受體配體的假設(shè)一致。
通過有限的稀釋涂布平板，分離了未源于24-11細(xì)胞的克隆。一個(gè)指定為24-11-5#3的克隆在其與24-11庫相關(guān)的條件培養(yǎng)基中顯示出高水平的增生活性。發(fā)現(xiàn)其增生活性相當(dāng)于WEHI-3細(xì)胞的以1∶2000稀釋的條件培養(yǎng)基的活性(BectonDickinson Labware)。
實(shí)施例VI.24-11-5#3 cDNA文庫的構(gòu)建用異硫氰酸胍處理，再經(jīng)CsCl離心，從大約2.7×10824-11-5#細(xì)胞中提取總RNA(Chirgwin et al.，ibid)。用一個(gè)OLIGOTEX-dT-mRNA分離試劑盒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)按照廠商的說明分離poly(A)+RNA。
24-11-5#3細(xì)胞第一鏈在4個(gè)單獨(dú)平行的反應(yīng)中合成。每個(gè)反應(yīng)含有濃度為1.6μg/ml的7μl的polyd (T)一選擇的poly(A)+24-11-5#3的RNA和2.5μl的20pmol/μl的含一個(gè)XhoI限制性位點(diǎn)的第一鏈引物ZCb172(SEQ ID No14)?；旌衔镉?5℃下加熱4分鐘，再于冰上冷卻。通過向RNA-引物混合物中加入8μl的第一鏈緩沖液(5x SUPERSCRIPTTM緩沖液；GIB CO BRL)，4μl的100mM二硫蘇糖醇和2μl的包含各10mM的dATP，dGTP，dTTP和5-甲基-dCTP(Pharmacia LKBBiotechnology Inc.)的脫氧核苷酸三磷酸溶液，開始第一鏈cDNA合成。反應(yīng)混合物于45℃下溫育4分鐘，再加10μl的200U/μl，RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCOBRL)。通過把10μCi的32p-αdCTP加入到10μl任一反應(yīng)混合等分樣中標(biāo)記反應(yīng)液分析第一鏈合成的效率。反應(yīng)液于45℃下溫育1小時(shí)，再于50℃下溫育15分鐘。標(biāo)記反應(yīng)中未結(jié)合的32p-αdCTP通過400孔徑大小的凝膠過濾柱子(Clontech Laboratories)層析去除掉。把未標(biāo)記的第一鏈反應(yīng)液集中起來，未結(jié)合的核苷酸在32μg的糖原載體，2.5M醋酸銨和2.5倍體積的乙醇存在時(shí)通過兩次cDNA沉淀去除掉。未標(biāo)記的cDNA重新懸浮于144μl的水中，供第二鏈合成使用。通過瓊脂糖凝膠電泳測定標(biāo)記的第一鏈cDNA的長度。
在啟動的第一鏈指導(dǎo)第二鏈合成產(chǎn)生DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的條件下，根據(jù)第一鏈cDNA進(jìn)行第二鏈的合成。每個(gè)第二條鏈的反應(yīng)包含48μl的未標(biāo)記的第一鏈cDNA，16.5μl的水，20μl的5x聚合酶I緩沖液(100mM TrisHCl，pH7.4，500mM Kcl，25mMMgCl2，50mM(NH4)2SO4)，1μl的100mM的二硫蘇糖醇，1μl的含10mM各脫氧核苷三磷酸的溶液，3μl的5mM β-NAD，1μl的3U/μl的大腸桿菌DNA連接酶(New England Biolabs Inc.)和5μl的10U/μl大腸桿菌DNA聚合酶I(Amersham Corp.)。在室溫下組裝反應(yīng)，于室溫下溫育5分鐘后再加入1.5μl的20U/μl Rnase H(GIBCO BRL.)。向任一第二鏈合成反應(yīng)的10μl等分樣中加入10μCi32p-αdCTP進(jìn)行標(biāo)記以監(jiān)測第二鏈合成的效率。反應(yīng)液于15℃下溫育2小時(shí)，再于室溫下溫育15分鐘。通過400孔徑大小的凝膠過濾柱(Clontech Laboratories)層析以去除標(biāo)記反應(yīng)中未結(jié)合的32p-αdCTP，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析。收集未進(jìn)行標(biāo)記的反應(yīng)液，任苯酚/氯仿和氯仿抽提，再在2.5M醋酸銨存在下用乙醇沉淀cDNA。
用綠豆核酸酶切割發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA。反應(yīng)混合物含有100μl的第二鏈cDNA，20μl的10x的綠豆核酸酶緩沖液(Stratagene Cloning Systems)和6μl的50U/μl的綠豆核酸酶(Promega Corp.)。反應(yīng)于37℃下溫育30分鐘。通過加入20μl的1M TrisHCl，pH8.0，再經(jīng)以上描述的連續(xù)的苯酚/氯仿和氯仿抽提終止該反應(yīng)。抽提之后，DNA用乙醇沉淀，重新懸浮于水中。
重新懸浮的cDNA用T4DNA聚合酶進(jìn)行末端補(bǔ)平。重新懸浮于188μl水中的cDNA與50μl 5x的T4DNA聚合酶緩沖液(250mMTrisHCl，pH8，0，250mM Kcl，25mM MgCl2)，3μl 0.1M的二硫蘇糖醇，4μl的含10mM的各脫氧核苷酸三磷酸的溶液和5μl的1U/μl T4DNA聚合酶(Boehringer Mannheim Corp.)相混合。在15℃下溫育30分鐘后，通過加入10μl的0.5M EDTA，接著經(jīng)一系列以上描述的苯酚/氯仿和氯仿抽提終止該反應(yīng)。DNA通過400孔徑大小的凝膠過凝柱子(Clontech Laboratories Inc.)層析以去除微量的蛋白質(zhì)和不到約400bp長度的較短的cDNA。在10μg糖原載體和2.5M的醋酸銨存在下用乙醇沉淀DNA，并重新懸浮于15μl的水中。根據(jù)滲入的32p-αdCTP，經(jīng)估算由40μg起始mRNA模板合成的cDNA產(chǎn)量為大約8μg。
EcoRI接頭連接至以上描述的cDNA的5’末端，使之能夠克隆至一個(gè)表達(dá)載體上。將10μl等份的cDNA(～5μg)和21μl的65pmol/μl的EcoRI接頭(Pharmacia LKB Biotechnology Inc.)與4μl的10x連接酶緩沖液(Promega Corp.)、3μL的10mM ATP和3μl的15U/μl T4DNA連接酶(Promega Corp.)混合。反應(yīng)于9℃溫育過夜(約48小時(shí))。通過140μl的水，20μl的10x緩沖液H(Boehringer Mannbeim Corp)和65℃下溫育40分鐘終止反應(yīng)。溫育之后，cDNA用以上描述的苯酚/氯仿和氯仿抽提以及在2.5M醋酸銨和1.2倍體積的異戊醇存在時(shí)沉淀cDNA。離心之后，用70％乙醇洗滌cDNA沉淀帶，空氣干燥和重新懸浮于89μl的水中。
為了便于cDNA定向克隆至一個(gè)表達(dá)載體中，cDNA用XhoI消化，產(chǎn)生具有5’EcoRI粘性末端和3’XhoI粘性末端的cDNA。cDNA的3’末端的XhoI限制性位點(diǎn)已事先用引物ZC6172(SEQID No14)引入。在以上描述的含有89μl的cDNA、10μl的10x緩沖液H(Promega Corp.)和1.5μl的40U/μl XhoI(BoehringerMannheim Corp.)的混合物中進(jìn)行限制性酶消化。消化于37℃下進(jìn)行1小時(shí)。通過一系列的苯酚/氯仿和氯仿抽提及通過400孔徑大小的凝膠過濾柱子(Clontech Laboratories Inc.)層析終止此反應(yīng)。
cDNA經(jīng)乙醇沉淀，用70％乙醇洗滌，空氣干燥，并重新懸浮于20μl的1x含凝膠的緩沖液(10mM TrisHCl，pH8.0，1mMEDTA，5％甘油和0.125％溴酚藍(lán))。
將重新懸浮的cDNA加熱至60℃持續(xù)5分鐘，于冰上冷卻并在0.8％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(SEA PLAQUE GTGTM低熔點(diǎn)瓊脂糖；FMC Corp)上電泳。從膠上切下污染的接頭和低于0.5Kb長的cDNA。顛倒電極，電泳直至cDNA集中于近泳道起點(diǎn)處。切下含濃縮的cDNA的凝膠區(qū)，置于一個(gè)微量離心管中，測定膠條的大致體積。向管中加入大約為膠條件積3倍的水等份樣(300μl)，通過加熱至65℃熔化瓊脂糖15分鐘。在樣品平衡至45℃時(shí)，加入5μl的1U/μl β-瓊脂酶I(New England Biolabs，Inc.)，再于45℃下溫育90分鐘，以消化瓊脂糖。溫育之后，加入40μl的3M醋酸鈉至樣品中，混合物于冰上溫育15分鐘。樣品在室溫下以14,000×g離心15分鐘，以去除未消化的瓊脂糖，接著通過400孔徑大小的凝膠過濾柱子(Clontech Laboratories)層析。cDNA經(jīng)乙醇沉淀，用70％乙醇洗滌，空氣干燥，重新懸浮于70μl的水中，供激酶反應(yīng)使用，酶連接的EcoRI接頭磷酸化。
向70μl的cDNA溶液中加入10μl 10x連接酶緩沖液(Stratagene Cloning Systems)，并把混合物加熱至65℃持續(xù)5分鐘。該混合物于冰上冷卻，加入16μl的10mM ATP和4μl的10U/μl的T4多聚核苷酸激酶(Stratagene Cloning Systems)。反應(yīng)混合物于37℃下溫育1小時(shí)，然后加熱至65℃持續(xù)10分鐘，再經(jīng)一系列苯酚/氯仿和氯仿抽提終止該反應(yīng)。磷酸化的cDNA在2.5M醋酸銨存在下經(jīng)乙醇沉淀，用70％的乙醇洗滌，空氣干燥和重新懸浮于10μl的水中。磷酸化的cDNA的濃度估計(jì)為～40fmol/ml。
pDX哺乳動物表達(dá)質(zhì)粒(在美國專利4,959,318中已公開)(附圖)經(jīng)改造后可接受用EcoRI-XhoI末端合成的cDNA。通過用SalI消化質(zhì)粒，和用T4DNA聚合酶補(bǔ)平SalI的粘性末端后再重新環(huán)化質(zhì)粒從而使pDX上的內(nèi)源SalI位點(diǎn)消失。重新環(huán)化的質(zhì)粒用EcoRI消化后，用由兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸ZC6936(SEQ IDNo15)和ZC6937(SEQ ID No16)組成的較短的多接頭序列與之相連產(chǎn)生質(zhì)粒pDX.ES。pDX.ES上引入的多接頭序列包含EcoRI和SalI位點(diǎn)，便于用EcoRI-XhoI末端合成的24-11-5cDNA的定向克隆。
通過將EcoRI-XhoI24-11-5cDNA連接到EcoRI/SaI消化的pDX.ES上制備一個(gè)質(zhì)粒的cDNA文庫。經(jīng)使用基因脈沖儀/脈沖控制儀和0.2cm的透明小容器(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，用0.2KV，400ohm和25μFAD把混合物電擊穿至大腸桿菌中(ELECTROMAX DH10BTM感受態(tài)細(xì)胞；GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)。細(xì)胞用Luria培養(yǎng)基稀釋至1.5ml，于37℃下溫育45分鐘，然后加入0.75ml的50％的甘油。等分轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，貯藏于-70℃下備用。80fmols的cDNA可產(chǎn)生超過700,000個(gè)獨(dú)立的重組質(zhì)粒。
實(shí)施例VII.MPL活性的24-11-5cDNA文庫的表達(dá)篩選將24-11-5#3cDNA文庫涂布于大約2000個(gè)10cm直徑的補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素的Luria瓊脂培養(yǎng)基中。涂板的密度為每個(gè)平板200至250個(gè)細(xì)菌菌落。用MAGIC MINIPREPTMDNA提純樹脂(Promega Corp.)，按照廠商的說明從每個(gè)細(xì)菌平板中制備供轉(zhuǎn)染至BHK 570細(xì)胞的質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA保存于-20℃直至轉(zhuǎn)染到BHK 570細(xì)胞中。
將24-11-5#3cDNA質(zhì)粒庫(各含有約200至250個(gè)cDNA克隆)用2，3-二油基(dioleoly)-N-〔2-(精胺羧基酰胺)乙基〕-N，N-二甲基-丙烷銨三氟乙酸和二油基-磷脂酰膽堿在水中的3∶1脂質(zhì)體配方(LIPOFECTAMINETM；GIBCO BRL)轉(zhuǎn)染至BHK570細(xì)胞中。將20μl的30ng/μl的DNA加入到1∶10稀釋的LIPOFECTAMINETM溶液中，于室溫下溫育30分鐘。溫育之后，向DNA/LIPOFECTAMINETM混合物中加入160μl的無血清培養(yǎng)基(Hams F12Dulbeccos MEM (1∶1)，補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺，0.11mg/ml丙酮酸鈉，5μg/ml胰島素，5μ8lml胎球蛋白，10μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白，2ng/ml硒IV氧化物和25mM HEPES緩沖液)，并轉(zhuǎn)移至24孔的含有-100,000個(gè)BHK570細(xì)胞的微滴平板中。細(xì)胞于37℃，5％CO2下溫育4小時(shí)，之后再加入200μl的BHK生長培養(yǎng)基(Dulbecco’s modifiedEagles’s培養(yǎng)基，補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺，0.11mg/ml丙酮酸鈉，5％熱鈍化小牛胎兒血清和100x PSN抗生素(GIBCOBRL))。細(xì)胞溫育16小時(shí)。除去培養(yǎng)基，更換為0.5ml的新鮮培養(yǎng)基，并于MPL活性檢測前使之適應(yīng)48小時(shí)。
使用細(xì)胞增生試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染BHK570細(xì)胞文庫的條件培養(yǎng)基中MPL活性的存在。向補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺，PSN抗生素(GIBCO BRL)，0.00036％2-疏基乙醇及10％熱鈍化水中胎兒血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(JRH Bioscience Inc.，Lenexa，KS)上的100μl的106/ml洗滌過的BaF3/MPLR1.1細(xì)胞中加入100μl的條件培養(yǎng)基。在測定增生之前，試驗(yàn)細(xì)胞于37℃，5％CO2條件下溫育3天。
根據(jù)3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑溴(MTT)(Mosman，J.Immunol.Meth 6555-63，1983)的代謝分解，用比色試驗(yàn)定量檢測MPL存在時(shí)的細(xì)胞增生。將20μl的10mg/ml的MTT溶液(Polyscience，In.，Warrington，PA)加入到100μl的BaF3/MPL R1.1試驗(yàn)細(xì)胞中，細(xì)胞于37℃下溫育。4小時(shí)后，加入溶于異丙醇中的0.04NHCl，混合溶液，在一個(gè)EL320ELISA讀數(shù)計(jì)上(Bio-Tek Instruments Inc.，Highland Park，VT)讀出570nm下樣品的吸光值。
將發(fā)現(xiàn)為陽性的一個(gè)質(zhì)粒庫(指定為T1081)轉(zhuǎn)染至BHK570細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染子的上清液在MTT增生試驗(yàn)中顯示出陽性信號。PCR和抗體中和實(shí)驗(yàn)表明活性并非由于IL-3或IL-4引起。
從陽性庫中來源的質(zhì)粒用未轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，并把細(xì)胞涂布于平板上(42個(gè)板中每板約15～20個(gè)菌落；10個(gè)板中每板約90個(gè)菌落；8個(gè)板中每板約250個(gè)菌落)。對每個(gè)板進(jìn)行復(fù)制，并保存于4℃下。對原始板上的菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，并于液體培養(yǎng)基中快速生長幾小時(shí)，然后制備DNA。
將來源于亞庫的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至BHK570細(xì)胞中，收集細(xì)胞上清液并按以上方法進(jìn)行測定。約2小時(shí)后，通過顯微鏡觀察一個(gè)亞庫(#22)被計(jì)劃陽性(伸長的細(xì)胞形狀)。幾個(gè)小時(shí)之后，另外兩個(gè)亞庫(#19和#28)也被計(jì)為陽性。每個(gè)陽性亞庫剩余的上清液與對照BaF3細(xì)胞對比檢測，發(fā)現(xiàn)沒有活性。此外，發(fā)現(xiàn)三個(gè)陽性亞庫的活性被可溶性類型I MPL受體抑制。
讓三個(gè)陽性亞庫的復(fù)制板生長幾小時(shí)，然后挑出單個(gè)菌落，用來接種3ml的培養(yǎng)基。培養(yǎng)物于37℃下生長大約8小時(shí)，然后按以上描述的小量制備的方法提取質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至BHK570細(xì)胞中，約10小時(shí)后收獲上清液并測定活性。一小時(shí)之后，一個(gè)克隆(指定為T1081-19-215，相當(dāng)于亞庫19)被計(jì)為陽性。此克隆重新劃線培養(yǎng)成單個(gè)菌落。從12個(gè)菌落中提取DNA并轉(zhuǎn)染至BHK570細(xì)胞中。在以后的試驗(yàn)中，所有12個(gè)轉(zhuǎn)染子都被計(jì)為陽性。來源于12個(gè)陽性菌落中任一菌落的DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52。該質(zhì)粒被指定為pZGmol-1081。該轉(zhuǎn)化子于1994年2月14日貯藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD)，其保藏號為69566。
編碼血細(xì)胞生成蛋白(血小板生成素)的cDNA的核苷酸序列已經(jīng)測定(SEQ ID No1)。其編碼的氨基酸序列分析表明成熟蛋白的氨基末端位于第45個(gè)核苷酸。兩個(gè)甲硫氨酸密碼子，位于SEQID No1的第105位和第174位置上，似乎為起始密碼子，主要的起始位點(diǎn)預(yù)期位于第174個(gè)位置上。
實(shí)施例VIII.重組血小板生成素的血細(xì)胞生成活性從雌性CD-1懷孕后的小鼠的股骨和脛骨中收獲骨髓，并置于25ml的CATCH緩沖液(99mg茶堿，0.75g的檸檬酸鈉，75mg的腺苷，20ml 10x的無Ca#Mg#的Hank’s平衡鹽溶液，溶于每200ml的去離子水中，pH7.4)中。用25ml的移液管移取把細(xì)胞懸浮為單個(gè)細(xì)胞懸浮液。用CATCH緩沖液使體積增加至50ml，并于1000rpm離心7分鐘使細(xì)胞沉淀。用25ml CATCH緩沖液重新懸浮細(xì)胞沉淀，于包有第一層塑料粘合薄膜的T74組織培養(yǎng)燒瓶中于37℃下溫育2小時(shí)。通過于1000rpm離心7分鐘，收獲非粘著的細(xì)胞使之沉淀。細(xì)胞沉淀重新懸浮于15ml的α-MEM+10％FBS(+L-谷氨酰胺，丙酮酸鈉和PSN抗生素)中，并在以上描述的于第一層塑料粘合薄膜上再覆蓋第二層塑料粘合薄膜的T75燒瓶中培養(yǎng)。在最后離心和重新懸浮之后，對細(xì)胞計(jì)數(shù)。密度為576,000細(xì)胞/ml的0.5ml細(xì)胞懸浮液與對照BHK細(xì)胞的樣品培養(yǎng)基或與用pZGmpl-1081轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞的條件培養(yǎng)基一起涂布于24-孔的組織培養(yǎng)平板中。37℃下培養(yǎng)3天之后，收獲細(xì)胞并按以上描述的方法染色。
從用標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)基處理的對照孔中收獲150μl的細(xì)胞。從用10pZGmol-1081轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞的條件培養(yǎng)基處理的孔中收獲50μl的細(xì)胞。這些樣品經(jīng)離心，制備標(biāo)準(zhǔn)的顯微載玻片。
這些載玻片用100％的甲醇固定，然后用1∶1的Wright’s(0.5g的Wright染料溶于300ml的甲醇中)/水浸泡6分鐘，經(jīng)水沖洗，再干燥。然后將載玻片用溶于Sorensen緩沖液(2.28克KH2PO4/2.38G NaPO4溶于250ml水中)的Giemsa染料浸泡，經(jīng)水沖洗，再干燥。
當(dāng)調(diào)整使用體積之后，BHK/pZGmpl-1081培養(yǎng)基樣品每150μl體積含有120個(gè)巨核細(xì)胞，相比之下，對照培養(yǎng)基每150μl體積只含有9個(gè)巨核細(xì)胞。此外，處理實(shí)驗(yàn)樣品的巨核細(xì)胞比對照細(xì)胞在顯微鏡下觀察明顯的要大，對多核內(nèi)含物的染色明顯要深。
在缺乏血清條件下收集突變的BaF3/MPLR1.1細(xì)胞系24-11-5#3的條件培養(yǎng)基，用一個(gè)10KD剪下的Amico Inc.(Beverly，MA)過濾裝置濃縮20倍。從小鼠股骨收獲骨髓并懸浮于IScove’s Mulbecco’s Media (GIBCO BRL)+15％小牛胎兒血清(FCS)中。懸浮之后，對具核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用每板0.9ml密度為75000個(gè)細(xì)胞/ml的懸浮液涂布于調(diào)整為含有50％甲基纖維素、15％FCS，10BSA和0.6％PSN(半固體培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的1ml組織培養(yǎng)平板中。加入各種條件培養(yǎng)基和對照樣品使總體積達(dá)到1ml。峽板于37℃/5％ CO2條件下培養(yǎng)6天，然后于顯微鏡下觀察粒性白細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(GM)菌落數(shù)。對于24-11-5#3條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的平板觀察，具有較弱的類似GMCFS活性，產(chǎn)生的菌落數(shù)為24個(gè)，相比之下，負(fù)對照樣品的菌落數(shù)為0，用正對照(商陸促脾細(xì)胞分裂素條件培養(yǎng)基)(PWMSCM)刺激的平板菌落數(shù)為130個(gè)；PWMSCM的制備是通過在商陸促細(xì)胞分裂素(從Boehringer Mannbeim，Mannbeim，Indianapolis，IN獲得)+2個(gè)單位/ml的促紅細(xì)胞生成素存在時(shí)溫育切碎的鼠脾一周。
從鼠脛骨收獲骨髓并懸浮于含有15％ FCS的IScove’sModified Dulbecco’s培養(yǎng)基(GIBCO-BRL)中，對成核細(xì)胞(nucleated cell)進(jìn)行計(jì)數(shù)，并涂布于以上描述的半固體培養(yǎng)基上。用這些細(xì)胞檢驗(yàn)形成pZGmpl-1081插入片段編碼的蛋白質(zhì)的活性的巨核細(xì)胞菌落。
將pZGmpl-1081穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK570細(xì)胞庫在缺乏血清時(shí)培養(yǎng)，收集其條件培養(yǎng)基。將該條件培養(yǎng)基單獨(dú)地或與商陸促脾細(xì)胞分裂素條件培養(yǎng)基，重組的鼠IL-3，IL-6(Genzyme Corp.，Cambridge，MA)，IL-11(Genzyme Corp.)結(jié)合或這些因子的組合一起進(jìn)行試驗(yàn)。PWMSCM用作陽性對照。非條件培養(yǎng)基用作負(fù)對照。
將試驗(yàn)或?qū)φ諛悠芳拥焦撬枧囵B(yǎng)物中使總體積達(dá)到1ml。涂覆的平板于37℃、5％CO2下培養(yǎng)6天，然后于顯微鏡下檢驗(yàn)巨核細(xì)胞菌落數(shù)。結(jié)果于表4顯示。總之，BHK/pZGmpl-1081條件培養(yǎng)基顯示出巨核細(xì)胞菌落形成活性，該活性在這些早期作用因子存在時(shí)增加的水平顯著地高于任何一個(gè)早期作用因子單獨(dú)作用時(shí)的水平。
測定了BHK/pZGmpl-1081條件培養(yǎng)基在小鼠體內(nèi)的活性。收集無血清的培養(yǎng)基并用一個(gè)10Kd剪下的過濾裝置(Amicon，Inc.，Beverly，MA)濃縮5倍。對照(非條件)培養(yǎng)基以同樣方式濃縮。6只BALB/c小鼠(Simonsen Laboratories，Inc.，Golroy，CA)經(jīng)7次每天腹膜內(nèi)注射0.5ml的對照或條件培養(yǎng)基。在第0、3、7天收集血樣，并對血小板內(nèi)含物進(jìn)行計(jì)數(shù)。如表5所示，結(jié)果表明來源于BHK/pZGmpl-1081細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有血小板生成活性。
表4巨核細(xì)胞樣品 菌落負(fù)對照 0PWMSCM 7BHK/pZGmpl-10812BHK/pZGmpl-1081+PWMSCM15IL-3 1IL-3+BHK/pZGmpl-1081 8IL-6 0IL-6+BHK/pZGmpl-1081 6IL-11 1IL-11+BHK/pZGmpl-1081 6IL-3+IL-6 2IL-3+IL-6+BHK/pZGmpl-1081 9IL-3+IL-11 5IL-3+IL-11+BHK/pZGmpl-108115表5血小板計(jì)數(shù)(104/μl)處理第0天第3天第7天對照141 141 87對照159 149 184BHK/pZGmpl-1081 157 160 563BHK/pZGmpl-1081 169 154 669BHK/pZGmpl-1081 139 136 492BHK/pZGmpl-1081 135 187 554實(shí)施例IX人血小板生成素基因的分離利用小鼠mpl受體的配體cDNA作探針，從擴(kuò)增的人肺λFIX基因文庫(Stratagene Cloning Systems)篩選編碼人的血小板生成素的基因。測定文庫效價(jià)，用大腸桿菌菌種LE-392細(xì)胞(Stratagene Cloning Systems)接種的30個(gè)150mm的平板用4×104個(gè)噬菌斑形成單位(PFU)侵染。平板于37℃下溫育過夜。用HYBOND-NTM尼龍膜(Amersham)按廠商推薦的方法提起過濾噬菌斑。過濾膜于含有1.5M NaCl和0.5MNaOH中于室溫下變性處理7分鐘。濾膜于濾紙上簡單地吸干以去除多余的變性溶液，接著用1M Tris-HCl(pH7.5)和1.5M NaCl中和5分鐘。用STRATALINKER紫外線交聯(lián)儀(UV crosslinker)(Stratagene Cloning Systems)的1,200μ焦?fàn)柕淖贤饩€能量把噬菌體DNA固定于濾膜上。固定之后，濾膜于0.25×SSC，0.25％SDS和1M EDTA中于65℃預(yù)洗三次。預(yù)洗完畢之后，濾膜于經(jīng)過0.45μM濾器過濾的雜交液(5×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.2％SDS和1mM EDTA)中預(yù)雜交。使用之前迅速地加入熱變性、剪切的鮭魚精DNA(終濃度為100μg/ml)。濾膜于65℃下預(yù)雜交過夜。
按照廠商推薦的方法，通過32p隨機(jī)引物用MEGAPRIMETMDNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham)對pZGmpl-1081的全長小鼠TPOcDNA進(jìn)行標(biāo)記。用含有大約1×106cpm探針的新鮮雜交溶液更換預(yù)雜交液。雜交完畢之后，去掉雜交溶液，濾膜于含有0.25×SSC，0.25％SDS和1mM EDTA的洗膜溶液中漂洗4至5次。漂洗完畢之后，濾膜于洗膜溶液中于50℃下連續(xù)洗滌8次。最后一次洗滌之后，濾膜用一個(gè)增感屏于-70℃暴露于放射自顯影光片(XAR-5；Eastman Kodak Co.，Rochester，NY)下4天。
放射自顯影檢查表明幾百個(gè)區(qū)域與標(biāo)記的探針雜交。從100個(gè)區(qū)域挑取瓊脂栓進(jìn)行提純，將每個(gè)瓊脂栓浸泡于1ml的含1％(v/v)氯仿的SM中過夜(Maniatis et al.，eds.，MolecularCloningA Laboratories Manual，Cold Spring Harbor，NY，1982)。過夜溫育之后，每個(gè)瓊脂栓上的噬菌體用SM稀釋至1∶1,000。將5μl稀釋液等分樣涂布于大腸桿菌菌株LE392細(xì)胞上。平板于37℃下溫育過夜，按上面描述的方法制備噬菌體過濾提起物，預(yù)雜交，雜交，洗膜和放射自顯影。
放射自顯影檢查表明，兩個(gè)原來的分離物呈現(xiàn)較強(qiáng)的陽性信號，其它18個(gè)分離物呈現(xiàn)較弱的信號。從呈現(xiàn)20個(gè)信號的每個(gè)陽性區(qū)域中挑取瓊脂栓。瓊脂栓按上面描述的方法處理。從每個(gè)瓊脂栓中洗提的噬菌體以1∶100稀釋于SM中，取1μl稀釋液等分樣涂布于大腸桿菌菌株LE392細(xì)胞上。如上面描述的方法一樣，平板經(jīng)溫育，制備噬菌體過濾提起物，雜交。濾膜于55℃下用洗膜緩沖液洗滌。濾膜的放射自顯影顯示出雜交區(qū)域，這些雜交區(qū)域?qū)?yīng)于3個(gè)原來的分離物8-3-2，10-1-1和29-2-1的單一不連續(xù)的噬菌斑。
噬菌體分離物8-3-2，10-1-1和29-2-1分別指定為λZGmpl-H8，λZGmpl-H10和λZGmpl-H29。按照廠商的說明用LAMBDASORBTM噬菌體吸附法(Promega Corp.，Madison，WI)提純分離物λZGmpl-H8，λZGmpl-H10和λZGmpl-H29的DNA。通過用XbaI消化和瓊脂糖凝膠電泳純化從噬菌體載體DNA中分離來源于噬菌體的人基因組DNA插入片段。Souther印跡分析表明，所有三個(gè)噬菌體分離物含有與小鼠mpl受體的配體cDNA探針交雜的序列(Maniatis et al.ibid)。對噬菌體λZGmpl-H8進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)λZGmpl-H8的雜交區(qū)域位于長度為9.5Kb，2.5Kb和1Kb的3個(gè)XbaI DNA片段上。2.5Kb的片段亞克隆至XbaI消化的BLUESCRIPTSKT的噬菌粒上(Stratagene Cloning Systems)，產(chǎn)生質(zhì)粒pZGmpl-H82.5。
SEQ ID No28和SEQ ID No29分別表示人的TPO基因序列和其編碼的氨基酸序列。實(shí)施例X 全長人血小板生成素cDNA的分離利用來源于經(jīng)鑒定的pZGmpl-H82.5上的外顯子序列和小鼠TPO cDNA的保守的5’非翻譯序列為特定引物，從人的肝和腎cDNA模板通過聚合酶鏈反應(yīng)分離全長人TPO編碼cDNA。
人體的腎臟、肝臟和肺的poly d(T)選擇的poly(A)+RNAs(Cbontech，Palo Alto，CA)被用來合成第一鏈cDNA。用4μg的poly(A)+RNA與1μg的寡聚d(T)18(5’磷酸鹽號)mRNA引物(NeW England Biolab，Beverly，MA)混合至終體積為19μl進(jìn)行每個(gè)反應(yīng)。混合物加熱至65℃持續(xù)5分鐘，置于冰上冷卻。通過向每個(gè)RNA一引物混合物中加入8μl的5x SUPERSCRIPTTM緩沖液(GIBCO BRL)，2μl的100mM的二硫蘇糖醇，2μl的含有各10mM的dATP，dGTP，dTTP和dCTP(Pharmacia LKBBiotechnology Inc.，Piscataway，NJ)的脫氧核苷酸三磷酸溶液，2μl的1μCi/μl32p-α-dCTP(Amersham，Arlington Heights，IL)和8μl的200U/μl SUPERSCRIPTTM逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCO BRL)開始cDNA合成。反應(yīng)于45℃下溫育1小時(shí)，用TE(10mM TrisHCl，pH8.0，1mM EDTA)稀釋至120μl。通過加入50μl的8M醋酸銨和160μl的異丙醇沉淀cDNA兩次。產(chǎn)生的cDNA沉淀帶重新懸浮于10μl的TE中。由32p-dCTP滲入的量估計(jì)每個(gè)反應(yīng)第一鏈cDNA的產(chǎn)量。
用單獨(dú)的聚合酶鏈反應(yīng)，從肝、肺和腎mRNA合成的第一鏈cDNA用于產(chǎn)生2個(gè)cDNA區(qū)段，N-端三分之一序列和C-端三分之二序列。使用引物ZC7422(SEQ ID No20)和ZC7423(SEQID No21)通過PCR突變從基因組序列的一個(gè)單獨(dú)堿基的變化把一個(gè)Kpn限制性位點(diǎn)引入到cDNA區(qū)段中。產(chǎn)生的核苷酸變化創(chuàng)造了一個(gè)普通的KpnI限制性位點(diǎn)，而不改變預(yù)計(jì)的氨基酸編碼能力。
在含有5ng的模板cDNA(對腎、肝和肺cDNA用不同的反應(yīng))，各80pmol的寡聚核苷酸ZC7424(SEQ ID No22)和ZC7422(SEQ ID No20)，5μl的2.5mM的脫氧核苷酸三磷酸溶液(Cetus Corp.，Emeryville，CA)，5μl的10x PCR緩沖液(Promega Corp.，Madison，WI)和2.5單位的Taq聚合酶(Biehringer Mannheim)的50μl的反應(yīng)物中擴(kuò)增N-端片段。聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94℃1分鐘，58℃1分鐘和72℃1.5分鐘)，緊接著于72℃下溫育7分鐘。有意引物ZC7424(SEQID No22)跨越小鼠mpl受體的配體5’非翻譯區(qū)域，包括ATG起始密碼子。反義引物ZC7422(SEQ ID No20) 包括對應(yīng)于人的基因組TPO DNA的第4和第5個(gè)外顯子區(qū)域的序列。
在含有5ng的模板cDNA(如上所述的人的腎、肝或肺)。各80pmol的寡聚核苷酸ZC7423(SEQ ID No21)和ZC7421(SEQID No23)，5μl的2.5mM脫氧核苷酸三磷酸溶液(CetusCorp.)，5μl的10x PCR緩沖液(Promega Corp.)和2.5單位的Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的50μl反應(yīng)物中擴(kuò)增C-端片段。聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，再于37℃下溫育7分鐘。有意引物包括對應(yīng)于人的基因組TPO DNA的第4和第5個(gè)外顯子區(qū)域序列，反義引物ZC7423(SEQ ID No21)包括對應(yīng)于人的基因3’非編碼序列的區(qū)域序列，且包括翻譯終止密碼子。
擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA序列分析和亞克隆至pGEM-T(Promega Corp.)中，通過與小鼠cDNA序列和人的基因組序列比較進(jìn)一步分析。編碼人的TPO DNA序列表示于SEQ ID No18中，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No19所示，序列分析表明信號肽切割位點(diǎn)位于第22個(gè)氨基酸(SEQ ID No19)，成熟蛋白質(zhì)從第22個(gè)氨基酸開始(SEQ ID No19)。
從pGEM-T上切下人的N-端和C-端PCR產(chǎn)物片段EcoRI-KpnI，并連接于表達(dá)載體Zem229R的EcoRI位點(diǎn)。用LipofectaineTM(GIBCO BRL)把該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK 570細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后，用新鮮培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基(DMEM+PSV+10％FCS)，細(xì)胞在缺乏選擇因子時(shí)溫育48小時(shí)。如以前所描述的，用BaF3/MPLR1.1細(xì)胞系對條件培養(yǎng)基檢測增生活性。結(jié)果清楚地表明培養(yǎng)基中人的TPO可刺激表達(dá)鼠MPL受體的BaF3細(xì)胞增生。
按照廠商的說明，用SUPERSCRIPTTM逆轉(zhuǎn)錄酶(GIBCOBRL)從人的肝和腎mRNA(從Clontech Laboratories，Inc.獲得)制備cDNA。然后用兩個(gè)PCR反應(yīng)(條件見表6)構(gòu)建肝一和腎一來源的人TPO cDNA克隆。反應(yīng)于94℃下1分鐘，58℃下1分鐘，72℃下1.5分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；再于72℃下溫育7分鐘。
表6反應(yīng)#15ng肝或腎cDNA4μl寡聚核苷酸ZC7454(20pM/μl)(SEQ ID No24，在ATG的5’引入一個(gè)EcoRI位點(diǎn))4μl寡聚核苷酸ZC7422(20pM/μl)(SEQ ID No20；創(chuàng)造一個(gè)Asp714位點(diǎn))5μl含有2.5mM dATP，2.5mM dGTP，2.5mM dCTP和2.5mMdTTP的dNTPs溶液。
5μl 10x的Taq緩沖液(Boehringer Mannkeim)1μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)30μl的水反應(yīng)#25ng肝或腎cDNA4μl寡聚核苷酸ZC7423(20pM/μl)(SEQ ID No20，創(chuàng)造一個(gè)Asp718位點(diǎn))4μl寡聚核苷酸ZC7453(20pM/μl)(SEQ ID No25；在TGA的3’端引入一個(gè)EcoRI位點(diǎn))5μl含有2.5mM dATP，2.5mM dGTP，2.5mM dCTP和2.5mMdTTP的dNTPs溶液5μl 10x的Taq緩沖液(Boehringer Mamheim)1μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)30μl的水PCR產(chǎn)物用苯酚/氯仿/異戊醇處理并用95％乙醇沉淀，干燥和重新懸浮于20μl的水中。每個(gè)產(chǎn)物然后用限制性酶Asp718和EcoRI切割，于1％的瓊脂糖凝膠上電泳。從膠中切下反應(yīng)#1的410bp片段(肝和腎)和699bp的片段(肝和腎)，通過離心厚的膠塊，透過尼龍羊毛膜洗脫DNA片段。反應(yīng)#1和反應(yīng)#2的PCR產(chǎn)物一起用EcoRI切割的載體Zem229R(貯藏于American TypeCulture Collection，12301 Park lawn Drive，Rockville，MD，1993年9月28日，保藏號69447)，從而在創(chuàng)造的Asp718位點(diǎn)把兩種產(chǎn)物連接起來。產(chǎn)生的質(zhì)粒指定為#10(含腎來源的cDNA)和#28(含肝來源的cDNA)。
經(jīng)過對DNAs序列分析，發(fā)現(xiàn)單一PCR反應(yīng)產(chǎn)生的誤差分別位于#28和#10質(zhì)粒中唯一的AvrII位點(diǎn)的5’和3’。為了創(chuàng)造一個(gè)沒有錯(cuò)誤的TPO DNA，從#10質(zhì)粒中分離一個(gè)826bp的EcoRI-AvrII5’片段，從#28質(zhì)粒中分離一個(gè)283bp的AvrII-EcoRI3’片段。兩個(gè)片段與用EcoRI切割的Zem229R載體一起連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒被指定為pZGmpl-124。該質(zhì)粒于1994年5月4日保存于美國懸典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD)作為大腸桿菌DH10b轉(zhuǎn)化體，保藏號為69615。
實(shí)施例XI.巨核細(xì)胞cDNA文庫為了擴(kuò)增活體內(nèi)巨核細(xì)胞前體，20只小鼠每天通過腹膜注射40,000活性單位(在MTT試驗(yàn)中(實(shí)施例VII)，50U/ml可使BaF3/MPLR1.1細(xì)胞獲得一半的最大增生率)的重組小鼠血小板生成素(經(jīng)小鼠血小板cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK570細(xì)胞的濃縮的無血清條件培養(yǎng)基)。在注射的第5天，取出脾臟，置于CATCH緩沖液+Hepes(Hank’s平衡鹽溶液CHBSS)，無鈣和鎂，10mMHepes(GIBCO BRL)，1.4mM腺苷，2.74mM的茶堿(SigmaChemical Corp.，St.Louis，MO)和0.38％的檸檬酸鈉(J.T.BakerInc.Philipsburg，NJ)用NaOH調(diào)整pH至7.40)中。每次處理5個(gè)脾臟，切開每個(gè)脾臟，在兩個(gè)不銹鋼切口處擠出細(xì)胞，置于CATCH緩沖液+Hepes中。用一個(gè)25ml的吸管分散細(xì)胞凝塊后，把體積增加至50ml，細(xì)胞于Sorval(TJ-6離心機(jī)中以208g離心7分鐘。每個(gè)細(xì)胞沉淀重新懸浮于10ml的CATCH緩沖液+Hepes中，通過130μm的尼龍網(wǎng)過濾，獲得單細(xì)胞懸浮物。用CATCH緩沖液+Hepes使體積增加至50ml，細(xì)胞于33g下離心15分鐘。細(xì)胞用另外的50ml的CATCH+Hepes洗滌，于33g下離心10分鐘。細(xì)胞沉淀物重新懸浮于10ml的CATCH緩沖液+Hepes中，在離心管中置于三級Percoll(Pharmacia LKBBiotechpology AB，Uppsala，Sweden)梯度(65、40.27％的1×CATCH緩沖液+Hepes，每50ml的離心管中加入12ml)于833g下離心45分鐘。收集40％和63％Percoll層之間的細(xì)胞，用CATCH緩沖液+Hepes使其體積增加至50ml。細(xì)胞于208g下離心7分鐘，并重新懸浮于50ml的巨核細(xì)胞生長培養(yǎng)基(最低必需培養(yǎng)基α修飾物，無核苷酸和脫氧核苷酸的15％熱鈍化小牛胎兒血清，2mM L-谷氨酸 (從JRH Biosciences，Lenexa，CA獲得的培養(yǎng)基成分)，1mM丙酮酸鹽(Irvine Scientific，SantaAna，CA)，1×PSN抗生素混合物(GIBCO BRL)中并加入每毫升1000活性單位的重組小鼠血小板生成素(來源于小鼠血小板cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞的無血清條件培養(yǎng)基)。然后以每毫升106個(gè)單成核細(xì)胞涂布于150mm組織培養(yǎng)皿中，在6.0％ CO2、37℃下于充分濕潤的培養(yǎng)箱中生長。生長3天之后，把外粘著細(xì)胞收集于50ml的離心管中，置于冰上冷卻。通過4℃下以33g離心15分鐘沉淀較大的細(xì)胞。細(xì)胞于室溫下重新懸浮于50ml的CATCH+Hepes中，并于33g下離心10分鐘(所有進(jìn)一步的操作步驟均在室溫下進(jìn)行)。此洗滌步驟再重復(fù)一次以獲得高純度的成熟巨核細(xì)胞。剩余的細(xì)胞重新懸浮于15ml的CATCH+Hepes(收集的體積)并置于小牛胎兒血清三級梯度上(JRH Biosciences)(用CATCH緩沖液+Hepes稀釋的65％和40％的梯度)以1g離心30分鐘沉淀剩余細(xì)胞。收集底部5ml的65％的部分，用CATCH緩沖液+Hepes稀釋至50ml，并以33g離心10分鐘，按Burstein等的方法(J.Cell.Physiol. 122159-165，1985)測定細(xì)胞的乙酰膽堿酯酶，并確定純度大于99％的成熟巨核細(xì)胞。沉淀的細(xì)胞用硫氰酸胍/2-疏基乙醇裂解，通過氯化銫密度梯度離心提取RNA。如以上實(shí)施例VI中描述的方法，從巨核細(xì)胞RNA制備cDNA。
實(shí)施例XII.人血小板生成素基因的螢光原位雜交的基因作圖把下列混合物加入到置于冰上的微量離心管中含有人血小板生成素基因的λZGmpl-H8，λZGmpl-H10或λZGmpl-H29，5μl的缺口平移緩沖液(Nick Translation buffer，0.5M Tris/HCl，50mM MgCl2，0.5mg/ml BSA)(無核酸酶)，含有0.5mM dATP、0.5mM dGTP和0.5mM dCTP的5μl的dNTPs溶液，5μl的5mM的Bio-11-dUTP(5-NIN-生物素-ε-氨基己?；?3-氨基烯丙基-2’-脫氧尿苷-5’-三磷酸，Sigma Chemical Co.)，5μl的100mM的DTT，5μl的DNaseI(從10U/μl的貯存液中稀釋1000α，Boehringer Mannheim，無Rnase)，2.5μl的DNA聚合酶I(5U/μl Boehringer Mannheim)和水至終體積50μl。混合之后，于Bockel微型低溫培養(yǎng)箱中于15℃下溫育2小時(shí)，通過向反應(yīng)液中加入5μl的0.5M EDTA，pH7.4終止反應(yīng)。按照廠商的說明，用SephadexG-50 DNA純化旋轉(zhuǎn)柱(WorthingtonBiochemical Corporation，F(xiàn)reehold，NJ)純化探針。為了檢查探針的大小，5-10μl的每種純化的探針與5μl含凝膠緩沖液(12.5％聚蔗糖(ficoll)、0.2％的溴酚藍(lán)，0.2M Tris-乙酸，0.1M醋酸鈉，1mM EDTA)，于0.7％的瓊脂糖小型凝膠上以80v電壓電泳。用λ-HindIV片段(GIBCO BRL)和φX-Hae片段(GIBCO BRL)作為堿基對(bp)大小標(biāo)記。從Oncor(Gaithersburg，MD)獲得一個(gè)地高辛標(biāo)記的(digoxigenin-labeled)的染色體3(D3Z1)特定的著絲粒探針。
從HEL細(xì)胞培養(yǎng)中獲得中期染色體。加入100μl的Colcemid(GIBCO BRL，100μg/ml貯存液)到用于細(xì)胞培養(yǎng)的100×15mm平皿的培養(yǎng)基中，于37℃下溫育。2.5-3小時(shí)之后，用10ml的無菌塑料吸管從平皿中移去培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移到15ml的聚丙烯園錐形管(Blue MaxTM，Becton Dickinson)中。用5ml的無菌塑料吸管加入2ml的1×PBS(140mM NaCl，3mM Kcl，8mMNa2HPO4，1.5mM KH2PO4，pH7.2)至平皿中沖洗，并轉(zhuǎn)移到圓錐形管中。用無菌的5ml的塑料吸管加入2ml的胰蛋白酶(GIBCOBRL，貯存液)至平皿中，輕輕搖動平皿，置于37℃的培養(yǎng)箱中3-5分鐘。用5ml的無菌塑料吸管沖洗平皿中的細(xì)胞，并把細(xì)胞加入至帶有培養(yǎng)基的試管中。培養(yǎng)試管于250×g下離心8分鐘，取出幾乎為0.5ml的上清液。通過輕輕拍打離心管重新懸浮沉淀，然后緩慢和輕輕地加入0.075M KCl(預(yù)熱至37℃)。輕輕混合懸浮液并置于37℃水浴中10分鐘。以250×g離心溶液5分鐘，取出沉淀上面的大約0.5ml的上清液。輕輕拍打離心管重新懸浮沉淀。以點(diǎn)注方式加入2ml冷的甲醇∶乙酸(3∶1)，搖動試管以固定細(xì)胞。以這種方式共加入8ml的固定液。試管置于冰箱中20分鐘，接著以250×g離心5分鐘。再吸出上清，并重復(fù)固定過程二次以上。把中期分散的染色體點(diǎn)滴于25×75mm預(yù)先洗凈的冰凍的載玻片上(VMR Scientific，Media，PA)，用20μl的PipenmanTM(Gilson Medical Electronics，Inc.，Middleton，WI)滴加5μl的50％的乙酸于每個(gè)載玻片上，再加5μl的細(xì)胞懸乳液。載玻片于空氣中干燥，使用之前再于42℃的烘箱(Boekel Industries，Inc.，Philadelphia，PA)中過夜老化，用配有相襯濃縮裝置的顯微鏡對合適的中期分散的染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)。某些中期染色體制備物用Gurr’s改進(jìn)的R66Giema’s染料(BDH Ltd.)Dorset，England)染色呈現(xiàn)G-帶型，對這些染色體照相，用于雜交實(shí)驗(yàn)之前再脫色。用人的中期染色體擴(kuò)散物制備的載玻片于2×SSC(0.3MNaCl，0.03M檸檬酸鈉，pH7.0)中溫育2小時(shí)，簡單地用水沖洗，用Giemsa’s緩沖液，pH6.5(BHK Ltd.)以1∶4稀釋的Gurr’sGiemsa’s染料染色(染料使用之前經(jīng)Whatman#1濾紙過濾)。某些制備的載玻片先于90℃的烘箱中溫育45分鐘至1小時(shí)，在SSC中溫育之前冷卻。這些制備的載玻片于Giemsa’s緩沖液中使染色體變異，用水沖洗載玻片并于空氣中干燥。用Kodak EktachromeTM400幻燈片膠卷，在Olympus顯微鏡下對合適的呈G-帶型的中期染色體擴(kuò)散物照相，并用Optronics (Goleta，CA)ZVS-47ECCD RGB彩色視象系統(tǒng)和Optimus軟件(來自Bioscan Inc.，Edmonds，WA)使其數(shù)字化并貯存起來。進(jìn)一步使用之前，制備的載玻片于100％乙醇中脫色20分鐘，空氣干燥。未用的中期染色體載玻片制備物保存于-70℃下。
經(jīng)在1.5ml的無菌微量離心管中組合2.5μg的競爭DNA(Cot-1DNA，GIBCO BRL)，40-60ng的生物素標(biāo)記的λZGmpl-H8，λZGmpl-H10或λZGmpl-H29噬菌體(含人血小板生成素基因)，7μg的載體DNA(變性的鮭魚精巢DNA，SigmaChemical Co.)，1ml 3M的醋酸鈉和2倍體積的乙醇制備雜交混合物，并在真空離心蒸發(fā)濃縮器中真空干燥，將離心沉淀溶于由葡萄糖硫酸鹽，2×SSC和50％的甲酰胺(EM Science，Gibbstwn，NJ)組成的10μl的雜交液中。使探針和競爭DNA于70℃-80℃下變性5分鐘，置于冰上冷卻，并于37℃下預(yù)退火1-2小時(shí)。通過把每個(gè)載玻片浸入70％甲酰胺，2×SSC中于70-80℃下5分鐘，接著于冰冷的70％乙醇中立即冷卻，然后置于100％乙醇中5至10分鐘使染色體變性。這些載玻片再經(jīng)空氣干燥，在用20μl的Gilson PipetmanTM加入雜交混合物至載玻片之前把載玻片加熱至42℃。雜交混合物和染色體再用18×18mm的1號外套(VWRScientific)罩上。于潤濕的培養(yǎng)箱中在37℃下進(jìn)行雜交過夜。在某些情況下，在雜交約6小時(shí)之后，向制備物中加入5-10ng的變性的地高辛標(biāo)記的D3Z1著絲粒探針(于10％的葡萄糖硫酸鹽，2×SSC和65％的甲酰胺雜交液中)。
揭開外罩之后，載玻片于50％甲酰胺、2×SSC在42℃中洗滌3×5分鐘，于2×SSC在42℃下洗滌3×5分鐘和于4×SC，0.05％多氧乙烯山梨糖醇單月桂酸( TWeen-20，SigmaChemical Co.)中洗滌1×3分鐘。緊接著于濕潤的培養(yǎng)箱中用含有5％脫脂干奶粉的4×SSC(100μl，于24×50mm外罩下)預(yù)培養(yǎng)20分鐘。對包括染色體3 D3Z1著絲粒探針在內(nèi)的制備物，再于4×SSC/5％BSA中與1∶100稀釋的生物素一標(biāo)記的小鼠抗地高辛(Sigma Chemical Co.)一起溫育45分鐘，接著于4×SSC，0.05％Tween-20中每次3分鐘共洗滌3次。于24×50mm外罩下，用熒光素標(biāo)記的禽抗生物素蛋白(熒光素抗生物素蛋白DCS，Vector Laboratories，Burlingame，CA)(100μl，5μg/ml，于4×SSC，5％脫脂干奶粉中)對所有的制備物進(jìn)行雜交后的20分鐘的溫育。然后將載玻片于4×SSC，0.05％Tween-20中洗滌3×3分鐘，接著在24×50mm外罩下，用生物素化的羊抗-抗生物素蛋白D(親和提純，Vector Laboratories)(5μg/ml于4×SSC，5％脫脂干奶粉)再溫育20分鐘。載玻片再于4×SSC，0.05％ Tween20洗滌3×3分鐘，再于24×50mm外罩下用熒光素一標(biāo)記的抗生物素蛋白(100μl/ml于4×SSC，5％脫脂干奶粉)溫育。在某些情況下，信號擴(kuò)增步驟可再重復(fù)一次。最后于4×SSC，0.05％Tween-20中洗滌2×3分鐘，于1×PBS中洗滌1×3分鐘。把載玻片固定于antifade培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由9份含有2％ 1，4-重氮基雙環(huán)-(2，2，2)-辛烷(DABCO，于70℃下溶解)的甘油和1份0.2M Tris/HCl，pH7.5和0.25-0.5μg/ml Propidium碘化物組成。在配有BH2-RFC反射光熒光的Olympus BH2顯微鏡(PM-10 ADS自動顯微照相系統(tǒng)，Optronics ZVS-47E CCD RGB彩色攝象系統(tǒng)和Chroma技術(shù)公司(Brattlebow，VT)FITC/Texas為觀察FITC的紅色濾光裝置)下觀看載玻片。用Optronics視象照相系統(tǒng)和Optimus軟件使中期染色體擴(kuò)散物的圖象數(shù)字化并存貯起來。
從物理圖譜定位程序的初步結(jié)果表明人血小板基因座位于3q26區(qū)域的染色體3q臂的遠(yuǎn)端。實(shí)施例XIII.小鼠TPO細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域在啤酒糖酵母中的表達(dá)質(zhì)粒pBJ3-5含有啤酒糖酵母TPI1啟動子，α-因子分泌前導(dǎo)區(qū)，從237bp至692bp的小鼠TPO編碼序列，TPI1轉(zhuǎn)錄終止子，酵母中復(fù)制的2M序列和酵母中選擇的粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸酯異構(gòu)酶基因(POT1基因)。該質(zhì)粒的設(shè)計(jì)是為了指導(dǎo)分泌含SEQID No2的氨基酸45-196的小鼠TPO蛋白。
為了構(gòu)建pBJ3-5，用SphI和XbaI消化pMVR1(圖2)，回收含有TPI1啟動子5’部分和PTI1終止子的載體主要部分。然后將以下片段插入到載體的主要部分中。
1)一個(gè)來源于pBS114的SphI/HindIV片段，該片段含有TPI1的3’部分和α-因子前導(dǎo)區(qū)。質(zhì)粒pBS114為酵母穿棱質(zhì)粒，含有TPI1啟動子和α-因子，緊接著為一個(gè)包含HindIV位點(diǎn)的多接頭序列。
2)一個(gè)PCR產(chǎn)生的Hind III/SalI片段，該片段含有一個(gè)設(shè)計(jì)的與α-因子前導(dǎo)區(qū)中Hind IV位點(diǎn)處于同一框架內(nèi)的Hind IV位點(diǎn)，一個(gè)Kex2蛋白水解切割位點(diǎn)和SEQ ID No1中的從237bp至335個(gè)bp的小鼠TPO序列。
3)一個(gè)SalI/EcoRI片段，該片段含有SEQ ID No1中的小鼠TPO336個(gè)堿基對到692個(gè)堿基對，來源于質(zhì)粒pSL-MPL-100(通過用引物ZC7319(SEQ ID No27)和ZC7318 (SEQ IDNo26)擴(kuò)增pZGmpl-1081，用EcoRI消化并把含有TPO細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域序列和5’非編碼序列的片段克隆至Zem229R〔ATCC69447〕中)。通過克隆至事先用SalI和EcoRI消化的pIC19H中可以把該片段變化為SaI/XbaI片段。
產(chǎn)生的質(zhì)粒指定為pBJ3(圖2)，再用BglII和XhoI消化，以釋放含有啟動子，前導(dǎo)區(qū)，TPO編碼序列和終止子的整個(gè)表達(dá)盒。該BglII/XhoI片段插入到用BamHI和XhoI消化的pRPOT中(在美國專利5,128,321中已被公開，本文一并參考)，產(chǎn)生的質(zhì)粒指定為pBJ3-5。
通過醋酸鋰方法(已由Ito等作一般性描述，J.Bacteriol.153163-168，1983)，用pBJ3-5和pRPOT轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母菌株JG134(MATαura3-52 leu2-Δ2 pep4-Δ1 ΔtpilURA3〔Cir0〕)。通過在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長選擇轉(zhuǎn)化體。使JG134/pBJ3-5和JG134/pRPOT于YEPD液體培養(yǎng)基中生長3天。通過離心把培養(yǎng)基與細(xì)胞分離開，并在含有MPL受體的BaF3細(xì)胞中通過細(xì)胞增生試驗(yàn)分析培養(yǎng)基。來源于菌株JG134/pBJ3-5的培養(yǎng)基含有5000-7000單位/ml的TPO活性，而負(fù)對照J(rèn)G134/pRPOT則沒有活性。該結(jié)果表明酵母可分泌一種生物活性形式的TPO。
實(shí)施例XIV重組人TPO的活性通過用堿裂解細(xì)胞，接著再把DNA結(jié)合到高鹽樹脂上(用Promega公司的Magic MiniprepsTMSampler Kit)從用pZGmpl-124轉(zhuǎn)化的2個(gè)5ml過夜細(xì)菌培養(yǎng)物中制備DNA。DNA用75μl的10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0洗提。
用pZGmpl-124 DNA轉(zhuǎn)染50,000細(xì)胞/孔的BHK570細(xì)胞培養(yǎng)物。在加入到BHK570細(xì)胞和于37℃下溫育4小時(shí)之前，于室溫下30分鐘內(nèi)把20μl的1∶10稀釋的LIPO FECTAMINETM(GIBCO BRL)加入到20μl的質(zhì)粒DNA和160μl的無血清培養(yǎng)基(F/DV培養(yǎng)基〔DMEM和Ham’s以1∶1的混合物〕，補(bǔ)充有10μg/ml)胎球蛋白，20ng/ml硒，5μg/ml胰島素，10μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，2mM L-谷氨酰胺，110μg/ml的丙酮酸鈉，25mMHEPES和0.1mM的非必需氨基酸溶液〔GIBCO BRL〕)中，μl然后加入200μl的生長培養(yǎng)基(DMEM (Biowhittaker)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有2mM的L-谷氨酰胺，110μg/ml丙酮酸鈉，0.05mg/ml青霉素，0.05mg/ml鏈霉素，0.01mg/ml新霉素，25mM HEPES，10％小牛胎兒血清)，將細(xì)胞于37℃下溫育過夜。然后用含有5％的小牛胎兒血清的生長培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，并于37℃下溫育4小時(shí)。
測定BHK570轉(zhuǎn)染體的條件培養(yǎng)基在表達(dá)小鼠MPL受體的BaF3細(xì)胞中引起細(xì)胞增生的能力。使細(xì)胞于BaF3培養(yǎng)基中生長(RPMI 1640培養(yǎng)基(JRH Biosciences)，并補(bǔ)充有10％小牛胎兒血清，2mM L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸鈉，10mM HEPES，57μm β-疏基乙醇，0.05mg/ml青霉素，0.05mg/ml的鏈霉素，0.01mg/ml新霉素和4％ V/V的WEHI-3細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基(小鼠白細(xì)胞介素-3，培養(yǎng)基補(bǔ)充物，CollaborativeBiochemical Proclucts))。測定之前，BaF3細(xì)胞用沒有IL-3的培養(yǎng)基稀釋并重新懸浮至10,000細(xì)胞/100μl。加入pZGmpl-124轉(zhuǎn)染BHK570細(xì)胞的100μl的條件培養(yǎng)基，于37℃下溫育培養(yǎng)物。通過視覺觀察30分鐘和24小時(shí)之后的細(xì)胞伸長情況。對由沒有IL-3的BaF3培養(yǎng)基組成的負(fù)對照和用小鼠TPO DNA轉(zhuǎn)染的BHK570細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的正對照也進(jìn)行測定。結(jié)果表明負(fù)對照中BaF3細(xì)胞沒有伸長，正對照中有些伸長，在pZGmpl-124轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中細(xì)胞有明顯的伸長。
實(shí)施例XI.受體親和沉淀將含有產(chǎn)生TPO細(xì)胞或正常的BHK細(xì)胞的150-mm組織培養(yǎng)皿用沒有甲硫氨酸、含有2mM L-谷氨酰胺，抗生素和Expressr 200μCi的35S(Amersham，Arlington Heights，IL)Dulbecco’s MEM標(biāo)記18小時(shí)。
過夜溫育之后，收集營養(yǎng)耗盡的培養(yǎng)基，用Centriprep-10TM(Amicon，Inc.)離心15分鐘。產(chǎn)生的0.75ml濃縮的上清液與按提供商提供的說明與CNBr-Sepharose 4B(Pharmacia)連接的40μl多聚組氨酸尾序的可溶性受體相混合?；旌衔镏糜诒蠐u動溫育2小時(shí)。
細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后用1ml的RIPA緩沖液(10mMTris，pH7.4，1％脫氧膽酸鹽，1％ Triton x-100，0.1％SDS，5mMEDTA，0.15M NaCl)裂解。裂解物經(jīng)離心去除不溶解的物質(zhì)，用如上所述的方法加入40μl的MPL-Sepharose。
然后通過低速離心使MPL-Sepharose沉淀，去掉耗盡的培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解物。沉淀用含0.5M NaCl的PBS洗滌4次。最后一次沖洗之后，去除PBS，加入含4％ β-疏基乙醇的40μl的2x樣品緩沖液(10％甘油，4％ SDS，5mM Tris，pH7.0，1mM0.05％溴酚藍(lán))。
樣品煮沸5分鐘，每個(gè)樣品18μl上樣至10-20％的梯度微型凝膠上(Integrated Separaition System)，然后于100v下電泳大約2小時(shí)。固定凝膠30分鐘(于40％甲醇，16％冰醋酸的蒸餾水中)，然后于AmplifyTM(Amersham)中浸透20分鐘。干燥之后，凝膠暴露于膠片下過夜。在與用TPO cDNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的耗盡營養(yǎng)的培養(yǎng)基相對應(yīng)的泳道中清淅可見一條～70KD的帶。該帶不存在于BHK細(xì)胞的耗盡培養(yǎng)基中，也不是這兩種細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物。
從前面所述將意識到的是，雖然為了說明的目的，本文已對本發(fā)明的具體實(shí)施方案作了描述，但可作各種各樣的修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，除了所附權(quán)利要求書之外，本發(fā)明不受限制。
序列表(1)一般信息(i)申請人ZymoGenetics，Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattleWAUS98102申請人University of WashingtonSeattleWAUS98195(ii)發(fā)明名稱血細(xì)胞生成蛋白及其制造材料和方法(iii)序列數(shù)29(iV)通信地址(A)通信人ZymoGenetics，Inc.
(B)街道1201 Eastlake Avenue East(C)城市Seattle(D)州WA(E)國家USA(F)郵政編碼98102(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前的申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(viii)律師/代理人信息
(A)姓名Parker，Gary E(B)注冊號31-648(C)證書/文件號93-12PC(ix)電訊信息(A)電話206-442-6600ext 6673(B)電傳206-442-6678(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長度1486個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型cDNA(vii)直接來源(B)克隆1081(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置105..1241(xi)序列描述SEQ ID NO1CCTCGTGCCG GTCCTGAGGC CCTTCTCCAC CCGGACAGAG TCCTTGGCCC ACCTCTCTCC60CACCCGACTC TGCCGAAAGA AGCACAGAAG CTCAAGCCGC CTCC ATG GCC CCA GGA116Met Ala Pro Gly1AAG ATT CAG GGG AGA GGC CCC ATA CAG GGA GCC ACT TCA GTT AGA CAC 164Lys Ile Gln Gly Arg Gly Pro Ile Gln Gly Ala Thr Ser Val Arg His5 10 15 20CTG GCC AGA ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GCG GCC ATG CTT CTT 212Leu Ala Arg Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu25 30 35GCA GTG GCA AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCC GTA GCT CCT GCC TGT GAC 260Ala Val Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp40 45 50CCC AGA CTC CTA AAT AAA CTG CTG CGT GAC TCC CAC CTC CTT CAC AGC 308Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser55 60 65CGA CTG AGT CAG TGT CCC GAC GTC GAC 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(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC5762(xi)序列描述SEQ ID NO5AGAGAGAGAG AGAGCTCGAG TCAAGGCTGC TGCCAATAGC TTAGTGGTAG GT 52(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC5742(xi)序列描述SEQ ID NO6GACCCTGGAG CTGCGCCCGC GATCTCGCTA(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)長度49個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC6091(xi)序列描述SEQ ID NO7GAGCACAGAA TTCACTACTC GAGGCGGCCG CTTTTTTTTT TTTTTTTTT(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)長度45個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC6603(xi)序列描述SEQ ID NO8GAGGAATTCG CAGAAGCCAT GCCCTCTTGG GCCCTCTTCA TGGTC(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)長度8個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(xi)序列描述SEQ ID NO9Val Arg Thr Ser Pro Ala Gly Glu1 5(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)長度48個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC6704(xi)序列描述SEQ ID NO10GAAGAGGAAT TCACCATGGA TGTCTTCTTG CTGGCCTTGG GCACAGAG(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)長度60個(gè)堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC6703(xi)序列描述SEQ ID NO11 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140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145 150 155 160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala165 170 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu180 185 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr195 200 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly210 215220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225 230 235 240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly245 250 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro260 265 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu275 280 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305 310 315 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser325 330 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu340 345 350Gly(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7422(xi)序列描述SEQ ID NO20GGAAGCTGGG TACCAAGGAG GCT(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7423(xi)序列描述SEQ ID NO21AGCCTCCTTG GTACCCACCT TCC(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征
(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7424(xi)序列描述SEQ ID NO22TTAGACACCT GGCCAGAATG(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7421(xi)序列描述SEQ ID NO23TGATGTCGGC AGTGTCTGAG AACC(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7454(xi)序列描述SEQ ID NO24CCGGAATTCT TAGACACCTG GCCAGAATG(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7453(xi)序列描述SEQ ID NO25CCGGAATTCT GATGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)長度33個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7318(xi)序列描述SEQ ID NO26TACCGAATTC TAGACACAGA GGGTGGGACC TTC(2)SEQ ID NO27信息(i)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(vii)直接來源(B)克隆ZC7319(xi)序列描述SEQ ID NO27ACACTGAATT CTTCTCCACC CGGACAGAGT(2)SEQ ID NO28信息(i)序列特征(A)長度4823個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置連接(632..644，876..1003，1290..1376，3309..3476，3713..4375)(xi)序列描述SEQ ID NO28CTTTCTTGCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTCT TTCTTTTTTT TTTTTGAGAC GGAGTTTCAC 60TCTTATTGCC CAGGCTGGAG TGCAATGGTG CGATCTCGGC TCACCACAAC CTCCGCCTCC 120CAGGTACAAG CGATTCTCCT GTCTCAGCCT CCCAAGTAGC TTGGATTACA GGCATGAACC 180ACCACACCCT GCTAGTTTTT TTGTATTTCG TAGAGCCGGG GTTTCACCAT GTTAGTGAGG 240CTGGTGGCGA ACTCCTGACC TCAGGTGATC CACCCGCCTT GGACTCCCAA AGTGCTGGGA 300TTACAGGCAT GAGCCACTGC ACCCGGCACA CCATATGCTT TCATCACAAG AAAATGTGAG 360AGAATTCAGG GCTTTGGCAG TTCCAGGCTG GTCAGCATCT CAAGCCCTCC CCAGCATCTG 420TTCACCCTGC CAGGCAGTCT CTTCCTAGAA ACTTGGTTAA ATGTTCACTC TTCTTGCTAC 480TTTCAGGATA GATTCTTCAC CCTTGGTCCG CCTTTGCCCC ACCCTACTCT GCCCAGAAGT 540GCAAGAGCCT AAGCCGCCTC CATGGCCCCA GGAAGGATTC AGGGGAGAGG CCCCAAACAG 600GGAGCCACGC CAGCCAGACA CCCCGGCCAG A ATG GAG CTG ACT G GTGAGAACAC 654Met Glu Leu Thr1ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC 714TGCAGGGGGC AGGAAGCTGG GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG 774ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG 834ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G AA TTG CTC CTC 886Glu Leu Leu Leu5GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT934Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala10 15 20CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC982Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser25 30 35 40CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC 1033His Val Leu His Ser Arg Leu45CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT 1093GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAAGGA 1153TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA AGCTCTCGTC TAGAGATAGT ACTCATGGAG 1213GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC 1273CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 1322Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr50 55CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 1370Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr60 65 70CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT1426Gln Met75CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA 1486GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT 1546GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA 1606AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCCGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG 1666AAGCAAGACT CATATGTCAT CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC 1726AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC 1786AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG 1846AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC 1906GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAGAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT 1966CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA 2026GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 2086AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG 2146GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA 2206TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT 2266AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA 2326GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT 2386GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA 2446GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG CAATAGTTTA AAAAACTAAA 2506ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG 2566CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT 2626CTCATACCTA CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC 2686CCAGGCTGGA GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC CCGGATTCAA 2746GCGATTCTCC TGTCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC AGGTGCCCAC CACCATGCCC2806AGCTAATTTG TGTATTTGTG GTAGAGATGG GGTTTCACCA TGTTGGGCAG GCTGATCTTG2866AACTCCTGAC CTCAGGTGAT CCACCTGCCT CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG2926TGAGCCACTG CACCCAGCCT TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG2986CAGAAAGAGT AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA GGGCAGATTT3046CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA AGTGTAAGAC CAGGCTGGAC3106TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG CTGATGACCA GCTGTCGGGA GACTGTGAAG3166GAATTCCTGC CCTGGGTGGG ACCTTGGTCC TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC3226TGCTGGCTAC TCCTAAGGCT CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT3286CTCTCTTCCA TCTCTTTCTC AG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA 3338Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly80 85GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG 3386Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu90 95 100GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC 3434Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val105 110 115CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG 3476Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln120 125 130GTAAGTCCCC AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT CTGACTCAGT CCCCCTAGAA3536GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG ATCTACTAAG3596AGTGCTCCCT GCCAGCCACA ATGCCTGGGT ACTGGCATCC TGTCTTTCCT ACTTAGACAA3656GGGAGGCCTG AGATCTGGCC CTGGTGTTTG GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAG3712CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC 3760Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile135 140 145TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG 3808Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met150 155 160CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA 3856Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr165 170 175 180GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA 3904Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro185 190 195AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA 3952Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg200 205 210ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG 4000Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys215 220 225ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC 4048Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro230 235 240GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC 4096Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu245 250 255 260TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA 4144Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser265 270 275GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT 4192Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr280 285 290TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT 4240Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro295 300 305CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT 4288Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu310 315 320CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC 4336Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn325 330 335 340ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC 4385Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly345 350AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG4445GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA4505TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT4565TTTTTAAGCT ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCAGA4625AATTTGCAAC TCACTGATTC TCAACATGCT CTTTTTCTGT GATAACTCTG CAAAGACCTG4685GGCTGGCCTG GCAGTTGAAC AGAGGGAGAG ACTAACCTTG AGTCAGAAAA CAGAGGAAGG4745GTAATTTCCT TTGCTTCAAA TTCAAGGCCT TCCAACGCCC CCATCCCCTT TACTATCATT4805CTCAGTGGGA CTCTGATC(2)SEQ ID NO29信息(i)序列特征(A)長度353個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO29Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala1 5 10 15Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val20 25 30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser35 40 45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala50 55 60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys65 70 75 80Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met85 90 95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly100 105 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu115 120 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp130 135 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val145 150 155 160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala165 170 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu180 185 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr195 200 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly210 215 220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu225 230 235 240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly245 250 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro260 265 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu275 280 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu305 310 315 320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser325 330 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu340 345 350Gly
權(quán)利要求
1.一種選自由以下物質(zhì)組成的組的分離的蛋白質(zhì)。a)包含SEQ ID No2的從第45個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。b)包含SEQ ID No2的從第45個(gè)氨基酸殘基到第206個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。c)包含SEQ ID No19的從第22個(gè)氨基酸殘基到第173個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。d)包含SEQID No19的從第22個(gè)氨基酸殘基到第175個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。e)(a)，(b)，(c)，(d)的等位變異體；和f)(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的物種同系物，其中所述的蛋白質(zhì)刺激骨髓樣或淋巴樣前體的增生或分化。
2.一種按照權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)包含SEQ ID No2的從第45個(gè)氨基酸殘基到第379個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
3.一種按照權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)包含SEQ ID No19的從第22個(gè)氨基酸殘基到第353個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
4.一種按照權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)為一種小鼠蛋白質(zhì)。
5.一種按照權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)為一種人體蛋白質(zhì)。
6.一種按照權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)包括SEQ ID No2中所示的第45個(gè)氨基酸殘基到第379個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No2中所示的第24個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No2中所示的第24個(gè)氨基酸殘基到第206個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No2中所示的第24個(gè)氨基酸殘基到第379個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No2中所示的第1個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No2中所示的第1個(gè)氨基酸殘基到第206個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；或SEQ ID No2中所示的第1個(gè)氨基酸殘基到第379個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
7.一種按照權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包括SEQ ID No19中所示的第1個(gè)氨基酸殘基到第173個(gè)殘基的氨基酸序列；SEQ ID No19中所示的第1個(gè)氨基酸殘基到第175個(gè)殘基的氨基酸序列；SEQ ID No19中所示的第1個(gè)氨基酸殘基到第353個(gè)殘基的氨基酸序列；或SEQ ID No19中所示的第22個(gè)氨基酸殘基到第353個(gè)殘基的氨基酸序列。
8.一種基本上由選自以下序列組成的組的氨基酸序列組成的分離的蛋白本質(zhì)SEQ ID No2中從第45個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No2中從第45個(gè)氨基酸殘基到第206個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No2中從第45個(gè)氨基酸殘基到第379個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；SEQ ID No19中從第22個(gè)氨基酸殘基到第175個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列；和SEQ ID No19中從第22個(gè)氨基酸殘基到第353個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
9.一種可刺激骨髓樣或淋巴樣前體增生或分化的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)包含與SEQ ID No2中的第45個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列或SEQ ID No19中的第22個(gè)氨基酸殘基到第173個(gè)氨基酸殘基的第173個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列在氨基酸水平上至少具有80％的同源性的區(qū)段。
10.一種編碼按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的分離的多核苷酸分子。
11.一種按照權(quán)利要求10的分離的多核苷酸分子，其中該分子為包含一條編碼鏈的DNA分子，所述編碼鏈包含SEQ ID No1中的第237個(gè)核苷酸到第692個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
12.一種按照權(quán)利要求10的分離的多核苷酸分子，其中該分子為包含一條編碼鏈的DNA分子，所述編碼鏈包含SEQ ID No18中的第64個(gè)核苷酸到第519個(gè)核苷酸的核苷酸序列。
13.一種按照權(quán)利要求10的分離的多核苷酸分子，其中該分子編碼SEQ ID No2中的第45個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
14.一種按照權(quán)利要求10的分離的多核苷酸分子，其中該分子編碼SEQ ID No19中的第22個(gè)氨基酸殘基到第173個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
15.一種選自由以下物質(zhì)組成的組的分離的多核苷酸分子(a)編碼血細(xì)胞生成蛋白并包含SEQ ID No1中所示的第237個(gè)核苷酸到第692個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA分子；(b)編碼血細(xì)胞生成蛋白并包含SEQ ID No18中所示的第64個(gè)核苷酸到第519個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA分子；(c)(a)或(b)的等位變異體；(d)編碼血細(xì)胞生成蛋白的DNA分子，該蛋白與(a)，(b)或(c)編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列方面至少有90％的同源性；和(e)與(a)，(b)，(c)或(d)互補(bǔ)的分子。
16.一種按照權(quán)利要求15的分離的多核苷酸分子，其中該分子編碼的血細(xì)胞生成蛋白與(a)，(b)或(c)編碼的蛋白在氨基酸序列方面至少具有90％的同源性。
17.一種按照權(quán)利要求15的分離的多核苷酸分子，其中該分子包含SEQ ID No1的第237個(gè)核苷酸到722個(gè)核苷酸或SEQ ID No18的第64個(gè)核苷酸到第525個(gè)核苷酸。
18.一種選自由以下物質(zhì)組成的組的分離的DNA分子(a)質(zhì)粒pZGmpl-1081(ATCC 69566)的EcoRI-XhoI插入片段；(b)(a)的等位變異體；和(c)編碼與(a)或(b)編碼的蛋白質(zhì)在氨基酸序列方面至少具有80％同源性的蛋白質(zhì)的DNA分子，其中該分離的DNA分子編碼具有血細(xì)胞生成活性的蛋白質(zhì)。
19.一種按照權(quán)利要求18的分離的DNA分子，其中該分子編碼包含SEQ ID No2中的第45個(gè)氨基酸殘基至第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的多肽。
20.一種包含以下可操作連接的元件的表達(dá)載體一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動子；一個(gè)選自由以下物質(zhì)組成的組的DNA區(qū)段(a)編碼血細(xì)胞生成蛋白并包含SEQ ID No1中所示的第237個(gè)到第692個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA；(b)編碼血細(xì)胞生成蛋白并包含SEQ ID No18中所示的第64個(gè)核苷酸到第519個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA；(c)(a)或(b)的等位變異體；和(d)編碼血細(xì)胞生成蛋白的DNA分子，該蛋白與(a)、(b)或(c)編碼的蛋白在氨基酸序列方面至少具有80％的同源性和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。
21.一種按照權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其中所述的DNA區(qū)段編碼的血細(xì)胞生成蛋白與(a)，(b)或(c)編碼的蛋白在氨基酸序列方面至少具有90％的同源性。
22.一種按照權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其中所述的DNA區(qū)段包含SEQ ID No1中的第237個(gè)核苷酸到第722個(gè)核苷酸或SEQ ID No18中的第64個(gè)核苷酸到第525個(gè)核苷酸。
23.一種按照權(quán)利要求20的表達(dá)載體，該載體還包括可經(jīng)操作與所述DNA區(qū)段連接的分泌信號序列。
24.一種培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞中已引入了按照權(quán)利要求20的表達(dá)載體，其中所說的細(xì)胞表達(dá)的由DNA區(qū)段編碼的血細(xì)胞生成蛋白。
25.一種按照權(quán)利24的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞為一種真菌細(xì)胞。
26.一種按照權(quán)利要求25的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞為一種酵母細(xì)胞。
27.一種按照權(quán)利要求24的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞為一種哺乳動物細(xì)胞。
28.一種按照權(quán)利要求24的培養(yǎng)細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞為一種細(xì)菌細(xì)胞。
29.一種非人哺乳動物，該哺乳動物種系中已引入選自由以下物質(zhì)組成的組的異說DNA區(qū)段(a)編碼血細(xì)胞生成蛋白并包含SEQ ID No1中所示的第64個(gè)核苷酸到第519個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA區(qū)段；(b)編碼血細(xì)胞生成蛋白并包含SEQ ID No18中所示的第64個(gè)核苷酸到第519個(gè)核苷酸的核苷酸序列的DNA區(qū)段；(c)(a)或(b)的等位變異體；和(d)編碼與(a)，(b)或(c)編碼的蛋白在氨基酸序列方面至少具有80％同源性的血細(xì)胞生成蛋白的DNA區(qū)段；其中上述哺乳動物產(chǎn)生由所述DNA區(qū)段編碼的血細(xì)胞生成蛋白。
30.一種按照權(quán)利要求29的非人哺乳動物，該哺乳動物選自由豬、山羊、綿羊、牛和小鼠組成的組。
31.一種按照權(quán)利要求29的非人哺乳動物，其中所述DNA區(qū)段包含SEQ ID No1的第237個(gè)核苷酸到第722個(gè)核苷酸或SEQ ID No18的第64個(gè)核苷酸到第525個(gè)核苷酸。
32.一種產(chǎn)生血細(xì)胞生成蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)已引入按照權(quán)利要求20的表達(dá)載體的細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞表達(dá)由所說DNA區(qū)段編碼的血細(xì)胞生成蛋白。回收血細(xì)胞生成蛋白。
33.一種按權(quán)利要求32的方法，其中所說的血細(xì)胞生成蛋白由所述細(xì)胞分泌并從培養(yǎng)所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收。
34.一種藥物組合物，該組合物包含按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)和藥理學(xué)上可接受的載體。
35.一種抗體，該抗體結(jié)合按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的抗原決定簇。
36.一種在哺乳動物中刺激血小板產(chǎn)生的方法，該方法包括給所述哺乳動物施用治療有效量的選自由以下物質(zhì)組成的組的血細(xì)胞生成蛋白a)包含SEQ ID No2的從第45個(gè)氨基酸殘基到第196個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；b)包含SEQ ID No19的從第22個(gè)氨基酸殘基到第173個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；c)(a)或(b)的等位變異體；和d)(a)，(b)或(c)的物種同系物。其中所述的蛋白質(zhì)與藥理上可接受的載體一起刺激骨髓樣或淋巴樣前體增生或分化。
37.一種探針，該探針包含至少14個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，其中所述的寡聚核苷酸的序列與以下序列的同一長度部分至少有80％的同源性；(a)SEQ ID No1；(b)SEQ ID No18；(c)SEQ ID No28；或(d)與SEQ ID No1，SEQ ID No18或SEQ ID No28互補(bǔ)的序列。
38.一種在DNA分子的混合物中檢測編碼血小板生成素的DNA分子的方法，該方法包括用探針探測DNA分子的混合物，所述探針包含至少14個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，其中所述的寡聚核苷酸的序列與以下序列的同一長度部分至少有80％的同源性(a)SEQ ID No1；(b)SEQ ID No18；(c)SEQ ID No28；或(d)與SEQ ID No1，SEQ No18或SEQ ID No28互補(bǔ)的序列；和檢測與所述探針雜交的DNA分子。
39.一種刺激細(xì)胞增生的方法，該方法包括向培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞中以足以刺激細(xì)胞增生的量加入按照權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)。
40.一種按照權(quán)利要求39的方法，其中所述的細(xì)胞為巨核細(xì)胞或巨核細(xì)胞前體。
41.一種提純血小板生成素的方法，該方法包括把含血小板生成素的溶液暴露于附加有固體支持物的抗體中，按照權(quán)利要求1，其中的所述的抗體與按照權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合；洗滌所述的抗體，去除未結(jié)合的污染物；從所述的抗體中洗脫結(jié)合的血小板生成素；和回收所述洗脫的血小板生成素。
全文摘要
本發(fā)明提供了血細(xì)胞生成蛋白及其多肽片段，包括小鼠和人的蛋白質(zhì)和多肽。本發(fā)明也提供了編碼這些蛋白質(zhì)和多肽的DNA分子，以及在其生產(chǎn)中有用的載體和細(xì)胞。本發(fā)明還提供了與所述蛋白質(zhì)上的抗原決定簇結(jié)合的抗體。這些蛋白質(zhì)和多肽對體內(nèi)和體外治療有用，也可以作為細(xì)胞培養(yǎng)和研究細(xì)胞增生和發(fā)育的試劑。
文檔編號A61P7/00GK1148408SQ9419499
公開日1997年4月23日 申請日期1994年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月14日
發(fā)明者R·D·霍利, S·羅克, D·C·弗斯特, F·S·哈根, K·考山斯奇, J·F·貴皮爾, C·羅夫頓-得, P·J·歐特, S·K·伯克哈德 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司, 華盛頓大學(xué)