專利名稱：能中和流感病毒h3n2的人結(jié)合分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及能中和各種甲型流感病毒亞型的人結(jié)合分子，包括針對包含H3亞型的HA的流感病毒如流感病毒H3N2的中和結(jié)合分子。本發(fā)明特別涉及包含H3亞型的HA的流感病毒、特別是流感病毒H3N2的感染的診斷、預(yù)防和/或治療。
背景技術(shù)：
流感病毒是RNA正粘病毒，由甲、乙和丙三種類型組成。乙型和丙型流感病毒是主要的人病原體，甲型流感病毒感染各種鳥類和哺乳動物，包括人、馬、海洋哺乳動物、豬、雪貂和雞。在動物中，大多數(shù)甲型流感病毒導(dǎo)致呼吸道和腸道的輕度局部感染。然而，也存在高致病性甲型流感病毒亞型如H5m，其導(dǎo)致家禽全身感染，死亡率可達到100%。甲型流感病毒的一些亞型在人類也導(dǎo)致嚴重疾病。甲型流感病毒基于編碼表面糖蛋白的兩個基因的抗原性區(qū)域中的等位基因變化而可以分成亞型，所述表面糖蛋白即血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，其是病毒粘附和細胞釋放所必需的。其它主要的病毒蛋白包括核蛋白、核殼結(jié)構(gòu)蛋白、膜蛋白(Ml和M2)、聚合酶(PA、PB和PB2)以及非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和NS2)。目前已知甲型流感病毒的16個HA亞型 (H1-H16)和9個NA抗原變體(N1-N9)。流感病毒亞型根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)生類群(phylogenetic group)可被進一步分類。系統(tǒng)發(fā)生分析(Fouchier et al. ,2005)已經(jīng)證實分成兩個主要類群的HA亞型(Air，1981)系統(tǒng)發(fā)生類群1中的HI、H2、H5和H9亞型及系統(tǒng)發(fā)生類群2 中的H3、H4和H7亞型(
圖1)。僅有一些甲型流感病毒亞型(即H1N1、H1N2和H3N》在人群中傳播，但是16個HA 和9個NA亞型的所有組合均已經(jīng)在禽類動物中鑒別。感染甲型流感病毒的動物通常作為流感病毒的貯主，且一些亞型已經(jīng)示出通過物種屏障進入人類，如高致病性甲型流感病毒株 H5N1。流感病毒感染是已知人類最常見的疾病之一，導(dǎo)致在世界范圍內(nèi)每年3-5百萬的嚴重病例以及250，000-500, 000的死亡人數(shù)。流感在季節(jié)性流行中迅速傳播，影響5-15% 的人口，加重衛(wèi)生保健成本以及喪失生產(chǎn)力(世界衛(wèi)生組織(WHO))。住院治療和死亡病例主要發(fā)生在高危人群(老人，慢性病人)中。每年的流感流行是在病毒表面蛋白HA和NA的抗原性質(zhì)改變時發(fā)生。改變的抗原性的機制是雙重的抗原性轉(zhuǎn)變，由于宿主細胞的雙重感染后在人與動物病毒之間的遺傳重排導(dǎo)致，這可以導(dǎo)致大流行；以及抗原性漂移，由于病毒表面上的HA和NA蛋白中的小變化導(dǎo)致，這可導(dǎo)致流感流行。通過這兩種機制浮現(xiàn)出的變體病毒毒株是導(dǎo)致流感流行的原因。在上世紀爆發(fā)三次，甲型流感病毒經(jīng)歷了主要在其HA成分中的主要遺傳改變，導(dǎo)致全球大流行，發(fā)病率和死亡率均高發(fā)。最嚴重的大流行是“西班牙流感”，由流感病毒Hmi導(dǎo)致，其影響了大部分世界人口，認為其在1918-1919年間導(dǎo)致至少4千萬人死亡。近年來發(fā)生了兩起其它甲型流感大流行，即在1957年(亞洲流感，由流感病毒H2N2導(dǎo)致)和1968 年(香港流感，由流感病毒H3N2導(dǎo)致)，致全球重大的發(fā)病率和死亡率。與當前的季節(jié)性流感流行相反，這些大流行也與涉及一般年輕人的嚴重后果相關(guān)。
目前處理每年流感流行的方法包括每年進行接種，優(yōu)選產(chǎn)生異型交叉保護作用。 然而，如上所述，對在人群中傳播的流感病毒進行永久抗原性改變需要每年改變流感疫苗配制物以保證流感疫苗株與正在傳播的流感毒株之間最密切的可能匹配。盡管每年接種流感疫苗是防止流感的最佳方式，但是抗病毒藥物如奧司他韋 (Tamiflu 可有效地預(yù)防和治療流感。然而，示出對這種奧司他韋具有抗性的流感病毒的數(shù)目越來越多。另一種方法是開發(fā)基于抗體的預(yù)防或者治療方式以中和各種季節(jié)性流感病毒。起免于流感病毒感染的保護作用的中和抗體的主要靶是病毒HA蛋白的球狀頭部(HAl部分)， 其含有受體結(jié)合位點，但是其在抗體結(jié)合位點中隨著氨基酸取代而進行持續(xù)遺傳進化(抗原性漂移)。近來已經(jīng)鑒別了識別系統(tǒng)發(fā)生類群1(如Hl和Η5)的甲型流感病毒的HA的更保守干區(qū)的交叉中和抗體(例如W02008/(^8946)。然而，在鑒別中和系統(tǒng)發(fā)生類群2如H3 病毒的一或多種甲型流感病毒亞型的抗體中獲得的成功有限，其中和范圍窄且效力低。已經(jīng)描述了特異性識別H3N2流感病毒毒株的抗體。因此，能結(jié)合及中和 1968-1980年間的一些H3N2流感病毒毒株的人單克隆抗體C28已經(jīng)由0stberg和 Pursch (1983)描述。Wang et al. (2010)描述了中和幾十年間的H3病毒的抗-HA2鼠抗體， 但是示出其不中和任何非H3亞型病毒。識別H3亞型以及H4亞型和H7亞型的HA以及能在體外降低H3和H4流感病毒的流感病毒復(fù)制的交叉反應(yīng)性抗-HA2鼠抗體已經(jīng)由Stropkovskdet al. , (2009)描述。證實在天然病毒中HA2表位對這些抗體可及性低，且所述抗體在胰蛋白酶裂解和pH5處理后與HA具有較高的反應(yīng)性(VareSkovd et al.，2003a)，這可以解釋在體外抑制病毒復(fù)制 (Vareckovaetal. ,2003b)以及在體內(nèi)這些抗體效力相對低(Gocniket al. ,2007)的觀測結(jié)果。在W02009/115972中揭示了人單克隆抗體Fal^8，其識別HA干區(qū)上的表位并展示針對Hmi的中和活性，但是對于H3N2的中和活性較低。鑒于由某些甲型流感病毒導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)疾病的嚴重性及總是存在潛在大流行的危脅以及季節(jié)性流行的高度經(jīng)濟影響，因此繼續(xù)需要有效的方式預(yù)防和治療各種甲型流感病毒亞型。因此需要結(jié)合分子，優(yōu)選廣泛中和性人結(jié)合分子，其能中和季節(jié)性流感病毒亞型，包括包含H3亞型的HA的流感病毒，優(yōu)選H3N2，且其沒有或者較少本領(lǐng)域已知的抗體的缺點。本發(fā)明提供了這些結(jié)合分子，其可用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別用于診斷、預(yù)防和/或治療包含H3亞型的HA的流感病毒的感染、優(yōu)選H3N2感染。本發(fā)明的一些結(jié)合分子在其在H3亞型內(nèi)的中和活性的范圍方面是獨特的。因此，本發(fā)明鑒別的一些結(jié)合分子能中和H3N2亞型中的一些包括至少一或多種近來的毒株且可以用作季節(jié)性流感的普遍預(yù)防和/或治療劑， 不論致病性流感H3N2毒株如何。至少一些結(jié)合分子能防止HA前體分子HAO由胰蛋白酶在體外裂解。此外，本發(fā)明的至少一些結(jié)合分子能防止認為參與流感病毒膜與感染的細胞的內(nèi)體膜的膜融合的HA蛋白的構(gòu)象改變。此外，本發(fā)明的至少一些結(jié)合分子是獨特的，在于其也能交叉中和至少一種其它亞型的流感病毒，包括包含H7和/或HlO亞型的HA的流感病毒，及因此可用作流感病毒的普遍預(yù)防、診斷和/或治療劑，甚至不考慮致病的流感病毒亞型。
附圖描述ai示出了在亞型水平的氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹。圖中表明了類群亞型分支。 包含Hl亞型的Hl進化枝及包含H9亞型的H9進化枝組成系統(tǒng)發(fā)生類群1，包含H7亞型的 H7進化枝和包含H3亞型的H3進化枝組成系統(tǒng)發(fā)生類群2。Ml是示出在用胰蛋白酶(條紋條)、ρΗ4·9緩沖的介質(zhì)(實心白色條)及DTT (交叉形條)相繼處理后，通過FACS分析測量的IgGl與表面表達的H3rHA結(jié)合的條形圖，以與未處理的rHA(實心黑色條)的結(jié)合百分比表示。Ml示出體外蛋白酶易感性測定的結(jié)果。將樣品在于1XM0PS緩沖液中的4-12% BisTris凝膠上運行。通過膠體藍染色觀察蛋白條帶。Mi是在感染期間HA蛋白的不同構(gòu)象的示意圖。@是示出在用胰蛋白酶(條紋條)、ΡΗ4·9緩沖的介質(zhì)(實心白色條)及DTT (交叉形條)相繼處理后，通過FACS分析測量的在不同處理后H3mAb與HA表達細胞的結(jié)合的條形圖，以與未處理的rHA(實心黑色條)的結(jié)合百分比表示。圖6示出在實施例11中描述的時程實驗結(jié)果，以確定HA與胰蛋白酶的保溫時間以實現(xiàn)H3HA的裂解。Ml示出用mAb預(yù)保溫的H3HA樣品的胰蛋白酶消化結(jié)果，如實施例11所述。M8是證實CR8043抑制pH誘導(dǎo)的H3HA構(gòu)象變化的條形圖。M9示出CR8020和CR8041也能阻斷pH誘導(dǎo)的HA構(gòu)象改變A，在胰蛋白酶裂解之前加入mAb ；B，在胰蛋白酶裂解之后加入mAb ；C，在所有處理之后加入mAb。圖10示出Kaplan-Meier存活概率曲線。在攻擊前一天經(jīng)靜脈內(nèi)施用抗體，使用的劑量范圍是30-lmg/kg。施用30mg/kg對照Ab(灰色)，隨后在第0天用25LD50A/ ΗΚ/1/68-ΜΑ20(Η3Ν2)致死攻擊。CR8020 (A)在與 CR8041 (B)和 CR8043 (C)分開的研究中檢測，后二者在一個實驗中評估。因此，對于B和C使用同一對照抗體組。圖11示出相對于第0天的平均體重變化)。在攻擊前一天經(jīng)靜脈內(nèi)施用抗體，使用劑量范圍是30-lmg/kg。施用30mg/kg對照Ab (灰色)，隨后在第0天用25LD50A/ ΗΚ/1/68-ΜΑ20(Η3Ν2)致死攻擊。條圖表示平均值的95% CI。如果小鼠在繼續(xù)研究期間死亡/安樂死，則最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)(carry forward)。CR8020 (A)在與CR8041 (B)和 CR8043(C)分開的研究中檢測，后二者在一個實驗中評估。因此，對于B和C使用同一對照抗體組。_示出中位數(shù)臨床評分。在攻擊前一天經(jīng)靜脈內(nèi)施用抗體，使用劑量范圍是 30-lmg/kg。施用 30mg/kg 對照 Ab (灰色)，隨后在第 0 天用 25LD50A/HK/1/68-MA20 (H3N2) 致死攻擊。條圖表示四分位數(shù)間距范圍。CR8020(A)在與CR8041(B)和CR8043 (C)分開的研究中檢測，后二者在一個實驗中評估。因此，對于B和C使用同一對照抗體組。臨床評分說明0 =無臨床跡象；1 =皮毛粗糙(rough coat) ；2 =皮毛粗糙，反應(yīng)性較差，在處理期間被動狀態(tài)；3 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動狀態(tài)；4 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當背部向下躺時不滾回至腹部向下。在同一天對觀測到臨床評分為4的小鼠行安樂死。圖13證實在用流感病毒A/HK/1 /68-MA20 (H3N2)的小鼠致死攻擊模型中mAb CR8020的治療效力。在U9Xl/SvJ小鼠(n = 10只/組)中在攻擊前一天或者在攻擊后
7第1、2、3、4、5或6天經(jīng)靜脈內(nèi)施用一劑mAb CR8020 (15mg/kg)。在攻擊后第1天施用對照 mAb(15mg/kg)。在第 0 天用 25LD50A/HK/1/68-MA20 (H3N2)攻擊小鼠并監(jiān)測 21 天。A 組: Kaplan-Meier存活概率曲線。B組相對于第0天的平均體重改變(％ )。條圖表示平均值的95% Cl。如果小鼠在繼續(xù)研究期間死亡/安樂死，最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)。C組中位數(shù)臨床評分。條圖表示四分位數(shù)間距范圍。0 =無臨床跡象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反應(yīng)性較差，在處理期間被動；3 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4 =皮毛粗糙， 蜷縮，呼吸困難，當背部向下躺時不滾回至腹部向下。在同一天對觀測到臨床評分為4的小鼠行安樂死。圖14示出在用小鼠適應(yīng)的流感病毒A/CH/NL/621557/03(H7N7)的小鼠致死攻擊模型中mAb CR8020的預(yù)防效力。A組=Kaplan-Meier存活概率曲線。B組相對于第0天的平均體重改變(<%)。條圖表示平均值的95% Cl。如果小鼠在繼續(xù)研究期間死亡/安樂死，最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)。C組中位數(shù)臨床評分。條圖表示四分位數(shù)間距范圍。0=無臨床跡象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反應(yīng)性較差，在處理期間被動；3 =皮毛粗糙，蜷縮， 呼吸困難，在處理期間被動；4 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當背部向下躺時不滾回至腹部向下。在同一天對觀測到臨床評分為4的小鼠行安樂死。圖15示出在用小鼠適應(yīng)的流感病毒A/CH/NL/621557/03(H7N7)的小鼠致死攻擊模型中mAb CR8020、CR8041和CR8043的預(yù)防效力。在雌性Balb/c小鼠(n = 8只/組) 中在攻擊前一天經(jīng)靜脈內(nèi)施用mAb，使用的劑量范圍是10-lmg/kg(CR8020)或者30_lmg/ kg(CR8041和CR8043)。在前一天施用30mg/kg對照mAb (灰色)。在第0天，通過鼻內(nèi)接種用25LD50小鼠適應(yīng)的A/CH/NL/621557/03 (H7N7)致死攻擊，隨后監(jiān)測小鼠21天。A組: Kaplan-Meier存活概率曲線。B組相對于第0天的平均體重改變(％ )。條圖表示平均值的95% Cl。如果小鼠在繼續(xù)研究期間死亡/安樂死，最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)。C組中位數(shù)臨床評分。條圖表示四分位數(shù)間距范圍。0 =無臨床跡象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反應(yīng)性較差，在處理期間被動；3 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4 =皮毛粗糙， 蜷縮，呼吸困難，當背部向下躺時不滾回至腹部向下。在同一天對觀測到臨床評分為4的小鼠行安樂死。圖16示出在用小鼠適應(yīng)的流感病毒A/CH/NL/621557/03(H7N7)的小鼠致死攻擊模型中mAb CR8020的治療效力。在雌性Balb/c小鼠(n = 8只/組)中在攻擊前一天或者在攻擊后第1、2、3、4、5或6天經(jīng)靜脈內(nèi)施用一劑mAb CR8020 (15mg/kg)。在攻擊后第一天施用對照mAb (15mg/kg)。在第0天用25LD5(1小鼠適應(yīng)的A/CH/NL/621557/03 (H7N7)攻擊小鼠并監(jiān)測小鼠21天。A組=Kaplan-Meier存活概率曲線。B組相對于第0天的平均體重改變(％)。條圖表示平均值的95% Cl。如果小鼠在繼續(xù)研究期間死亡/安樂死，最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)。C組中位數(shù)臨床評分。條圖表示四分位數(shù)間距范圍。0=無臨床跡象； 1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙，反應(yīng)性較差，在處理期間被動；3 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難， 在處理期間被動；4 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當背部向下躺時不滾回至腹部向下。在同一天對觀測到臨床評分為4的小鼠行安樂死。發(fā)明描述本發(fā)明中所用術(shù)語的定義在下文給出。如本文所用，術(shù)語“包括”被認為后接詞語“不限于”。
如本文所用，術(shù)語“結(jié)合分子”是指完整的免疫球蛋白，包括單克隆抗體，如嵌合的、人源化的或者人單克隆抗體，或者是指包含免疫球蛋白片段的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或可變結(jié)構(gòu)域，其與完整免疫球蛋白競爭特異性結(jié)合所述免疫球蛋白的結(jié)合配偶體，如H3。無論結(jié)構(gòu)如何，抗原結(jié)合片段均結(jié)合由所述完整免疫球蛋白識別的同一抗原?？乖Y(jié)合片段可包含肽或者多肽，所述肽或者多肽包含所述結(jié)合分子氨基酸序列的至少2、5、10、15、20、 25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200 或者 250 個連續(xù)氨基酸殘基的氨基酸序列。如本文所用，術(shù)語“結(jié)合分子”包括本領(lǐng)域已知的所有免疫球蛋白類別和亞類。 根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，結(jié)合分子可以分成五種主要類別的完整抗體IgA、 IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可進一步分為亞類(同種型)，例如IgAl、IgA2、IgGl、IgG2、 IgG3 禾口 IgG4?？乖Y(jié)合片段包括Fab、F(ab' )、F(ab' ) 2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(qū)(CDR)片段、 單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、(多)肽等，其至少含有足以賦予所述多肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白的片段。上述片段可以合成產(chǎn)生或者通過酶或化學(xué)裂解完整免疫球蛋白產(chǎn)生或者可以通過重組DNA技術(shù)遺傳工程化產(chǎn)生。所述產(chǎn)生方法為本領(lǐng)域熟知，在例如Antibodies :A Laboratory Manual, Edited by:E. Harlow and D,Lane(1988), Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, New ^rk中描述，所述文獻援引加入本文。結(jié)合分子或者其抗原結(jié)合片段可具有一或多個結(jié)合位點。如果有一個以上結(jié)合位點，則所述結(jié)合位點可以與另一結(jié)合位點相同或者可以不同。所述結(jié)合分子可以是裸的或者未綴合的結(jié)合分子，但是也可以是免疫綴合物的一部分。裸的或者未綴合的結(jié)合分子是指這樣的結(jié)合分子，其是未綴合的，可操作地連接或者另外與效應(yīng)部分或者標記如毒性物質(zhì)、放射性物質(zhì)、脂質(zhì)體、酶物理性地或功能性地相關(guān)聯(lián)。應(yīng)理解裸的或者未綴合的結(jié)合分子不排除已經(jīng)穩(wěn)定化、多聚體化、人源化或者以除了附著效應(yīng)部分或者標記之外任何其它方式操作的結(jié)合分子。因此，所有翻譯后修飾的裸的和未綴合的結(jié)合分子均包含在內(nèi)，包括其中所述修飾是在天然結(jié)合分子產(chǎn)生細胞環(huán)境中產(chǎn)生、通過重組結(jié)合分子產(chǎn)生細胞產(chǎn)生及在開始結(jié)合分子制備之后人工導(dǎo)入。當然，術(shù)語裸的或者未綴合的結(jié)合分子不排除在施用給機體之后所述結(jié)合分子與效應(yīng)細胞和/或分子形成功能性關(guān)聯(lián)的能力，因為一些這樣的相互作用是發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)必需的。相關(guān)聯(lián)的效應(yīng)基團或者標記的缺少因此用于定義在體外而不是在體內(nèi)的裸的或者未綴合的結(jié)合分子。如本文所用，術(shù)語“生物學(xué)樣品”涵蓋了多種樣品類型，包括血液及生物來源的其它液體樣品、固體組織樣品如生物活檢樣品或者組織培養(yǎng)物，或者衍生自其中的細胞及其后代。該術(shù)語還包括在獲得后已經(jīng)以任何方式操作過的樣品，如用試劑處理、溶解或者富集某些成分如蛋白質(zhì)或者多核苷酸。該術(shù)語涵蓋得自任何物種的各種臨床樣品，也包括培養(yǎng)細胞、細胞上清和細胞裂解物。如本文所用，術(shù)語“互補決定區(qū)(CDR) ”是指結(jié)合分子如免疫球蛋白可變區(qū)內(nèi)的序列，其在很大程度上通常促成抗原結(jié)合位點，其與在抗原上被識別的表位在形態(tài)和電荷分布上互補。CDR區(qū)可以特異于蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段的線性表位、不連續(xù)表位或者構(gòu)象表位，其以其天然構(gòu)象存在于蛋白質(zhì)上或者在某些情況中以變性形式存在于蛋白質(zhì)上，例如通過在SDS中溶解而變性。表位也可以由蛋白質(zhì)的翻譯后修飾組成。如本文所用，術(shù)語“缺失”是指氨基酸或者核苷酸序列中的改變，其中與參考分子通常為天然發(fā)生的分子相比分別缺少一或多個氨基酸或者核苷酸殘基。如本文所用，術(shù)語“表達調(diào)節(jié)核酸序列”是指為可操作地連接的編碼序列在特定宿主生物體中表達所需和/或影響所述表達的多核苷酸序列。所述表達調(diào)節(jié)核酸序列如合適的轉(zhuǎn)錄起始序列、終止序列、啟動子、增強子序列、阻抑物或者激活物序列、有效RNA加工信號如剪接和聚腺苷酸化信號、穩(wěn)定胞質(zhì)mRNA的序列、增強翻譯效率的序列(例如核糖體結(jié)合位點)、增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列，以及當需要時增強蛋白質(zhì)分泌的序列，這些序列可以是在選擇的宿主生物體中示出活性的任何核酸序列及可以衍生自與所述宿主生物體同源或者異源的基因編碼蛋白質(zhì)。表達調(diào)節(jié)序列的鑒別和應(yīng)用為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。如本文所用，術(shù)語“功能變體”是指這樣的結(jié)合分子，其包含與參考結(jié)合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比有一或多個核苷酸和/或氨基酸改變的核苷酸和/或氨基酸序列且仍能與參考結(jié)合分子競爭結(jié)合所述結(jié)合配偶體例如H3N2。換句話說，參考結(jié)合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不明顯影響或者改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述氨基酸序列的結(jié)合分子的結(jié)合特性，即所述結(jié)合分子仍能識別并結(jié)合其靶。功能變體可具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)導(dǎo)入，如定向誘變和隨機PCR介導(dǎo)的誘變，及可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基置換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)在本領(lǐng)域中定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有無電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、 酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚也可以應(yīng)用除了上述之外的其它類別氨基酸殘基家族。此外，變體可具有非保守氨基酸取代，例如一個氨基酸由具有不同結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基置換。相似的微小變化也可包括氨基酸缺失或者插入或者這二者。確定哪個氨基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫活性的指導(dǎo)可通過使用本領(lǐng)域熟知的計算機程序發(fā)現(xiàn)。核苷酸序列中的突變可以是在一個基因座進行的單一改變(點突變)，如轉(zhuǎn)換或者顛換突變，或者在一個基因座可以插入、缺失或者改變多個核苷酸。此外，可以在核苷酸序列中任何數(shù)目的基因座進行一或多個改變。所述突變可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法進行。如本文所用，術(shù)語“流感病毒亞型”是指甲型流感病毒變體，其特征在于血凝素(H) 與神經(jīng)氨酸酶(N)病毒表面蛋白的各種組合。根據(jù)本發(fā)明，流感病毒亞型可以其H數(shù)目命名，例如“包含Η3亞型的HA的流感病毒”或者“Η3流感病毒”，或者以組合H數(shù)目與N數(shù)目命名，例如“流感病毒亞型Η3Ν2”或者“Η3Ν2”。術(shù)語“亞型”特別包括每個亞型中所有個體 “毒株”，其通常得自突變并示出不同的病原圖譜。這種毒株也可以稱作各種病毒亞型的“分離株”。因此，如本文所用，術(shù)語“毒株”和“分離株”可互換使用。目前對于人流感病毒毒株或者分離株的命名法包括第一次分離的地理位置，毒株編號和分離年份，通常在括號內(nèi)給出HA和NA的抗原性描述，例如A/Moscow/10/00 (H3N2)。非人毒株命名法中還包括起源宿主。流感病毒亞型可根據(jù)其系統(tǒng)發(fā)生類群進一步分類。系統(tǒng)發(fā)生分析(Fouchier et al.，2005)證實HA被再分為兩個主要類別(Air，1981)系統(tǒng)發(fā)生類群1中的H1、H2、H5和 H9亞型以及系統(tǒng)發(fā)生類群2中的H3、H4和H7亞型(圖1)。如本文所用，關(guān)于本發(fā)明結(jié)合分子所用術(shù)語“中和”是指結(jié)合分子抑制流感病毒重復(fù)感染靶細胞，無論通過何種機制實現(xiàn)中和。因此，中和可例如通過抑制病毒與細胞表面的吸附或者粘附而實現(xiàn)，或者通過在病毒與靶細胞吸附后抑制病毒與細胞膜的融合而實現(xiàn)等寸。如本文所用，關(guān)于本發(fā)明結(jié)合分子的術(shù)語“交叉中和”是指本發(fā)明的結(jié)合分子中和不同亞型甲型流感病毒例如包含H3、H7和/或HlO亞型的HA的流感病毒的能力。如本文所用，術(shù)語“宿主”是指其中已經(jīng)導(dǎo)入了載體如克隆載體或者表達載體的生物體或者細胞。所述生物體或者細胞可以是原核或者真核生物或細胞。優(yōu)選所述宿主分離的宿主細胞，如培養(yǎng)的宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”僅是指被修飾以(過)表達本發(fā)明的結(jié)合分子的細胞，包括起初表達這些結(jié)合分子以及細胞已經(jīng)通過永生化、擴增、增強表達等方式被修飾為過表達所述接合分子的B細胞。應(yīng)理解術(shù)語宿主不僅是指特定的對象生物體或者細胞，也包括這種生物體或細胞的后代。由于在隨后的世代中由于突變或者環(huán)境影響而可以發(fā)生某些修飾，這種后代事實上與親代生物體或者細胞可以不同，但是仍包括在本發(fā)明所用術(shù)語“宿主”的范圍內(nèi)。術(shù)語“人”當用于本文所述的結(jié)合分子時是指直接衍生自人或者基于人序列的分子。當結(jié)合分子衍生自或者基于人序列及隨后被修飾時，在本說明書中仍認為其是人結(jié)合分子。換句話說，術(shù)語人當用于結(jié)合分子時是指包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)或者基于在人或者人淋巴細胞中出現(xiàn)的可變區(qū)或者恒定區(qū)以及以一些方式被修飾的結(jié)合分子。因此，人結(jié)合分子可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基，包含取代和/或缺失(例如通過在體外隨機或者位點特異性誘變或者在體內(nèi)通過體細胞突變導(dǎo)入的突變)。如本文所用，“基于”是指核酸序列可精確拷貝自模板的情況，或者具有微小突變，如通過易錯PCR方法或者合成產(chǎn)生精確匹配模板或者具有微小修飾。基于人序列的半合成分子在本文也被認為是人結(jié)合分子。術(shù)語“插入”，也稱作“添加”，是指氨基酸或者核苷酸序列中的改變，導(dǎo)致與親代序列相比分別添加一或多個氨基酸或者核苷酸殘基。術(shù)語“分離的”當用于本文所述結(jié)合分子時是指基本上沒有其他蛋白質(zhì)或者多肽的結(jié)合分子，特別是沒有具有不同抗原特異性的其它結(jié)合分子，以及也基本上沒有其它細胞材料和/或化學(xué)物。例如，當所述結(jié)合分子是重組產(chǎn)生的時，其優(yōu)選基本上沒有培養(yǎng)基成分；當所述結(jié)合分子是通過化學(xué)合成產(chǎn)生的時，其優(yōu)選基本上沒有化學(xué)物前體或者其它化學(xué)物，即其與參與該蛋白質(zhì)合成的化學(xué)物前體或者其它化學(xué)物是分開的。術(shù)語“分離的”當用于編碼本文所述結(jié)合分子的核酸分子時是指其中編碼所述結(jié)合分子的核苷酸序列沒有其它核苷酸序列、特別是編碼結(jié)合H5m之外的結(jié)合配偶體的結(jié)合分子的核苷酸序列的核酸分子。此外，術(shù)語“分離的”是指與在其天然宿主中天然伴隨天然核酸分子的其它細胞成
11分(例如與其天然結(jié)合的核糖體、聚合酶或者基因組序列)基本上分開的核酸分子。此外， “分離的”核酸分子如cDNA分子可以基本上沒有其它細胞材料，或者當通過重組技術(shù)產(chǎn)生時基本上沒有培養(yǎng)基，或者當通過化學(xué)合成時基本上沒有化學(xué)物前體或者其它化學(xué)物。如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”是指單一特異性的抗體分子的制備。單克隆抗體展示了對于特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”是指展示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有衍生自或者基于人種系免疫球蛋白序列或者衍生自完全合成序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。制備單克隆抗體的方法與結(jié)合特異性無關(guān)。如本文所用，術(shù)語“天然發(fā)生的”當用于一個對象時是指該對象可以在自然界發(fā)現(xiàn)。例如，可以分離自自然來源且未通過在實驗室中人為有意修飾的存在于生物體中的多肽或者多核苷酸序列是天然發(fā)生的。如本文所用，術(shù)語“核酸分子”是指聚合形式的核苷酸，包括RNA、cDNA、基因組DNA 的有義和反義鏈，以及其合成形式和混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或者任一類型核苷酸的修飾形式。該術(shù)語還包括單鏈和雙鏈形式的DNA。此外，多核苷酸可包括通過天然發(fā)生的和/或非天然發(fā)生的核苷酸鍵連接在一起的天然發(fā)生的和修飾的核苷酸之一或二者。所述核酸分子可以被化學(xué)或者生物化學(xué)修飾或者可以含有非天然或者衍生化的核苷酸堿基，這些為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。這種修飾包括例如標記、甲基化、用類似物取代一或多個天然發(fā)生的核苷酸、核苷酸內(nèi)修飾如不帶電荷的鍵(如例如甲基磷酸酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)、帶電荷的鍵(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)、側(cè)基(pendent moiety)(例如多肽)、嵌入劑(例如吖啶，補骨脂素等)、螯合劑、烷基化劑以及修飾的鍵(如α異頭核酸等等)。上述術(shù)語也是指包括任何拓撲構(gòu)象，包括單鏈、雙鏈， 部分雙鏈、三鏈、發(fā)夾、環(huán)形和扣鎖構(gòu)象。還包括合成分子，其模擬多核苷酸通過氫鍵及其它化學(xué)相互作用結(jié)合指定序列的能力。這種分子為本領(lǐng)域已知，且包括例如所述分子主鏈中其中肽鍵取代磷酸鍵的那些。除非特別指出，則核酸序列涵蓋其互補序列。因此，具有特定序列的核酸分子應(yīng)被理解為涵蓋其互補鏈，及其互補序列。互補鏈例如對于反義治療、雜交探針和PCR引物也是有用的。術(shù)語“可操作地連接”是指通常經(jīng)物理連接的且彼此存在功能關(guān)系的兩或多個核酸序列元件。例如，如果啟動子能起始或者調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄或者表達，則該啟動子與所述編碼序列是可操作地連接的，在這種情況中，所述編碼序列應(yīng)被理解為是在所述啟動子的“控制下”?！八幬锟山邮艿馁x形劑”是指與或活性分子如藥物、制劑或者結(jié)合分子組合以制備合適的或者常規(guī)劑型的任何惰性物質(zhì)。所述“藥物可接受的賦形劑”是對于受體而言在應(yīng)用的劑量和濃度下是非毒性的賦形劑，且與包含所述藥物、制劑或者結(jié)合分子的配制物的其它成分相容。藥物可接受的賦形劑廣泛用于本領(lǐng)域中。如本文所用，關(guān)于結(jié)合分子如抗體與其結(jié)合配偶體如抗原之間的相互作用所用術(shù)語“特異性結(jié)合”是指該相互作用依賴于特定結(jié)構(gòu)的存在，例如所述結(jié)合配偶體上抗原決定簇或者表位的存在。換句話說，所述抗體優(yōu)先結(jié)合或者識別所述結(jié)合配偶體，即使當所述結(jié)合配偶體存在于其它分子或者生物體的混合物中時。所述結(jié)合可以通過共價或者非共價相互作用或者組合這二者而介導(dǎo)。再換句話說，術(shù)語“特異性結(jié)合”是指與抗原決定簇或者表位的免疫特異性結(jié)合以及與其它抗原決定簇或者表位不免疫特異性結(jié)合。與抗原免疫特異
12性結(jié)合的結(jié)合分子可以較低親和性結(jié)合其它肽或者多肽，通過例如放射性免疫測定(RIA)、 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、BIAC0RE或者本領(lǐng)域已知的其它測定方法確定。與抗原免疫特異性結(jié)合的結(jié)合分子或者其片段可以與攜帶相同表位的相關(guān)抗原交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子或者其片段與其它抗原不交叉反應(yīng)。如本文所用，“取代”是指一或多個氨基酸或者核苷酸分別由不同氨基酸或者核苷酸的置換。術(shù)語“治療有效量”是指本文所述結(jié)合分子有效預(yù)防、改善和/或治療得自H3亞型流感病毒感染的病癥的量。如本文所用，“改善”是指可見或者可感受的疾病癥狀、病毒血癥或者流感病毒感染的任何其它可測表現(xiàn)的減輕。術(shù)語“治療”是指治療性處理以及預(yù)防措施以治愈或者停止或者至少延遲疾病進展。需要治療的那些對象包括已經(jīng)患有得自包含H3亞型的HA的流感病毒感染的病癥的那些對象以及其中包含H3亞型的HA的流感病毒感染被預(yù)防的那些對象。部分或者全部從H3 流感病毒感染中恢復(fù)的對象可能也需要治療。預(yù)防包括抑制或者降低包含H3亞型的HA的流感病毒的傳播或者抑制或者降低與H3流感病毒感染相關(guān)的一或多個癥狀的發(fā)生、發(fā)展或者進展。術(shù)語“載體”是指其中可以插入第二種核酸分子的核酸分子，用于導(dǎo)入其將在其中復(fù)制及在一些情況中表達的宿主中。換句話說，載體能將轉(zhuǎn)運與其連接的核酸分子。如本文所用，克隆以及表達載體涵蓋在術(shù)語“載體”中。載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)以及衍生自噬菌體或者植物或者動物(包括人)病毒的載體。載體包含由提議的宿主識別的復(fù)制起點以及在表達載體的情況中包含啟動子及由宿主識別的其它調(diào)節(jié)區(qū)。含有第二種核酸分子的載體通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或者通過使用病毒進入機制而被導(dǎo)入細胞中。某些載體能在其被導(dǎo)入的宿主中自主復(fù)制(例如具有細菌復(fù)制起點的載體可以在細菌內(nèi)復(fù)制)。其它載體在導(dǎo)入宿主中時可以整合進宿主的基因組中，從而隨宿主基因組一起復(fù)制。發(fā)明概述本發(fā)明提供了人結(jié)合分子，其能特異性結(jié)合包含H3亞型的HA的流感病毒株包括 H3N2且呈現(xiàn)出針對這種流感病毒的中和活性。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是獨特的，其能高效中和一些、包括至少一或多種近年來發(fā)現(xiàn)的、優(yōu)選所有已知的流感病毒亞型 H3(在人中最常見的流行亞型)的毒株。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子結(jié)合H3HA蛋白質(zhì)干區(qū)中的保守表位。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子具有血細胞凝集抑制活性。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子能防止HA前體分子HAO的體外裂解。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能防止流感病毒膜與感染的細胞的內(nèi)體膜融合所需的HA蛋白的構(gòu)象改變。本發(fā)明還提供了結(jié)合血凝素蛋白中表位的結(jié)合分子，所述表位是H3亞型所屬系統(tǒng)發(fā)生類群2中的流感病毒亞型之間所共有的，及因此本發(fā)明涉及在基于H3-、H7-和/或 HlO的流感病毒亞型以及含有具有這些特定表位的HA蛋白的其它流感病毒亞型、優(yōu)選系統(tǒng)發(fā)生類群2的所有亞型之間交叉反應(yīng)的結(jié)合分子。本發(fā)明的一些結(jié)合分子因此是獨特的， 其具有針對一或多種其它甲型流感病毒亞型如包含H7和/或HlO亞型的HA的流感病毒的交叉中和活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子能交叉中和系統(tǒng)發(fā)生類群2的所有流感病毒亞型，包括H3、H7和HlO亞型，及因此可用作屬于系統(tǒng)發(fā)生類群2的流感病毒的普遍預(yù)防、診斷和/或治療劑，甚至無論是該系統(tǒng)發(fā)生類群中的哪個致病流感病毒亞型。推測本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合迄今為止還未知的保守表位，其不具有抗原性漂移或抗原性轉(zhuǎn)變的傾向或者傾向較低。因此本發(fā)明還涵蓋了使用本發(fā)明的結(jié)合分子鑒別和/或鑒定這些表位。本發(fā)明還涉及編碼至少人結(jié)合分子的結(jié)合區(qū)的核酸分子。本發(fā)明進一步提供了本發(fā)明的人結(jié)合分子在預(yù)防和/或治療患有或者處于發(fā)生H3流感病毒感染如H3N2流感病毒感染危險中的對象中的應(yīng)用。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人結(jié)合分子在診斷/檢測這種流感病毒感染中的應(yīng)用。詳細描述第一方面，本發(fā)明涵蓋了能與甲型流感病毒、特別是包含H3亞型的HA的甲型流感病毒、特別是H3N2特異性結(jié)合且具有中和活性的結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子是人結(jié)合分子。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子與一些流感病毒H3N2毒株、優(yōu)選兩或更多種不同的H3N2毒株、更優(yōu)選三或更多種、更優(yōu)選四或更多種、更優(yōu)選五或更多種不同H3N2毒株能特異性結(jié)合和/或具有中和活性。所述毒株可得自人或者非人動物， 如鳥類。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子結(jié)合及中和至少一或多種近來的H3N2毒株， 所述毒株選自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005, A/Panama/2007/99 和 A/ Johannesburg/33/940在另一實施方案中，所述結(jié)合分子也結(jié)合及中和H3N2毒株A/Hong Kong/1/68。更優(yōu)選地，所述結(jié)合分子結(jié)合從1968年至2005年期間的所有流感病毒H3N2 毒株并具有中和活性。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子對于2010年1月20日之前已知的流感病毒 H3N2的至少所有天然發(fā)生的分離株具有中和活性。本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合HA蛋白的HAO、HAl和/或HA2亞基。它們能特異性結(jié)合HA蛋白的HA0、HA1和/或HA2亞基上的線性或結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象表位。所述HA分子可純化自病毒或者重組產(chǎn)生，及任選在使用之前分離?；蛘?，HA可以在細胞表面上表達。 優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合這樣的表位，其包含在H3HA蛋白的HA2多肽的第19、25、27、 33和34位的一或多個氨基酸。在一個實施方案中，當所述第19位氨基酸是天冬氨酸(D)、 第25位氨基酸是谷氨酰胺(Q)、第27位氨基酸是甘氨酸(G)、第33位氨基酸是甘氨酸(G) 和/或第34位氨基酸是谷氨酰胺(HA2的編號從在組成HAl與HA2之間裂解位點的精氨酸殘基隨后第1位開始)時，所述結(jié)合分子結(jié)合HA2上所述表位。在一個實施方案中，當一或多個所述氨基酸被改變時，所述結(jié)合分子不結(jié)合HA2上所述表位。另一方面，本發(fā)明涵蓋了結(jié)合分子，其至少在體外能防止H3HA前體分子HAO被胰蛋白酶裂解為HAl和HA2。另一方面，本發(fā)明涵蓋了結(jié)合分子，其至少在體外能防止流感病毒膜與感染細胞的內(nèi)體膜的膜融合所需的H3HA蛋白的構(gòu)象改變。另一方面，所述結(jié)合分子具有一些或者全部上述性質(zhì)，即交叉中和活性、結(jié)合HA2 的干區(qū)上的保守表位、抑制HAO的體外胰蛋白酶裂解，和/或抑制構(gòu)象改變。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子具有全部或者一些上述性質(zhì)，且另外不能結(jié)合和/或中和包含Hl亞型的HA的甲型流感病毒如Hmi。本發(fā)明的機會分子能特異性結(jié)合如流感病毒H3N2，所述流感病毒是活的、存活的和/或感染性的或者是失活/減毒形式。失活/減毒病毒如流感病毒H3N2的方法為本領(lǐng)域熟知，包括但不限于用福爾馬林、β-丙酸內(nèi)酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外光處理。
本發(fā)明的結(jié)合分子也能特異性結(jié)合流感病毒的一或多個片段，如衍生自亞型H3N2 的一或多種蛋白質(zhì)和/或(多)肽或者H3N2的一或多種重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和/或多肽的制備物。對于治療和/或預(yù)防H3N2感染的方法，所述結(jié)合分子優(yōu)選能特異性結(jié)合H3N2的表面可接近的蛋白質(zhì)，如表面糖蛋白、血凝素(HA)，這是為病毒吸附和細胞釋放所需的。各種H3N2毒株蛋白質(zhì)的核苷酸和/或氨基酸序列可見于GenBank-數(shù)據(jù)庫、 NCBI流感病毒序列數(shù)據(jù)庫、流感病毒序列數(shù)據(jù)庫(Influenza Sequence Database, ISD)、 EMBL-數(shù)據(jù)庫和/或其它數(shù)據(jù)庫。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在各自的數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)這種序列。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合上述蛋白質(zhì)和/或多肽的片段，其中所述片段至少包含由本發(fā)明的結(jié)合分子識別的表位。如本文所用，“表位”是能以足夠高的親和力結(jié)合本發(fā)明結(jié)合分子以形成可檢測的抗原-結(jié)合分子復(fù)合物的部分。本發(fā)明的結(jié)合分子可以能或不能特異性結(jié)合HA的細胞外部分(在本文也稱作可溶 HA(sHA))。本發(fā)明的結(jié)合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，如多克隆或者單克隆抗體，或者所述結(jié)合分子可以是抗原結(jié)合片段，包括但不限于Fab、F(ab' )、F(ab' )2、Fv、dAb、Fd、 互補決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和(多)肽，其含有至少足以賦予與流感病毒H3N2毒株或者其片段的特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白的片段。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子是人單克隆抗體。本發(fā)明的結(jié)合分子可以非分離的或者分離的形式使用。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以單獨使用或者在包含至少一種本發(fā)明結(jié)合分子(或者其變體或片段)的混合物中使用。換句話說，所述結(jié)合分子可以組合應(yīng)用，例如作為包含本發(fā)明的兩或更多種結(jié)合分子、 其變體或者片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的結(jié)合分子可以在單一治療中組合以實現(xiàn)希望的預(yù)防、治療或者診斷作用，但是或者具有相同活性的結(jié)合分子也可以在單一治療中組合以實現(xiàn)希望的預(yù)防、治療或者診斷作用。任選地，所述混合物進一步包含至少一種其它治療劑。優(yōu)選地，所述治療劑如M2抑制劑(例如金剛胺、金剛乙胺)和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋、奧司他韋)可用于預(yù)防和/或治療流感病毒H3N2感染。典型地，本發(fā)明的結(jié)合分子可結(jié)合其結(jié)合配偶體，即流感病毒H3N2或者其片段，結(jié)合親和性常數(shù)(Kd-值)低于0. 2χ10"4Μ,1. 0χ1(Γ5Μ、1. OxlO^6MU. 0χ10_7Μ，優(yōu)選低于 1. 0x10、，更優(yōu)選低于1. 0x101，更優(yōu)選低于1. ΟχΙΟ,Μ，甚至更優(yōu)選低于1. OxKT11M,特別低于1.0χ10~Μ。親和性常數(shù)對于抗體同種型而可以有所變化。例如，對于IgM同種型的親和性結(jié)合是指結(jié)合親和性為至少大約1.0χ1(ΓΜ。親和性常數(shù)可例如通過使用表面等離子共振測量，如使用 BIAC0RE 系統(tǒng)(Wiarmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)測量。典型地，本發(fā)明的結(jié)合分子具有10μ g/ml或更低的中和活性，優(yōu)選5μ g/ml或更低，更優(yōu)選2 μ g/ml或更低，甚至更優(yōu)選1 μ g/ml或更低，如在實施例6中描述的體外病毒中和測定(VNA)中確定。本發(fā)明的結(jié)合分子可以結(jié)合可溶形式如在樣品中或者在懸浮液中的流感病毒 H3N2或者其片段或者可以結(jié)合與載體或者基質(zhì)例如微滴定平板、膜和珠等結(jié)合或者附著的流感病毒H3N2或者其片段。載體或者基質(zhì)可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龍、 硝化纖維或者Teflon等制成。這種支持物的表面可以是固體或者有孔材料及可以是任何常規(guī)形狀。此外，所述結(jié)合分子可以結(jié)合純化的/分離的或者非純化的/非分離形式的流感病毒H3N2。本發(fā)明的結(jié)合分子呈現(xiàn)出中和活性。中和活性可例如如本文所述測量。測量中和活性的其他測定在例如WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva :fforld Health Organisation, 2005, version 2002. 5 中描述。本發(fā)明涉及分離的人結(jié)合分子，其能識別及結(jié)合流感病毒血凝素蛋白(HA)中的表位，特征在于所述結(jié)合分子對包含H3亞型的HA的甲型流感病毒具有中和活性。含有H3亞型的HA的流感病毒亞型的一個實例是H3N2。特別優(yōu)選的是中和H3N2流感病毒亞型的結(jié)合分子。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子中和至少一或多種近來出現(xiàn)的 H3N2毒株。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子因此至少結(jié)合及中和一或多種H3N2毒株， 所述毒株選自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005, A/Panama/2007/99 和 A/ Johannesburg/33/940在另一實施方案中，所述結(jié)合分子也結(jié)合及中和H3N2毒株A/Hong Kong/1/68。最優(yōu)選地，所述結(jié)合分子結(jié)合自1968年至2005年出現(xiàn)的所有流感病毒H3N2 毒株、優(yōu)選所述流感病毒亞型的所有已知毒株且具有中和活性。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子還具有對于其它甲型流感病毒、優(yōu)選至少包含H7亞型的HA的流感病毒如A/Mallard/Netherlands/12/2000株和/或包含HlO亞型的HA的流感病毒如A/chick/Germany/N/49株的中和活性。因此已經(jīng)示出一些本發(fā)明的結(jié)合分子交叉中和這些流感病毒亞型。本發(fā)明因此還提供了結(jié)合血凝素蛋白中流感病毒亞型之間共有及保守的表位的結(jié)合分子，及因此涉及在基于H3-、H7-和/或HlO流感病毒亞型及含有具有這些特定表位的HA蛋白的其它流感病毒亞型、優(yōu)選系統(tǒng)發(fā)生類群2的所有流感病毒之間交叉反應(yīng)的結(jié)合分子。所述交叉中和結(jié)合分子優(yōu)選結(jié)合并中和H3-、H7和/或 HlO-亞型的一些毒株。在一個實施方案中，這些交叉中和結(jié)合分子結(jié)合并中和至少一或多種近來出現(xiàn)的 H3N2 毒株，所述毒株選自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/ Johannesburg/33/94和A/Panama/2007/99。在另一實施方案中，所述結(jié)合分子還結(jié)合及中和H3N2毒株A/Hong Kong/1/68。最優(yōu)選地，所述結(jié)合分子結(jié)合自1968年至2005年出現(xiàn)的所有流感病毒H3N2毒株、優(yōu)選所有已知以及甚至更優(yōu)選未來的H3N2毒株并具有中和活性。 在進一步的實施方案中，所述結(jié)合分子基本上中和所述其它流感病毒亞型的所有分離株。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子結(jié)合并中和系統(tǒng)發(fā)生類群2的所有流感病毒亞型?；诒疚慕沂?，技術(shù)人員可以確定一種抗體是否確實與不同亞型的HA蛋白交叉反應(yīng)及也可以確定它們是否能在體內(nèi)中和不同亞型的流感病毒。流感病毒通過結(jié)合靶細胞的細胞表面上的唾液酸殘基及隨后轉(zhuǎn)移進內(nèi)體，通過其膜與內(nèi)體膜的融合并釋放基因組-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物進入細胞中從而感染細胞。受體結(jié)合及膜融合過程均由HA糖蛋白介導(dǎo)。甲型流感病毒的HA包含兩個結(jié)構(gòu)不同的區(qū)域，即球形頭區(qū)以及干區(qū)，球形頭區(qū)含有負責(zé)病毒附著于靶細胞的受體結(jié)合位點及參與HA的血細胞凝集活性，干區(qū)含有為病毒包膜與細胞的內(nèi)體膜之間膜融合所必需的融合肽。所述HA蛋白是三聚體，其中每個單體由兩個二硫化物連接的糖多肽HAl和HA2組成，其是在感染期間由于前體(HAO)的蛋白酶解而產(chǎn)生的。裂解是病毒感染性必需的，因為其是激發(fā)HA進行膜融合必需的，使得構(gòu)象改變。激發(fā)的分子的活化在內(nèi)體中在PH5至pH6的低pH下發(fā)生，且需要在 HA結(jié)構(gòu)中廣泛改變。融合前未裂解的(I)、融合前裂解的(II)以及融合后HA(III)構(gòu)象的
16三維結(jié)構(gòu)在圖4中示出。參與膜融合過程的HA的激發(fā)和活化中的每個階段存在不同的抑制靶位，例如通過單克隆抗體進行。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述結(jié)合分子至少能防止HA前體分子HAO在體外測定中裂解，例如在下文實施例中描述的測定。如上所述，HA前體分子HAO通過宿主蛋白酶被裂解為HAl和HA2是激活病毒感染性必需的。通過本發(fā)明的結(jié)合分子阻止HA前體分子 HAO裂解因此可以預(yù)防流感病毒感染。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子結(jié)合包含在H3HA蛋白質(zhì)的HA2多肽的第19、25、 27,33和/或34位的氨基酸的表位。在一個實施方案中，當?shù)?9位的氨基酸是天冬氨酸 (D)、在第25位的氨基酸是谷氨酰胺(Q)、在第27位的氨基酸是甘氨酸(G)、在第33位的氨基酸是甘氨酸(G)和/或在第34位的氨基酸是谷氨酰胺時，所述結(jié)合分子結(jié)合HA2上所述表位。優(yōu)選地，當一或多個所述氨基酸改變時，所述結(jié)合分子不結(jié)合HA2上所述表位。氨基酸的編號基于來自Uniprot數(shù)據(jù)庫編號Q91MA7 (SEQ ID NO 193)的血凝素序列。Q91MA7提供了來自A/Hong Kong/1/1968的未成熟HA的全長序列。所述HA2序列在未裂解的HA未成熟蛋白質(zhì)的G346開始。在上述編號中，G346是HA2序列中的Gl。優(yōu)選本發(fā)明的結(jié)合分子選自下組a)包含 SEQ ID NO 81 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 82 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 83所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；b)包含 SEQ ID NO 87 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 88 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 89所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；c)包含 SEQ ID NO 103 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 104 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 105所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；d)包含 SEQ ID NO 109 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 110 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 111所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；e)包含 SEQ ID NO :115 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 116 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 117所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；f)包含 SEQ ID NO :121 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 122 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 123所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；g)包含 SEQ ID NO :1 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 127 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 128所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；ti)包含 SEQ ID NO 132 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 133 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 134所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；i)包含 SEQ ID NO :138 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 139 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 140所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；j)包含 SEQ ID NO :144 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 145 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 146所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；k)包含 SEQ ID NO :150 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 151 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 152所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；1)包含 SEQ ID NO :156 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 157 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 158所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；
m)包含 SEQ ID NO 162 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 163 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 164所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；η)包含 SEQ ID NO 168 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 169 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 170所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；ο)包含 SEQ ID NO 173 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 174 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 175所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；及ρ)包含 SEQ ID NO :179 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 180 所示重鏈 CDR2 區(qū)及 SEQ ID NO 181所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子用作藥物，優(yōu)選用于診斷、治療和/或預(yù)防流感病毒感染。優(yōu)選地，導(dǎo)致流感病毒感染及可以由本發(fā)明的結(jié)合分子治療的流感病毒是流感病毒亞型H3N2。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明結(jié)合分子及藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。在再一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子在制備用于診斷、預(yù)防和/ 或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。這種感染可以在小范圍群體中發(fā)生，但是也可以是季節(jié)性流行病在世界范圍內(nèi)傳播，或者更嚴重地在全球大流行，其中數(shù)百萬人處于危險中。 本發(fā)明提供了結(jié)合分子，其可以中和導(dǎo)致這種季節(jié)性流行病以及潛在大流行的流感病毒毒株感染。重要的是，可以展望使用本發(fā)明的結(jié)合分子預(yù)防和治療多種流感病毒亞型，因為已經(jīng)揭示了本發(fā)明的結(jié)合分子能交叉中和系統(tǒng)發(fā)生類群2的不同流感病毒亞型，包括亞型 H3、H7 禾口 HlO0在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人結(jié)合分子特征在于所述人結(jié)合分子選自下組a)包含 SEQ ID NO 81 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 82 所示重鏈 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO 83所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO 84所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :85所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :86所示氨基酸序列的輕鏈⑶R3 區(qū)的結(jié)合分子；b)包含 SEQ ID NO 87 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 88 所示重鏈 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO 89所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO 90所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :91所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :92所示氨基酸序列的輕鏈⑶R3 區(qū)的結(jié)合分子；c)包含 SEQ ID NO 87 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 88 所示重鏈 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO 89所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO 93所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :94所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :95所示氨基酸序列的輕鏈⑶R3 區(qū)的結(jié)合分子；d)包含 SEQ ID NO 87 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 88 所示重鏈 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO 89所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO 96所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :97所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :98所示氨基酸序列的輕鏈⑶R3 區(qū)的結(jié)合分子；e)包含 SEQ ID NO 87 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 88 所示重鏈 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO 89所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO 99所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQID NO 100所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :101所示氨基酸序列的輕鏈 CDR3區(qū)的結(jié)合分子；f)包含 SEQ ID NO 87 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO 88 所示重鏈 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO :89所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO 102所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :85所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :86所示氨基酸序列的輕鏈⑶R3 區(qū)的結(jié)合分子；g)包含SEQ ID NO :103所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :104所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :105所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :106所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 107所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :108所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；ti)包含 SEQ ID NO :109 所示重鏈 CDRl 區(qū)、SEQ ID NO :110 所示重鏈 CDR2 區(qū)和 SEQ ID NO :111所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :112所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 113所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :114所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；i)包含SEQ ID NO :115所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :116所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :117所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :118所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 119所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :120所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；j)包含SEQ ID NO :121所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 122所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :123所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :1 所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 119所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :125所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；k)包含SEQ ID NO :1 所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 127所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :1 所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :1 所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :130所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO 131所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；1)包含SEQ ID NO :132所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 133所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :134所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :135所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 136所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :137所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；m)包含SEQ ID NO :138所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 139所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :140所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :141所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 142所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :143所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；η)包含SEQ ID NO :144所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 145所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :146所示重鏈CDR3區(qū)、具有SEQ ID NO :147所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQ ID NO 148所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :149所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；ο)包含SEQ ID NO :150所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :151所示重鏈CDR2區(qū)和SEQ ID NO :152所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :153所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 154所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :155所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；ρ)包含SEQ ID NO :156所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 157所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :158所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :159所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :160所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO 161所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；q)包含SEQ ID NO :162所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 163所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :164所示重鏈CDR3區(qū)、具有SEQ ID NO :165所示氨基酸序列的輕鏈CDRl區(qū)、具有SEQ ID NO 166所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :167所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；r)包含SEQ ID NO :168所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 169所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :170所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :171所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 172所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :137所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；s)包含SEQ ID NO :173所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :174所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :175所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :176所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 177所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :178所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子 ’及t)包含SEQ ID NO :179所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 180所示重鏈CDR2區(qū)和 SEQ ID NO :181所示重鏈⑶R3區(qū)、具有SEQ ID NO :182所示氨基酸序列的輕鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 183所示氨基酸序列的輕鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :184所示氨基酸序列的輕鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子。在一特定實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子選自下組包含具有SEQ ID NO 81所示氨基酸序列的重鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO 82所示氨基酸序列的重鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO J3所示氨基酸序列的重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；包含具有SEQ ID NO :109所示氨基酸序列的重鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :110所示氨基酸序列的重鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ IDNO 111所示氨基酸序列的重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；包含具有SEQ ID NO 138所示氨基酸序列的重鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :139所示氨基酸序列的重鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :140 所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；包含具有SEQ ID NO :144所示氨基酸序列的重鏈CDRl區(qū)、具有SEQ ID NO :145所示氨基酸序列的重鏈CDR2區(qū)和具有SEQ ID NO :146所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子；以及包含具有SEQ ID NO :173所示氨基酸序列的重鏈⑶Rl區(qū)、具有SEQ ID NO :174所示氨基酸序列的重鏈⑶R2區(qū)和具有SEQ ID NO :175 所示氨基酸序列的重鏈CDR3區(qū)的結(jié)合分子。本發(fā)明結(jié)合分子的⑶R區(qū)在表1中示出。⑶R區(qū)是根據(jù)Kabat et al. (1991)在 Sequences of Proteins of Immunological Interest 巾白勺 $。明白勺巾， 結(jié)合分子可包含如本文揭示的1、2、3、4、5或者所有6個⑶R區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少2個如本文揭示的⑶R。在再一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含這樣的重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含選自下組的氨基酸序列:SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :14、 SEQ ID NO18,SEQ ID NO22,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO30,SEQ ID NO34,SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO 74 和 SEQ ID NO :78。在進一步的實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含這樣的輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :56、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :68、 SEQ ID NO :72、SEQ ID NO 76 和 SEQ ID NO :80。本發(fā)明另一方面包括本文定義的結(jié)合分子的功能變體。如果所述某分子能與“親代”或者“參考”結(jié)合分子競爭特異性結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段，則認為所述分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。換句話說，即當所述功能變體仍能結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的相同或者重疊表位時。對于本申請，“親代”和“參考”用作同義詞，是指所述參考或者親代分子或者物理分子自身的信息可構(gòu)成變異的基礎(chǔ)。優(yōu)選地，所述功能變體能競爭特異性結(jié)合由所述參考結(jié)合分子特異性結(jié)合的至少兩種(或更多種)不同的流感病毒H3N2毒株或者其片段。此外，如果某分子對所述親代結(jié)合分子呈現(xiàn)出中和活性的流感病毒H3N2、優(yōu)選對至少兩種(或更多種)流感病毒H3N2毒株具有中和活性，則認為所述分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。功能變體包括但不限于一級結(jié)構(gòu)序列基本上相似的衍生物，包括在Fc 受體或者參與效應(yīng)功能的其它區(qū)具有修飾的那些，和/或其含有例如在親代結(jié)合分子中未發(fā)現(xiàn)的體外或者體內(nèi)化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾。這種修飾包括乙?；?、?；⒑塑账峄蛘吆塑账嵫苌锏墓矁r附著、脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物的共價附著、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等等?；蛘?，功能變體可以是在本發(fā)明中定義的結(jié)合分子，其包含與親代結(jié)合分子的氨基酸序列相比具有一或多個氨基酸的取代、插入、缺失或其組合的氨基酸序列。此外，功能變體可在氨基或者羧基末端任一端或者這兩端包含氨基酸序列的截短。本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有相同或者不同的(較高或者較低)結(jié)合親和性，但是仍能結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段。例如，本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比對于流感病毒 H3N2或者其片段可具有增加或者降低的結(jié)合親和性。優(yōu)選地，可變區(qū)的氨基酸序列包括但不限于構(gòu)架區(qū)、超變區(qū)、特別是CDR3區(qū)被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區(qū)包含包括三個CDR 的三個超變區(qū)及更保守的區(qū)域，所謂構(gòu)架區(qū)(F 。超變區(qū)包含來自CDR的氨基酸殘基和來自超變環(huán)的氨基酸殘基。符合本發(fā)明范圍的功能變體與本文定義的親代結(jié)合分子具有至少大約50 %至大約99 %、優(yōu)選至少大約60 %至大約99 %、更優(yōu)選至少大約70 %至大約99 %、 甚至更優(yōu)選至少大約80%至大約99%、最優(yōu)選至少大約90%至大約99%、特別是至少大約 95%至大約99%、特別是至少大約97%至大約99%氨基酸序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計算機算法如Gap或者Bestfit可用于優(yōu)化排列對比被比較的氨基酸序列及確定相似或者相同的氨基酸殘基。功能變體可以通過本領(lǐng)域已知的一般分子生物學(xué)方法通過改變親代結(jié)合分子或者其一部分而獲得，所述方法包括但不限于易錯PCR、寡核苷酸定向誘變、定點誘變和重鏈和/或輕鏈改組。在一個實施方案中，本發(fā)明的功能變體對于流感病毒H3N2 具有中和活性。所述中和活性與親代結(jié)合分子相比可以是相同的或者是較高或者較低的。此后，當使用術(shù)語(人)結(jié)合分子時，其也涵蓋所述(人)結(jié)合分子的功能變體。另一方面，本發(fā)明包括免疫綴合物，即包含至少一個本文定義的結(jié)合分子及進一步包含至少一個標記如可檢測部分/物質(zhì)的分子。本發(fā)明還涵蓋了本發(fā)明的免疫綴合物的混合物或者至少一種本發(fā)明的免疫綴合物與另一分子如治療劑或者另一結(jié)合分子或者免疫綴合物的混合物。在另一實施方案中，本發(fā)明的免疫綴合物可包含一個以上的標記。這些標記彼此可以相同或者不同，可以與所述結(jié)合分子非共價連接/綴合。所述標記也可以通過共價鍵與人結(jié)合分子直接連接/綴合?；蛘撸鰳擞浛梢酝ㄟ^一或多種連接化合物與所述結(jié)合分子連接/綴合。使標記與結(jié)合分子綴合的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。本發(fā)明免疫綴合物的標記可以是治療劑，但是其也可以是可檢測部分/物質(zhì)。適于治療和/或預(yù)防的標記可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強吞噬作用或者免疫刺激作用的其它結(jié)合分子。包含可檢測物質(zhì)的免疫綴合物可診斷性地用于例如評定對象是否感染了流感病毒H3N2毒株或者作為臨床檢驗的一部分監(jiān)測流感病毒H3N2感染的發(fā)生或進展以例如確定給予的治療方案的效力。然而，其也可用于其它檢測和/或分析和/或診斷目的。可檢測部分/物質(zhì)包括但不限于酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬及非放射性順磁性金屬離子。所述標記用于標記所述結(jié)合分子以根據(jù)使用的特異性檢測/分析/診斷技術(shù)和/或方法進行檢測和/或分析和/或診斷目的，所述技術(shù)和方法如(組織)樣品的免疫組織化學(xué)染色、流式細胞計量術(shù)檢測、激光掃描細胞計量術(shù)檢測、熒光免疫測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、生物測定(例如吞噬作用測定).Western印跡應(yīng)用等。本領(lǐng)域熟知的用于檢測/分析/診斷技術(shù)和/或方法的合適標記為技術(shù)人員熟知。此外，本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物也可以附著于固體支持物，其特別用于流感病毒H3N2或者其片段的體外免疫測定或者純化。這種固體支持物可以是有孔或者無孔的、平面或者非平面的。本發(fā)明的結(jié)合分子可以與標記序列如肽融合以促進純化。例子包括但不限于6-組氨酸標記、血凝素(HA)標記、myc標記或者flag標記。或者，一個抗體可以與第二抗體綴合以形成抗體異源綴合物(heteroconjugate)。另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子可以與一或多種抗原綴合/附著。優(yōu)選地，這些抗原是由施用所述結(jié)合分子-抗原綴合物的對象的免疫系統(tǒng)識別的抗原。所述抗原彼此可以相同，但也可以不同。使抗原與結(jié)合分子附著的綴合方法為本領(lǐng)域熟知，包括但不限于使用交聯(lián)劑。本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合流感病毒H3N2，且附著于結(jié)合分子的抗原將引起對綴合物有力的T-細胞攻擊，最終導(dǎo)致流感病毒H3N2破壞。在通過化學(xué)方式直接或者通過如接頭間接綴合產(chǎn)生免疫綴合物之后，所述免疫綴合物可以作為包含本發(fā)明的結(jié)合分子及合適標記的融合蛋白產(chǎn)生。融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，例如通過構(gòu)建包含編碼所述結(jié)合分子的核苷酸序列與符合讀框地編碼合適標記的核苷酸序列的核酸分子及隨后表達所述核酸分子而重組產(chǎn)生。本發(fā)明另一方面提供了至少編碼本發(fā)明結(jié)合分子、功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。這種核酸分子可用作中間物以進行克隆，如在如上所述的親和性成熟過程中。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述核酸分子是分離的或純化的。本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變體是可以使用標準遺傳密碼被直接翻譯以提供與從親代核酸分子翻譯的氨基酸序列相同的氨基酸序列的核酸序列。優(yōu)選地，所述核酸分子編碼包含上述⑶R區(qū)的結(jié)合分子。在進一步的實施方案中， 所述核酸分子編碼包含本發(fā)明結(jié)合分子的2、3、4、5或者甚至6個⑶R區(qū)的結(jié)合分子。在另一實施方案中，所述核酸分子編碼包含重鏈的結(jié)合分子，所述重鏈包含上述可變重鏈序列。在另一實施方案中，所述核酸分子編碼包含輕鏈的結(jié)合分子，所述輕鏈包含上述可變輕鏈序列。本發(fā)明結(jié)合分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列在下文給出。本發(fā)明另一方面提供了載體，即核酸構(gòu)建體，其包含本發(fā)明的一或多種核酸分子。 載體可以衍生自質(zhì)粒，如F、RU RPU Col、pBR322、T0L、Ti等；粘粒；噬菌體，如lambda、 lambdoid、M13、Mu、Pl、P22、Q3、T-even、T-odd、T2、T4、T7 等；植物病毒。載體可用于克隆和/或表達本發(fā)明的結(jié)合分子且甚至可用于基因治療目的。與一或多種表達調(diào)節(jié)核酸分子可操作地連接的包含本發(fā)明一或多種核酸分子的載體也涵蓋在本發(fā)明中。載體的選擇依賴于隨后的重組程序和使用的宿主。載體導(dǎo)入宿主細胞中可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、 DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂染或者電穿孔實現(xiàn)。載體可以是自主復(fù)制或者可以與其已經(jīng)整合進其中的染色體一起復(fù)制。優(yōu)選地，所述載體含有一或多個選擇標記。標記的選擇可依賴于選擇的宿主細胞，盡管如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這對于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。所述標記包括但不限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、來自單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。本發(fā)明還涵蓋這樣的載體，其包含編碼如上述人結(jié)合分子的一或多種核酸分子，其與編碼可用于分離人結(jié)合分子的蛋白質(zhì)或者肽的一或多種核酸分子可操作地連接。這些蛋白質(zhì)或肽包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、金屬結(jié)合聚組氨酸、綠色熒光蛋白、熒光素酶和半乳糖苷酶。含有上述載體的一或多個拷貝的宿主是本發(fā)明的另一主題。優(yōu)選地，所述宿主是宿主細胞。宿主細胞包括但不限于哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或者細菌來源的細胞。細菌細胞包括但不限于來自革蘭氏陽性細菌或者革蘭氏陰性細菌的細胞，如埃希氏菌屬如大腸桿菌和假單胞菌屬的一些物種。在真菌細胞中，優(yōu)選使用酵母細胞。在酵母中表達可以通過使用酵母株如巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和多形漢遜氏酵母(Hansenula polymorpha)實現(xiàn)。此外，昆蟲細胞如果蠅和 Sf9細胞可用作宿主細胞。除此之外，宿主細胞可以是植物細胞，如農(nóng)作物如林業(yè)植物的細胞，或者來自提供食物和原材料如谷類植物的植物或者藥用植物的細胞，或者裝飾用植物的細胞，或者球根花卉作物細胞。轉(zhuǎn)化的(轉(zhuǎn)基因)植物或者植物細胞通過已知方法產(chǎn)生，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、葉片轉(zhuǎn)化、通過聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移進行的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、超聲、顯微注射或者bolistic基因轉(zhuǎn)移。此外，合適的表達系統(tǒng)可以是桿狀病毒系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選使用哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞或者Bowes黑素瘤細胞。哺乳動物細胞提供具有翻譯后修飾的表達的蛋白質(zhì)，其與哺乳動物來源的天然分子最相似。由于本發(fā)明涉及可能施用給人的分子，因此特別優(yōu)選完全人表達系統(tǒng)。因此，更優(yōu)選地，宿主細胞是人細胞。舉例的人細胞是HeLa、 911、AT1080、A549、293和HEK293T細胞。在優(yōu)選的實施方案中，人生產(chǎn)細胞包含可表達形式的編碼腺病毒El區(qū)的核酸序列的至少功能部分。在更優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細胞衍生自人視網(wǎng)膜并用包含腺病毒El序列的核酸永生化，如911細胞或者在1996年2月四日以編號 9602四40在European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain保藏以及以商標PER. C6 銷售的細胞系(PER. C6是 Crucell Holland B. V.的注冊商標)。對于本申請，“PER. C6細胞”是指以編號9602^40 保藏的細胞或者保藏細胞的祖先細胞、上游或下游傳代細胞以及祖先細胞的后代細胞以及任何前述細胞的衍生物。在宿主細胞中生產(chǎn)重組蛋白可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進行。以商標PER. C6 銷售的細胞作為感興趣蛋白質(zhì)生產(chǎn)平臺的應(yīng)用在WO 00/63403中描述，所述文獻在此以其全部內(nèi)容援引加入本文。結(jié)合分子可以通過各種方式制備。產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合分子的方法是本發(fā)明的另一部分。所述方法包括步驟a)在有助于結(jié)合分子表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主，及b)任選地，回收所述表達的結(jié)合分子。所述表達的結(jié)合分子可以從無細胞提取物中回收，但是優(yōu)選從培養(yǎng)基中回收。上述生產(chǎn)方法也可用于產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體和/或免疫綴合物。從無細胞提取物或者培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)如結(jié)合分子的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。 通過上述方法可獲得的結(jié)合分子、其功能變體和/或免疫綴合物也是本發(fā)明的一部分?；蛘?，在宿主如在宿主細胞中表達之后，本發(fā)明的結(jié)合分子和免疫綴合物可以通過常規(guī)肽合成儀或者在無細胞翻譯系統(tǒng)中使用衍生自本發(fā)明DNA分子的RNA核酸合成產(chǎn)生。通過上述合成產(chǎn)生方法或者無細胞翻譯系統(tǒng)可獲得的結(jié)合分子和免疫綴合物也是本發(fā)明的一部分。在再一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子也可以在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物如兔、山羊或者牛中產(chǎn)生，并且分泌進例如其乳汁中。在另一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選特異性結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的人結(jié)合分子可以由表達人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物如轉(zhuǎn)基因小鼠或者兔產(chǎn)生。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組， 所述轉(zhuǎn)基因編碼上述人結(jié)合分子的全部或者一部分。轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物可以用純化的或者富集的流感病毒H3N2或者其片段的制備物免疫。免疫非人哺乳動物的方案為本領(lǐng)域熟知。見 Using Antibodies :A Laboratory Manual, Edited by :E. Harlow, D. Lane(1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 禾口 Current Protocols in Immunology, Edited byJ. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, Ε.M. Shevach, W. Strober(2001),John Wiley & Sons Inc.，New York所述，所述文獻援引加入本文。免疫方案通常包括多次免疫，有或無佐劑如Freund' s完全佐劑和Freund' s非完全佐劑，但是也可包括裸DNA免疫。在另一實施方案中，人結(jié)合分子由衍生自轉(zhuǎn)基因動物的B-細胞、 漿細胞和/或記憶細胞產(chǎn)生。在再一個實施方案中 ，人結(jié)合分子由雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤是通過將得自上述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的B-細胞與永生化細胞融合而制備?？傻米陨鲜鲛D(zhuǎn)基因非人哺乳動物的B-細胞、漿細胞和雜交瘤和可得自上述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物、B-細胞、漿細胞和/或記憶細胞及雜交瘤的人結(jié)合分子也是本發(fā)明的一部分。另一方面，本發(fā)明提供了鑒別特異性結(jié)合流感病毒H3N2的結(jié)合分子如人結(jié)合分子例如人單克隆抗體或者其片段或者編碼這種結(jié)合分子的核酸分子的方法，所述方法包括步驟(a)將在可復(fù)制遺傳包裝表面上的結(jié)合分子集合與流感病毒H3N2或者其片段在有助于結(jié)合的條件下接觸，(b)對結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的可復(fù)制遺傳包裝至少選擇一次，(c)從不結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的可復(fù)制遺傳包裝中分離并回收結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的可復(fù)制遺傳包裝。如本文所用，可復(fù)制遺傳包裝可以是原核或者真核的， 包括細胞、孢子、酵母、細菌、病毒、噬菌體、核糖體和多核糖體。優(yōu)選的可復(fù)制遺傳包裝是噬菌體。所述結(jié)合分子如單鏈Fv被展示在所述可復(fù)制遺傳包裝上，即其附著于位于所述可復(fù)制遺傳包裝外表面的基團或者分子。所述可復(fù)制遺傳包裝是包含被篩選的結(jié)合分子的可篩選單位，其與編碼所述結(jié)合分子的核酸分子連接。所述核酸分子應(yīng)可以在體內(nèi)(例如作為載體)或者體外(例如通過PCR，轉(zhuǎn)錄和翻譯)復(fù)制。體內(nèi)復(fù)制可以是自主復(fù)制(如對于細胞而言)，借助于宿主因子(如對于病毒而言)或者借助于宿主和輔助病毒二者(如對于噬菌粒而言)。展示結(jié)合分子集合的可復(fù)制遺傳包裝通過將編碼被展示的外源結(jié)合分子的核酸分子導(dǎo)入可復(fù)制遺傳包裝的基因組中以與通常從可復(fù)制遺傳包裝外表面表達的內(nèi)源蛋白質(zhì)形成融合蛋白而形成。融合蛋白表達、轉(zhuǎn)運至外表面及裝配導(dǎo)致外源結(jié)合分子在可復(fù)制遺傳包裝外表面的展示。本發(fā)明方法中的選擇步驟可以用活的且仍具有感染性或者失活的流感病毒H3N2 進行。流感病毒H3N2的失活可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的病毒失活方法進行，如用福爾馬林、β-丙酸內(nèi)酯(BPL)、硫柳汞和/或紫外光處理。檢測流感病毒Η3Ν2是否仍是活的、 感染性和/或可存活的或者部分或者完全失活的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。用于上述方法中的流感病毒Η3Ν2不需要是純化形式，例如可以存在于感染個體的血清和/或血液中。 使用的流感病毒Η3Ν2也可以分離自在合適培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)物。在一個實施方案中，當流感病毒Η3Ν2與可復(fù)制遺傳包裝接觸時是懸浮狀態(tài)。或者，當其發(fā)生接觸時也可以與載體綴合。在一個實施方案中，可以針對一個流感病毒Η3Ν2 毒株進行第一次和進一步選擇?；蛘?，可以針對不同的流感病毒Η3Ν2毒株進行第一次和進一步選擇。或者，選擇步驟可以在存在流感病毒Η3Ν2的片段如細胞膜制備物、重組Η3Ν2 蛋白質(zhì)或多肽、包含Η3Ν2蛋白質(zhì)或多肽的融合蛋白、表達重組Η3Ν2蛋白質(zhì)或者多肽的細胞等的情況下進行。這些蛋白質(zhì)或者多肽的細胞外暴露部分也可以用作選擇材料。流感病毒 Η3Ν2的片段在使用之前可以固定在合適材料上或者可以懸浮狀態(tài)使用。在一個實施方案中，所述選擇可以對流感病毒Η3Ν2的不同片段或者對不同流感病毒Η3Ν2毒株的片段進行。 發(fā)現(xiàn)合適的選擇組合為技術(shù)人員熟知。選擇可以通過ELISA或者FACS進行。再一方面，本發(fā)明提供了獲得特異性結(jié)合流感病毒Η3Ν2毒株或者其片段或者編碼這種結(jié)合分子的核酸分子的方法，所述方法步驟步驟a)進行上述鑒別結(jié)合分子的方法，及b)從回收的可復(fù)制遺傳包裝中分離所述結(jié)合分子和/或編碼所述結(jié)合分子的核酸分子?？蓮?fù)制遺傳包裝表面上的結(jié)合分子集合可以是scFv或者Fab的集合。一旦使用上述鑒別結(jié)合分子或者編碼結(jié)合分子的核酸分子的方法確定或者鑒別出新的scFv或者FabJlJ 可以將編碼所述scFv或Fab的DNA與細菌或者噬菌體分離并與標準分子生物學(xué)技術(shù)組合產(chǎn)生編碼具有希望特異性的scFv、二價scFv、Fab或者完整人免疫球蛋白(例如IgG、IgA 或者IgM)的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)染進合適的細胞系中，最終產(chǎn)生完整的人單克隆抗體(見 Huls et al.，1999 ；Boel et al.，2000)。如前所述，優(yōu)選的可復(fù)制遺傳包裝是噬菌體。鑒別和獲得(人)結(jié)合分子如 (人)單克隆抗體的噬菌體展示方法是迄今為止本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的熟知方法。所述方法在例如美國專利 5，696，108 ；Burton and Barbas, 1994 ；de Kruif et al.，1995b 和 Phage Display :A Laboratory Manual. Edited by :CF Barbas, DR Burton, JK Scott andGJ Silverman(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,New ^rk中描述。所有這些誒參考文獻均以其全部內(nèi)容援引加入本文。對于構(gòu)建噬菌體展示文庫，使人單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的集合在噬菌體表面上表達，優(yōu)選絲狀噬菌體、 顆粒，如單鏈Fv(ScFv)或者Fab形式(見Kruif et al. , 1995b) 0表達抗體片段的噬菌體的較大文庫典型含有超過1. OxlO9抗體特異性且可以從在免疫或者未免疫的個體的B-淋巴細胞中表達的免疫球蛋白V區(qū)中裝配。在本發(fā)明一個特定實施方案中，結(jié)合分子的噬菌體文庫、優(yōu)選scFv噬菌體文庫是從自得自已經(jīng)針對流感病毒接種、近期針對不相關(guān)病原體接種、近期患有流感病毒H3N2感染的對象或者得自健康個體的細胞分離的RNA制備的。RNA 可以分離自骨髓或者外周血液，優(yōu)選外周血淋巴細胞或者分離的B細胞或者甚至B細胞亞群如記憶B細胞，其被鑒別為⑶M+/⑶27+B細胞。對象可以是動物，優(yōu)選人。在一個優(yōu)選實施方案中，所述文庫可以從由經(jīng)鑒別為IgM+/⑶M+/⑶27+細胞的IgM記憶B細胞表達的免疫球蛋白V區(qū)裝配?；蛘撸删w展示文庫可以從已經(jīng)在體外部分裝配的免疫球蛋白可變區(qū)構(gòu)建，以在文庫(半合成文庫)中導(dǎo)入另外的抗體多樣性。例如，在體外裝配的可變區(qū)在對于抗體特異性重要的那些分子區(qū)域如CDR區(qū)中含有合成產(chǎn)生的、隨機化或者部分隨機化的DNA序列。特異于流感病毒H3N2的噬菌體抗體可以從文庫中選擇，通過將所述病毒或者其片段暴露于噬菌體文庫以使得表達特異于所述病毒或者其片段的抗體片段的噬菌體結(jié)合。未結(jié)合的噬菌體通過洗滌除去，結(jié)合的噬菌體洗脫以感染大腸桿菌及隨后增殖。通常需要多輪選擇和增殖循環(huán)以充分富集特異性結(jié)合所述病毒或者其片段的噬菌體。如果需要，在噬菌體文庫暴露于所述病毒或者其片段之前，可以通過將所述噬菌體文庫暴露于非靶材料如不同毒株的病毒或者其片段即非H3N2流感病毒而首先對噬菌體文庫進行扣減。這些扣減病毒或者其片段可以結(jié)合固相或者是懸浮狀態(tài)。噬菌體也可以針對與復(fù)合抗原的結(jié)合而選擇， 如任選補加其它材料的H3N2蛋白質(zhì)或者(多)肽的復(fù)合混合物。表達流感病毒H3N2的一或多種蛋白質(zhì)或者(多)肽的宿主細胞也可以用于選擇目的。使用這些宿主細胞的噬菌體展示方法可以通過在篩選期間加入過量的不包含靶分子或者包含與靶分子相似但不同的非靶分子的宿主細胞扣減不相關(guān)結(jié)合物而擴展和改良，從而顯著增強發(fā)現(xiàn)相關(guān)結(jié)合分子的機會。當然，在用病毒或者其片段篩選之前、期間或者之后可以進行扣減。所述方法被稱作默851肌01逸方法(默8511^0^是01^611 Holland B. V.的注冊商標，也見援引加入本文的美國專利6，265，150所述)。再一方面，本發(fā)明提供了獲得潛在具有針對流感病毒H3N2的中和活性的結(jié)合分子的方法，所述方法包括步驟(a)進行如上述獲得特異性結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的結(jié)合分子或者編碼這種結(jié)合分子的核酸分子的方法，及(b)核實所述分離的結(jié)合分子對于所述病毒、優(yōu)選針對選自下組的至少一或多種流感病毒H3N2毒株是否具有中和活性A/ Hong Kong/1/68、A/Johannesburg/33/94、A/Panama/2007/99、A/ffisconsin/67/2005 禾口 A/Hiroshima/52/2005,優(yōu)選所有H3N2毒株，特別是所有已知和未來的H3N2毒株。核實結(jié)合分子是否具有中和活性的測定為本領(lǐng)域熟知(見WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva :World Health Organisation,2005 version 2002. 5)。另一方面，本發(fā)明涉及通過上述方法之一可獲得的人結(jié)合分子，其至少對于包含H3亞型的HA的甲型流感病毒具有中和活性。再一方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含至少本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選人單克隆抗體、至少其功能變體、至少本發(fā)明的免疫綴合物和/或其組合。除此之外，所述組合物可包含穩(wěn)定分子，如白蛋白或者聚乙二醇，或者鹽。優(yōu)選地，所使用的鹽是保留希望的結(jié)合分子的生物學(xué)活性及不賦予任何不希望的毒理學(xué)作用的鹽。如果需要，本發(fā)明的人結(jié)合分子可以包被在一種材料之中或之上以保護其免于酸或者其他可以使所述結(jié)合分子失活的天然或者非天然條件的作用。再一方面，本發(fā)明提供了組合物，其至少包含本發(fā)明定義的核酸分子。所述組合物可包含水溶液如含有鹽(例如NaCl或者如上述的鹽)、去污劑(例如SDS)和/或其它合適成分的水溶液。此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含至少本發(fā)明結(jié)合分子如人單克隆抗體(或者其功能片段或者變體)、至少本發(fā)明的免疫綴合物、至少本發(fā)明的組合物或者其組合。本發(fā)明的藥物組合物進一步包含至少一種藥物可接受的賦形劑。藥物可接受的賦形劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。本發(fā)明的藥物組合物可進一步包含至少一種其它治療劑。合適的治療劑也為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種另外的結(jié)合分子，即所述藥物組合物可以是結(jié)合分子的混合劑(cocktail)或者混合物。所述藥物組合物可包含至少兩種本發(fā)明的結(jié)合分子，或者至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子和至少一種另外的流感病毒結(jié)合和/或中和分子。在另一實施方案中，所述另外的結(jié)合分子可以配制為同時分開施用或者相繼施用。在一個實施方案中，所述藥物組合物可包含兩或多種結(jié)合分子，其具有針對包含 H3亞型的HA的甲型流感病毒如H3N2的中和活性。在一個實施方案中，所述結(jié)合分子當組合使用時呈現(xiàn)出協(xié)同中和活性。換句話說，所述組合物可包含具有中和活性的至少兩種結(jié)合分子，特征在于所述結(jié)合分子在中和流感病毒H3N2中起協(xié)同作用。如本文所用，術(shù)語“協(xié)同”是指當所述結(jié)合分子組合使用時的組合效應(yīng)高于當單獨使用時的加性效應(yīng)。協(xié)同作用的結(jié)合分子可以結(jié)合流感病毒H3N2的相同或者不同片段上的不同結(jié)構(gòu)。一種計算協(xié)同作用的方式是通過組合指數(shù)。組合指數(shù)(Cl)的概念由Chou and Talalay(1984)描述。所述組合物可例如包含具有中和活性的一種結(jié)合分子以及一種非中和H3N2特異性結(jié)合分子。 所述非中和和中和H3N2特異性結(jié)合分子在中和流感病毒H3N2中也可以協(xié)同作用。在一個實施方案中，所述藥物組合物可包含至少兩種流感病毒中和結(jié)合分子，其中至少一種結(jié)合分子能中和系統(tǒng)發(fā)生類群1的一或多種流感病毒亞型，其中至少一種結(jié)合分子能中和系統(tǒng)發(fā)生類群2的一或多種流感病毒亞型。在一個實施方案中，所述藥物組合物可包含至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子及至少一種其他流感病毒中和結(jié)合分子。在另一實施方案中，所述其他流感病毒中和結(jié)合分子優(yōu)選能結(jié)合并中和不同亞型的流感病毒，優(yōu)選包含Hl的HA的流感病毒，如HlNUP /或包含H5亞型的HA的流感病毒， 如H5m，如WO 2008/028946中揭示的結(jié)合分子。更優(yōu)選地，所述其他結(jié)合分子是針對系統(tǒng)發(fā)生類群1包括H1、H2、H5、H9的(所有)流感病毒亞型的交叉中和結(jié)合分子。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述其他結(jié)合分子是在WO 2008/028946中被鑒別為CR6261的結(jié)合分子，其包含包含SEQ ID N0:186所示氨基酸序列的第1-121位氨基酸的重鏈可變區(qū)或者其功能變體和/或包含SEQ ID NO 188的第1-112位氨基酸的輕鏈可變區(qū)。在再一個實施方案中， 所述結(jié)合分子包含分別包含SEQ ID NO :186和SEQ ID NO :188所示氨基酸序列的重鏈和輕鏈。藥物組合物中的結(jié)合分子因此優(yōu)選能與不同亞型的流感病毒反應(yīng)。所述結(jié)合分子應(yīng)是高親和性的且應(yīng)具有廣泛特異性。優(yōu)選地，兩個結(jié)合分子均是交叉中和分子，其均中和不同亞型的流感病毒。此外，優(yōu)選其中和盡可能多的每種不同流感病毒亞型的毒株。本發(fā)明的藥物組合物可進一步包含至少一種其它治療劑、預(yù)防劑和/或診斷劑。 優(yōu)選地，所述藥物組合物包含至少一種其它預(yù)防和/或治療劑。優(yōu)選地，所述其他的治療劑和/或預(yù)防劑是能預(yù)防和/或治療流感病毒H3N2感染和/或得自這種感染的病癥的物質(zhì)。 治療劑和/或預(yù)防劑包括但不限于抗病毒劑。這種抗病毒劑可以是結(jié)合分子、小分子、有機或無機化合物、酶、多核苷酸序列、抗病毒肽等。目前用于治療流感病毒H3N2感染患者的其它物質(zhì)是M2抑制劑(例如金剛烷胺、金剛乙胺)和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋、 奧司他韋)。這些物質(zhì)可與本發(fā)明的結(jié)合分子組合使用?！敖M合”在本文是指作為單獨的配制物或者作為一個組合配制物同時施用，或者作為單獨的配制物根據(jù)相繼施用方案以任意順序施用。在實驗階段的能預(yù)防和/或治療流感病毒H3N2感染和/或得自這種感染的病癥的物質(zhì)也可用作在本發(fā)明中有用的其它治療劑和/或預(yù)防劑。本發(fā)明的結(jié)合分子或者藥物組合物在用于人體之前可以在合適的動物模型系統(tǒng)中檢驗。這種動物模型系統(tǒng)包括但不限于小鼠、雪貂和猴。典型地，藥物組合物在生產(chǎn)和貯存條件下必須是無菌及穩(wěn)定的。本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫綴合物、核酸分子或者組合物可以是粉末形式以在遞送之前或遞送時在適當?shù)乃幬锟山邮艿馁x形劑中重建。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，從其先前無菌過濾的溶液中產(chǎn)生活性成分的粉末加上任何另外需要的成分。或者，本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫綴合物、核酸分子或者組合物可以是在溶液中以及在遞送之前或者在遞送時可以加入和/或混合適當?shù)乃幬锟山邮艿馁x形劑以提供單位劑量注射形式。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的藥物可接受的賦形劑適合高藥物濃度，可以保持適當流動性，且如果需要時可以延緩吸收。施用所述藥物組合物的最佳途徑的選擇受一些因素的影響，包括組合物內(nèi)活性分子的理化性質(zhì)、臨床狀況的緊急度以及活性分子的血漿濃度與希望的治療作用之間的關(guān)系。例如，如果需要，本發(fā)明的結(jié)合分子可以用載體制備，這將保護其免于快速釋放，如控制釋放配制物，包括植入體、經(jīng)皮貼劑及微囊輸送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類和聚乳酸。此外，可能需要用防止所述人結(jié)合分子失活的材料或化合物包被所述結(jié)合分子或者與所述結(jié)合分子一起施用。例如，所述結(jié)合分子可以在合適的載體如脂質(zhì)體或者稀釋劑中施用給對象。施用途徑可分為兩種主要方式口服和胃腸外施用。優(yōu)選的施用途徑是靜脈內(nèi)或者通過吸入?？诜┬涂梢耘渲茷槠瑒?、含片(troche)、錠劑(lozenge)、水性或者油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳狀液、硬膠囊、軟凝膠膠囊、糖漿或者酏劑、丸劑、糖衣片、液體、凝膠或者膏劑。這些配制物可含有藥物賦形劑，包括但不限于惰性稀釋劑、粒化和崩解劑、結(jié)合齊IJ、潤滑劑、防腐劑、著色劑、調(diào)味劑或者增甜劑、植物油或者礦物質(zhì)油、增濕劑以及增稠劑。本發(fā)明的藥物組合物也可以配制為胃腸外施用。胃腸外施用的配制物可以是水性或者非水性等滲無菌無毒注射或灌注溶液或者懸浮液的形式。所述溶液或懸浮液可包含在所用劑量和濃度對于受體無毒性的物質(zhì)，如1，3-丁二醇、Ringer’ s溶液、Hank’ s溶液、等滲氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局麻劑、防腐劑、緩沖液、增稠劑或者增溶劑、水溶性抗氧化劑、 油溶性抗氧化劑以及金屬螯合劑。再一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子如人單克隆抗體(其功能片段和變體)、免疫綴合物、組合物或者藥物組合物可用作藥物。因此，使用本發(fā)明的結(jié)合分子、免疫綴合物、組合物或者藥物組合物診斷、治療和/或預(yù)防流感病毒H3N2感染的方法是本發(fā)明的另一部分。上述分子可用于流感病毒H3N2感染的診斷、預(yù)防、治療或其組合。其適用于治療仍未治療的患有流感病毒H3N2感染的患者以及已經(jīng)或者正針對流感病毒H3N2感染進行治療的患者。上述分子或者組合物可與用于診斷、預(yù)防和/或治療的其它分子聯(lián)合使用。其可在體外、離體或者體內(nèi)使用。例如，本發(fā)明的結(jié)合分子如人單克隆抗體(或者其功能變體)、 免疫綴合物、組合物或者藥物組合物可以與流感病毒H3N2的疫苗(如果可獲得)一起施用。或者，所述疫苗也可以在施用本發(fā)明的分子之前或者之后施用。代替疫苗，抗病毒劑也可以與本發(fā)明的結(jié)合分子聯(lián)合使用。合適的抗病毒劑如上文所述。所述分子典型以治療或者診斷有效量在本發(fā)明組合物和藥物組合物中配制?；蛘?，其可以單獨配制和施用。例如，可以全身性應(yīng)用其它分子如抗病毒劑，同時靜脈內(nèi)應(yīng)用本發(fā)明的結(jié)合分子。治療可以針對H3N2感染易感的患者群。這種患者群包括但不限于例如老年人(例如彡50歲，彡60歲及優(yōu)選彡65歲)、幼兒(例如彡5歲，彡1歲)、住院患者以及已經(jīng)用抗病毒化合物治療但是抗病毒應(yīng)答不充分的患者?？梢哉{(diào)整給藥方案以提供最佳的希望的應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。合適的劑量范圍可例如是0. Ι-lOOmg/kg體重、優(yōu)選l-50mg/kg體重、優(yōu)選0. 5_15mg/kg體重。此外，例如可以在一定時間施用一次推注、幾次分開的劑量，或者根據(jù)治療情況的需要按比例降低或者增加劑量。本發(fā)明的分子和組合物優(yōu)選是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法為本領(lǐng)域熟知?？捎糜谠\斷、預(yù)防和/或治療的其它分子可以與本發(fā)明結(jié)合分子相似的給藥方案施用。如果單獨施用其它分子，其可以在施用本發(fā)明的一或多種人結(jié)合分子或者藥物組合物之前(例如2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、4小時、 6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、2天、 3天、4天、5天、7天、2周、4周或者6周之前)、同時或者隨后(例如2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、2天、3天、4天、5天、7天、2周、4周或者6 周后)施用給患者。精確的給藥方案通常在病人臨床試驗期間整理。人結(jié)合分子及包含所述人結(jié)合分子的藥物組合物當作為體內(nèi)治療劑施用給人時是特別有益且通常是優(yōu)選的，因為受體對于施用的抗體的免疫應(yīng)答通常基本上低于施用單克隆鼠結(jié)合分子、嵌合結(jié)合分子或者人源化結(jié)合分子引起的。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子如中和人單克隆抗體(其功能片段和變體)、免疫綴合物、核酸分子、組合物或者藥物組合物在制備用于流感病毒H3N2感染的診斷、預(yù)防、治療或其組合的藥物中的應(yīng)用。接下來，試劑盒也是本發(fā)明的一部分，所述試劑盒包含至少本發(fā)明的結(jié)合分子如中和人單克隆抗體(其功能片段和變體)、至少本發(fā)明的免疫綴合物、至少本發(fā)明的核酸分子、至少本發(fā)明的組合物、至少本發(fā)明的藥物組合物、至少本發(fā)明的載體、至少本發(fā)明的宿主或其組合。任選地，上述本發(fā)明試劑盒的成分包裝在合適的容器中，并標示用于指定病癥的診斷、預(yù)防和/或治療。上述成分可以水溶液優(yōu)選無菌溶液或者作為凍干的優(yōu)選無菌的用于重建的配制物形式貯存在單位或者多劑量容器中。所述容器可以由各種材料如玻璃或者塑料制成，可具有無菌存取口(例如所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的小瓶)。所述容器可還包含包含藥物可接受緩沖液的更多個容器。其還可以包括從商業(yè)和用戶立場所需的材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、用于一或多種合適的宿主的培養(yǎng)基，以及可能地，甚至至少一種其他的治療劑、預(yù)防劑或診斷劑。與所述試劑盒相關(guān)的可以是按慣例包含在治療、預(yù)防或診斷產(chǎn)品的商業(yè)包裝中的說明書，其含有關(guān)于例如這種治療、預(yù)防或者診斷產(chǎn)品使用相關(guān)的適應(yīng)癥、用法、劑量、生產(chǎn)、施用、禁忌癥和/或注意事項的信息。本發(fā)明的結(jié)合分子也可以在體外方法中有利地用作診斷劑以檢測系統(tǒng)發(fā)生類群2 亞型流感病毒。本發(fā)明因此進一步涉及檢測樣品中流感病毒系統(tǒng)發(fā)生類群2亞型流感病毒的方法，所述方法包括步驟(a)將樣品與診斷有效量的本發(fā)明結(jié)合分子(其功能片段和變體)或者免疫綴合物接觸，及(b)確定所述結(jié)合分子或者免疫綴合物是否特異性結(jié)合所述樣品的分子。所述樣品可以是生物學(xué)樣品，包括但不限于血液、血清、糞便、痰液、鼻咽部抽吸物、支氣管灌洗液、尿液、組織或者來自(潛在)感染的對象的其它生物學(xué)材料，或者非生物學(xué)樣品如水、飲料等。(潛在)感染的對象可以是人，但也可以是懷疑是流感病毒系統(tǒng)發(fā)生類群2亞型的載體的動物進行檢測所述病毒的存在情況，使用本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物進行。首先對樣品進行操作以使其更適合檢測方法。所述操作是指對懷疑含有和/或含有病毒的樣品進行處理，由此所述病毒分解成抗原性成分如蛋白質(zhì)、(多)肽或者其它抗原性片段。優(yōu)選地，將本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物與樣品在使得所述人結(jié)合分子與樣品中可能存在的病毒或者其抗原性成分之間形成免疫復(fù)合物的條件下接觸。然后通過合適方式檢測及測量表示樣品中存在病毒的免疫復(fù)合物的形成(如果有的話)。這種方法包括同源和異源結(jié)合免疫測定，如放射性免疫測定(RIA)、ELISA、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、FACS, BIAC0RE和Western印跡分析。優(yōu)選的測定技術(shù)、特別是針對大規(guī)模臨床篩選患者血清和血液及血液衍生制品的測定技術(shù)是ELISA和Western印跡技術(shù)。特別優(yōu)選ELISA檢測。對于在這些測定中用作試劑，本發(fā)明的結(jié)合分子或免疫綴合物與微滴定孔的內(nèi)表面方便地結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物可直接與微滴定孔結(jié)合。然而，本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物與所述孔的最大結(jié)合可以通過在孔中加入所述結(jié)合分子或者免疫綴合物之前用聚賴氨酸對所述孔進行預(yù)處理而實現(xiàn)。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物可以通過已知方式與所述孔共價附著。盡管也可以使用較高以及較低的量，但通常使用0. 01-100 μ g/ml的所述結(jié)合分子或者免疫綴合物進行包被。然后將樣品加入用本發(fā)明的結(jié)合分子或者免疫綴合物包被的孔中。
此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可用于鑒別流感病毒H3N2的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)可以是蛋白質(zhì)和/或多肽上的表位。其可以是線性的，但是也可以是結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象的。在一個實施方案中，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)可以通過PEPSCAN分析進行分析(見WO 84/03564， WO 93/09872，Slootstra et al.，1996)?；蛘撸梢詫Π瑏碜粤鞲胁《綡3N2的蛋白質(zhì)的肽的隨機肽文庫篩選能結(jié)合本發(fā)明結(jié)合分子的肽。發(fā)現(xiàn)的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)/肽/表位可用作疫苗及用于診斷流感病毒H3N2感染。在除了蛋白質(zhì)和/或多肽之外的片段由所述結(jié)合分子結(jié)合的情況中，結(jié)合結(jié)構(gòu)可以通過質(zhì)譜分析、高效液相層析及核磁共振鑒別。另一方面，本發(fā)明提供了篩選特異性結(jié)合與由本發(fā)明的人結(jié)合分子結(jié)合的表位相同的流感病毒H3N2的表位的結(jié)合分子(或者其功能片段或者變體)的方法，所述方法包括步驟(a)將待篩選的結(jié)合分子、本發(fā)明的結(jié)合分子與流感病毒H3N2或者其片段接觸，(b) 測量待篩選的結(jié)合分子是否能與本發(fā)明的結(jié)合分子競爭特異性結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段。在進一步的步驟中可以確定能競爭特異性結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的篩選的結(jié)合分子是否具有中和活性。能與本發(fā)明的結(jié)合分子競爭特異性結(jié)合流感病毒H3N2或者其片段的結(jié)合分子是本發(fā)明的另一部分。在上述篩選方法中，“特異性結(jié)合相同表位”也涵蓋了特異性結(jié)合與由本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位基本上或者實質(zhì)上相同的表位。阻斷或者競爭本發(fā)明結(jié)合分子與流感病毒H3N2的結(jié)合的能力典型示出待篩選的結(jié)合分子結(jié)合流感病毒H3N2上的表位或者結(jié)合位點，所述表位或者結(jié)合位點在結(jié)構(gòu)上與由本發(fā)明的結(jié)合分子免疫特異性識別的流感病毒H3N2上的結(jié)合位點重疊。或者，這可以表示待篩選的結(jié)合分子結(jié)合與由本發(fā)明的結(jié)合分子免疫特異性識別的結(jié)合位點足夠接近的表位或者結(jié)合位點，在空間上或者另外地抑制本發(fā)明結(jié)合分子與流感病毒H3N2的結(jié)合。通常，競爭性抑制是通過這樣的測定測量，其中將抗原組合物即包含流感病毒 H3N2或者其片段的組合物與參考結(jié)合分子即本發(fā)明的結(jié)合分子以及待篩選的結(jié)合分子混合。通常，所述待篩選的結(jié)合分子是過量存在的?；贓LISA和Western印跡的方案適用于這種簡單競爭研究。通過使用物種或者同種型二抗，僅能檢測結(jié)合的參考結(jié)合分子，其結(jié)合由于待篩選的基本上識別相同表位的結(jié)合分子的存在而降低。在進行參考結(jié)合分子與任何待篩選的結(jié)合分子(無論物種或者同種型如何)之間的結(jié)合分子競爭性研究中，可以首先對所述參考結(jié)合分子用可檢測標記如生物素、酶、放射性標記或者其它標記物進行標記以使得隨后可以進行鑒別。通過這些競爭性測定鑒別的結(jié)合分子(競爭性結(jié)合分子或者交叉反應(yīng)性結(jié)合分子)包括但不限于結(jié)合由所述參考結(jié)合分子即本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位或者結(jié)合位點的抗體、抗體片段及其它結(jié)合劑，以及結(jié)合與由所述參考結(jié)合分子結(jié)合的表位足以接近的表位或者結(jié)合位點的抗體、抗體片段及其它結(jié)合劑，在待篩選的結(jié)合分子與參考結(jié)合分子之間發(fā)生競爭性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的競爭性接合分子當過量存在時抑制參考結(jié)合分子與選擇的靶物種的特異性結(jié)合，抑制程度為至少10%、優(yōu)選至少25%、 更優(yōu)選至少50%、最優(yōu)選至少75% -90%或者更高。結(jié)合與本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合的表位大致、基本上、實質(zhì)上相同或者相同表位的一或多種競爭性結(jié)合分子的鑒別是一種簡單易行的技術(shù)。與參考結(jié)合分子即本發(fā)明的結(jié)合分子相比鑒別競爭性結(jié)合分子，應(yīng)理解實際上確定所述參考結(jié)合分子和競爭性結(jié)合分子結(jié)合的表位在任何方式上不是鑒別與所述參考結(jié)合分子結(jié)合相同或者基本上相同的表位的競爭性結(jié)合分子必需的。本發(fā)明在如下的實施例和附圖中進一步闡述。所述實施例不以任何方式意圖限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1 使用從記憶B細胞提取的RNA構(gòu)建scFv噬菌體展示文庫從正常健康供體通過在EDTA抗凝取樣管中靜脈穿刺收集外周血。scFv噬菌體展示文庫如WO 2008/028946所述獲得，所述文獻援弓I加入本文。將記憶B細胞(⑶M+/⑶27+) 與天然B細胞(⑶M+/⑶27-)和記憶T細胞(⑶M-/⑶27+)分離，在接下來的步驟中，使用 IgM表達將IgM記憶B細胞(IgM+)與轉(zhuǎn)換(switch)記憶B細胞(IgM-)分離。從IgM記憶 B細胞分離RNA及制備cDNA。進行兩輪PCR擴增，使用表1和2中列出的引物，以從各自供體全部組成成分中分離免疫球蛋白VH和VL區(qū)。使用表1中列出的引物組對各個cDNA進行第一輪擴增針對各自的VH、Vkappa和 Vlambda區(qū)產(chǎn)生大約650堿基對的7、6和9個產(chǎn)物。對于IgM記憶B細胞VH區(qū)擴增，OCM恒定引物與0H1-0H7組合使用。第一輪擴增的熱循環(huán)程序是2分鐘96°C (變性步驟)；30個如下循環(huán)30秒96°C /30秒55°C /60秒72°C ； 10分鐘72°C最終延伸以及4°C冷卻。將產(chǎn)物加樣并分離自瓊脂糖凝膠，使用凝膠提取柱Oliagen)進行，并在50μ1 ImM Tris-HCl PH 8.0中洗脫。將10%的第一輪產(chǎn)物(5μ1)進行第二輪擴增，使用表2列出的引物進行。 這些引物用限制位點擴展，使得各自的VL和VH區(qū)定向克隆進噬菌體展示載體PDV-C06中。 第二輪擴增的PCR程序如下2分鐘96°C (變性步驟)；30個如下循環(huán)30秒96°C /30秒 60°C/60秒72°C ；10分鐘72°C最終延伸以及4°C冷卻。首先根據(jù)在免疫球蛋白基因產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的J節(jié)段的自然發(fā)生情況集合第二輪產(chǎn)物( 350個堿基對)，針對VH、Vkappa和 Vlambda可變區(qū)分別獲得7、6和9個集合(見表3和4)。為了獲得免疫球蛋白序列在免疫文庫中的標準化分布，根據(jù)表3中所述百分比混合所述6個Vkappa和9個Vlambda輕鏈集合。將這個單一最終VL集合(3yg)用限制酶MlI和NotI消化過夜，加樣并分離自1.5% 瓊脂糖凝膠( 350個堿基對)，使用Qiagen凝膠提取柱進行，并如下所述在MlI-NotI切割PDV-C06載體( 5000堿基對)中連接10 μ 1 PDV-C06載體(50ng/ μ 1),7 μ 1 VL插入體(lOng/ μ 1),5 μ 1 IOX 連接緩沖液(NEB)，2. 5 Τ4 DNA 連接酶(400U/ μ 1) (NEB)，25. 5 μ 1 超純水(載體與插入體比率為1 2)。在16°C水浴中連接過夜。接下來，將該體積用水加倍，用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(75 24 1) (Irwitrogen)提取，隨后用氯仿(Merck) 提取，及用 Ιμ Pellet Paint (Novogen)、10 μ 1 乙酸鈉(3M ρΗ 5.0)和 100 μ 1 異丙醇在-20°C沉淀2小時。獲得的樣品隨后在4°C以20. OOOxg離心30分鐘。將獲得的沉淀用 70%乙醇洗滌及在室溫以20. OOOxg離心10分鐘。通過真空抽吸除去乙醇，將所得沉淀風(fēng)干幾分鐘，然后溶解在含有IOmM Tris-HCl, pH 8. 0的50 μ 1緩沖液中。將1 μ 1連接混合物用于在冷卻的0. Icm電穿孔杯(Biorad)中轉(zhuǎn)化40 μ 1 TG-I電感受態(tài)細胞(Stratagene)， 使用 Gen印ulser II 設(shè)備(Biorad)，設(shè)定為 1. 7kV、2000hm、25 μ F (時間常數(shù) 4，5msec)。 緊接在脈沖后，將細菌用含有5% (w/v)葡萄糖(Sigma)的1000 μ 1 SOC介質(zhì)(Invitrogen) 在37°C從所述杯中沖洗出，移至15ml圓底培養(yǎng)管中。另外500 μ 1 SOC/葡萄糖用于從電穿孔杯中沖洗剩余的細菌并加入所述培養(yǎng)管中。通過在搖床培養(yǎng)箱中在37°C以220rpm培養(yǎng)精確1小時回收細菌。將轉(zhuǎn)化的細菌鋪板在大MOmm方形培養(yǎng)皿(NUNC)中，所述培養(yǎng)皿含有200ml 2TY瓊脂(16g/l細菌用胰蛋白胨，10g/l細菌用酵母提取物，5g/l NaCl，15g/l瓊脂，pH 7.0)，補加了 50 μ g/ml氨芐青霉素和5% (w/v)葡萄糖(Sigma)。將1-1000稀釋液鋪板在含有相同介質(zhì)的15cm培養(yǎng)皿上進行計數(shù)。重復(fù)進行20次這個轉(zhuǎn)化程序，將完整的文庫鋪板在總共30個大方形培養(yǎng)皿上，在37°C培養(yǎng)器中生長過夜。典型地，使用上述方案獲得大約lxl07cfU。通過輕微刮取細菌置于IOml 2TY培養(yǎng)基/平板中而從所述平板收獲中間體VL輕鏈文庫。通過0D600測量確定細胞團塊，將兩倍的5000D細菌用于maxi質(zhì)粒 DNA制備物，使用兩個P500 maxipr印柱^jiagen)根據(jù)廠商指導(dǎo)進行。與VL可變區(qū)相似，首先將第二輪VH-JH產(chǎn)物混合在一起，獲得標準J節(jié)段使用分布(見表4)，獲得稱作PH1-PH7的7個VH亞集合。將該集合使用表4所述百分比混合以獲得標準化的序列分布，獲得一個VH部分，將其用SfiI和B10I限制酶消化并連接進如上述獲得的SfiI-XhoI切割PDV-VL中間文庫中。TGl的連接設(shè)置、純化方法、隨后的轉(zhuǎn)化以及細菌的收獲如針對VL中間文庫所述(見上述)。使用集落PCR檢測最終文庫(大約^ClO6Cfu) 的插入頻率，使用在插入的VH-VL區(qū)兩側(cè)的引物組進行。95%以上的集落示出適當長度的插入物(見表幻。所述集落PCR產(chǎn)物用于隨后的DNA序列分析以檢測序列變異及評估示出完整ORF的集落百分比。這典型為70%以上(見表5)。也分析了 V基因中的突變頻率。在 50個序列中，47個序列(94%)不是表示成熟過程的種系構(gòu)型及與用作文庫RNA來源的B 細胞的記憶表型一致。最終，通過使用CT輔助噬菌體拯救文庫及擴增(見WO 02/103012) 并通過如下文所述淘選方法用于噬菌體抗體選擇。實施例2 攜帶針對甲型流感病毒亞型H3和H7及乙型流感病毒的單鏈Fv片段的噬菌體的選擇使用基本如上述構(gòu)建的抗體噬菌體展示文庫及一般的噬菌體展示技術(shù)和基本如美國專利6，沈5，150和WO 98/15833(均援引加入本文)所述的MABSTRACT 技術(shù)選擇抗體片段。此外，如WO 02/103012(援引加入本文)所述方法和輔助噬菌體用于本發(fā)明中。針對甲型流感病毒亞型H3(A/Wisconsin/67/2005)和 H7 (A/ Netherlands/219/2003)或者乙型流感病毒(B/0hio/01/2005)的重組血凝素(HA)進行選擇。將 HA 抗原在 PBS(5. 0μ g/ml)中稀釋，加入 MaxiSorp Nunc-Immuno Tubes (Nunc)中， 在4°C在旋轉(zhuǎn)盤上保溫過夜。倒空所述immimotubes，用封閉緩沖液(在PBS中2%脫脂奶粉(ELK))洗滌三次。隨后將該immimotubes用封閉緩沖液完全充填，在室溫保溫1_2小時。將等份的噬菌體展示文庫(500-1000 μ 1，0. ^dO13-IxIO13Cfu，使用CT輔助噬菌體擴增 (見WO 02/103012))在補加10%非加熱失活的胎牛血清和2%小鼠血清的封閉緩沖液中在室溫封閉1-2小時。將封閉的噬菌體文庫加入immimotubes中，在室溫保溫2小時，用洗滌緩沖液(在PBS中0.05% (v/v)Tween-20)洗滌以除去未結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬菌體從各自的抗原中洗脫，通過與Iml的IOOmM三乙胺(TEA)在室溫保溫10分鐘進行。隨后， 將洗脫的噬菌體與0.5ml的IM Tris-HCl pH7. 5混合以中和pH。這個混合物用于感染已經(jīng)在37°C生長至OD 600nm為大約0. 3的5ml的XLl-Blue大腸桿菌培養(yǎng)物。使所述噬菌體在37°C感染XLl-Blue細菌30分鐘。然后，將該混合物在室溫以3000xg離心10分鐘， 將細菌沉淀重懸于0. 5ml 2-胰蛋白胨酵母提取物OTY)培養(yǎng)基中。將獲得的細菌懸浮液分成兩個補加了四環(huán)素、氨芐青霉素和葡萄糖的2TY瓊脂平板中。在將平板在37°C保溫過夜后，從平板中刮取集落，用于制備富集的噬菌體文庫，基本如De Kruif et al. (1995a)和 WO 02/103012所述進行。簡而言之，刮取的細菌用于接種含有氨芐青霉素、四環(huán)素和葡萄糖
33的2TY培養(yǎng)基，在37°C生長至OD 600nm為 0. 3。加入CT輔助噬菌體，并使其感染細菌， 之后將培養(yǎng)基改變?yōu)楹邪逼S青霉素、四環(huán)素和卡那霉素的2TY培養(yǎng)基。在30°C保溫過夜。 第二天，通過離心從所述2TY培養(yǎng)基除去細菌，之后培養(yǎng)基中的噬菌體通過使用聚乙二醇 (PEG)6000/NaCl沉淀。最后，將噬菌體溶解于具有牛血清白蛋白(BSA)的^il PBS中， 過濾滅菌，并用于下一輪選擇。對相同HA亞型或者對不同亞型的HA進行第二輪選擇。進行兩輪連續(xù)選擇，之后分離單獨的單鏈噬菌體抗體。在第二輪選擇后，單獨的大腸桿菌集落用于制備單克隆噬菌體抗體?；旧希瑢为毜募湓?6孔平板中生長至對數(shù)期，用VCS-M13輔助噬菌體感染，之后使得噬菌體抗體產(chǎn)生進行過夜。將含有噬菌體抗體的上清直接用于ELISA中以結(jié)合HA抗原?；蛘?，將噬菌體抗體進行PEG/NaCl-沉淀并過濾滅菌，以進行ELISA和流式細胞計量術(shù)分析。實施例3 =HA特異性單鏈噬菌體抗體的確認將含有在上述篩選中獲得的單鏈噬菌體抗體的選擇的上清在ELISA中確認特異性，即與不同HA抗原的結(jié)合。為此，用桿狀病毒表達的重組H3(A/WisConsin/67/2005)、 H7(A/Netherlands/219/2003)和 B(B/0hio/01/2005)HA，s(Protein Sciences,CT,USA)包被Maxisorp ELISA平板。包被后，將平板用含有0. 1 % v/v Tween-20的PBS洗滌3次及在含有3% BSA或2% ELK的PBS中在室溫封閉1小時。將選擇的單鏈噬菌體抗體在含有 4% ELK的等體積的PBS中保溫1小時以獲得封閉的噬菌體抗體。倒空該平板，用PBS/0. 1 % Tween-20洗滌3次，將封閉的單鏈噬菌體抗體加入孔中。保溫1小時，將平板用PBS/0. 1% Tween-20洗滌并使用與過氧化物酶綴合的抗M13抗體檢測(使用0D492nm測量)結(jié)合的噬菌體抗體。作為對照，同時不使用單鏈噬菌體抗體及使用不相關(guān)陰性對照單鏈噬菌體抗體進行該方法。從用IgM記憶B細胞文庫對不同HA抗原進行的選擇中，獲得特異于重組H3HA 和 H7HA 的 6 個獨特的單鏈噬菌體抗體(SC08-001、SC08-003、SC08-006、SC08-014、SC08-017 和SC08-018)。此外，分離了特異于重組H3HA(SC08-015和SC08-016)的2個獨特的單鏈噬菌體抗體及特異于重組 H7HA(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011 和 SC08-013)的 5 個獨特的單鏈噬菌體抗體。見表6。或者，使用PEG/NaCl-沉淀的及過濾滅菌的噬菌體抗體確認ELISA結(jié)合及特異性。為此，將桿狀病毒表達的重組甲型流感病毒Hl (A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/ Wisconsin/67/2005)、H5 (A/Vietnam/1203/2004)、H7 (A/Netherlands/219/2003)和乙型流感病毒(B/0hio/01/2005, B/Malaysia/2506/2004, B/Jilin/219/2003) HA，s (Protein Sciences, CT, USA)包被Maxisorp ELISA平板。包被之后，將平板用含有0. 1 % ν/ν Tween-20的PBS洗滌3次并在含有3% BSA或2% ELK的PBS中在室溫封閉1小時。將選擇的單鏈噬菌體抗體在等體積的含有4% ELK的PBS中保溫1小時以獲得封閉的噬菌體抗體。倒空該平板，用PBS/0. 1 % Tween-20洗滌3次，將封閉的單鏈噬菌體抗體加入孔中。繼續(xù)保溫1小時，將該平板用PBS/0. 1% Tween-20洗滌，結(jié)合的噬菌體抗體用與過氧化物酶綴合的抗-M13抗體檢測(使用OD 492nm測量)。作為對照，不用單鏈噬菌體抗體及使用陰性對照單鏈噬菌體抗體同時進行該程序。從使用IgM記憶B細胞文庫對不同HA 抗原的選擇中，獲得特異于重組HI、H3和H7HA的2個獨特的單鏈噬菌體抗體(SC08-001 和SC08-014)。此外，分離了特異于重組H3HA的6個獨特的單鏈噬菌體抗體(SC08-003、 SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017 和 SC08-018)及 5 個特異于重組 H7HA 的獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011 和 SC08-013)。見表 7?；蛘撸褂肞EG/NaCl-沉淀的和過濾滅菌的噬菌體抗體通過FACS分析確認結(jié)合和特異性。為此，使全長重組甲型流感病毒亞型Hl (A/New Caledonia/20/1999), H3(A/ ffisonsin/67/2005)、H5 (TV)、H7 (A/Netherlands/219/2003)和乙型流感病毒(B/0hio/ ol/2005)HA在PER. C6細胞表面上表達。將該細胞與單鏈噬菌體抗體保溫1小時，隨后用 PBS+0. 1 % BSA洗滌3次。結(jié)合的噬菌體用FITC綴合的M13-抗體檢測。從使用IgM記憶 B細胞文庫對不同HA抗原的選擇中，分離了特異于甲型流感病毒亞型HI、H3和H7HA的一個單鏈噬菌體抗體(SC08-001)。此外，分離了特異于H3HA的6個獨特的單鏈噬菌體抗體 (SC08-003、SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017 和 SC08-018)、特異于 H7HA 的 4 個獨特的單鏈噬菌體抗體(SC08-007、SC08-010、SC08-011和SC08-013)。見表8。其中6個噬菌體抗體(SC08-001、SC08-003、SC08-015、SC08-016、SC08-017、SC08-018)用于構(gòu)建完全人免疫球蛋白以進一步鑒定(見實施例5)。實施例4 甲型流感病毒(H3N2) HA特異性永生化B細胞克隆的選擇和確認除了噬菌體展示之外，本發(fā)明的結(jié)合分子也可以通過其它方法分離，例如使用永生化B細胞，如WO 2007067046所述。將衍生自接種的供體的的永生化IgM記憶細胞 (⑶19+/⑶27+，IgD+)用APC標記的H3HA染色，并將淘選的單細胞進行限制性稀釋培養(yǎng)。在回收及細胞擴展后，通過固相ELISA測量H3HA淘選的細胞的上清的HI、H3和H7免疫反應(yīng)性。隨后，鑒定靶特異性B細胞的結(jié)合活性和中和作用。將B細胞通過限制稀釋克隆， 產(chǎn)生單一克隆。將這些克隆種植在培養(yǎng)平板中，培養(yǎng)細胞14天。篩選克隆上清的抗-HA單克隆抗體的產(chǎn)生情況，所述抗-HA單克隆抗體結(jié)合表達Hl、H3、H5和H7衍生的HA的HA轉(zhuǎn)染的293細胞。作為特異性或者背景染色的對照，使用未轉(zhuǎn)染的293細胞。為了確定在上述篩選中獲得的含有IgM或IgG抗體的選擇的B細胞克隆上清是否能阻斷甲型流感病毒(H3N2)感染，進行體外病毒中和測定(VNA)。在MDCK細胞(ATCC CCL-34)上進行VNA。將MDCK細胞在MDCK細胞培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基，補加抗生素、20mM Hepes 和0. 15% (w/v)碳酸氫鈉(完全MEM培養(yǎng)基)，補加10% (ν/ν)胎牛血清)中培養(yǎng)。將在測定中使用的毒株 H3N2(A/Wisconsin/67/2005)稀釋至 5. 7X 103TCID50/ml 效價(50%組織培養(yǎng)物感染劑量/ml)，效價根據(jù)Spearman和Karber方法計算。在一式四份孔中將IgG 或者IgM制備物在完全MEM培養(yǎng)基中進行2-倍系列稀釋(1 2-1 64)。將25 μ 1各個 IgG稀釋液與25 μ 1病毒懸浮液(100TCID50/25l·! 1)混合，在37°C保溫1小時。然后將此懸浮液移至96孔平板的一式四份孔中，所述孔中含有在50 μ 1完全MEM培養(yǎng)基中鋪滿的MDCK 培養(yǎng)物。在使用前，將MDCK細胞以3χ104個細胞/孔種植在MDCK細胞培養(yǎng)基中，生長直至細胞達到鋪滿，用300-350 μ 1 PBS、pH 7. 4洗滌，最后將50 μ 1完全MEM培養(yǎng)基加入每個孔中。接種的細胞在37°C培養(yǎng)3-4天，每天觀測致細胞病變作用(CPE)的發(fā)生。將CPE與陽性對照進行對比。在檢測的187個IgG上清中，發(fā)現(xiàn)43個中和這個測定中使用的H3N2 (A/ Wisconsin/67/2005)毒株。其中14個用于構(gòu)建人IgG免疫球蛋白，如實施例5所述。實實例5 從選擇的單鏈Fv和B細胞克隆構(gòu)建完全人免疫球蛋白分子(人單克隆抗體)
從選擇的特異性單鏈噬菌體抗體(scFv)克隆中獲得質(zhì)粒DNA，根據(jù)標準技術(shù)確定核苷酸和氨基酸序列。通過限制性消化直接克隆scFv的重鏈和輕鏈可變區(qū)，以在IgG表達載體 pIg-C911-HCgammal (見 SEQ ID No :189)、pIG_C909_Ckappa (見 SEQ ID NO :190)或者pIg-C910-Clambda (見SEQ ID No :191)中表達。將B細胞克隆的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過PCR擴增并通過限制性消化直接克隆以在IgG表達載體pIg-C911-HCgammal (見SEQ ID No :190)、pIG-C909-Ckappa (見 SEQ ID NO :191)或者 pIg-C910_Clambda (見 SEQ ID No: 192)中表達。確定 scFv 的 VH和 VL基因相同性(見 iTomlinson IM et al. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom :MRC Centre for Protein Engineering(1997)) (見表9)。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)證實所有構(gòu)建體的核苷酸序列。所得的編碼人IgGl重鏈和輕鏈的表達構(gòu)建體在細胞中組合瞬時表達，使用標準純化方法獲得并產(chǎn)生含有人IgGl抗體的上清。將人IgGl抗體在10-0. 003 μ g/ml濃度范圍對H3、H7或B 抗原進行滴定(數(shù)據(jù)未示出)。不相關(guān)抗體作為對照抗體。選擇的免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈的CDR的氨基酸序列在表9中給出。重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列在下文給出。所述免疫球蛋白包含的重鏈和輕鏈恒定區(qū)，如下文示出。實實例6 通過H3N2結(jié)合IgG(病毒中和測定)對流感病毒的體外中和為了確定選擇的IgG是否能阻斷甲型流感病毒(H3N2)感染，進行體外病毒中和測定(VNA)。對MDCK細胞(ATCC CCL-34)進行VNA。將MDCK細胞在MDCK細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng) (MEM培養(yǎng)基，補加了抗生素、20mM !fepes和0. 15% (w/v)碳酸氫鈉(完全MEM培養(yǎng)基)，補加10% (ν/ν)胎牛血清)。將用于該測定中的H3N2(A/WiSCOnsin/67/2005)毒株稀釋至 5，7xl03TCID50/ml效價(50%組織培養(yǎng)物感染劑量/ml)，效價根據(jù)Spearman和Karber所述方法計算。將IgG制備物ΟΟΟμ g/ml)在一式四份孔中在完全MEM培養(yǎng)基中2-倍系列稀釋(1 2-1 512)。將25μ 1各個IgG稀釋液與25μ 1病毒懸浮液(100TCID50/25y 1) 混合，在37°C保溫1小時。然后將該懸浮液移至96孔平板的一式四份孔中，孔中含有在 50 μ 1完全MEM培養(yǎng)基中鋪滿的MDCK培養(yǎng)物。在使用之前，將MDCK細胞以3χ104個細胞/ 孔種植在MDCK細胞培養(yǎng)基中，生長直至細胞達到鋪滿，用300-350 μ 1 PBS pH 7. 4洗滌，最后向每個孔中加入50μ 1完全MEM培養(yǎng)基。將接種的細胞在37°C培養(yǎng)3-4天，每天觀測致細胞病變作用(CPE)的發(fā)生。將CPE與陽性對照進行對比。對實施例5的人抗-H3HA和/或抗-H7HA抗體進行上述VNA。在這些抗體中，除了 CR8040、CR8052 和 CR8069 之外的所有抗體均中和 A/Wi sconsin/67/2005H3N2 毒株。這些抗體保護MDCK培養(yǎng)物免于CPE的濃度(μ g/ml)在表11中示出。實施例7 抗-H3N2 IgG的交叉結(jié)合反應(yīng)性在ELISA中確認上述H3N2中和IgG抗體的結(jié)合特異性，即與不同HA抗原的結(jié)合。 為此，桿狀病毒表達的重組 Hl (A/New Caledonia/20/1999)、H3 (A/ffisconsin/67/2005, A/ New York/55/2004, A/ffyoming/3/2003)和 H7 (A/Netherlands/219/2003) HA，s (Protein Sciences, CT, USA)包被Maxisorp ELISA平板。包被之后，將平板用含有0. 1 % ν/ν Tween-20的PBS洗滌3次并在含有3% BSA或2% ELK的PBS中在室溫封閉1小時。倒空平板，用PBS/0. 1 % Tween-20洗滌3次，將所述IgG抗體加入孔中。繼續(xù)保溫1小時，將平板用PBS/0. 1% Tween-20洗滌，使用與過氧化物酶綴合的抗人IgG抗體檢測結(jié)合的抗體(使用OD 492nm測量)。作為對照，使用不相關(guān)的IgG CR4098。從選擇的H3N2中和抗體中，CR8001示出與所有檢測的重組HA的異源亞型 (heterosubtypic)交叉結(jié)合，CR8020、CR8021、CR8041、CR8043 和 CR8057 示出與所有三個檢測的 H3HA 以及 H7HA 的異源亞型交叉結(jié)合。CR8003、CR8015、CR8016、CR8017、CR8018、 CR8038、CR8039、CR8040、CR8049、CR8050、CR8052 和 CR8069 示出與所有 3 個檢測的 H3HA 的交叉結(jié)合。一個抗體CR8019示出僅結(jié)合2個H3HA。見表12。此外，選擇的H3N2中和抗體用于通過FACS分析檢測異源亞型結(jié)合。為此，使全長重組甲型流感病毒亞型 Hl (A/New Caledonia/20/1999)、H3 (A/ffisonsin/67/2005)和 H7 (A/Netherlands/219/2003)HA在PER. C6細胞表面上表達。將細胞與IgG抗體保溫1小時，隨后用PBS+0. 1%BSA洗滌3次。結(jié)合的抗體用PE綴合的抗人抗體檢測。作為對照，使用未轉(zhuǎn)染的PER. C6細胞。從H3N2中和抗體中，CR8001示出對甲型流感病毒亞型H1、H3和H7HA的交叉結(jié)合活性而野生型PER. C6細胞沒有。此外，CR8020和CR8041示出與H3和H7HA均強力結(jié)合。 CR8043和CR8057示出與H3HA強力結(jié)合，與H7HA弱結(jié)合。CR8055示出在PER. C6細胞上低水平背景染色。剩余的13種抗體示出僅與H3轉(zhuǎn)染的細胞結(jié)合。見表12。實施例8 抗-H3N2 IgG的交叉中和活性為了確定選擇的IgG是否能阻斷多個甲型流感病毒毒株，進行另外的體外病毒中和測定(VNA)。對MDCK細胞(ATCC CCL-34)進行VNA。將MDCK細胞在MDCK細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)基，補加了抗生素、20mM Hepes和0. 15 % (w/v)碳酸氫鈉(完全MEM培養(yǎng)基)，補加10% (ν/ν)胎牛血清)。將該測定中使用的Hmi (A/New Caledonia/20/1999 A/Brisbane/59/2007 和 A/Solomon Islands/IVR-145)、H3N2 (A/ Hong Kong/1/68, A/Johannesburg/33/94, A/Panama/2000/1999, A/Hiroshima/52/2005 和 A/Wisconsin/67/2005)、H7N3 (A/Mallard/Netherlands/12/2000)以及 HlO (A/Chick/ Germany/N/49)毒株均稀釋至5，7xl03TCID50/ml效價(50%組織培養(yǎng)物感染劑量/ml)，效價根據(jù)Spearman和Karber所述方法計算。將IgG制備物(80 μ g/ml)在一式四份孔中用完全MEM培養(yǎng)基2-倍系列稀釋(1 2-1 512)。將25 μ 1各個IgG稀釋液與25 μ 1病毒懸浮液(100TCID50/25y 1)混合，在37°C保溫1小時。然后將懸浮液移至96孔平板的一式四份孔中，所述孔中含有在50 μ 1完全MEM培養(yǎng)基中的鋪滿MDCK培養(yǎng)物。在使用之前，將MDCK細胞以3χ104個細胞/孔種植在MDCK細胞培養(yǎng)物中，生長直至細胞達到鋪滿，用 300-350 μ 1 PBS，ρΗ 7. 4洗滌，最后在每個孔中加入50 μ 1完全MEM培養(yǎng)基。將接種的細胞在37°C培養(yǎng)3-4天，每天觀察致細胞病變作用(CPE)的發(fā)生。將CPE與陽性對照對比。從一組H3N2中和抗體中，CR8020和CR8041示出對所有檢測的甲型流感病毒亞型 H3、H7和HlO病毒的異源亞型交叉中和活性，但是對Hl病毒沒有。此外，CR8043示出對所有檢測的H3和HlO病毒毒株的交叉中和作用。CR8039、CR8041、CR8043和CR8057示出對所有檢測的H3病毒毒株的交叉中和作用。另外的13種抗體示出對1種以上檢測的H3病毒毒株的交叉中和作用。見表13。實施例9 抗-H3N2抗體結(jié)合HA的融合前構(gòu)象為了確定選擇的IgG是否能結(jié)合HA分子的融合前或者融合后構(gòu)象，進行體外ρΗ轉(zhuǎn)移實驗。為此，使全長重組甲型流感病毒亞型H3 (A/ffisonsin/67/2005) HA在PER. C6細胞表面上表達。為了測定在不同結(jié)構(gòu)HA構(gòu)象的特異性反應(yīng)性，將3X IO5個細胞用在DMEM中的 10 μ g/ml胰蛋白酶-EDTA在室溫處理30分鐘，洗滌及在酸化PBS(pH 4.9)中保溫5分鐘，洗滌，然后在存在20mM DTT條件下在室溫保溫20分鐘。使細胞在每個步驟均分裂，未處理的粘附細胞重懸于0.05% EDTA中。將每次處理的細胞級分與抗-H3N2 IgG CR8001、CR8020、 CR8041、CR8043和CR8057保溫30分鐘。然后將細胞與藻紅蛋白綴合的抗-IgG(Southern Biotech)保溫 30 分鐘。使用 FACS Calibur 用 CELLQuest Pro 軟件(Becton Dickinson) 分析染色的細胞。在用胰蛋白酶(條紋條)、pH 4. 9緩沖的介質(zhì)(實心白條)以及DTT (交叉條)相繼處理后測量IgGl與表面表達的H3rHA的FACS結(jié)合并以與未處理的rHA(實心黑條)的結(jié)合百分比表示。見圖2。抗體CR8001、CR8020、CR8041和CR8043均示出在pH轉(zhuǎn)移后結(jié)合顯著降低，表明對于表位的特異性僅存在于低PH誘導(dǎo)的HA分子構(gòu)象改變之前。抗體CR8057示出僅在DTT 處理后結(jié)合降低，表明僅當存在HAl時才能獲得對于構(gòu)象非依賴性表位的特異性。實施例10 抗-H3N2抗體CR8041阻止HAO裂解為確定選擇的IgG是否能保護HA分子免于蛋白酶裂解，進行體外蛋白酶易感性測定。為此，對7. 5yg重組可溶甲型流感病毒亞型H3 (A/ffisonsin/67/2005) HA(Protein Sciences,CT,USA)在 37°C進行 1 小時不同 ρΗ(4. 9、5· 3 和 8. 0)處理。在保溫后，中和反應(yīng)。將樣品在存在和不存在7. 5 μ g CR8041或CR8057Fab片段的條件下用0. 5 μ g 胰蛋白酶消化過夜。通過加入SDS加樣緩沖液猝滅反應(yīng)。在每個樣品中加入3μ1 Nupage 還原劑(Invitrogen)。將樣品在Ix MOPS緩沖液中4-12% Bis1Tris凝膠上運行。蛋白質(zhì)條帶通過膠體藍染色觀測(見圖3)。在不存在Fab條件下，Η3ΗΑ分子在pH 4. 9或5. 3易于被轉(zhuǎn)變?yōu)槠涞鞍酌敢赘械娜诤虾笮问?，但是在PH 8.0則否。在存在Fab片段CR8057條件下，Η3ΗΑ的降解及因此在ρΗ4. 9的構(gòu)象變化不被抑制。相反，F(xiàn)ab CR8041的存在不僅防止在低PH條件下Η3ΗΑ的構(gòu)象變化和降解，而且還防止HAO的pH非依賴性裂解為HAl和ΗΑ2。 這些結(jié)果表明CR8041的表位在裂解位點上或者在其附近。用抗-Η3Ν2抗體進行的競爭實驗(結(jié)果未示出)表明CR8001、CR8020和CR8043抗體的重疊表位和相似工作機制。實施例11 本發(fā)明結(jié)合分子的作用機制HA糖蛋白是三聚體，其中每個單體由兩個二硫鍵連接的糖多肽(稱作HAl和ΗΑ2) 組成，其是在感染期間由于前體(HAO)的蛋白酶解而產(chǎn)生的。裂解是病毒感染性必需的，因為其需要引發(fā)HA的膜融合，使得構(gòu)象改變。引發(fā)的分子的活化在內(nèi)體中在ρΗ5_ρΗ6之間的低pH條件下發(fā)生，且需要HA結(jié)構(gòu)的廣泛改變。融合前未裂解的(I)、融合前裂解的(II)以及融合后HA(III)構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)在圖4中示出。在體外，HA分子的構(gòu)象改變可以使用HA表面表達哺乳動物細胞模擬。首先，可以通過向細胞中加入胰蛋白酶而觸發(fā)蛋白酶解。其次，融合前至融合后的構(gòu)象改變可以通過降低PH實現(xiàn)。此外，所述分子的HAl部分可以通過加入還原劑如DTT而除去。以此方式及通過在特定階段加入抗體，可以檢驗所述抗體在哪個階段干擾感染進程。為此，將PER. C6 細胞用攜帶來自A/Wisonsin/67/2005的HA的H3HA表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并進行如實施例10所述的不同處理。對于這個實驗，首先將細胞與抗_H3mAb在胰蛋白酶裂解之前保溫，隨后如上述進行處理(見圖5)。抗-H3mAb的結(jié)合通過使用PE綴合的抗人抗體根據(jù)標準方案進行檢測。熒光信號通過FACS分析測量。“僅細胞”是指在mAb與未處理的細胞結(jié)合后獲得的信號，設(shè)定為 100%。從圖5可以看出，在不同處理后所述mAb仍結(jié)合HA。因為在實施例10中表明H3mAb CR8020、CR8041和CR8043僅結(jié)合融合前狀態(tài)(即在由于降低pH而導(dǎo)致構(gòu)象改變之前)，由此推斷抗體的結(jié)合實際上至少在體外抑制胰蛋白酶裂解(也見實施例10)，且因此也抑制隨后的導(dǎo)致構(gòu)象改變和融合的步驟。結(jié)合在受體附著位點附近的HA分子的HAl部分的抗體CR8057在構(gòu)象改變之后能結(jié)合HA，以及正如所期望的HAl部分在當通過DTT處理使得 HAl與HA2結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵破壞之后被除去時喪失。胰蛋白酶裂解的抑制隨后在不同的體外實驗中證實。首先，進行時程實驗以確定應(yīng)將H3HA與胰蛋白酶保溫多長時間以實現(xiàn)HAO適當?shù)亓呀鉃镠Al和HA2。為此，將重組可溶 H3HA(A/Wisconsin/67/2005 ；Protein Sciences, CT, USA)在含有 6· 7 μ g/ml 胰蛋白酶和1 % N-dodecyl-β -demaltosid的4mM Tris. HCl緩沖液pH8. 0中保溫。在不同時間點通過加入BSA終止胰蛋白酶消化。根據(jù)標準方法使樣品在SDS-page凝膠(還原的) 上運行和印跡。HAO、HAl和HA2條帶使用兔抗-H3HA多克隆抗體(Protein Sciences, CT, USA)檢測。圖6示出2小時保溫足以幾乎完全裂解，通過還原凝膠上HAl和HA2條帶的顯現(xiàn)而證實。接下來，將重組可溶H3HA與CR8020、CR8041、CR8043或CR8057任一保溫，隨后在pH8. 0進行胰蛋白酶裂解。胰蛋白酶消化再次在不同時間點通過加入BSA終止。將樣品在SDS-page凝膠(還原的)上運行及印跡。HA0、HA1和HA2條帶使用抗-H3多克隆抗體進行檢測。結(jié)果示出所有這三種mAb CR8020、CR8041和CR8043均阻止體外胰蛋白酶裂解，因為與抗體結(jié)合的H3HA與胰蛋白酶保溫導(dǎo)致凝膠上HA的HAO形式被保護(圖7)。相反，H3HA與對照mAb (CR8057)在相同條件下保溫導(dǎo)致HAO條帶消失。這個實驗證實在實施例10中針對CR8041揭示的數(shù)據(jù)，并將這個觀測結(jié)果擴展至CR8020和CR8043抗體。本發(fā)明的結(jié)合分子因此至少在體外防止HAO分子的胰蛋白酶裂解。然而，應(yīng)注意這不排除另外的抑制作用也由CR8020、CR8041和CR8043mAb介導(dǎo)，其在感染過程的更下游且導(dǎo)致干擾pH 誘導(dǎo)的構(gòu)象改變和/或融合過程。為研究是否可能存在這種情況，重復(fù)上述實驗，但是僅在胰蛋白酶裂解之后，將抗體CR8043或作為對照的抗體CR8057加入表達H3HA的細胞中。在保溫之后，隨后將細胞如實施例10所述在低PH條件下保溫及用DTT處理。如果作用機制限于胰蛋白酶裂解抑制， 期望所述mAb CR8043在pH處理后喪失結(jié)合，因為我們在實施例10中已經(jīng)確定所述抗體不結(jié)合HA的融合后構(gòu)象。相反，從圖8中可以看出，mAb CR8043結(jié)合在暴露于低pH及隨后 DTT處理后仍被檢測到，表明pH誘導(dǎo)的構(gòu)象改變至少在體外也由CR8043抑制。已經(jīng)示出結(jié)合HA的HAl區(qū)的CR8057正如期望地起作用，而且當HAl部分在DTT處理后喪失時不再可檢測到。為了檢驗抗體CR8020和CR8041是否也能阻斷HA的pH誘導(dǎo)的構(gòu)象改變，重復(fù)上述實驗?，F(xiàn)在在上述所有處理之后、在低PH保溫之前或者在胰蛋白酶裂解之前，將抗體CR8020、CR8041 和 CR8043 或者作為對照的抗體 CR8057 加入表達 A/Hong Kong/1/1968、A/ Hong Kong/24/1985 或者 A/Wisconsin/67/2005 亞型 H3HA 的細胞中。如先前對于A/Wisconsin/67/2005 H3HA 所示，CR8020、CR8041 和 CR8043 抗體識別僅在低PH處理之前存在的表位。這個表位在用于這個實驗中的三個HA中是保守的，從圖9c中可以看出。如果作用機制限于胰蛋白酶裂解的抑制，預(yù)期mAb CR8020、CR8041和 CR8043在pH處理后喪失與已經(jīng)裂解的HA的結(jié)合，因為我們在實施例10中已經(jīng)確定所述抗體不結(jié)合HA的融合后構(gòu)象。相反，從圖9b可以看出三種不同的H3HA在暴露于低pH及隨后的DTT處理之后仍可檢測到mAb結(jié)合，表明pH誘導(dǎo)的構(gòu)象改變至少在體外也被CR8020、 CR8041和CR8043抑制。已經(jīng)示出結(jié)合HA的高可變HAl區(qū)的CR8057示出不結(jié)合A/Hong kong/1/1968 和 A/Hong Kong/24/1985HA。實施例12 體外產(chǎn)生的逃逸突變體表明所述表位的位置與H3HA中保守序列一致為了研究CR8020、CR8041和CR8043結(jié)合HA中的哪個區(qū)域，嘗試在體外培養(yǎng)物中產(chǎn)生逃逸突變體。將A/Hong Kong/1/1968病毒在存在限制量的單克隆抗體的條件下在 MDCK細胞培養(yǎng)物中傳代。首先，在用100TCID50單位的混合不同量單克隆抗體的MDCK細胞接種及保溫3天之后，確定導(dǎo)致病毒感染降低31og的抗體濃度。將這個濃度的抗體加入系列傳代的接種物中，在每次傳代后，在不存在和存在不同量抗體的條件下對病毒進行噬斑滴定以確定該病毒是否仍對抗體介導(dǎo)的中和作用敏感。對每一個mAb CR8020、CR8041和 CR8043進行這個程序。從每個培養(yǎng)物中可以通過噬斑測定分離逃逸病毒，從每個病毒的兩個分離株中提取病毒RNA并用于確定HA序列。觀測到的突變的氨基酸如下CR8020 :D19N和Q27L，在分析的兩個噬斑中；CR8041 :G33E，在兩個噬斑中；CR8043 :R25M，在一個噬斑中；Q!34R，在另一噬斑中。所有三個單克隆抗體均示出在與融合肽相鄰的HA干區(qū)的HA2部分中相似結(jié)構(gòu)域中的逃逸突變。存在于NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/ FLU/Database/select. cgi)中H3N2病毒的這個區(qū)域的氨基酸序列對比顯示出該序列的一個明顯保守。表14示出HA2區(qū)中W14與K39氨基酸之間的序列變異，標明了觀測到的逃逸突變。N=具有特定序列的毒株數(shù)目。此外，也示出了分離年份以及在用H3抗體的中和試驗中檢測陽性的毒株(Pa = A/Panama/2000/1999 ；Wis = A/Wisconsin/67/2005 ；Hs = A/Hiroshima/52/2005 ；HK = A/HongKong/1/1968)。在含有所述 HA2 序列的數(shù)據(jù)庫中存在的1363個H3病毒中，大部分(81% )具有示出被中和的病毒毒株中存在的序列。在剩下的序列中，大多數(shù)具有可以認為是保守改變的氨基酸。對于其它突變，需要功能性中和試驗以確定所述改變是否影響抗體的功能性。重要的是在逃逸病毒實驗發(fā)生的三個氨基酸改變 (R25、G33和Q34)在天然流感病毒序列中不出現(xiàn)，另兩個突變僅組合出現(xiàn)(D19和Q27)，這是在天然序列中也不存在的一個組合。這可能意味著所述突變對于病毒適合度具有負面影響?？傊茢嗨隹贵w與HA2上在H3亞型病毒之間高度保守的表位相互作用，證實所述單克隆抗體的廣泛中和能力。實施例13 進行體內(nèi)實驗的單克隆抗體的制備為了能鑒定及隨后確認IgG作為潛在的體內(nèi)治療抗體，需要以足夠數(shù)量生產(chǎn)及純化其。使IgG在PER.C6 細胞中在25L Wave-bag中產(chǎn)生并收獲培養(yǎng)物。從澄清的收獲物中，使用A蛋白親和性層析及緩沖液交換步驟純化IgG。純化的緩沖液交換的IgG的單體含量在0. 2 μ m滅菌過濾之前和之后均是 99%。此外，用如上述獲得的不同抗體制備物進行體外病毒中和測定(VNA)。結(jié)果在表15中示出。實施例14 人IgG單克隆抗體對于體內(nèi)致死性H3N2攻擊的預(yù)防活性在雌性U9Xl/SvJ 小鼠(Jackson Labs)中用流感病毒 A/HK/1/68-MA20 (H3N2)病毒的小鼠致死性攻擊模型檢測mAb CR8020、CR8041和CR8043的預(yù)防效力(MA =小鼠適應(yīng)白勺)。Α/ Κ/1/68_ΜΑ20^|_ | 自 E. G. Brown ^gjUniversity of Ottawa, Ottawa, Ontario, Canada ；Brown, Ε. G. et al. (2001)。將該病毒在含胚雞蛋中傳代一次，之后用于所述小鼠實驗。使所有小鼠適應(yīng)環(huán)境并維持至少4天，之后再開始實驗。在攻擊前一天在尾靜脈(vena coccygeus)中通過靜脈內(nèi)注射給予30、10、3和 lmg/kg的mAb，假定小鼠平均體重為18g/小鼠，給予固定劑量體積為0. 2mL。然后對小鼠 (n = 8只/組)在第0天通過鼻內(nèi)接種用25LD50A/HK/l/68-MA20(H3N2)病毒攻擊。施用的病毒的實際劑量通過滴定在完成動物接種后剩余的接種物的少量復(fù)制樣品估計。所述接種物的病毒效價(TCID50/mL)在MDCK細胞上確定。結(jié)果示出在所述接種物的制備或者施用期間沒有無意病毒失活發(fā)生。從攻擊前一天開始每天確定臨床跡象和體重直至在第21 天結(jié)束研究。用評分系統(tǒng)對臨床跡象打分(0 =無臨床征象；1 =皮毛粗糙；2 =皮毛粗糙， 反應(yīng)性較低，在操作期間被動狀態(tài)；3 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在操作期間被動狀態(tài)；4 =皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當背部向下躺時不滾回至腹部向下)。對得分為4的動物行安樂死。為了分析在第0天的mAb血漿水平及在第21天確定血凝抑制(HI)抗體的存在，在 D0、攻擊之前以及在感染后D21從所有小鼠中抽取血樣。在2個單獨實驗中檢測mAb。在每個實驗中，陰性對照抗體(CR3014)組給予30mg/ kg。在第一個實驗中檢測mAb CR8020，在第二個實驗中檢測mAb CR8041和CR8043。在適應(yīng)環(huán)境期間，所有小鼠均是活性的且表現(xiàn)為無疾病跡象的健康狀態(tài)。圖10示出在施用mAb之后小鼠的存活率。觀測到明顯的劑量應(yīng)答關(guān)系，給予30、10或者;3mg/kg的 CR8020、CR8041或者CR8043的所有組示出100%存活率，而在lmg/kg CR8020組中25%的小鼠存活，lmg/kg CR8041和CR8043組中無小鼠存活。兩個對照mAb組示出0%存活率。在第一個實驗中，與對照組相比(P < 0. 005 ；Log Rank Test)，施用mAb CR8020在檢測的所有四個濃度均導(dǎo)致存活時間存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異。在第二個實驗中，與對照組相比(對于兩個mAb均ρ < 0. 001 ；Log Rank iTest)，施用mAb CR8041和CR8043在檢測的所有四個濃度均導(dǎo)致存活時間存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異。在圖11中，示出在施用mAb之后的21天研究期間小鼠的平均體重改變。與存活率一樣，在體重下降與使用的抗體劑量之間存在明確的反比關(guān)系。當抗體濃度增加時，體重降低下降給予30、10或者:3mg/kg的CR8020、CR8041或者CR8043組中的小鼠示出從第0_21 天平均體重增加大約10-15%，與年齡相關(guān)的體重增加一致，而在lmg/kg組及對照mAb組中小鼠的平均體重在研究期間降低。使用曲線下面積(AUC)分析更詳細地分析體重改變。對于這個分析，如果小鼠在研究繼續(xù)期間死亡/行安樂死，則最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)至第21天。簡而言之，第0天的體重/小鼠作為基線值，確定相對于基線的從0-21天的體重改變。AUC被定義為基線上面積和基線下面積的總和。使用多重比較Durmet’ s調(diào)整方差分析，將給予mAb組的平均AUC值與各自的對照組進行對比(表16)。分析示出3、10和30mg/kg的CR8020、CR8041和CR8043組的平均AUC與相應(yīng)對照組相比存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P < 0. 001)(表16)。對于lmg/kg CR8041-和CR8043組， 當與對照組相比時發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著差異(分別為ρ = 0. 004及ρ < 0. 001)。然而，由于在 CR8020 lmg/kg劑量組中兩只小鼠存活，觀測到體重變化增加及因此當與對照組相比時無統(tǒng)計學(xué)顯著差異可被證實。使用多重比較Tukey’ s調(diào)整方差分析，通過對比每個抗體的每個抗體濃度的平均AUC值進行另外的分析以研究體重降低下降的劑量應(yīng)答(表16)。對于mAb CR8020和 CR8041, lmg/kg組的體重下降統(tǒng)計學(xué)上明顯高于各自的:3mg/kg組(ρ < 0. 001)，而3、10和 30mg/kg組之間無統(tǒng)計學(xué)顯著差異(ρ > 0. 05)。對于mAb CR8043, lmg/kg組的體重下降統(tǒng)計學(xué)上顯著高于:3mg/kg組的(ρ <0.001) ；:3mg/kg組的體重下降明顯高于10mg/kg組的(ρ < 0. 001)。CR8043 的 10 和 30mg/kg 組的平均 AUC 無明顯差異(p = 0. 997)。小鼠的中位數(shù)臨床得分在圖12中示出。給予30和10mg/kg的CR8020、CR8041或者CR8043的小鼠未示出任何臨床跡象，通過在2項研究的第0-21天研究期間的中位數(shù)臨床得分表明。mAb 8020在;3mg/kg劑量組中也示出無臨床得分，而在mAb 8041和8043的 3mg/kg劑量組中觀測到臨床得分的中位數(shù)得分分別為1分和3分。在所有三種mAb的Img/ kg劑量組中，臨床得分增加達到在所有組中的中位數(shù)得分為4分。在同一天對臨床得分為4 分的小鼠行安樂死。在CR8020 lmg/kg劑量組中2只存活的小鼠在研究的第7天發(fā)病并示出分別為1分和3分的最大臨床得分。這兩只小鼠均完全康復(fù)。在CR8041和CR8043 3mg/ kg劑量組中，體重降低譜示出與臨床得分譜相似的模式。這些結(jié)果示出本文鑒別和揭示的至少三種人抗-H3N2抗體(CR8020、CR8041和 CR8043)均能單獨提供針對致死劑量流感病毒H3N2的體內(nèi)保護作用。觀測到在施用的每種抗體的量與存活率之間的明確劑量應(yīng)答關(guān)系。結(jié)果示出當在感染前一天以10mg/kg或更高的劑量施用時，抗-H3N2 IgG抗體CR8041和8043能預(yù)防小鼠中H3N2感染的臨床表現(xiàn)。當在感染前一天以3mg/kg或更高劑量施用時，mAb CR8020能預(yù)防小鼠中H3N2感染的臨床表現(xiàn)。實施例15 人IgG單克隆抗體對體內(nèi)致死性1 H3N2攻擊的保護和治療活性進行研究以檢測本文揭示的單克隆抗體如CR8020在感染后模型中對于致死性 H3N2 A/HK/1/68-MA20流感病毒體內(nèi)攻擊的治療作用。在攻擊前一天(第1組；預(yù)防陽性對照)或者在攻擊后第1、2、3、4、5或者第6天 (2-7組)在尾靜脈(vena coccygeus)靜脈內(nèi)給予小鼠(n = 10只/組)15mg/kg的mAb CR8020，假定小鼠平均體重為18g/小鼠，給予固定劑量體積0.2mL。第8組在攻擊后第1 天接受陰性對照mAb CR3014(15mg/kg)。將小鼠在第0天用25LD5(K2. 81og TCID50)A/ ΗΚ/1/68-ΜΑ20(Η3Ν2)病毒通過鼻內(nèi)接種進行攻擊。病毒批次和類型以及鼠齡與實施例14 所用相同。從攻擊前一天開始直至在第21天研究結(jié)束，每日確定臨床跡象和體重。圖13A示出在靜脈內(nèi)施用mAb CR8020 (15mg/kg,所有組)或者對照mAb (15mg/kg) 之后小鼠的存活率。當在攻擊前1天或者攻擊后1或2天施用15mg/kg mAb CR8020時，所有動物在病毒攻擊下均存活，而在對照mAb組中存活率為0 %。當在攻擊后3或4天施用 15mg/kg mAb CR8020時，觀測到分別為50%和10%的存活率。這些組的每一組存活時間與對照組相比存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(第3天組p < 0. 001，第4天組p = 0. 002 ；Log Rank Test)。用15mg/kg CR8020處理的組在第5或6天示出存活率為0%。在第5或6天處理組與對照組相比存活時間無統(tǒng)計學(xué)顯著差異(分別為P = O. 648和ρ = 0. 342 ；Log Rank Test).在圖13B中，示出在21天研究期間相對于第0天的小鼠平均體重改變。與存活率一樣，體重降低與施用15mg/kg mAb CR8020的時間存在明確關(guān)系當在較晚的時間點施用 15mg/kg mAb CR8020處理時，體重降低增加。使用曲線下面積(AUC)分析，對體重改變進行更詳細的統(tǒng)計學(xué)分析(表17)。對于曲線下面積分析，如果小鼠在研究繼續(xù)期間死亡/行安樂死，則最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)至第 21天。簡而言之，在第0天的體重/小鼠作為基線值，確定相對于基線的從第0-21天的體重改變。AUC被定義為基線上面積和基線下面積的總和。小鼠的中位數(shù)臨床得分示于圖13C。在攻擊前一天用15mg/kg CR8020處理的小鼠在觀測期間全部存活，無一示出任何臨床跡象。在攻擊后第1天用15mg/kg CR8020處理的小鼠示出100%存活，然而10只小鼠中的4只示出臨床跡象，達到在1-3之間的最大臨床得分。在攻擊后第2天用15mg/kg CR8020處理的動物全部存活。然而，10只小鼠中有9只示出臨床跡象，達到2或3分的最大臨床得分。在攻擊后第3天用15mg/kg CR8020處理的動物示出50%存活率。在存活的小鼠中(n = 5)，所有小鼠均示出臨床跡象，最大臨床得分3 分。在攻擊后第4天用15mg/kg CR8020處理的動物除了一只之外全部死亡。存活的小鼠示出臨床跡象，達到最大臨床得分2分。經(jīng)處理存活的所有小鼠在21天均無癥狀。使用GENMOD程序(SAS)分析臨床得分以對于用小鼠作為對象的重復(fù)測量和在分類量表上測量的數(shù)據(jù)擬合模型(表18)。由于該曲線具有不同模式，因此在這個模型中輸入可變的“天數(shù)”作為類別變量(class variable) 0在其中100%動物存活的、攻擊前1天和攻擊后第1和2天用15mg/kg mAb CR8020處理組中，在最多21天的研究期間其中位數(shù)臨床得分與對照mAb組明顯不同(三組均ρ彡0. 001)。在攻擊后第3或4天用15mg/kg mAb CR8020處理組中(其中分別具有50%和10%的小鼠存活)，其在最多21天研究期間的中位數(shù)臨床得分與對照mAb組也顯著不同(兩組均ρ < 0. 05)。在攻擊后第5或6天用 15mg/kg mAb CR8020處理組中，中位數(shù)臨床得分與對照mAb組僅在第3天具有顯著不同 (p ( 0. 001)。這種差異盡管具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，但不認為是相關(guān)的。綜上所述，在致死性H3N2小鼠模型中，在直至攻擊后第2天用15mg/kg的mAb CR8020治療提供100%保護作用。當在攻擊后第3天或第4天施用15mg/kg mAb CR8020 治療時提供部分保護作用。當在攻擊后第5或第6天施用時，在致死性H3N2小鼠模型中觀測到15mg/kg mAb CR8020無保護作用。這些結(jié)果示出在感染后用本文揭示的針對H3N2流感病毒的單克隆抗體如抗體 CR8020進行治療，在致死劑量H3N2流感病毒攻擊后可以挽救哺乳動物對象如本文小鼠所示。即使在晚期，即在感染后第4天，所述抗體也能部分保護小鼠免于流感病毒H3N2致死感染。引人注目地，在感染后第21天，所有存活的經(jīng)抗體治療的動物均達到正常體重水平且不示出任何殘余臨床跡象。實施例16 人IgG單克隆抗體針對體內(nèi)致死性H7N7攻擊的預(yù)防活性進行研究以檢測本文所述單克隆抗體如CR8020針對體內(nèi)流感病毒H7N7的致死性攻擊的預(yù)防作用。在小鼠致死攻擊模型中檢測mAb CR8020的預(yù)防效力，使用小鼠適 1 ^^^! A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7) __ (Central Veterinary Institute(CVI)，Lelystad, The Netherlands)。使 A/CH/NL/621557/03 (H7N7)病毒在肺-肺傳代3次之后以適應(yīng)小鼠。在CVI實驗室中將小鼠適應(yīng)的H7N7 3代病毒在含胚雞卵中增殖。使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8周齡，n = 8只/組)適應(yīng)環(huán)境并維持至少4天，之后再開始實驗。在攻擊前一天在尾靜脈(vena coccygeus)靜脈內(nèi)給予30、10、3或者lmg/ kg的mAb CR8020，假定小鼠平均體重為18g/小鼠，給予固定劑量體積0.2mL。對照組給予 30mg/kg 陰性對照 mAb CR3014。然后將小鼠在第 0 天用 25LD5(1A/CH/NL/621557/03 (H7N7) 病毒通過鼻內(nèi)接種進行攻擊。施用的病毒的實際劑量通過滴定在完成動物接種后剩余的接種物的少量復(fù)制樣品估計。接種物的病毒效價(TCID5ciAiL)在MDCK細胞上確定。從攻擊前一天開始直至在第21天結(jié)束，以如實施例14所述相同方式每日確定臨床跡象和體重。為了分析在第0天的mAb血漿水平以及確定在第21天血凝抑制(HI)抗體的存在，在DO、就在攻擊之前以及在感染后D21從所有小鼠中抽取血樣。所有小鼠在適應(yīng)環(huán)境期間均是活性且表現(xiàn)為無疾病跡象的健康狀態(tài)。圖14A示出在施用HiAb之后小鼠的存活率。給予lmg/kg或更多的mAb CR8020的小鼠示出存活率為 100%，而在對照mAb組中存活率為0%。圖14B示出了在施用mAb之后的21天研究期間小鼠的平均體重變化。在mAb CR8020的3、10和30mg/kg組中，小鼠在21天研究期間未示出體重降低，而在mAb CR8020 lmg/kg以及對照mAb組中觀測到體重降低，在mAb CR8020 lmg/kg組中小鼠平均體重在第21天恢復(fù)至基線水平。使用曲線下面積(AUC)分析更詳細地分析體重變化(表19)。對于曲線下面積分析，如果小鼠在研究繼續(xù)期間死亡/行安樂死，則最后觀測的體重結(jié)轉(zhuǎn)至第21天。簡而言之，在第0天的體重/小鼠作為基線值，確定相對于基線的從第0-21天的體重改變。AUC被定義為基線上面積和基線下面積的總和。在體重降低與抗體使用劑量之間存在明確的反比關(guān)系。當抗體濃度增加時，體重降低下降。與對照HiAb組相比，mAb CR8020的1、3、10和30mg/kg組中體重降低的平均差異分別是47. 44,79. 75,86. 71和80. 48g*天。所有差異均是統(tǒng)計學(xué)顯著的(ρ < 0. 001)。小鼠的中位數(shù)臨床得分在圖14C中示出。除了一或兩只外，每個組內(nèi)的所有動物在攻擊后第1天均示出臨床跡象(得分=1)。這可能與病毒攻擊不相關(guān)，因為該研究中的未攻擊組在第1天也示出相似作用(數(shù)據(jù)未示出)。在攻擊前1天用3、10或者30mg/kg mAb CR8020處理的小鼠中，在觀測期間所有小鼠均存活且無一動物示出任何臨床跡象(從感染后第2天至第21天)。在攻擊前1天用 lmg/kg mAb CR8020處理的小鼠示出100%存活率，但是8只小鼠中的8只示出臨床跡象， 達到最大臨床得分3分。這些結(jié)果示出本文鑒別和揭示的人抗-H3N2抗體CR8020 (CR8020)能提供針對體內(nèi)致死劑量流感病毒H7N7的異源亞型保護作用。當在感染前一天以:3mg/kg或更高劑量施用時，mAb CR8020在小鼠中能完全預(yù)防H7N7感染的臨床表現(xiàn)。在感染前一天以lmg/kg CR8020劑量施用時，所有小鼠在致死攻擊下均存活，在21天研究期間結(jié)束時觀測到體重降低和臨床跡象完全消失。進行另外研究以評估和對比mAb CR8020、CR8041和CR8043在H7N7小鼠模型中的預(yù)防效力。在小鼠致死性攻擊模型中，檢測mAb CR8020、CR8041和CR8043 (在PER. C6 細胞中產(chǎn)生)的預(yù)防效力，使用小鼠適應(yīng)的流感病毒A/Chicken/ Netherlands/621557/2003 (H7N7) ^ (Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, The Netherlands。簡而言之，使所有小鼠(Balb/c，雌性，6_8周齡，η = 8只/組)適應(yīng)環(huán)境并維持至少4天，之后開始實驗。在攻擊前一天在尾靜脈(vena coccygeus)靜脈內(nèi)給予 10、3或lmg/kg的mAbCR8020，假定小鼠平均體重為18g/小鼠，固定劑量體積0. 2mL。以相同方式給予30、10、3或者lmg/kg的mAb CR8041和CR8043。對照組給予30mg/kg陰性對照 mAb CR3014。在施用 mAb 后，在第 0 天用 25LD5(1 小鼠適應(yīng)的 A/CH/NL/621557/03 (H7N7)通過鼻內(nèi)接種攻擊小鼠。從攻擊前一天直至第21天研究結(jié)束，每日確定臨床跡象和體重。圖15示出了在預(yù)防性施用所述mAb之后小鼠的存活率、體重改變百分比以及臨床得分。如圖15A示出，在接受3或10mg/kg CR8020U0或30mg/kg CR8041以及接受30mg/ kg CR8043的組中觀測到100%存活率。在對照mAb組中，存活率為0%。預(yù)防性施用所有這三個劑量水平的CR8020以及所有4個劑量水平的CR8041與對照mAb組相比均提供了統(tǒng)計學(xué)顯著的存活時間改善(log-rank，ρ < 0. 002)。預(yù)防性施用lmg/kg的CR8043與對照 mAb組相比未導(dǎo)致存活時間統(tǒng)計學(xué)顯著改善(log-rank，ρ = 0. 692)。將CR8043劑量增加至:3mg/kg或更多導(dǎo)致與對照mAb組相比存活時間統(tǒng)計學(xué)顯著改善(log-rank，ρ ^ 0. 034)。在事后分析中，對比mAb CR8020、CR8041和CR8043最低劑量組的存活時間。預(yù)防性施用lmg/kg CR8020導(dǎo)致與施用lmg/kg的CR8041和lmg/kg的CR8043相比其存活時間統(tǒng)計學(xué)顯著改善(log-rank,分別為ρ = 0. 029和ρ < 0. 001)。此外，預(yù)防性施用Img/ kg CR8041導(dǎo)致當與施用lmg/kg CR8043相比時存活時間統(tǒng)計學(xué)顯著改善(log-rank，p = 0. 004)。圖15B示出在預(yù)防性施用所述mAb之后，在21天研究期間小鼠的平均體重改變。 在mAb CR8020和mAb CR8041的lmg/kg組中，觀測到與對照mAb組相當?shù)捏w重降低。在較高劑量mAb CR8020和CR8041組中，在21天研究期間體重降低有限或者不降低。在給予mAb CR8043的組中，在所有組都觀測到嚴重的體重降低，給予30mg/kg組的平均體重在第21天幾乎恢復(fù)到基線水平。用曲線下面積(AUC)分析更詳細地分析體重變化(表21)。在體重降低與抗體使用劑量之間存在明確的反比關(guān)系。當抗體濃度增加時，體重降低下降。使用 lmg/kg的CR8020與對照組相比體重降低無統(tǒng)計學(xué)顯著下降(p = 0. 356)。劑量增加至3 或10mg/kg導(dǎo)致與對照組相比體重降低統(tǒng)計學(xué)顯著下降(在兩種情況中均ρ < 0. 001)。使用lmg/kg的CR8041，與對照組相比體重降低無統(tǒng)計學(xué)顯著下降(p = 1)。劑量增加至3、10或者30mg/kg CR8041導(dǎo)致與對照組相比體重降低統(tǒng)計學(xué)顯著下降(在三種情況中均P < 0. 001)。使用1、3或者10mg/kg的CR8043與對照組相比體重降低無統(tǒng)計學(xué)顯著下降(分別為P = 0. 997,0. 510和0. 992)。劑量增加至30mg/kg導(dǎo)致與對照組相比體重降低統(tǒng)計學(xué)顯著下降(P < 0. 001)。在另外的體重變化數(shù)據(jù)平均AUC分析中，使用單變量方差分析對比mAb CR8020、CR8041和CR8043，模型中包含抗體和劑量作為固定因子。由于該研究中不包含30mg/kg的CR8020劑量，因此對比限于1、3和10mg/kg抗體劑量。通過使用多重比較Sidak調(diào)整邊際均數(shù)估計抗體之間的差異。在這三個抗體劑量中，用CR8020處理與CR8041和CR8043相比導(dǎo)致體重降低統(tǒng)計學(xué)顯著下降(邊際均數(shù)中平均差異分別為23. 73和68. 29g*day，p = 0. 013和ρ < 0. 001)。此外，用CR8041處理導(dǎo)致與CR8043相比體重降低統(tǒng)計學(xué)顯著下降(邊際均數(shù)中差異為44. 56g*day，ρ < 0. 001)。
小鼠的中位數(shù)臨床得分在圖15C中示出。除了在第0天有一只C3mg/kgCR8020組) 之外，所有小鼠在第0-3天均示出臨床跡象(得分=1，皮毛粗糙))。這個增加在適應(yīng)環(huán)境期間和攻擊前一天未觀測到。導(dǎo)致這個臨床得分增加的原因還未十分明確。在攻擊前一天用3或10mg/kg mAb CR8020處理組中，中位數(shù)臨床得分在攻擊后第9天恢復(fù)至0分；而在對照組中，中位數(shù)臨床得分在第8天為4分，所有小鼠在第9天均死亡或行安樂死。lmg/kg CR8020處理組示出在第4-13天中位數(shù)臨床得分為3分，在第15天恢復(fù)至0分。在攻擊前一天用3、10或30mg/kg mAb CR8041處理組中，中位數(shù)臨床得分分別在攻擊后第9、10或 12天恢復(fù)至0分。lmg/kg CR8041組在攻擊后第10天中位數(shù)臨床得分達到4分。在用1、 3或10mg/kg CR8043處理組中，中位數(shù)臨床得分分別在第9、9或12天達到4分；而30mg/ kg CR8043組的中位數(shù)臨床得分在第6-13天達到3分及在第14天恢復(fù)至0分。上述結(jié)果清晰示出人抗-H3N2抗體CR8020、CR8041和CR8043能提供針對體內(nèi)致死劑量流感病毒H7N7攻擊的異源亞型保護作用?；诖婊顣r間和體重改變事后分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)mAb CR8020在這三種mAb中最強力對抗小鼠適應(yīng)的流感病毒A/CH/ NL/621557/03(H7N7)。在感染前一天施用3或10mg/kg劑量的mAb CR8020，100 %的小鼠在致死攻擊下均存活且H7N7感染的臨床表現(xiàn)明顯降低。在感染前一天施用lmg/kg劑量的 CR8020，75%的小鼠在這個實驗中在致死攻擊下存活且存活小鼠的臨床跡象在21天研究期間的第15天完全消失。實施例17 人IgG單克隆抗體針對體內(nèi)致死性H7N7攻擊的治療活性進行這項研究以在H7N7模型中評估m(xù)Ab CR8020的治療效力和窗口。在小鼠致死攻擊模型中檢測mAb CR8020(在PER.C6 細胞中產(chǎn)生)的治療效力，使用小鼠適應(yīng)的胃 _ _ A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7) ^f _ (Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, The Netherlands)。簡而言之，使所有小鼠(Balb/c，雌性，6-8 周齡，η = 8只/組)適應(yīng)環(huán)境并維持至少4天，之后開始實驗。在攻擊前一天(第1組，預(yù)防性陽性對照)或者在攻擊后第1、2、3、4、5或6天(第2-7組)在尾靜脈(vena coccygeus) 靜脈內(nèi)給予15mg/kg的mAb CR8020，假定平均體重為18g/小鼠，固定劑量體積0. 2mL。第8 組在攻擊后第1天接受對照mAb CR3014(15mg/kg)。在第0天用25LD5(1小鼠適應(yīng)的A/CH/ NL/621557/03(H7N7)通過鼻內(nèi)接種攻擊小鼠。從攻擊前一天直至第21天研究結(jié)束，每日確定臨床跡象和體重。圖16A示出在靜脈內(nèi)施用mAb CR8020 (所有組15mg/kg)或者對照mAb (15mg/kg) 之后小鼠的存活率。當在攻擊前一天或者在攻擊后第1或3天施用15mg/kg mAb CR8020 時，所有動物在病毒攻擊下均存活，而在對照mAb組中小鼠存活率為0%。當在第2天和第 4天施用15mg/kg mAb CR8020時，觀測到分別為87. 5%和50%的存活率。這些組的存活時間與對照mAb組相比具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(分別為p = 0. 002和ρ = 0. 014)。在第5天和第6天15mg/kg CR8020處理組的存活率為0%，這些組中存活時間與對照mAb組相比無統(tǒng)計學(xué)顯著差異(分別為P = 0. 837和ρ = 0. 876)。圖16B示出在21天研究期間相對于第0天小鼠平均體重變化。通常，當在攻擊后較晚時間點施用mAb CR8020時，小鼠平均體重降低增加。然而，在第2天和第3天mAb CR8020處理組的平均體重曲線與第10天交叉，由于在第2天處理組中無存活小鼠所致。體重變化的曲線下面積分析示出在第-1天至第3天之間處理與在第4-6天處理相比平均體重降低的顯著轉(zhuǎn)變(表22)。用15mg/kg的CR8020在攻擊前1天或者在攻擊后第1、2或3 天處理導(dǎo)致與對照組相比體重降低的統(tǒng)計學(xué)顯著下降(四組均ρ <0.001)。在第4、5或6 天用15mg/kg的CR8020處理與對照組相比不導(dǎo)致體重降低的統(tǒng)計學(xué)顯著下降(分別為ρ =0. 566、ρ = 0. 979 和 ρ = 0. 858)。小鼠的中位數(shù)臨床得分在圖16C中示出。在攻擊前一天用15mg/kg CR8020處理的動物中，所有動物在觀測期間均存活且無一動物示出任何臨床跡象。在攻擊后第1天處理的動物示出100%存活率，然而8只動物中有7只示出臨床跡象，最大臨床得分1分。第 8只動物最大臨床得分達到3分。在攻擊后第2天處理的動物中，除了一只之外所有動物均存活。存活的動物(8只中的7只)示出臨床跡象，最大臨床得分1分(n = 4)或者3分(η =3)。在攻擊后第3天處理的動物示出100%存活，所有動物示出臨床跡象，最大臨床得分 3分。在攻擊后第4天處理的動物中，50%的動物在致死攻擊下存活。存活動物示出臨床跡象，最大臨床得分達到3分。在攻擊后第5或6天處理的動物未存活。使用GENMOD程序 (SAS)分析臨床得分以對于以小鼠作為對象的重復(fù)測量和在分類量表上測量的數(shù)據(jù)擬合模型(表23)。在攻擊前1天和攻擊后第1、2、3或4天用15mg/kg mAb CR8020處理組中，在大部分21天研究期間其中位數(shù)臨床得分與對照mAb組存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異(第8-21天， 四組均p< 0.038)。在攻擊后第5天用15mg/kg mAb CR8020處理組中，僅在第8天其中位數(shù)臨床得分與對照mAb組顯著不同(p ( 0. 001)。這種差異盡管具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，但不認為是相關(guān)的。在第6天15mg/kg mAb CR8020處理組的中位數(shù)臨床得分與對照組無統(tǒng)計學(xué)顯著差異。這項研究明確表明在致死性H7N7小鼠模型中，用15mg/kg的mAb CR8020治療當在直至攻擊后第3天施用時也提供87. 5-100%的保護作用。當在攻擊后第4天施用時，用 15mg/kg mAb CR8020治療提供部分保護作用。當在攻擊后第5或6天施用時，觀測到15mg/ kg mAb CR8020在致死性H7N7小鼠模型中無保護作用。換句話說，當在死亡之前4天或者更多天施用時，CR8020在這個致死性小鼠模型中提供保護作用。實施例18 有效中和來自系統(tǒng)發(fā)生類群1和2的多種流感病毒亞型的單克隆抗體的混合物每年的季節(jié)性流感疫苗由誘導(dǎo)針對甲型流感病毒毒株免疫性的兩種不同的制備物組成，一個代表循環(huán)Hl亞型，一個代表循環(huán)H3毒株。其根本原因在于Hl和H3亞型的流感病毒毒株太不相同，以至于從任一型中制備的疫苗均不誘導(dǎo)針對另一亞型的保護作用。 理想的是治療流感的廣泛保護性單克隆抗體制備物可有效抗來自兩個系統(tǒng)發(fā)生類群1 (Hl) 和2(H3)的流感病毒毒株。然而，再次由于HA分子之間的序列差異，難以發(fā)現(xiàn)這種單一抗體。例如，WO 2009/115972中描述的？&1^8抗體結(jié)合并中和Hl亞型優(yōu)于與H3亞型病毒，可能是由于類群1與類群2病毒之間的表位保守性與一個系統(tǒng)發(fā)生類群中的病毒相比較低。 為了實現(xiàn)一種產(chǎn)品可有效抗來自兩個系統(tǒng)發(fā)生類群的多種流感病毒亞型的目標，因此可將兩或多種不同抗體組合在一種混合物中。為了成功，這種制備物應(yīng)由彼此不相干擾的抗體組成。有效中和HI、H5和H9亞型病毒的抗體已經(jīng)在W02008/(^8946中描述，典型以 CR6261和CR6323為例。的結(jié)合區(qū)(表位)已經(jīng)詳細闡明，使用Hl或H5HA分子與 CR6261的共結(jié)晶闡明(也見PDB數(shù)據(jù)庫條目3GBM和3GBM，http //www. pdb. org和Ekiertet al.，2009)。為了研究本發(fā)明的單克隆抗體是否可以與先前描述的CR6261抗體組合使用，檢測所述抗體是否能結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生類群1和2的亞型。至此，如實施例7所述進行 ELISA和FACS結(jié)合試驗，使用Hl和H5亞型以及H3和H7亞型的HA分子及CR6^1、CR6323、 CR8001、CR8020、CR8041和CR8043進行。結(jié)果概括在表20中，示出廣泛中和系統(tǒng)發(fā)生類群 1的病毒的抗體不結(jié)合系統(tǒng)發(fā)生類群2的病毒，反之亦然。由于所述抗體不彼此干擾，預(yù)期所述抗體針對各個亞型的中和潛力得以保持，使得可以有效中和類群1和2的亞型。因此，一方面包含CR6261和/或CR6323及另一方面包含CR8020、CR8041和/或 CR8043的混合物對于至少Hl和H3亞型的病毒具有活性。因此，使用一種制備物有效防護系統(tǒng)發(fā)生類群1和2的流感病毒亞型是可能的。實施例19 結(jié)合分子的結(jié)合動力學(xué)使用Octet RED系統(tǒng)和來自R)rteBi0的鏈霉抗生物素蛋白生物傳感器測量CR8020和CR8043的木瓜蛋白酶裂解的Fab片段的親和性。將H3亞型A/ Wisconsin/67/2005 (Protein Science)禾口 A/Brisbane/10/2007 (Protein Science)、流感病毒血凝素抗原生物素?；怨潭ㄔ阪溍箍股锼氐鞍咨飩鞲衅?ForteBio)上。使用濃度范圍分別在2. 3-150nM和0. 16_30nM之間的CR8020和CR8043,在動力學(xué)緩沖液 (ForteBio, 18. 5032)中重復(fù)進行5次Fab結(jié)合實驗。在Octet上的親和性測量實驗設(shè)置如下將所述生物素酰化的血凝素固定至鏈霉抗生物素蛋白生物傳感器上1800秒，隨后結(jié)合系列稀釋的Fab CR8020和CR8043 1200秒，及隨后在動力學(xué)緩沖液中解離1800秒。結(jié)合數(shù)據(jù)使用Octet分析軟件使用1 1模型分析。H3亞型HA的結(jié)合分子的親和性常數(shù)(Kd-值)在表M中示出。表1 第一輪 Vkappa，Vlambda 和 VH 擴增
權(quán)利要求
1.一種分離的人結(jié)合分子，其能特異性識別及結(jié)合流感病毒血凝素蛋白(HA)中的表位，具有針對包含H3亞型的HA的流感病毒如H3N2的中和活性及至少具有針對包含H7亞型的HA的流感病毒和/或包含HlO亞型的HA的流感病毒的交叉中和活性。
2.權(quán)利要求1的分離的結(jié)合分子，其能特異性識別及結(jié)合流感病毒血凝素蛋白(HA)中的表位，具有針對包含H3亞型的HA的流感病毒如H3N2的中和活性，特征在于所述結(jié)合分子具有至少針對選自 A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/Panama/2007/99 和 A/Johannesburg/33/94的一或多種H3N2毒株的中和活性。
3.權(quán)利要求2的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子進一步具有針對H3N2毒株A/Hong Kong/1/68的中和活性。
4.權(quán)利要求2或3的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有針對在2010年1月20日之前已知的所有天然發(fā)生的流感病毒H3N2分離株的中和活性。
5.權(quán)利要求1-4任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子結(jié)合包含在H3HA蛋白的HA2多肽的第19、25、27、33和/或34位氨基酸的表位。
6.權(quán)利要求5的結(jié)合分子，其中當?shù)?9位的氨基酸是天冬氨酸(D)、第25位的氨基酸是谷氨酰胺(Q)、第27位的氨基酸是甘氨酸(G)、第33位的氨基酸是甘氨酸(G)和/或第 34位氨基酸是谷氨酰胺時，所述結(jié)合分子結(jié)合HA2上所述表位。
7.權(quán)利要求6的結(jié)合分子，其中當一或多個所述氨基酸改變時，所述結(jié)合分子不結(jié)合 HA2上所述表位。
8.權(quán)利要求1-7任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子能在體外阻止胰蛋白酶使H3HA 前體分子HAO裂解為HAl和HA2。
9.權(quán)利要求1-8任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子能阻止病毒膜與感染的細胞的內(nèi)體膜融合所需的H3HA蛋白的構(gòu)象改變。
10.權(quán)利要求1-9任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子不能結(jié)合及中和包含Hl亞型的HA的甲型流感病毒如Hmi。
11.權(quán)利要求1-10任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有針對至少一種包含H7亞型的HA的流感病毒和/或包含HlO亞型的HA的流感病毒的交叉中和活性。
12.權(quán)利要求1-11任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子具有針對系統(tǒng)發(fā)生類群2的所有流感病毒亞型的交叉中和活性。
13.權(quán)利要求1-12任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子選自下組a)包含SEQID NO 81所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 82所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 83所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；b)包含SEQID NO 87所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 88所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 89所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；c)包含SEQID NO 103所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :104所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 105所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；d)包含SEQID NO 109所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :110所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 111所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；e)包含SEQID NO :115所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :116所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 117所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；f)包含SEQID NO 121所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :122所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 123所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；g)包含SEQID NO 126所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :127所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 128所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；h)包含SEQID NO 132所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :133所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 134所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；i)包含SEQID NO 138所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :139所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 140所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；j)包含SEQ ID NO 144所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :145所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 146所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；k)包含SEQ ID NO 150所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :151所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 152所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；1)包含SEQ ID NO 156所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :157所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 158所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；m)包含SEQ ID NO :162所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :163所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 164所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；η)包含SEQ ID NO :168所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :169所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 170所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；ο)包含SEQ ID NO 173所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :174所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 175所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；以及P)包含SEQ ID NO 179所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :180所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 181所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子。
14.權(quán)利要求1-13任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子選自下組a)包含SEQID NO 81所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO 82所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 83所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；b)包含SEQID NO 109所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :110所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 111所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；c)包含SEQID NO 138所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :139所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 140所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；d)包含SEQID NO 144所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :145所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 146所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子；以及e)包含SEQID NO :173所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO :174所示重鏈CDR2區(qū)及SEQ ID NO 175所示重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子。
15.權(quán)利要求1-14任一項的結(jié)合分子，其中所述結(jié)合分子是人單克隆抗體。
16.權(quán)利要求1-15任一項的結(jié)合分子，其用作藥物。
17.權(quán)利要求1-16任一項的結(jié)合分子，其用作由包含H3亞型的HA的流感病毒如H3N2 所致流感病毒感染的診斷、治療和/或預(yù)防處理中的藥物。
18.權(quán)利要求1-17任一項的結(jié)合分子的功能變體，特征在于所述功能變體具有針對包含H3亞型的HA的流感病毒如H3N2的中和活性。
19.包含權(quán)利要求1-17任一項的結(jié)合分子或者權(quán)利要求18的功能變體的免疫綴合物， 所述免疫綴合物進一步包含至少一個標記。
20.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-17任一項的結(jié)合分子、和/或權(quán)利要求18的功能變體、和/或權(quán)利要求19的免疫綴合物以及藥物可接受的賦形劑。
21.權(quán)利要求1-17任一項的結(jié)合分子和/或權(quán)利要求18的功能變體和/或權(quán)利要求 19的免疫綴合物在制備用于流感病毒感染的診斷、預(yù)防和/或治療的藥物中的應(yīng)用。
22.權(quán)利要求21的應(yīng)用，特征在于所述流感病毒感染是由包含H3亞型H3的HA的流感病毒如H3N2引起的。
23.權(quán)利要求20的藥物組合物，其包含至少一種額外的結(jié)合分子。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，特征在于所述額外的結(jié)合分子能中和包含Hl和H5亞型的HA的流感病毒如Hmi和H5W或者其功能變體。
25.一種藥物組合物，其包含至少兩種流感病毒中和性結(jié)合分子，特征在于至少一種結(jié)合分子能中和系統(tǒng)發(fā)生類群1的一或多種流感病毒亞型以及至少一種結(jié)合分子能中和系統(tǒng)發(fā)生類群2的一或多種流感病毒亞型。
26.—種藥物組合物，其包含至少兩種流感病毒中和性結(jié)合分子，特征在于至少一種結(jié)合分子能中和包含Hl和/或H5亞型的HA的流感病毒，以及至少一種結(jié)合分子能中和包含 H3、H7和/或HlO亞型的HA的流感病毒。
27.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-17任一項的結(jié)合分子或者權(quán)利要求18的功能變體。
28.—種載體，其包含至少一種權(quán)利要求27的核酸分子。
29.一種宿主，其包含至少一種權(quán)利要求觀的載體。
30.權(quán)利要求四的宿主，其中所述宿主是人細胞。
31.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1-17任一項的結(jié)合分子或者權(quán)利要求18的功能變體的方法，其中所述方法包括步驟a)在有助于所述結(jié)合分子或者功能變體表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求四或30的宿主， 及任選地b)回收所述表達的結(jié)合分子或者功能變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及結(jié)合分子，如人單克隆抗體，其結(jié)合包含H3亞型的HA的流感病毒，如H3N2，且具有針對這種流感病毒的廣泛中和活性。本發(fā)明提供了編碼所述抗體的核酸分子、其序列及包含所述抗體的組合物，以及鑒別或者產(chǎn)生所述抗體的方法。所述抗體可用于診斷、預(yù)防和/或治療流感病毒H3N2感染。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體提供了交叉-亞型保護作用，由此基于H3、H7和/或H10的流感亞型的感染得以預(yù)防和/或治療。
文檔編號C07K16/10GK102448986SQ201080021000
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月11日
發(fā)明者M·A·C·容格尼倫, M·思羅斯比, R·H·E·弗里森, T·H·J·克瓦克斯 申請人:克魯塞爾荷蘭公司