專利名稱：編碼mlo蛋白質(zhì)并賦予植物抗真菌抗性的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了所編碼蛋白質(zhì)控制植物對真菌疾病的抗性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及抗真菌疾病的植物以及抗真菌疾病的植物的制備方法。
真菌疾病在美國每年造成農(nóng)作物損失約91億美元，它們由多種生物學上差異很大的病原體引起。傳統(tǒng)上已用不同的方法來控制它們?，F(xiàn)已培育出農(nóng)業(yè)上重要的抗性品種，從而提供了抗小范圍或較大范圍病原體分離物或品種的多水平抗性。不過，這項工作包括通過遺傳雜交將所需性狀引入商品化株系的長期辛苦的過程，且由于害蟲可能進化成可克服天然植物抗性的風險，需要持續(xù)努力將新的抗性性狀引入商品化品系中。此外，已通過應(yīng)用化學殺真菌劑控制真菌疾病。這種方法通常產(chǎn)生有效的控制作用，但也與可能產(chǎn)生的抗性病原體相關(guān)，并可能對環(huán)境產(chǎn)生負面影響。而且，在某些農(nóng)作物，諸如大麥和小麥中，用化學殺真菌劑控制真菌病原體是困難或不切實際的。目前的技術(shù)已能更好地在分子水平上理解植物及其病原體之間的相互作用，且已部分揭示了抗性機制。已對模型植物擬南芥進行了該分子鑒定的大部分工作，現(xiàn)已開始闡明重要經(jīng)濟農(nóng)作物中的抗性機制。
白粉病是影響大部分植物種類的主要疾病且已被廣泛研究。它們的特征在于植物組織上生長的白色至淺灰色斑點或片狀物，相應(yīng)于真菌的菌絲體和閉囊殼。白粉病是由白粉菌目(Erysiphales)的數(shù)種真菌引起的。例如，禾白粉菌(Erysiphe graminis)引起谷類和草的白粉病。雖然白粉病在大部分農(nóng)作物中難于控制，卻有一些抗多數(shù)已知病原體分離菌的大麥品系。研究工作已顯示，單位點即mlo位點的突變與抗性表型有關(guān)。Mlo抗性機制已部分闡明；包括在與病原體的接觸位點形成被稱為乳突的大細胞壁外加體(apposition)，其中主要包含胼胝質(zhì)，但也有碳水化合物、酚和蛋白質(zhì)。在mlo植物中，細胞壁外加體阻止了病原體的侵入，因而產(chǎn)生了抗性。
不幸的是，此控制白粉病的有力工具只局限于針對大麥。由農(nóng)業(yè)中真菌疾病，尤其是白粉病引起的問題看來，依然需要新的有效方法以控制其它農(nóng)作物中的這些類型病原體，這些方法在經(jīng)濟上對農(nóng)場主有吸引力且在環(huán)境上可接受。
本發(fā)明提出了對通過遺傳工程技術(shù)的新型植物疾病控制方法的需求。更具體地說，本發(fā)明涉及控制白粉病的方法，優(yōu)選是控制經(jīng)濟上重要的農(nóng)作物中的白粉病的方法。
本發(fā)明涉及編碼Mlo蛋白質(zhì)的分離DNA分子，其中所說的Mlo蛋白質(zhì)賦予植物抗真菌病原體的抗性。更具體地說，本發(fā)明涉及含本發(fā)明發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)的保守氨基酸序列的Mlo蛋白質(zhì)，并涉及編碼該Mlo蛋白質(zhì)的分離DNA分子。本發(fā)明還描述了用于在植物中表達本發(fā)明DNA分子的載體。本發(fā)明進一步涉及包含本發(fā)明任一種DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明也描述了具改善植物檢疫特性的農(nóng)產(chǎn)品，其中包括通過本發(fā)明任一種DNA分子的表達而抗真菌病原體的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還進一步涉及制備抗真菌疾病的植物的方法，該方法是通過改變由相應(yīng)于本發(fā)明任一種DNA分子之內(nèi)源基因拷貝編碼的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物中的表達，或通過改變由相應(yīng)于本發(fā)明任一種DNA分子之內(nèi)源基因拷貝編碼的蛋白質(zhì)的活性或穩(wěn)定性而進行的。這樣的轉(zhuǎn)基因植物如預期地能抗感染植物活表皮細胞的病原體，尤其是來自白粉菌目的真菌(還已知為白粉菌)，優(yōu)選抗引發(fā)白粉病的白粉菌屬(Erysiphe)真菌，更優(yōu)選抗禾白粉菌的植物。本發(fā)明進一步描述了分離所編碼蛋白質(zhì)具有與本發(fā)明DNA分子編碼蛋白質(zhì)相同或相似功能和編碼本發(fā)明所列保守氨基酸序列的DNA分子的方法。
本發(fā)明因而提供了控制重要經(jīng)濟農(nóng)作物中真菌疾病的新的有效方法，從而有可能減少用于農(nóng)作物的化學藥品量并降低對控制劑有抗性的病原體出現(xiàn)的危險。
因而本發(fā)明提供了編碼賦予植物對真菌病原體的抗性之Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子，其中所說的蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所列氨基酸序列相同或基本相似的至少一個氨基酸序列，其中所說的DNA分子優(yōu)選是cDNA分子。在優(yōu)選的實施方案中，DNA分子優(yōu)選不來自大麥而來自雙子葉植物或以下植物小麥、玉米、稻、燕麥、黑麥、高粱、甘蔗、小米、買羅高粱(milo)和棕櫚科。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的DNA分子與SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所列的任一種核苷酸序列相同或基本相似，或者編碼與SEQ ID NO4、SEQID NO6或SEQ ID NO8中所列Mlo蛋白質(zhì)相同或基本相似的Mlo蛋白質(zhì)。在更優(yōu)選的實施方案中，包含SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所列核苷酸序列的DNA分子來自小麥。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的DNA分子與SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或SEQ ID NO17中所列的任一種核苷酸序列相同或基本相似，或者編碼與SEQ ID NO10、SEQID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ ID NO18中所列任一種核苷酸序列編碼的Mlo蛋白質(zhì)相同或基本相似的Mlo蛋白質(zhì)。在更優(yōu)選的實施方案中，包含SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ IDNO13、SEQ ID NO15或SEQ ID NO17中所列核苷酸序列的DNA分子來自擬南芥。在另一優(yōu)選實施方案中，前文所提及的DNA分子被修飾以致內(nèi)源蛋白質(zhì)的活性喪失。在本發(fā)明的特殊實施方案中，所說的DNA修飾導致相應(yīng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列中發(fā)生以下改變中的一種、全部或多種改變的組合-色氨酸(163)改變?yōu)榫彼?脯氨酸(396)后移碼-色氨酸(160)后移碼-甲硫氨酸(1)改變?yōu)楫惲涟彼?甘氨酸(227)改變?yōu)樘於彼?甲硫氨酸(1)改變?yōu)槔i氨酸-精氨酸(11)改變?yōu)樯彼?丟失苯丙氨酸(183)、蘇氨酸(184)
-纈氨酸(31)改變?yōu)楣劝彼?絲氨酸(32)改變?yōu)楸奖彼?亮氨酸(271)改變?yōu)榻M氨酸。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，真菌病原體優(yōu)選感染活表皮細胞，更優(yōu)選真菌病原體來自白粉菌目(還已知為白粉菌)，尤其是來自白粉菌屬，最優(yōu)選真菌病原體是禾白粉菌。
在另外的實施方案中，分離的DNA分子是與上述分離分子反義的分子，如與編碼包含和SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所列氨基酸序列相同或基本相似的至少一種氨基酸序列的Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子，如cDNA分子反義的分子，尤其是與和SEQ ID NO3、5、7、9、11、13、15或17中所示DNA分子相同或基本相似、且所編碼Mlo蛋白質(zhì)與SEQ ID NO4、6、8、10、12、14、16或18所列Mlo蛋白質(zhì)相同或基本相似的DNA分子反義的DNA分子。
本發(fā)明進一步提供了至少包含一種與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所列氨基酸序列相同或基本相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)是Mlo蛋白質(zhì)且賦予植物對真菌病原體的抗性。該蛋白質(zhì)優(yōu)選不來自大麥，而是來自雙子葉植物或以下植物小麥、玉米、稻、燕麥、黑麥、高粱、甘蔗、小米、買羅高粱和棕櫚科。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所列的任一種核苷酸序列相同或基本相似的核苷酸序列編碼，或者與SEQID NO4、SEQ ID NO6或SEQ ID NO8中所列任一種Mlo蛋白質(zhì)相同或基本相似。在更優(yōu)選的實施方案中，所說的蛋白質(zhì)來自小麥。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO9、SEQ IDNO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或SEQ ID NO17中所列的任一種核苷酸序列相同或基本相似的核苷酸序列編碼，或者與SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ IDNO18中所列任一種Mlo蛋白質(zhì)相同或基本相似。在更優(yōu)選的實施方案中，該蛋白質(zhì)來自擬南芥。在另一優(yōu)選的實施方案中，優(yōu)選真菌病原體感染活表皮細胞，更優(yōu)選真菌病原體來自白粉菌目(還已知為白粉菌)，尤其是來自白粉菌屬，最優(yōu)選真菌病原體是禾白粉菌。在進一步的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明還包括由上述任一種DNA分子編碼的蛋白質(zhì)的突變形式或截短形式。
本發(fā)明進一步提供了含上述任一種DNA分子，如上述cDN A的表達盒，其中所說的DNA分子與啟動子和能在植物中表達該DNA分子的終止信號有效連接。在優(yōu)選的實施方案中，所說的表達盒是異源的。在更優(yōu)選的實施方案中，啟動子和終止信號是真核生物的。在更優(yōu)選的實施方案中，啟動子和終止信號相對于編碼區(qū)而言是異源的。
本發(fā)明還提供了含上述任一種表達盒的載體。在優(yōu)選的實施方案中，該載體用于植物中所說表達盒的轉(zhuǎn)化。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明載體用于任一種上述DNA分子的擴增。
本發(fā)明還提供了包括含本發(fā)明分離DNA分子之表達盒或其部分的細胞，其中所說表達盒內(nèi)的該DNA分子在所說細胞內(nèi)是可表達的。在優(yōu)選的實施方案中，DNA分子不來自大麥。在另一優(yōu)選實施方案中，該細胞是植物細胞。在更優(yōu)選的實施方案中，該表達盒穩(wěn)定整合入該細胞的基因組中，或包含在自主復制載體內(nèi)并作為染色體外分子保留在細胞中。
本發(fā)明進一步提供了包含具有本發(fā)明分離DNA分子之表達盒或其部分的植物。在優(yōu)選的實施方案中，該DNA分子不來自大麥。在另一優(yōu)選實施方案中，表達盒內(nèi)所含的DNA分子在植物中是可表達的。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述DNA分子穩(wěn)定整合入植物基因組中，或包含在自我復制載體內(nèi)并作為染色體外分子保留在細胞中。在另一優(yōu)選的實施方案中，植物可抗真菌病原體，優(yōu)選感染活表皮細胞的真菌病原體，更優(yōu)選真菌病原體來自白粉菌目(還已知為白粉菌)，尤其是來自白粉菌屬，最優(yōu)選真菌病原體是禾白粉菌。
本發(fā)明還涉及所說植物的種子，其中種子任選地已被處理(如接觸過抗原的或被包被的)和／或包裝，如放置于袋內(nèi)并附有使用說明。
本發(fā)明還提供了包括含本發(fā)明分離DNA分子之植物的農(nóng)產(chǎn)品。在優(yōu)選的實施方案中，所說的農(nóng)產(chǎn)品用做如飼料、食品或青貯飼料，其中不含真菌病原體產(chǎn)生的真菌毒素，如黃曲霉毒素。因此，所說的農(nóng)產(chǎn)品具有改善的植物檢疫特性。
本發(fā)明進一步提供了制備對真菌病原體有抗性的植物的方法，包括以下步驟a)在植物中以“有義”方向表達由上述任一種DNA分子編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物；或b)在植物中以“反義”方向表達由上述任一種DNA分子編碼的RNA轉(zhuǎn)錄物；或c)在植物中表達能特異切割由相應(yīng)于任一種上述DNA分子之內(nèi)源基因編碼的信使RNA轉(zhuǎn)錄物的核酶；或d)在植物中表達特異于相應(yīng)于任一種上述DNA分子之基因所編碼的內(nèi)源蛋白質(zhì)的aptamer；或e)在植物中表達上述任一種DNA分子的突變或截短形式，從而使其能成為顯性失活突變體；或f)在植物中通過同源重組修飾相應(yīng)于上述任一種DNA分子的基因的至少一個染色體拷貝；或g)在植物中通過同源重組修飾相應(yīng)于上述任一種DNA分子的基因的調(diào)節(jié)元件至少一個染色體拷貝。
本發(fā)明進一步提供了通過上述任一種方法獲得的植物，包括所說植物的種子，其中種子任選地已被處理(如接觸過抗原的或被包被的)和／或包裝，如放置于袋內(nèi)并附有使用說明。在另一優(yōu)選的實施方案中，所獲植物可抗真菌病原體，優(yōu)選為感染活表皮細胞的真菌病原體，更優(yōu)選真菌病原體來自白粉菌目(還已知為白粉菌)，尤其是來自白粉菌屬，最優(yōu)選真菌病原體是禾白粉菌。
本發(fā)明還提供了用上述任一種方法獲得的具改善的植物檢疫特性的農(nóng)產(chǎn)品。
本發(fā)明進一步提供了分離編碼Mlo蛋白質(zhì)之DNA分子的方法，包括以下步驟a)將編碼SEQ ID NO1中至少6個氨基酸的簡并寡核苷酸和互補于編碼SEQ ID NO2中至少6個氨基酸之序列的簡并寡核苷酸與提取自植物的DNA，在允許所說簡并寡核苷酸與所述DNA雜交的條件下混合；b)擴增所說植物DNA的DNA片段，其中所說的DNA片段在其左和右末端處含可與步驟a)中所說簡并寡核苷酸退火的核苷酸序列；和c)獲得含步驟b)之DNA片段的全長cDNA克隆。
本發(fā)明還提供了通過“體外重組”或“DNA重排”生產(chǎn)本發(fā)明核苷酸序列的突變拷貝的方法。本發(fā)明核苷酸序列的突變拷貝可用于賦與更高的真菌病原體抗性。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明核苷酸序列的突變拷貝用于使植物抵抗更寬范圍的病原體。這樣的一種方法描述如下誘變本發(fā)明DNA分子的方法，其中所說的DNA分子已被切割成預期大小的雙鏈隨機片段，該方法包括以下步驟a)向所得雙鏈隨機片段群中添加一或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中所說寡核苷酸包含與雙鏈模板多核苷酸相同的區(qū)域和異源的區(qū)域；b)將所得雙鏈隨機片段和寡核苷酸的混合物變性成單鏈片段；c)在導致所說的單鏈片段在所說的相同區(qū)域退火而形成退火片段配對的條件下，將所得單鏈片段群與聚合酶保溫，其中所說的相同區(qū)域足以使配對中的一成員引發(fā)另一成員的復制，從而形成經(jīng)誘變的雙鏈多核苷酸；并d)再重復第二和第三步驟至少兩個循環(huán)，其中下一循環(huán)中的第二步驟產(chǎn)生的混合物包括來自前一循環(huán)第三步驟的經(jīng)誘變雙鏈多核苷酸，并且該下一循環(huán)形成了進一步誘變的雙鏈多核苷酸。
定義“分離DNA分子”是因人工操作而存在于其天然環(huán)境之外、因此非天然產(chǎn)物的核苷酸序列。分離核苷酸序列可以純化形式存在，或存在于如轉(zhuǎn)基因宿主細胞之類的非天然環(huán)境中。
本文限定的“蛋白質(zhì)”是由相應(yīng)核苷酸序列編碼的完整蛋白質(zhì)，或由核苷酸序列的相應(yīng)部分編碼的蛋白質(zhì)部分。
“分離蛋白質(zhì)”是由分離核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，因而非天然產(chǎn)物。分離蛋白質(zhì)可以純化形式存在，或存在于非天然環(huán)境中，如轉(zhuǎn)基因宿主細胞中，其中所說的蛋白質(zhì)在等基因的非轉(zhuǎn)基因宿主細胞中通常不表達或者以不同的形式或不同的量表達。
“抗真菌病原體”的植物通過抑制或限制真菌病原體在植物上生長的能力而無或較少有由該真菌引起的真菌感染癥狀。結(jié)果植物生長得更好，具有較高的產(chǎn)量且產(chǎn)生更多的種子。
“賦予植物對真菌病原體的抗性的蛋白質(zhì)”表示蛋白質(zhì)涉及負責植物對真菌病原體的抗性的植物遺傳途徑的調(diào)控。該蛋白質(zhì)在其中可以是正調(diào)節(jié)物，可增強植物對真菌病原體的抗性，或者該蛋白質(zhì)在其中可以是負調(diào)節(jié)物，可抑制植物對真菌病原體的抗性。賦予植物對真菌病原體的抗性的蛋白質(zhì)一個特例是Mlo蛋白質(zhì)。
本文的“Mlo蛋白質(zhì)”指在疾病抗性途徑中具基本相似功能并有一些結(jié)構(gòu)同源性的蛋白質(zhì)家族(Mlo家族)成員。結(jié)構(gòu)同源性可以是，如，該家族成員具有至少一個保守區(qū)。
在最廣的意義上說，術(shù)語“基本相似”在此用于核苷酸序列時，表示與參照核苷酸序列相當?shù)暮塑账嵝蛄校渲性撓喈數(shù)男蛄芯幋a與參照核苷酸序列編碼的多肽具基本相同的結(jié)構(gòu)和功能的多肽，如，只在不影響多肽功能的氨基酸處發(fā)生了改變。優(yōu)選基本相似的核苷酸序列編碼由參照核苷酸序列編碼的多肽?；鞠嗨频暮塑账嵝蛄信c參照核苷酸序列之間的相同性百分率至少是80％，較好是至少85％，優(yōu)選至少是90％，更優(yōu)選至少為95％，還更優(yōu)選至少為99％。
術(shù)語“基本相似”在此用于蛋白質(zhì)時，表示與參照蛋白質(zhì)相當?shù)牡鞍踪|(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有與參照蛋白質(zhì)基本相同的結(jié)構(gòu)和功能，如，只在不影響多肽功能的氨基酸處發(fā)生了改變。當用于蛋白質(zhì)或氨基酸序列時，基本相似的蛋白質(zhì)或氨基酸序列與參照蛋白質(zhì)或氨基酸序列之間的相同性百分率至少是80％，較好是至少85％，優(yōu)選至少是90％，更優(yōu)選至少為95％，還更優(yōu)選至少為99％。
用基于動力學編程算法的計算機軟件確定序列相同性的百分率。在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的計算機軟件包括BLAST(基本的局部序列對比檢索工具)檢索軟件，它被設(shè)計成不管待查詢的是蛋白質(zhì)或DNA均可檢索所有可獲得的序列數(shù)據(jù)庫。此檢索工具的BLAST 2．0版本(缺刻BLAST)已公開于互聯(lián)網(wǎng)上(目前是http∥www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／)。其中使用采用局部序列對比而非完整序列對比的漸進式算法，因而能探測只共有分離區(qū)域的序列間的關(guān)系。BLAST檢索中指定的分值具有明確的統(tǒng)計學解釋。所說的軟件優(yōu)選用設(shè)定為默認值的任選參數(shù)運行。
術(shù)語“基因”指編碼序列和相關(guān)調(diào)節(jié)序列，其中編碼序列被轉(zhuǎn)錄成RNA，如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA。調(diào)節(jié)序列的例子是啟動子序列、5’和3’非翻譯序列和終止序列。另外可存在的元件是，例如內(nèi)含子。
“表達”指植物中內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和／或翻譯。例如，在反義構(gòu)建體情形下，表達可只指反義DNA的轉(zhuǎn)錄。
“表達盒”用于此處表示能指導特殊核苷酸序列在適當宿主細胞中表達的DNA序列，包含與該目的核苷酸序列有效連接的啟動子，該目的核苷酸序列還與終止信號有效連接。其中通常還包含核苷酸序列正確翻譯所要求的序列。編碼區(qū)通常編碼目的蛋白質(zhì)，但也可編碼有功能的目的RNA，例如反義RNA或在有義或反義方向抑制特殊基因表達的非翻譯RNA，如反義RNA。含目的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，意思是其中至少一種組分與其另一種組分異源。表達盒也可是天然存在的，但已按對異源表達有用的重組形式獲得的表達盒。不過，一般地說，表達盒與宿主是異源的，即表達盒內(nèi)的特殊DNA序列不是天然存在于宿主細胞中的，必須用轉(zhuǎn)化方式引入宿主細胞或宿主細胞前體。表達盒中核苷酸序列的表達可在組成型啟動子或只有當宿主細胞暴露于某些特殊外部刺激時才引發(fā)轉(zhuǎn)錄的誘導型啟動子控制下。在多細胞生物體，如植物的情況下，啟動子還可以是特殊組織或器官或發(fā)育階段特異性的。
此處所用“異源的”表示“不同的天然或合成來源”或代表非天然狀態(tài)。例如，如果用來自另一生物體，尤其是另一物種的核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞，則該基因與宿主細胞異源，還與帶此基因的宿主細胞后代異源。轉(zhuǎn)化的核酸可包含異源啟動子、異源編碼序列或異源終止序列?；蛘撸D(zhuǎn)化核酸可以是完全異源的，或可包含任何可能的異源和內(nèi)源核酸序列組合。同樣地，異源也指來自同一天然原始細胞類型并插入其中，但以非天然狀態(tài)出現(xiàn)的核酸序列，如不同的拷貝數(shù)，或在不同調(diào)節(jié)元件的控制下。
術(shù)語“啟動子”指可起始相關(guān)DNA序列轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子區(qū)域還包含可作為諸如激活子、增強子和／或阻抑物之類基因表達調(diào)節(jié)物的元件。
“合成的核苷酸序列”用于此處表示含有天然序列中不存在的結(jié)構(gòu)特征的核苷酸序列。例如，更近似于雙子葉植物和／或單子葉植物基因的G+C含量和正常密碼子分布的人工序列就稱作合成的。
如果兩序列所處的位置使得DNA調(diào)節(jié)序列影響DNA編碼序列的表達，即稱調(diào)節(jié)DNA序列與編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列“有效連接”或“相關(guān)”。
“調(diào)節(jié)元件”指涉及核苷酸序列表達的序列。調(diào)節(jié)元件含與目的核苷酸序列有效連接的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列正確翻譯需要的序列。
“植物”指任何植物或植物的一部分，尤其是任何發(fā)育階段的種子植物。其中還包括插條、細胞或組織培養(yǎng)物和種子。當用于本發(fā)明時，術(shù)語“植物組織”包括但不局限于整株植物、植物器官、植物種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、細胞培養(yǎng)物以及組織成結(jié)構(gòu)和／或功能單元的任何植物細胞群。
“植物細胞”指植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，包含原生質(zhì)體和細胞壁。植物細胞可以是分離的單個細胞或人工培養(yǎng)細胞的形式，或作為如植物組織或植物器官之類較高級組織單元的一部分。
“轉(zhuǎn)化”用于此處表示將核酸引入細胞內(nèi)。尤其是，將DNA分子穩(wěn)定整合入目的生物體的基因組。
“選擇標記”是由在植物細胞中的表達帶給細胞選擇優(yōu)勢的基因。與非轉(zhuǎn)化細胞的生長相比，用選擇標記基因轉(zhuǎn)化的細胞具有的選擇優(yōu)勢可能是由于它們在負選擇劑(如抗生素或除草劑)存在時生長的能力。與非轉(zhuǎn)化細胞相比，轉(zhuǎn)化細胞具有的選擇優(yōu)勢還可能是由于它們具有利用所添加的化合物作為營養(yǎng)物、生長因子或能量來源的增強的或新的能力。選擇標記基因還指在植物細胞中的表達帶給細胞正和負選擇優(yōu)勢的基因或基因組合。
“篩選標記”是由其表達未帶給轉(zhuǎn)化細胞選擇優(yōu)勢，但使轉(zhuǎn)化細胞的表型與未轉(zhuǎn)化細胞截然不同的基因賦予的。
序列表中的序列簡述SEQ ID NO1 保守氨基酸序列1SEQ ID NO2 保守氨基酸序列2SEQ ID NO3 小麥Mlo蛋白質(zhì)TrMlo1的核苷酸序列SEQ ID NO4 TrMlo1的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO5 小麥Mlo蛋白質(zhì)TrMlo2的核苷酸序列SEQ ID NO6 TrMlo2的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO7 小麥Mlo蛋白質(zhì)TrMlo3的核苷酸序列SEQ ID NO8 TrMlo3的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO9 擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)CIB10259的核苷酸序列
SEQ ID NO10 CIB10259的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO11 擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)CIB10295的核苷酸序列SEQ ID NO12 CIB10295的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO13 擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)CIB10296的核苷酸序列SEQ ID NO14 CIB10296的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO15 擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)F19850的核苷酸序列SEQ ID NO16 F19850的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO17 擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)U95973的核苷酸序列SEQ ID NO18 U95973的蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO19 寡核苷酸MLO-1SEQ ID NO20 寡核苷酸MLO-3SEQ ID NO21 寡核苷酸MLO-5SEQ ID NO22 寡核苷酸MLO-7SEQ ID NO23 寡核苷酸MLO-10SEQ ID NO24 寡核苷酸MLO-15SEQ ID NO25 寡核苷酸MLO-26SEQ ID NO26 寡核苷酸MLO-GSP1SEQ ID NO27 寡核苷酸MLO-GSP2SEQ ID NO28 寡核苷酸ST27SEQ ID NO29 寡核苷酸N37544-1SEQ ID NO30 寡核苷酸N37544-2SEQ ID NO31 寡核苷酸T22146-1SEQ ID NO32 寡核苷酸T22146-2SEQ ID NO33 寡核苷酸H76041-1SEQ ID NO34 寡核苷酸H76041-2SEQ ID NO35 寡核苷酸SAS-1SEQ ID NO36 寡核苷酸SAS-2SEQ ID NO37 寡核苷酸SAS-3SEQ ID NO38 寡核苷酸SAS-4
SEQ ID NO39 寡核苷酸SAS-5SEQ ID NO40 寡核苷酸SAS-6SEQ ID NO41 寡核苷酸SAS-7SEQ ID NO42 寡核苷酸SAS-8保藏菌種 所有的保藏菌種均保藏在北方地區(qū)研究中心，1815 NorthernUniversity Street，Peoria，Illinois 61604，USA。
本發(fā)明涉及編碼Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子，它們賦予植物對真菌病原體的抗性。本發(fā)明的發(fā)明者首次鑒定了Mlo蛋白質(zhì)中的保守氨基酸序列。本發(fā)明的保守氨基酸序列在來自小麥的三種Mlo蛋白質(zhì)和來自擬南芥的三種Mlo蛋白質(zhì)之間是保守的。在兩種推測的擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)中這些氨基酸序列也是保守的。SEQ ID NO1中所列的第一個保守氨基酸序列包括13個氨基酸。SEQ ID NO1中的第四個氨基酸是L、V或I，第五個氨基酸是V或L，而第七個氨基酸是F或L。SEQ ID NO1中的第十三個氨基酸不是I，而優(yōu)選為T、S或A。SEQID NO2中所列的第二個保守氨基酸序列包括14個氨基酸。SEQ IDNO2中的第一個氨基酸不是M而優(yōu)選為I、V、S或G。它的第三個氨基酸是F、L或V，它的第六個氨基酸是Y或N，它的第七個氨基酸是A或V，它的第八個氨基酸是L或I，它的第十個氨基酸是T或S。本發(fā)明包括含至少一種上述保守氨基酸序列的分離Mlo蛋白質(zhì)和編碼該Mlo蛋白質(zhì)的分離DNA分子。本發(fā)明還包括含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中所列保守序列的分離Mlo蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明Mlo蛋白質(zhì)的分離DNA分子是cDNA分子。
在另一實施方案中，編碼含至少一種所述保守氨基酸序列的Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子不是來自大麥的。在另一實施方案中，所說的DNA分子來自雙子葉植物或來自小麥、玉米、稻、燕麥、黑麥、高粱、甘蔗、小米、買羅高粱或棕櫚科。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的DNA分子與SEQ ID NO3、5或7或者SEQ ID NO9、11、13、15或17中所列DNA分子相同或基本相似，或編碼與SEQ ID NO4、6或8或者SEQ ID NO10、12、14、16、18中所列的任一種Mlo蛋白質(zhì)相同或基本相似的Mlo蛋白質(zhì)。SEQ ID NO3、5或7中所列的DNA分子來自小麥，分別編碼SEQ ID NO4、6或8中所列的Mlo蛋白質(zhì)。這種DNA分子的分離進一步描述于實施例1中。SEQ ID NO9、11、13、15或17中所列的DNA分子來自擬南芥屬，分別編碼SEQ IDNO10、12、14、16或18中所列的Mlo蛋白質(zhì)。這種DNA分子的分離進一步描述于實施例2中。
SEQ ID NO3的編碼被稱為TrMlo 1之小麥Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子以TrMlo 1和TrMlo 1-5株系保藏，接收號分別為NRRL B-21948和NRRL B-21949。SEQ ID NO5的編碼被稱為TrMlo 2之小麥Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子以TrMlo 2和TrMlo 2-5株系保藏，接收號分別為NRRL B-21950和NRRL B-21951。SEQ ID NO7的編碼被稱為TrMlo3之小麥Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子以TrMlo 3和TrMlo 3-5株系保藏，接收號分別為NRRL B-21952和NRRL B-21953。TrMlo1和TrMlo3包含相應(yīng)Mlo基因的全長cDNA，還包含相應(yīng)5’和3’非翻譯區(qū)的一部分。TrMlo2是被修復的相應(yīng)基因的最長cDNA克隆。它包含整個編碼區(qū)，只是缺少與TrMlo1和TrMlo3比較推斷出的第一個甲硫氨酸(起始密碼子)。TrMlo2還包含相應(yīng)基因3’非翻譯區(qū)的一部分。
SEQ ID NO9的編碼被稱為CIB10259之擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子以pCIB 10259株保藏，接收號為NRRL B-21945。SEQ IDNO11的編碼被稱為CIB10295之擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子以pCIB 10295株保藏，接收號為NRRL B-21946。SEQ ID NO13的編碼被稱為CIB10296之擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子以pCIB10296株保藏，接收號為NRRL B-21947。CIB10259、CIB10295和CIB10296包含相應(yīng)Mlo基因的全長cDNA，還包含相應(yīng)5’和3’非翻譯區(qū)的一部分。編碼擬南芥屬Mlo蛋白質(zhì)家族成員F19850和U95973的核苷酸序列是從Gembank中獲得的。不過，對于這兩個克隆均測定了預計的氨基酸序列并發(fā)現(xiàn)它與Gembank中預計的氨基酸序列不相匹配。因此本發(fā)明的發(fā)明者測定的Mlo蛋白質(zhì)是新的且非顯而易見的。兩種新預計蛋白質(zhì)均包含SEQ ID NO1和2中所列的保守氨基酸，因此它們及編碼它們的分離cDNA均包括于本發(fā)明中。
本發(fā)明DNA分子編碼的Mlo蛋白質(zhì)賦予植物對真菌病原體的抗性，優(yōu)選可感染活的植物表皮細胞的真菌病原體，更優(yōu)選真菌病原體來自白粉菌目(也已知為白粉菌)(Agrios G．(1988)植物病理學，第三版，Academic Press Inc．，尤其是在第271頁)。優(yōu)選地，本發(fā)明DNA分子編碼的Mlo蛋白質(zhì)賦予植物對來自白粉菌屬的病原體的抗性，更優(yōu)選真菌病原體是禾白粉菌。
本發(fā)明還包括含本發(fā)明任一種DNA分子的重組載體。在這些載體中，所說DNA分子優(yōu)選包含于表達盒中，該表達盒含有在能表達所說DNA分子的宿主細胞中用于表達該DNA分子的表達元件。所說的調(diào)節(jié)元件通常是啟動子和終止信號，還優(yōu)選包括允許由本發(fā)明DNA分子編碼的蛋白質(zhì)有效翻譯的元件。在優(yōu)選的實施方案中，表達盒是異源的。所說的載體用于將含本發(fā)明任一種DNA分子的表達盒轉(zhuǎn)化入宿主細胞。在優(yōu)選的實施方案中，表達盒穩(wěn)定整合入所說宿主細胞的DNA中。在另一優(yōu)選實施方案中，表達盒優(yōu)選包含于載體中，該載體能在宿主細胞中復制并作為染色體外分子保留于宿主細胞中。在進一步優(yōu)選的實施方案中，利用所說的染色體外復制分子在宿主細胞中擴增本發(fā)明的DNA分子。在優(yōu)選的實施方案中，所說的宿主細胞是微生物，如細菌，尤其是大腸桿菌。在另一優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是真核生物細胞，如酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞。
在進一步的實施方案中，用已知為體外重組或DNA重排的技術(shù)通過引入隨機突變修飾本發(fā)明的DNA分子。該技術(shù)描述于此處收編作為參考的文獻Stemmer等，自然370389-391(1994)和美國專利5605793中。以本文所述的原始核苷酸序列為基礎(chǔ)產(chǎn)生數(shù)百萬個核苷酸序列突變拷貝，并回收具有改良特性的變體，如增強了對真菌病原體的抗性或能抵抗更寬范圍的病原體。該方法包括從含本發(fā)明核苷酸序列的模板雙鏈多核苷酸形成經(jīng)誘變的雙鏈多核苷酸，其中模板雙鏈多核苷酸已切割成預期大小的雙鏈隨機片段，還包括下述步驟向所得雙鏈隨機片段群中添加一或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中所說寡核苷酸包含與雙鏈模板多核苷酸相同的區(qū)域和異源的區(qū)域；將所得雙鏈隨機片段和寡核苷酸的混合物變性成單鏈片段；在導致所說的單鏈片段在所說的相同區(qū)域退火而形成退火片段配對的條件下，將所得單鏈片段群與聚合酶保溫，其中所說的相同區(qū)域足以使配對中的一成員引發(fā)另一成員的復制，從而形成經(jīng)誘變的雙鏈多核苷酸；并且再重復第二和第三步驟至少兩個循環(huán)，其中下一循環(huán)中的第二步驟產(chǎn)生的混合物包括來自前一循環(huán)第三步驟的經(jīng)誘變雙鏈多核苷酸，并且該下一循環(huán)形成了進一步誘變的雙鏈多核苷酸。在優(yōu)選實施方案中，雙鏈隨機片段中的單種雙鏈隨機片段的濃度小于總DNA重量的1％。在進一步優(yōu)選的實施方案中，模板雙鏈多核苷酸包含至少約100種多核苷酸。在另一實施方案中，雙鏈隨機片段的大小為約5bp-5kb。在進一步的實施方案中，該方法的第四步包括重復第二和第三步驟至少10個循環(huán)。
本發(fā)明還包括含本發(fā)明DNA分子的細胞，其中所述DNA分子不存在于其天然細胞環(huán)境中。在優(yōu)選的實施方案中，所說的細胞是植物細胞。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明DNA分子可于所說細胞中表達，并包含于允許其在這種細胞內(nèi)表達的表達盒中。在優(yōu)選的實施方案中，表達盒穩(wěn)定整合入這種宿主細胞的DNA中。在另一優(yōu)選實施方案中，表達盒包含在載體內(nèi)，其能在細胞中復制并作為染色體外分子保持于細胞中。
本發(fā)明還包括含上述植物細胞的植物。在另外的實施方案中，本發(fā)明的DNA分子可表達于植物中，本發(fā)明任一種DNA分子或其部分在轉(zhuǎn)基因植物中的表達賦予該轉(zhuǎn)基因植物對真菌病原體的抗性。在優(yōu)選的實施方案中，所述真菌病原體優(yōu)選可感染活表皮細胞，更優(yōu)選真菌病原體來自白粉菌目(還已知為白粉菌)，尤其是來自白粉菌屬，最優(yōu)選真菌病原體是禾白粉菌。因此本發(fā)明還包含通過本發(fā)明任一種DNA分子或其部分的表達而可抵抗真菌病原體的轉(zhuǎn)基因植物。
按本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，包括但不局限于玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪箐、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫蘆、大麻、小胡瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、李子、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、西紅柿、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽(rapeseed)、苜蓿、煙草、胡蘿卜、棉花、苜蓿、稻、馬鈴薯、茄子、黃瓜、擬南芥和諸如針葉樹和落葉樹之類的木本植物，尤其是玉米、小麥或甜菜。
一旦預期核苷酸已被轉(zhuǎn)化入特殊種類植物中，即可用傳統(tǒng)育種技術(shù)在該物種中將其增殖或轉(zhuǎn)移入同一物種的其他變種內(nèi)，尤其包括商業(yè)化品種。
對于它們在轉(zhuǎn)基因植物中的表達，DNA分子可能需要修飾和優(yōu)化。本領(lǐng)域已知所有的生物體都有特殊偏愛使用的密碼子，本發(fā)明DNA分子所含核苷酸序列中的密碼子可在保持其編碼氨基酸的同時被改變，以符合特殊植物的偏愛。具有至少35％GC含量，優(yōu)選超過45％GC含量的編碼序列可在植物中最好地達到高表達。由于存在可破壞信使穩(wěn)定性的ATTTA基元和可能引起不恰當聚腺苷酸化的AATAAA基元，具低GC含量的核苷酸序列表達較差。盡管優(yōu)選的基因序列可充分地表達于單子葉和雙子葉種類植物中，因它們對密碼子的偏愛不同(Murray等，核酸研究17477-498(1989))，應(yīng)修飾序列從滿足單子葉或雙子葉植物的特殊密碼子偏愛和GC含量偏愛。此外，可篩選核苷酸序列以確定引起信使截短的不合理剪接位點的存在。用公開的專利申請EP 0385962、EP 0359472和WO 93／07278中的方法，通過眾所周知的定位誘變、PCR和合成基因構(gòu)建技術(shù)造成如上所述核苷酸序列中要求的所有改變。
為了有效起始翻譯，可能要求修飾與起始甲硫氨酸鄰近的序列。例如，它們可通過含有已知在植物中有效的序列而被修飾。Joshi已提出了對植物比較合適的共有序列(NAR156643-6653(1987))，而Clontech提出了進一步的共有翻譯起始區(qū)(1993／1994目錄，頁碼210)。這些共有序列可適用于本發(fā)明的核苷酸序列。將這些序列摻入含本發(fā)明核苷酸序列的結(jié)構(gòu)中，摻入程度直到并包括ATG(同時第二個氨基酸未修飾)，或摻入程度直到并包括ATG之后的GTC(具有修飾轉(zhuǎn)基因第二個氨基酸的可能性)。
轉(zhuǎn)基因植物中的DNA分子用在植物中顯示有功能的啟動子驅(qū)動。啟動子的選擇將隨表達的時間和空間需求而變化，也可依目標物種而變化。為了保護植物抵抗葉病原體，優(yōu)選在葉中表達；為了保護植物抵抗谷穗病原體，優(yōu)選在花序中表達(如穗狀花序、圓錐花序、玉米穗軸等)；為了保護植物抵抗根病原體，優(yōu)選在根中表達；為了保護幼苗抵抗土壤傳播的病原體，優(yōu)選在根和／或幼苗中表達。不過在許多情況下，要求保護物種抗一種以上類型的植物病原體，因而期望在多種組織中表達。盡管已顯示許多雙子葉植物的啟動子可用于單子葉植物且反之亦然，理想的還是選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，選擇單子葉植物啟動子用于單子葉植物中的表達。然而，對于所選啟動子的出處無限制；只要它們可驅(qū)動DNA分子在預期細胞中的表達就足夠了。
組成型表達的優(yōu)選啟動子包括來自農(nóng)桿菌冠癭堿合酶基因的啟動子，如nos啟動子，或來自農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的二元啟動子(Velten等(1984)EMBO J．32723-2730)，或在植物中有功能的病毒啟動子，如CaMV 35S和19S啟動子，和編碼肌動蛋白或遍在蛋白之基因的啟動子。另一優(yōu)選啟動子是合成型啟動子，如Gelvin Super MAS啟動子(Ni等(1995)植物雜志7661-676)。本發(fā)明的DNA分子還可在受化學調(diào)控的啟動子的調(diào)節(jié)下表達。這使引起真菌疾病的蛋白質(zhì)只在用誘導化學劑處理農(nóng)作物植物時才合成。用于化學誘導基因表達的優(yōu)選技術(shù)詳述于公開的申請EP 0332104和美國專利5614395。用于化學誘導的優(yōu)選啟動子是煙草PR-1a啟動子。
優(yōu)選的啟動子種類是創(chuàng)傷可誘導的。已描述了許多表達于創(chuàng)傷位置及植物病原體感染位置的啟動子。理想地，所說的啟動子應(yīng)只在感染位置處局部有活性，從而控制真菌疾病的蛋白質(zhì)只積聚于需要合成它以殺死侵襲害蟲的細胞內(nèi)。此類優(yōu)選啟動子包括以下文獻中所述的啟動子Stanford等，Mol．Gen．Genet．215200-208(1989)；Xu等，植物分子生物學22573-588(1993)；Logemann等，植物細胞1151-158(1989)；Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學22783-792(1993)；Firek等，植物分子生物學22129-142(1993)和Warner等，植物雜志3191-201(1993)。
優(yōu)選的組織特異性表達模式包括綠色組織特異性、根特異性、莖特異性和花特異性。適于在綠色組織中表達的啟動子包括許多調(diào)節(jié)光合成中所涉及基因的啟動子，其中的許多已自單子葉植物和雙子葉植物克隆。優(yōu)選的啟動子是來自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC啟動子(Hudspeth和Grula，植物分子生物學12579-589(1989))。根特異性表達的優(yōu)選啟動子是de Framond(FEBS290103-106(1991)；EP0452269)所述的啟動子，而進一步優(yōu)選的根特異性啟動子是來自本發(fā)明提供之T-1基因的啟動子。優(yōu)選的莖特異性啟動子如美國專利5625136中所述和驅(qū)動玉米trpA基因表達的啟動子。
優(yōu)選的本發(fā)明實施方案是以根特異方式表達DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物。進一步優(yōu)選的實施方案是以創(chuàng)傷誘導或病原體感染誘導方式表達DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物。
除了合適啟動子的選擇外，用于植物中表達蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)需要恰當轉(zhuǎn)錄終止子附著于異源核苷酸序列下游。數(shù)種所說的終止子是本領(lǐng)域中可獲得和已知的(如來自CaMV的tml，來自rbcS的E9)。已知在植物中起作用的任何可獲得的終止子可用于本發(fā)明的上下文中。
許多其它序列可摻入本發(fā)明DNA分子的表達盒中。這些序列包括已顯示可增強表達的序列，如內(nèi)含子序列(如來自Adh1和bronze1)和病毒前導序列(如來自TMV、MCMV和AMV)。
優(yōu)選將DNA分子的表達定位于植物中的不同細胞位置。在某些情況下，定位在胞液中比較理想，而在其他情況下，定位于某些亞細胞器中是優(yōu)選的?？捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因所編碼酶的亞細胞定位。一般來說，利用編碼來自已知靶向細胞器的基因產(chǎn)物的靶肽的DNA并將其融合于核苷酸序列的上游。許多這樣的靶序列對于葉綠體是已知的，已顯示它們在異源結(jié)構(gòu)中可起作用。
適于植物轉(zhuǎn)化的載體在本說明書的其它部分也有描述。對于農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化，雙元載體或至少帶一個T-DNA邊緣序列的載體是合適的，而對于直接的基因轉(zhuǎn)移來說，任何載體都是合適的，優(yōu)選只含目的結(jié)構(gòu)的線性DNA。在直接基因轉(zhuǎn)移的情況下，可采用單個DNA種類的轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化(Schocher等，生物技術(shù)41093-1096(1986))。對于直接的基因轉(zhuǎn)移和農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)移，通常(但非必須)與可提供抗生素(卡那霉素、潮霉素或氨甲喋呤)或殺蟲劑(glufosinate、草甘磷或原卟啉原氧化酶抑制劑)抗性的選擇標記，或可提供轉(zhuǎn)化細胞選擇優(yōu)勢的選擇標記(如磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因)一起進行轉(zhuǎn)化。不過，選擇標記的選擇對于本發(fā)明來說并不是關(guān)鍵的。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的DNA分子被直接轉(zhuǎn)化入質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)被廣泛描述于美國專利5451513、5545817和5545818及PCT申請WO95／16783和McBride等(1994)美國國家科學院院報91，7301-7305中。用于葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括如利用biolistics或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(如氯化鈣或PEG介導的轉(zhuǎn)化)將位于選擇標記與目的DNA分子側(cè)翼的克隆質(zhì)體DNA區(qū)域引入合適的靶組織中。被稱為打靶序列的1-1．5kb側(cè)翼序列促進了與質(zhì)體基因組之間的同源重組，因而允許原質(zhì)體系特異區(qū)的置換或修飾。最初，利用賦予植物抗壯觀霉素和／或鏈霉素抗性的葉綠體16S rRNA和rps12基因中的點突變作為轉(zhuǎn)化的選擇標記(Svab，Z．、Hajdukiewicz，P．和Maliga，P．(1990)美國國家科學院院報87，8526-8530；Staub，J．M．和Maliga，P．(1992)植物細胞4，39-45)。這導致穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)化子，頻率約為每轟擊100次目標葉產(chǎn)生1個轉(zhuǎn)化子。這些標記間克隆位點的存在使得可得到能用于引入外源基因的質(zhì)體打靶載體(Staub，J．M．和Maliga，P．(1993)EMBO J．12，601-606，在此收編作為參考)。用顯性選擇標記-編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的細菌aadA基因置換隱性rRNA或r-蛋白質(zhì)抗生素抗性基因能使得轉(zhuǎn)化率實質(zhì)上提高(Svab，Z．和Maliga，P．(1993)美國國家科學院院報90，913-917)。在此以前，已成功地將此標記用于綠藻萊因哈德衣藻質(zhì)體基因組高頻轉(zhuǎn)化中(Goldschmidt-Clermont，M．(1991)核酸研究19，4083-4089)。其他可用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的選擇標記在本領(lǐng)域中是已知的并包含于本發(fā)明范圍內(nèi)。一般地說，轉(zhuǎn)化后需約15-20個細胞分裂周期來達到同質(zhì)體狀態(tài)。通過同源重組將基因插入各植物細胞內(nèi)所有數(shù)千拷貝環(huán)狀質(zhì)體基因組的質(zhì)體表達與核表達基因相比具有巨大拷貝數(shù)的優(yōu)勢，從而使表達水平可容易地超過總可溶性植物蛋白質(zhì)的10％。
本發(fā)明還包含農(nóng)產(chǎn)品，其中包括通過本發(fā)明任一種DNA分子的表達而具有真菌病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物或用下文所述任一種方法制備的對真菌病原體有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。既然這些植物是抗真菌病原體的，病原體在其中的生長被抑制。因此這樣的植物及其農(nóng)產(chǎn)品不太可能包含許多真菌病原體天然產(chǎn)生且可能對人和動物非常有毒的真菌毒素。因而，這樣的農(nóng)產(chǎn)品具有更好的植物檢疫特性。在優(yōu)選的實施方案中，將這樣的農(nóng)產(chǎn)品用做飼料、青貯飼料或食品。
本發(fā)明的另一目的是提供制備對真菌病原體有抗性的植物的方法。由本發(fā)明DNA分子編碼的Mlo蛋白質(zhì)賦予植物對真菌病原體的抗性，改變所說蛋白質(zhì)在其天然宿主環(huán)境中的表達是本發(fā)明的一優(yōu)選目的。本發(fā)明的另一優(yōu)選目的是改變所說蛋白質(zhì)在其天然環(huán)境中的穩(wěn)定性或活性。植物中本發(fā)明DNA分子所編碼蛋白質(zhì)的表達、穩(wěn)定性或活性的這種改變導致植物對真菌病原體的抗性增強。在優(yōu)選的實施方案中，由本發(fā)明DNA分子編碼的蛋白質(zhì)是植物抵抗真菌病原體的負調(diào)控劑，因為其可抑制植物中負責植物對真菌病原體的抗性的遺傳途徑。因此，本發(fā)明的一優(yōu)選目的是降低由本發(fā)明DNA分子編碼的Mlo蛋白質(zhì)在其天然宿主環(huán)境中的表達，或降低這種蛋白質(zhì)在其天然宿主環(huán)境中的穩(wěn)定性或活性。
“有義抑制”在優(yōu)選的實施方案中，通過“有義抑制”減少本發(fā)明DNA分子所編碼蛋白質(zhì)的表達(參見如Jorgensen等(1996)，植物分子生物學31，957-973)。在這種情況下，本發(fā)明DNA分子的全部或部分包含于將引入宿主細胞的表達盒中，優(yōu)選植物細胞，其中DNA分子是可表達的。將DNA分子以“有義方向”插入表達盒中，即是指在表達盒中該DNA分子的5’末端鄰近啟動子處且該DNA分子的編碼鏈可被轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選的實施方案中，DNA分子是完全可翻譯的，且DNA分子或部分中所含的所有遺傳信息可被翻譯成蛋白質(zhì)。在另一優(yōu)選的實施方案中，DNA分子是部分可翻譯的，翻譯成短肽。在優(yōu)選的實施方案中，這是通過在DNA分子中插入至少一個早熟的終止密碼子而完成，導致翻譯停止。在另一更優(yōu)選的實施方案中，DNA分子被轉(zhuǎn)錄但無翻譯產(chǎn)物。這通常是通過去除DNA分子所編碼蛋白質(zhì)的起始密碼子，如“ATG”而完成。在進一步優(yōu)選的實施方案中，含所說DNA分子或其部分的表達盒被穩(wěn)定整合入宿主細胞基因組中。在另一優(yōu)選實施方案中，含所說DNA分子或其部分的表達盒包括于染色體外復制分子中。在含上述表達盒之一的轉(zhuǎn)基因植物中，表達盒內(nèi)所含DNA分子的相應(yīng)基因的表達被減少或消除，導致在轉(zhuǎn)基因植物中該蛋白質(zhì)水平降低或缺乏。結(jié)果是該轉(zhuǎn)基因植物可抗真菌病原體。
“反義”抑制在另一優(yōu)選實施方案中，通過“反義”抑制來減少本發(fā)明DNA分子所編碼蛋白質(zhì)的表達。本發(fā)明DNA分子的全部或部分包含于表達盒中，通過它將DNA分子引入宿主細胞，優(yōu)選植物細胞，其中該DNA分子是可表達的。DNA分子以“反義方向”插入表達盒中，即是指在表達盒中該DNA分子的3’末端鄰近啟動子處，并且DNA分子的非編碼鏈可被轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選的實施方案中，含所說DNA分子或其部分的表達盒被穩(wěn)定整合入宿主細胞基因組中。在另一優(yōu)選實施方案中，含所說DNA分子或其部分的表達盒包括于染色體外復制分子中。一些描述此方法的文章被引用于此以便進一步地說明(Green，P．J．等，生化年鑒55569-597(1986)；van der Krol，A．R．等，反義核酸及蛋白質(zhì)，pp．125-141(1991)；Abel，P．P．等，美國國家科學院院報866949-6952(1989)；Ecker，J．R．等，美國國家科學院院報835372-5376(1986年8月))。
同源重組在另一優(yōu)選的實施方案中，通過如進一步描述于Paszkowski等，EMBO雜志74021-26(1988)中的同源重組，對植物基因組中至少一個相應(yīng)于本發(fā)明DNA分子的基因組拷貝進行修飾。所說技術(shù)利用同源序列的特征來相互識別并用本領(lǐng)域已知的方法，如同源重組交換它們之間的核苷酸序列。同源重組可在細胞內(nèi)核苷酸序列的染色體拷貝與轉(zhuǎn)化進入細胞的引入拷貝核苷酸序列之間發(fā)生。從而將特異的修飾準確引入核苷酸序列的染色體拷貝中。在一實施方案中，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)之基因的調(diào)節(jié)元件被修飾。已有的調(diào)節(jié)元件被不同的調(diào)節(jié)元件置換，從而減少了蛋白質(zhì)的表達，或者突變或缺失該調(diào)控元件，因而消除蛋白質(zhì)的表達。在另一實施方案中，通過刪除整個編碼序列或其部分或者突變來修飾蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。突變蛋白質(zhì)的表達還可賦予植物對真菌病原體更強的抗性。
在另一優(yōu)選的實施方案中，用含RNA和DNA殘基連續(xù)序列的末端有雙發(fā)夾帽之雙螺旋構(gòu)象的嵌合寡核苷酸轉(zhuǎn)化細胞，從而在DNA分子染色體拷貝中引入突變。寡核苷酸的附加特征是在RNA殘基處存在2’-O-甲基化。將RNA／DNA序列設(shè)計成與本發(fā)明DNA分子的染色體拷貝序列一致并含預期的核苷酸改變。此技術(shù)進一步描述于美國專利5501967中。
核酶在另一實施方案中，用特異于所說RNA的催化性RNA或核酶切割編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA。核酶表達于轉(zhuǎn)基因植物中，造成植物細胞中編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的RNA量減少，從而導致細胞中積累的蛋白質(zhì)量減少并提高植物對真菌病原體的抗性。該方法進一步描述于美國專利4987071。
顯性失活突變在另一優(yōu)選實施方案中，由本發(fā)明核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的活性被改變。這是通過轉(zhuǎn)基因植物中該蛋白質(zhì)的顯性失活突變體的表達，導致內(nèi)源蛋白質(zhì)活性喪失而完成。
Aptamer在另一實施方案中，通過在轉(zhuǎn)基因植物中表達可特異結(jié)合該蛋白質(zhì)的核酸配體，即所謂的aptamer，從而抑制本發(fā)明DNA分子所編碼的蛋白質(zhì)的活性。優(yōu)選用SELEX(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment)方法獲得aptamer。在SELEX方法中，將具隨機化序列區(qū)的單鏈核酸候選混合物與該蛋白質(zhì)接觸，那些對目標親和性更高的核酸與候選混合物的殘余物公開。為了產(chǎn)生富含配體的混合物，擴增分配出來的核酸。多次反復后得到對蛋白質(zhì)具最佳親和性的核酸并用于轉(zhuǎn)基因植物中的表達。此方法進一步描述于美國專利5270163中。
含保守序列的核苷酸序列的分離方法本發(fā)明DNA分子所編碼Mlo蛋白質(zhì)中包含的保守序列被用于分離編碼這種序列的其他DNA分子。在優(yōu)選的實施方案中，產(chǎn)生簡并寡核苷酸的混合物，其中包括至少一種編碼SEQ ID NO1或SEQ IDNO2中所述序列的可能寡核苷酸。將編碼SEQ ID NO1所述序列的寡核苷酸混合物和與編碼SEQ ID NO2中所述序列的序列互補的寡核苷酸混合物與所選的模板DNA一起進行PCR擴增反應(yīng)。簡并寡核苷酸的混合物在本領(lǐng)域中是眾所周知的，簡并程度隨需要而變化。在優(yōu)選的實施方案中，模板DNA是來自植物的總DNA樣品，其中所說的DNA樣品可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法獲得。用本領(lǐng)域眾所周知的方法分離上述PCR反應(yīng)產(chǎn)生的擴增片段，并通過篩選cDNA文庫或利用RACE方案將其用于分離相應(yīng)的全長cDNA，后兩種技術(shù)也是本領(lǐng)域所共知的。這種方法代表了用于分離賦予植物對真菌病原體的抗性的新基因獨特且有用的策略。
參考以下詳述的實施例，本發(fā)明將得到進一步的描述。提供這些實施例的目的只是用于例證，而非試圖對其有所局限，除非有另外的說明。
實施例實施例1小麥Mlo基因的克隆和測序用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆小麥的Mlo基因。RNA制備自小麥栽培品種UC703的葉并利用Stratagene RT-PCR試劑盒將其進行逆轉(zhuǎn)錄。產(chǎn)生的cDNA用于PCR反應(yīng)，引物如下MLO-26 5’TTC CAG CAC CGG CAC AAG AA 3’(SEQ ID No25)MLO-10 5’AAG AAC TGC CTG AAG AAG GC 3’(SEQ ID No23)MLO-7 5’CAG AAA CTT GTC TCA TCC CTG G 3’(SEQ ID No22)MLO-5 5’ACA GAG ACC ACC TCC TTG GAA 3’(SEQ ID No21)MLO-15 5’CAC CAC CTT CAT GAT GCT CA 3’(SEQ ID No24)用以下所列的引物進行PCR，反應(yīng)產(chǎn)生了指示大小的擴增片段MLO-26和MLO-10 503bpMLO-26和MLO-7 1481bpMLO-5和MLO-15 650bp將片段克隆入pCR2．1或pCR2．1-TOPO(Invitrogen)。自轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒DNA并進行DNA測序。測序顯示了存在三種相互間有很高類似性的不同cDNA序列。這些小麥Mlo基因被稱為TrMlo1、TrMlo2和TrMlo3。
通過篩選構(gòu)建于λ-ZAPⅡ載體中的cDNA文庫來分離另外的小麥Mlo克隆。為了篩選該文庫，進行大量切除以將文庫轉(zhuǎn)變成以Bluescript為基礎(chǔ)的cDNA克隆群。將這些克隆以80000個獨立克隆的庫分別培養(yǎng)并制備質(zhì)粒DNA。用寡核苷酸引物MLO-5和MLO-15(見上文)在混合DNA中進行PCR反應(yīng)。三個庫產(chǎn)生了650個堿基對預期大小的帶。隨后通過以越來越低的密度培養(yǎng)細菌克隆將這些庫分級分離，每步之后都進行質(zhì)粒DNA制備并用引物MLO-5和MLO-15進行各亞庫的PCR。多次分級分離后得到含帶Mlo序列之插入片段的單個克隆。將這些克隆中的兩個進行插入片段測序，顯示它們包含相同的插入片段。第三個克隆的序列表明其中插入片段除了在5’末端有40個附加堿基外，其余與另兩個克隆的相同。
通過cDNA末端的隨機擴增(RACE)完成小麥Mlo剩余部分的克隆。用Marathon cDNA擴增試劑盒(Clontech)進行小麥UC703poly-A+RNA的RACE反應(yīng)。Poly-A+RNA是用oligo-dT纖維素柱(Gibco BRL)制備自小麥總RNA。用于RACE反應(yīng)的寡核苷酸是MLO-GSP1 5’TGG ACC TCT TCA TGT TCG ATC CCA TCT G 3’(SEQ ID No26)MLO-GSP2 5’CCT GAC GCT GTT CCA GAA TGC GTT TCA 3’(SEQ ID No27)用引物MLO-GSP1和試劑盒中所提供的5’銜接引物進行擴增產(chǎn)生約1300個核苷酸大小的DNA片段。用引物MLO-GSP2和3’銜接物進行擴增產(chǎn)生約600個核苷酸大小的DNA片段。將片段克隆入pCR2．1-TOPO，稱為TrMlo1-5、TrMlo2-5和TrMlo3-5，其中分別包含小麥Mlo基因TrMlo1、TrMlo2和TrMlo3的5’端。從所說克隆中制備質(zhì)粒DNA并將質(zhì)粒插入片段測序。
實施例2擬南芥屬Mlo cDNA的克隆用軟件TBLASTN比較Mlo蛋白質(zhì)序列和數(shù)據(jù)庫中序列的翻譯產(chǎn)物，表明其中許多序列與Mlo類似。其中，相應(yīng)于三種擬南芥屬EST序列的全長cDNA均已被克隆，接受號為H76041、N37544和T22146。對于各EST，設(shè)計寡核苷酸以自構(gòu)建于質(zhì)粒pFL61中的擬南芥屬cDNA文庫擴增相應(yīng)于所說EST的序列(Minet等(1992)Gene Nov16；121(2)393-396)。所用的寡核苷酸是N37544-1 5’AAG ATC AAG ATG AGG ACG TGG AAG TCG TGG 3’(SEQ ID No29)N37544-2 5’AGG CTG AAC CAC TGG GGC GCC TCT CAC CAC 3’(SEQ ID No30)T22146-1 5’CAA GTA TAT GAT GCG CGC TCT AGA GGA TGA 3’(SEQ ID No31)T22146-2 5’AGG TTT CAC CAC TAA GTC TCC TTC AAT GGC 3’(SEQ ID No32)H76041-1 5’GAT CAT TCA AGA CTT AGG CTC ACT CAT GAG 3’(SEQ ID No33)H76041-2 5’AAC AGC AAG GAA GAT TAC AAA TGA TGC CCA 3’(SEQ ID No34)用引物N37544-1和N37544-2將制備自cDNA文庫的DNA擴增得到約500個堿基對大小的片段，而用引物T22146-1和T22146-2擴增得到約250個堿基對大小的片段。用引物H76041-1和H76041-2擴增得到約350和約300個堿基對大小的兩個片段。約300個堿基的片段是按EST序列預計的大小，將其隨后用于檢測cDNA文庫中相應(yīng)于H76041EST的cDNA的存在。將來自所說文庫的DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，并將克隆分成各約20000個克隆的庫。用不同的引物對通過PCR篩選來自各個庫的DNA，隨后將陽性庫細分，以使克隆數(shù)越來越少。通過將此過程進行到底，或在某些情況下，一旦庫大小已達到200個克隆或更小時，通過以EST序列為探針進行菌落雜交，完成單個陽性克隆的分離。對于EST N37544和T22146，成功地分離出相應(yīng)于EST的克隆，將插入片段測序。相應(yīng)于EST N37544的cDNA序列在質(zhì)粒pCIB10295中被命名為CIB10295，含相應(yīng)于EST T22146(CIB10296)之cDNA的質(zhì)粒被命名為pCIB10296。對于這兩個EST，相應(yīng)基因組序列可以最近保藏入GenBank的擬南芥屬BAC克隆序列部分的形式獲得。需要指出的是，由GenBank所確定的這些基因組序列預計翻譯出的蛋白質(zhì)序列與cDNA直接測序所確定的序列不相符。因此，ESTN37544和T22146相應(yīng)基因的氨基酸序列不能由GenBank條目明顯得到，而只能通過克隆和cDNA克隆測序闡明。已發(fā)現(xiàn)用H76041 EST的引物分離的克隆不包含H76041的基因，而是含有一新的Mlo基因家族成員作為插入片段。將插入片段完整測序，該Mlo基因家族成員在質(zhì)粒pCIB10259中被命名為CIB10259。
實施例3用于小麥中Mlo基因表達的載體的構(gòu)建構(gòu)建兩個載體用于在小麥中“反義”表達大麥Mlo基因。用大麥cDNA和引物對MLO-5和MLO-7(見上文(1))進行PCR，反應(yīng)產(chǎn)生1124bp的擴增片段，將其克隆入pGEM-T(Promega)。用SacⅡ和NotⅠ兩種酶將此片段從pGEM-T中切出。將此1124bp片段克隆入pBluescript-SK(+)。這次通過BamHI和SacⅠ限制位點將插入片段切出并克隆入BamHⅠ-SacⅠ-消化的pCIB9806(專利申請08／838219中所述)，插入方向為其中Mlo編碼序列的方向與玉米遍在蛋白啟動子相反。質(zhì)粒被命名為pCK01。
為了構(gòu)建載體用于小麥中完整Mlo基因的“反義”表達，用引物對MLO-1(5’ATG TCG GAC AAA AAA GGG GT3’(SEQ ID NO19))和MLO-10(見上文(1))進行PCR，反應(yīng)產(chǎn)生635bp的擴增片段，將其克隆入pCR2．1(Invitrogen)。將此片段作為EcoRⅠ片段從pCR2．1中切出，并插入pGEM-9Zf(-)(Promega)。用SacⅠ和BstⅪ將跨越Mlo中天然存在的SacⅠ位點至引物位點MLO-10的320個核苷酸片段切出。用SacⅠ和BstⅪ消化pCK01，將此320個堿基片段插入。為了在單子葉植物表達載體中Mlo基因的完整構(gòu)建，從pGEM-9Zf(-)衍生物中切出210個核苷酸的SacⅠ片段。該片段包含Mlo編碼序列的5’端，從引物位點MLO-1至Mlo基因中天然存在的SacⅠ位點。用SacⅠ消化pCK01衍生物并將此210個堿基的片段插入。用引物MLO-1和MLO-10通過PCR分析克隆以確定此210個堿基的片段在新構(gòu)建載體中的方向。只有其中210個堿基的片段以相對于遍在蛋白啟動子反義的方向插入的克隆產(chǎn)生相應(yīng)于Mlo編碼序列5’末端的530個堿基對的產(chǎn)物。產(chǎn)生的質(zhì)粒包含相對于遍在蛋白啟動子處于“反義”方向的完整Mlo編碼序列，并被命名為pCK02。
為了構(gòu)建載體用于表達“有義”方向的Mlo基因，用BamHⅠ消化質(zhì)粒pCK02以釋放作為插入片段的Mlo編碼序列。將BamHⅠ片段再連接回pCK02基本載體。通過SacⅠ消化鑒定所帶Mlo編碼序列相對于pCK02為反向的菌落，在這樣的克隆中產(chǎn)生1．8kb片段，相比之下，與pCK02相同結(jié)構(gòu)的克隆中得到210個堿基片段。選擇所帶Mlo編碼序列相對于玉米遍在蛋白啟動子為“有義”方向的克隆，命名為pCK03。
實施例4用于在擬南芥中表達Mlo基因的載體的構(gòu)建將pCIB10259、pCIB10295和pCIB10296以及pCK02(大麥Mlo基因)中的Mlo克隆用于PCR反應(yīng)中，產(chǎn)生的帶含側(cè)翼有BamHⅠ限制位點的全長基因。所用引物序列如下SAS-15’GGA TTA AGA TCT AAT GGC 3’(SEQ ID No35，用于pCIB10295)SAS-25’CAA AGA TCT TCA TTT CTT AAA AG 3’(SEQ ID No36，用于pCIB10295)SAS-35’GCG GAT CCA TGT CGG ACA AAA AAG G 3’(SEQ ID No37，用于大麥Mlo)SAS-45’GCG GAT CCT CAT CCC TGG CTG AAG G 3’(SEQ ID No38，用于大麥Mlo)SAS-55’GGA TCC ACC ATG GCC ACA AGA TG 3’(SEQ ID No39，用于pCIB10259)SAS-65’GGA TCC TTA GTC AAT ATC ATT AGC 3’(SEQ ID No40，用于pCIB10259)SAS-75’GCG GAT CCA TGG GTC ACG GAG GAG AAG 3’(SEQ ID No41，用于pCIB10269)SAS-85’GCG GAT CCT CAG TTG TTA TGA TCA GGA 3’(SEQ ID No42，用于pCIB10296)將這些帶克隆入pCR2．1-TOPO，測定所產(chǎn)生質(zhì)粒中插入片段的序列以確認PCR未引入突變。用BamHⅠ消化質(zhì)粒，純化插入片段并克隆入BamHⅠ消化的pPEH28，一種含有直接位于BamHⅠ位點下游的一拷貝擬南芥遍在蛋白基因啟動子UBQ3(Norris等(1993)植物分子生物學21895-906)的穿梭載體。鑒定含與UBQ3融合之Mlo序列的克隆，進行限制酶分析，以鑒別含相對于UBQ3為“有義”和“反義”方向之插入片段的克隆。對于各Mlo基因，用XbaⅠ消化含有義方向插入片段的克隆和含反義方向插入片段的克隆，純化插入片段并克隆入XbaⅠ消化的pCIB200。此方法將UBQ3-Mlo基因融合體置入T-DNA邊界之間。
實施例5小麥的轉(zhuǎn)化和表達子的鑒定如專利申請WO94／13822中所詳述的，通過未成熟胚胎的粒子轟擊轉(zhuǎn)化小麥。將在含Basta的培養(yǎng)基中再生小植株并進行PCR分析。為通過PCR判斷Mlo轉(zhuǎn)基因的存在，所用引物如下MLO-35’ATG CTA CCA CAC GCA GAT CG 3’ST27 5’ACT TCT GCA GGT CGA CTC TA 3’引物MLO-3相應(yīng)于Mlo轉(zhuǎn)基因的區(qū)域，而引物ST27位于玉米遍在蛋白啟動子序列內(nèi)。在PCR中同時使用Mlo基因和遍在蛋白啟動子引物消除了使用兩個Mlo引物可引起的假陽性，這種假陽性可能是從存在于小麥中的Mlo基因染色體拷貝引發(fā)的。
將確認含Mlo轉(zhuǎn)基因的植物進行RNA凝膠印跡分析，以確定它們是否含改變水平的染色體編碼小麥Mlo mRNA。自各轉(zhuǎn)基因系制備Poly-A+RNA，并印跡到Hybond-N+濾膜上。用相應(yīng)于Mlo基因5’末端的530個堿基片段探測印跡。該區(qū)域在pCK01克隆不存在；因此，在含pCK01的轉(zhuǎn)基因系中不存在與自轉(zhuǎn)基因表達之反義RNA的雜交。對于其中轉(zhuǎn)基因包括該5’末端片段的pCK02轉(zhuǎn)基因系，探針與不同大小的兩條帶雜交。一條相應(yīng)于反義轉(zhuǎn)基因的約2．5kb的mRNA與來自小麥染色體編碼Mlo基因的2．0kb mRNA有明顯區(qū)分。監(jiān)測2．0kbmRNA的豐度，作為各株系中轉(zhuǎn)基因所達到的基因抑制效率的衡量。
實施例6轉(zhuǎn)基因小麥品系的疾病檢測將轉(zhuǎn)基因的和未轉(zhuǎn)化的UC703(對照)小麥品系植物溫室培養(yǎng)直到它們兩周大。將植物轉(zhuǎn)移入Percival生長腔內(nèi)(每個循環(huán)為黑暗中8小時，16℃和光亮中16小時，20℃)，并通過孢子充分接種禾白粉菌小麥小種。接種兩周后評估真菌孢子形成的程度。植物被評估為1(幾乎無至根本無菌絲生長和無可見的孢子形成)、2(有一些菌絲生長和孢子形成，但比對照植物少)或3(有可與對照相比的菌絲生長和孢子形成)。表達Mlo-構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小麥品系顯示出對病原體的抗性增強。用反義大麥Mlo構(gòu)建體獲得的結(jié)果例子如下文所列。
篩選轉(zhuǎn)基因品系R1和R2姊妹株的疾病抗性種植Mlo反義轉(zhuǎn)化子的姊妹株(T2種子)，接種禾白粉菌，并評估疾病抗性。
小百分率的R1和R2植物展示有抗性可能是由于被檢測的是仍然與轉(zhuǎn)基因分離的T2種群。
實施例7表達Mlo基因的擬南芥品系分析通過真空滲透將含Mlo基因的pCIB200衍生物用于轉(zhuǎn)化擬南芥屬生態(tài)型Ws-O(Bechtold，N．，Ellis，J．和Pelletier，G．(1993)C．R．Acad．Sci。Paris316，1194-1199)。通過卡那霉素選擇篩選后代以鑒定轉(zhuǎn)化子。對于Mlo轉(zhuǎn)基因品系，通過RNA凝膠印跡分析鑒定表達Mlo的植物。對于Mlo基因，通過RNA凝膠印跡分析法分析轉(zhuǎn)化子在mRNA積累穩(wěn)定狀態(tài)水平上的變化。檢測呈現(xiàn)靶基因有義或反義抑制的轉(zhuǎn)化子與致植物病真菌二孢白粉菌和寄生霜霉及細菌病原體丁香假單胞菌番茄致病變種反應(yīng)的改變。用臺盼藍染色宏觀和微觀地檢查轉(zhuǎn)基因植物的葉，從而檢測壞疽的存在。
對于白粉菌接種，將孢子充分施用于擬南芥花結(jié)，使植物在25℃保持于Percival生長腔中。接種10天后評估真菌孢子形成的程度。實施例8利用Mlo序列間的相似區(qū)分離另外的Mlo基因家族成員預計由Mlo基因編碼的氨基酸序列的對比顯示在所有的基因產(chǎn)物間有許多短的高度氨基酸類似區(qū)。設(shè)計這些區(qū)域的簡并引物，按PCR試劑供應(yīng)商的推薦方法用這些引物進行PCR反應(yīng)。擴增片段用作探針分離新Mlo基因的全長cDNA或基因組克隆。在本發(fā)明Mlo蛋白質(zhì)(粗線)與用于另外Mlo基因分離的簡并寡核苷酸之間的氨基酸序列保守區(qū)如下所示E L M X1 X2 G X3 I S L L L X4WHEATTrMlo1 GAG CTC ATG CTG GTG GGC TTC ATCTrMlo2 GAG CTG ATG CTG GTG GGG TTC ATCTrMlo3 GAG CTG ATG CTG GTG GGA TTC ATCARABIDOPSISCIB10259 GAG CTG ATG ATT CTA GGA TTC ATTCIB10295 GAG CTT ATG CTG TTG GGA TTC ATACIB10296 GAG CTG ATG TTG TTA GGG TTT ATAF19850 GAG CTG ATG GTT CTT GGA TTC ATCU95973 GAG TTG ATG TTG CTG GGA CTT ATA5’ GAG CTB ATG MTB BTR GGM TTC AT 3’X5 T X6 P L X7X8 X9 V X10 Q M G SWHEATTrMlo1 GCG CTC GTC ACA CAG ATG GGA TCATrMlo2 GCG CTC GTC ACA CAG ATG GGA TCGTrMlo3 GCG CTA GTC ACA CAG ATG GGA TCAARABIDOPSISCIB10259 GCA CTA GTT ACT CAG ATG GGT TCACIB10295 GCA CTT GTT ACT CAG ATG GGT AGTCIB10296 GCC ATC GTC TCA CAG ATG GGA AGTF19850 GCA CTC GTA ACT CAG ATG GGT TCTU95973 GTA ATC GTT ACT CAG ATG GGA TCT5’ WCC CAT CTG AGT GAC DAG BGC RTA 3’X1=L、V或I，X2=V或L，X3=F或L，X4=T、S或A。
X5=I、V、S或G，X6=F、L或V，X7=Y或N，X8=A或V，X9=L或I，X10=T或S。
R=A、G，Y=C、T，M=A、C，K=G、T，S=C、G，W=A、T，H=A、C、T，B=C、G、T，V=A、C、G，D=A、G、T，N=A、C、G、T。
實施例9編碼序列和鄰近序列的修飾為了在轉(zhuǎn)基因植物宿主中表達，本申請中所述的DNA分子可被修飾以完成和優(yōu)化或負調(diào)控它們的表達。以下問題可能會遇到，可以用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進行這些DNA分子的修飾。
(1)密碼子用法。一些植物中的偏愛密碼子用法與另一些植物物種是不一樣的。植物進化一般趨向于在單子葉植物第三個堿基位置較偏愛核苷酸C和G，而雙子葉植物在此位置通常用核苷酸A或T。通過修飾基因摻入對于特殊目標轉(zhuǎn)基因物種優(yōu)選的密碼子，將克服下述許多關(guān)于GC／AT含量和不合理剪接的問題。
(2)GC／AT含量。植物基因的GC含量通常超過35％。富含A和T核苷酸的DNA分子在植物中會引起許多問題。首先，ATTTA基元被認為會使信使不穩(wěn)定，已發(fā)現(xiàn)于許多短壽mRNA的3’末端。其次，在信使中的不恰當位置存在如AATAAA之類聚腺苷酸化信號被認為會造成轉(zhuǎn)錄提前截止。此外，單子葉植物可能會將富含AT序列識別為剪接位點(見下文)。
(3)鄰近起始甲硫氨酸的序列?，F(xiàn)認為核糖體附著于信使的5’末端并尋找第一個ATG以起始翻譯。不過，我們相信存在對某些ATG鄰近核苷酸的偏愛，在ATG處包含一新的共有翻譯起始密碼子可增強本發(fā)明DNA分子的表達。Clontech(1993／1994目錄，第210頁)已提出一序列可作為共有翻譯起始區(qū)用于植物中大腸桿菌uidA基因的表達。此外，Joshi(NAR 156643-6653(1987))已比較了許多鄰近ATG的植物序列并揭示了一共有序列。當植物中DNA分子表達遇到困難時，在起始ATG處含這些序列之一有可能促進翻譯。在這樣的情況下，由于其第二個氨基酸的修飾，共有區(qū)的最后三個核苷酸可能不適合包含于被修飾序列中。不同植物種類之間鄰近起始甲硫氨酸的優(yōu)選序列可能是不同的。位于GenBank數(shù)據(jù)庫中14個玉米基因的調(diào)查得到結(jié)果如下
14個玉米基因中起始ATG前的位置-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1C3846256010 7T3034321110A2314323723G6360654615可對將插入核苷酸序列的預期植物種類進行此項分析，并對鄰近ATG的序列進行修飾以摻入偏愛的核苷酸。
(4)不合理剪接位點的去除。本發(fā)明DNA分子還可能包含植物中會被識別為5’或3’剪接位點的基元，并被切割，從而產(chǎn)生截短或缺失的信使。用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可去除這些位點。
(5)顯性失活突變體的產(chǎn)生此外，本發(fā)明DNA分子還可包括被修飾，從而本發(fā)明核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)活性被改變的分子。通過蛋白質(zhì)顯性失活突變體在轉(zhuǎn)基因植物中的表達，導致內(nèi)源蛋白質(zhì)的活性喪失，可達到此結(jié)果。Mlo核苷酸序列中導致這種顯性失活突變體產(chǎn)生的突變位點列舉如下?？梢肓信e如下的單個突變或不同突變的組合。 用于修飾編碼序列和鄰近序列的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。若本發(fā)明DNA分子的起始表達水平低且適于如上所述改變序列，則按本領(lǐng)域眾所周知的方法完成合成基因的構(gòu)建。這些方法已被描述于發(fā)表的專利內(nèi)容中，如EP0385962、EP0359472和WO93／07278。在大部分情況下，優(yōu)選用瞬時檢驗方法(本領(lǐng)域眾所周知)在基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入轉(zhuǎn)基因植物中前檢測其表達。
實施例10植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建可獲得許多轉(zhuǎn)化載體用于植物轉(zhuǎn)化，本發(fā)明DNA分子可與任何這樣的載體結(jié)合使用。所用載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的目標物種。對于某些目標物種，可優(yōu)選不同的抗生素或殺蟲劑選擇標記。常規(guī)用于轉(zhuǎn)化中的選擇標記包括使植物抗卡那霉素、巴龍霉素、遺傳霉素和相關(guān)抗生素的nptII基因(Vieira和Messing，1982，基因19259-268；Bevan等，1983，自然304184-187)、編碼氨基糖苷3’-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶并賦予對鏈霉素或壯觀霉素的抗性的細菌aadA基因(Goldschmidt-Clermont，1991，核酸研究194083-4089)、賦予對抗生素潮霉素的抗性的hph基因(Blochlinger和Diggelmann，1984，分子細胞生物學42929-2931)和賦予對氨甲喋呤的抗性的dhfr基因(Bourouis和Jarry，1983，EMBO J．21099-1104)。其他可使用的標記包括使植物抗殺蟲劑膦絲菌素的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(White等，1990，核酸研究181062；Spencer等1990，理論與應(yīng)用遺傳學79625-631)、編碼草甘磷抗性的突變EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988，生物／技術(shù)6915-922)、賦予對咪唑啉酮或磺酰脲的抗性的突變乙酰乳酸合成酶(ALS)基因(Lee等，1988，EMBO J．71241-1248)、賦予對莠去凈的抗性的突變psbA基因(Smeda等，1993，植物生理學103911-917)或如美國專利5767373所述的突變原卟啉原氧化酶基因。還可使用產(chǎn)生陽性選擇的選擇標記，諸如磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因。
還可通過可篩選標記基因的表達完成轉(zhuǎn)化細胞的鑒定，諸如編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、螢光素酶和綠色熒光蛋白(GFP)或任何可賦予轉(zhuǎn)化細胞獨特表型性狀的其他蛋白質(zhì)。
(1)適于農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化之載體的構(gòu)建用于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的許多載體是可獲得的。這些載體一般攜帶至少一種T-DNA邊界序列，并包括諸如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ之類的載體。下文描述了兩個典型載體的構(gòu)建。
pCIB200和pCIB2001的構(gòu)建二元載體pCIB200和pCIB2001被用于構(gòu)建用于農(nóng)桿菌的重組載體并以下述方式構(gòu)建。通過用NarI消化pTJS75(Schmidhauser & Helinski，細菌學雜志164446-455(1985))切出四環(huán)素抗性基因，然后插入來自帶NPTII(Vieria & Messing，基因19259-268(1982)；Bevan等，自然304184-187(1983)；McBride等，植物分子生物學14266-276(1990))之pUC4K的AccI片段，產(chǎn)生pTJS75kan。將XhoⅠ接頭與含T-DNA左右邊界序列、植物nos／nptⅡ可選擇嵌合基因和pUC多接頭之pCIB7的EcoRV片段連接(Rothstein等，基因53153-161(1987))，并將XhoⅠ消化片段克隆入Sall消化的pTJS75kan，產(chǎn)生pCIB200(還可參見EP 0332104，實施例19)。pCIB200包含以下的單一多接頭限制位點EcoRⅠ、SstⅠ、KpnⅠ、BglⅡ、XbaⅠ和SalⅠ。pCIB2001是通過插入附加限制位點多接頭而產(chǎn)生的pCIB200的衍生物。pCIB2001多接頭中的單一限制位點是EcoRⅠ、SstⅠ、KpnⅠ、BglⅡ、XbaⅠ、SalⅠ、MluⅠ、BcⅡ、AvrⅡ、ApaⅠ、HpaⅠ和StuⅠ。除含這些單一限制位點外，pCIB2001還具有植物和細菌卡那霉素選擇基因、用于農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的左右T-DNA邊界序列、用于在大腸桿菌和其他宿主之間轉(zhuǎn)移的RK2-衍生trfA功能和同樣來自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001適用于克隆含自身調(diào)節(jié)信號的植物表達盒。
pCIB200及其潮霉素選擇衍生物的構(gòu)建二元載體pCIB10包含可用于植物中選擇的卡那霉素抗性編碼基因、T-DNA左右邊界序列，并摻入廣譜質(zhì)粒pRK252的序列，使其在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均能復制。Rothstein等(基因53153-161(1987))描述了它的構(gòu)建。已構(gòu)建了多個pCIB10衍生物，其中摻入了Gritz等(基因25179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。這些衍生物使得能夠僅對潮霉素(pCIB743)或?qū)Τ泵顾睾涂敲顾囟?pCIB715、pCIB717)選擇轉(zhuǎn)基因植物細胞。
(2)構(gòu)建適于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體非根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在所選轉(zhuǎn)化載體內(nèi)無需T-DNA序列，因此除上述含T-DNA序列的載體外，還可利用缺乏這些序列的載體。不依賴于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊、原生質(zhì)體攝入(如PEG和電穿孔)和顯微注射進行的轉(zhuǎn)化。載體的選擇很大程度上取決于所選的轉(zhuǎn)化物種。下文描述了一些典型載體的構(gòu)建。
pCIB3064構(gòu)建pCIB3064是適于與殺蟲劑Basta(或膦絲菌素)選擇結(jié)合進行直接轉(zhuǎn)移基因技術(shù)的pUC-衍生載體。質(zhì)粒pCIB246含與大腸桿菌GUS基因可操作性融合的CaMV 35S啟動子和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子，并被描述于PCT公開申請WO93／07278中。該載體的35S啟動子在起始位點5’端含兩個ATG序列。用標準PCR技術(shù)突變這些位點，以去除ATG并產(chǎn)生限制性位點SspⅠ和PvuⅡ。新的限制位點離單一SalⅠ位點96和37bp，離準確的起始位點101和42bp。產(chǎn)生的pCIB246衍生物被稱為pCIB3025。然后用SalⅠ和SacⅠ消化從pCIB3025中切下GUS基因，補平末端并再連接產(chǎn)生質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82獲自John Innes Centre，Norwich，切出含來自綠色產(chǎn)色鏈霉素之bar基因的400bp SmaⅠ片段并插入pCIB3060的HpaⅠ位點(Thompson等，EMBO J62519-2523(1987)))。這樣產(chǎn)生了pCIB3064，其中包括在CaMV 35S啟動子和終止子控制下的bar基因用于殺蟲劑選擇、氨芐青霉素抗性基因(用于在大腸桿菌中選擇)和帶SphⅠ、PstⅠ、HindⅢ和BamHⅠ單一位點的多接頭。該載體適于克隆含自身調(diào)節(jié)信號的植物表達盒。
pSOG19和pSOG35的構(gòu)建pSOG35是利用大腸桿菌二氫葉酸還原酶(DHFR)作為賦予氨甲喋呤抗性的選擇標記的轉(zhuǎn)化載體。用PCR擴增35S啟動子(約800bp)、來自玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(約550bp)和來自pSOG10之18bpGUS非翻譯前導序列。還用PCR擴增編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶類型Ⅱ基因的250bp片段，將這兩個PCR片段與來自pBI221(Clontech)的含pUC19載體骨架和胭脂堿合酶終止子之SacI-PstI片段裝配在一起。這些片段的裝配產(chǎn)生pSOG19，其中含與內(nèi)含子6序列、GUS前導序列、DHFR基因和胭脂堿合酶終止子融合的35S啟動子。用來自玉米褪綠斑駁病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus，MCMV)的前導序列置換pSOG19中的GUS前導序列產(chǎn)生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶氨芐青霉素抗性pUC基因，并具有可用于克隆外源序列的HindⅢ、SphⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ位點。
實施例11構(gòu)建植物表達盒的要求首先將預期在轉(zhuǎn)基因植物中表達的基因序列裝配入表達盒中，位于恰當?shù)膯幼又蠹扒‘數(shù)霓D(zhuǎn)錄終止子的上游。
啟動子選擇用于表達盒中的啟動子選擇將決定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的空間和時間表達模式。所選擇的啟動子將在特殊細胞類型(如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)或者在特殊組織或器官(例如根、葉或花)中表達轉(zhuǎn)基因，該選擇將反映本發(fā)明DNA分子生物合成的預期位置?；蛘?，所選啟動子可驅(qū)動基因在光誘導或其他時間調(diào)節(jié)啟動子控制下的表達。另外的選擇是所選啟動子被化學調(diào)節(jié)。這就有可能只在需要時誘發(fā)通過化學誘導物處理引起核苷酸序列表達。
轉(zhuǎn)錄終止子可獲得多種轉(zhuǎn)錄終止子用于表達盒中。它們負責轉(zhuǎn)基因之外的轉(zhuǎn)錄終止及其正確的聚腺苷酸化作用。已知在植物中起作用的合適轉(zhuǎn)錄終止子均可使用，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂堿合酶終止子、豌豆rbcS E9終止子。它們在單子葉植物和雙子葉植物中均可使用。
用于增強或調(diào)節(jié)表達的序列已發(fā)現(xiàn)許多序列可增強轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)的基因表達，這些序列可與本發(fā)明基因結(jié)合使用以提高它們在轉(zhuǎn)基因植物中的表達。
已顯示多種內(nèi)含子序列可增強表達，尤其是在單子葉植物細胞中。例如，已發(fā)現(xiàn)玉米Adh1基因內(nèi)含子在引入玉米細胞時可顯著增強其同源啟動子控制下的野生型基因表達。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1特別有效，可增強與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體的表達(Callis等，基因發(fā)育11183-1200(1987))。在相同實驗體系中，來自玉米bronze1基因的內(nèi)含子在增強表達方面具有類似作用(Callis等，見上文)。內(nèi)含子序列已被常規(guī)引入植物轉(zhuǎn)化載體中，一般引入到非翻譯前導序列內(nèi)。
已知許多來自病毒的非翻譯前導序列可增強表達，它們在雙子葉植物細胞中尤其有效。具體地說，已顯示來自煙草花葉病毒(TMV，‘Ω序列’)、玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導序列在增強表達方面有效(如Gallie等，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等，植物分子生物學1565-79(1990))。
細胞中基因產(chǎn)物的定向已知在植物中存在將基因產(chǎn)物定向的多種機制，控制這些機制功能的序列已鑒定到一定程度。例如，將基因產(chǎn)物定向于葉綠體是由發(fā)現(xiàn)于多種蛋白質(zhì)氨基末端的信號序列控制的，該信號序列在葉綠體輸入期間被切去從而產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)(如，Comai等，生物化學雜志26315104-15109(1988))。這些信號序列可與異源基因產(chǎn)物融合從而使異源產(chǎn)物輸入葉綠體(van den Broeck等，自然313358-363(1985))。編碼合適信號序列的DNA可分離自下述蛋白質(zhì)編碼cDNA的5’末端RUBISCO蛋白質(zhì)、CAB蛋白質(zhì)、EPSP合成酶、GS2蛋白質(zhì)和已知定位于葉綠體的許多其他蛋白質(zhì)。
其他一些基因產(chǎn)物定位于諸如線粒體和過氧化物酶體之類的其他細胞器中(如，Unger等，植物分子生物學13411-418(1989))。也可操縱編碼這些產(chǎn)物的cDNA以將異源基因產(chǎn)物定向于這些細胞器。所說的序列例子是核編碼ATPase和線粒體的特異性天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同工型。定向于細胞蛋白質(zhì)體的工作已由Roger等(美國國家科學院院報826512-6516(1985))描述。
此外，還鑒定出了使基因產(chǎn)物定向于其他細胞區(qū)室的序列。氨基末端序列負責定向于ER、質(zhì)外體和糊粉細胞的胞外分泌(Koehler & Ho，植物細胞2769-783(1990))。此外，氨基端序列與羧基端序列一起負責基因產(chǎn)物的液泡定向(Shinshi等，植物分子生物學14357-368(1990))。
通過將上述合適的靶向序列與目的轉(zhuǎn)基因序列融合，有可能指導轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至任何細胞器或細胞區(qū)室。例如，對于葉綠體定向，可將來自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合成酶基因或GS2基因的葉綠體信號序列讀框一致地與轉(zhuǎn)基因的氨基末端ATG融合。所選擇的信號序列應(yīng)包含已知的切割位點，構(gòu)建融合體應(yīng)考慮到切割位點后切割所需的任何氨基酸。在某些情況下，通過在切割位點和轉(zhuǎn)基因ATG之間添加少量氨基酸或置換轉(zhuǎn)基因序列中的一些氨基酸可達到此要求。通過體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建體的體外翻譯及隨后用文獻(Bartlett等，在Edelmann等(編輯)葉綠體分子生物學中的方法，Elsevier，pp1081-1091(1982)；Wasmann等，分子與普通遺傳學205446-453(1986))所述技術(shù)進行體外葉綠體攝取，可檢測為輸入葉綠體而構(gòu)建的融合體的葉綠體攝入效率。這些構(gòu)建技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并可同樣應(yīng)用于線粒體和過氧化物酶體。對于殺蟲毒素可能要求選擇定向。通常是胞質(zhì)的或葉綠體的，盡管在某些情況下也可能是線粒體的或過氧化物酶體的。核酸序列的表達也可能要求定向于ER、質(zhì)外體或液泡。
上述細胞定向機制不僅可與其同源啟動子聯(lián)合使用，還可與異源啟動子聯(lián)合使用，從而在與定向信號所來源的啟動子具不同表達模式的啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下達到特異細胞定向的目的。
實施例12表達盒構(gòu)建的例子本發(fā)明包含在任何植物中可表達的啟動子調(diào)節(jié)下的DNA分子表達，不管啟動子的來源如何。此外，本發(fā)明包括將任何植物可表達的啟動子與DNA分子表達所要求或選擇的任何其他序列聯(lián)合使用。所說的序列包括，但不局限于，轉(zhuǎn)錄終止子、增強表達的外來序列(如內(nèi)含子[如Adh內(nèi)含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])及將基因產(chǎn)物定向至特異細胞器和細胞區(qū)室的序列。
組成型表達CaMV 35S啟動子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建描述于公開的專利申請EP 0392225中。pCGN1761包含‘雙’35S啟動子和tml轉(zhuǎn)錄終止子，啟動子和終止子之間有單一的EcoRⅠ位點，還包括pUC-型骨架。構(gòu)建具有修飾多接頭的pCGN1761衍生物，該多接頭中除存在原有EcoRⅠ位點外還包括NotⅠ和XhoⅠ位點。該衍生物被稱為pCGN1761ENX。為了使基因在轉(zhuǎn)基因植物中于35S啟動子控制下表達，pCGN1761ENX可用于在其多接頭內(nèi)克隆cDNA序列或基因序列(包括微生物ORF序列)?？赏ㄟ^用啟動子5’側(cè)的HindⅢ、SphⅠ、SalⅠ和XbaⅠ位點和終止子3’側(cè)的XbaⅠ、BamHⅠ和BglⅠ位點切出這種結(jié)構(gòu)的完整35S啟動子-基因序列-tml終止子盒，將其轉(zhuǎn)移入如實施例35中所述之類的轉(zhuǎn)化載體。此外，為了用別的啟動子置換，可用HindⅢ、SphⅠ、SalⅠ、XbaⅠ或PstⅠ在5’切割，用多接頭限制性位點(EcoRⅠ、NotⅠ或XhoⅠ)中任一個在3’切割，去除雙35S啟動子片段。
通過優(yōu)化翻譯起始位點修飾pCGN1761ENX對于本部分所述的任何構(gòu)建，通過引入能增強翻譯的序列可在克隆位點周圍進行修飾。這一點在將來自微生物的基因引入植物表達盒中時尤其有用，因為這些基因可能在鄰近其甲硫氨酸處不包含適于植物中翻譯起始的序列。倘若來自微生物的基因?qū)⒃谄銩TG處克隆入植物表達盒，則修飾其插入位點以優(yōu)化其表達可能比較有用。作為引入數(shù)個植物表達優(yōu)化序列之一的方式例子，參見pCGN1761ENX的修飾(如Joshi，見上文)。
在可化學調(diào)控型啟動子控制下的表達本部分描述了用所選的任何啟動子置換pCGN1761ENX中的雙重35S啟動子；描述的一個例子是用化學調(diào)節(jié)的RP-1a啟動子置換。所選啟動子優(yōu)選通過限制酶從其天然來源中切出，但或者也可用帶合適末端限制位點的引物進行PCR擴增。若進行PCR擴增，則在擴增啟動子克隆入目標載體后應(yīng)將啟動子再測序以檢查有無擴增錯誤。從質(zhì)粒pCIB1004(見EP 0332104，關(guān)于構(gòu)建的實施例21)中切割出可化學調(diào)控的煙草PR-1a啟動子并將其轉(zhuǎn)移入質(zhì)粒pCGN1761ENX。用NcoI切割pCIB1004，并通過T4 DNA聚合酶的處理將產(chǎn)生的線性片段3’突出端補平。然后用HindⅢ切割此片段，產(chǎn)生的含PR-1a啟動子的片段凝膠純化并克隆入雙重35S啟動子已切除的pCGN1761ENX。這可通過用XhoⅠ切割并用T4聚合酶補平，隨后用HindⅢ切割并分離含克隆入pCIB1004啟動子片段的含載體一終止子的較大片段完成。這樣就產(chǎn)生了含PR-1a啟動子和tml終止子及具單一EcoRⅠ和NotⅠ位點之插入多接頭的pCGN1761ENX衍生物。本發(fā)明的DNA分子可插入該載體中，融合產(chǎn)物(即啟動子-基因-終止子)可隨后被轉(zhuǎn)移入任何選擇的轉(zhuǎn)化載體中，包括本申請中所述的載體。
組成型表達肌動蛋白啟動子已知數(shù)種肌動蛋白同種型表達于大部分細胞類型中，因此肌動蛋白啟動子是組成型啟動子的好選擇。尤其是，來自稻Act1基因的啟動子已被克隆和鑒定(McElroy等，植物細胞2163-171(1990))。已發(fā)現(xiàn)該啟動子的1．3kb片段，包含稻原生質(zhì)體中表達所需的所有調(diào)節(jié)元件。此外，已構(gòu)建了許多以ActⅠ啟動子為基礎(chǔ)、專門用于單子葉植物的表達載體(McElroy等，分子與普通遺傳學231150-160(1991))。它們中摻入了Act1-內(nèi)含子1、Adh1 5’側(cè)翼序列和Adh1-內(nèi)含子1(來自玉米乙醇脫氫酶基因)和來自CaMV 35S啟動子的序列。顯示最高表達的載體是35S和Act1內(nèi)含子的融合體或Act1 5’側(cè)翼序列和Act1內(nèi)含子的融合體。起始ATG(GUS報道基因的)周圍序列的優(yōu)化也增強了表達。McElroy等(分子與普通遺傳學231150-160(1991))描述的啟動子表達盒可容易地被修飾以用于本發(fā)明DNA分子的表達，其尤其適用于單子葉植物宿主。例如，含啟動子的片段可從McElroy構(gòu)建體中切出并用于置換pCGN1761ENX中的雙35S啟動子，該載體然后可用于插入特異基因序列。這樣構(gòu)建的融合基因可隨后被轉(zhuǎn)移入合適的轉(zhuǎn)化載體中。在個別報道中還已發(fā)現(xiàn)稻Act1啟動子與其第一個內(nèi)含子可指導人工培養(yǎng)大麥細胞中的高表達(Chibbar等，Plant CellRep．12506-509(1993))。
組成型表達遍在蛋白啟動子遍在蛋白是另一已知積累于許多細胞類型中的基因產(chǎn)物，其啟動子已自許多物種中克隆到，已用于轉(zhuǎn)基因植物(如向日葵-Binet等，植物科學7987-94(1991)，玉米-Christensen等，植物分子生物學12619-632(1989))。玉米遍在蛋白啟動子已被用于轉(zhuǎn)基因單子葉植物系統(tǒng)中，其序列和為單子葉植物轉(zhuǎn)化所構(gòu)建的載體公開于專利申請EP0342926中。此外，Taylor等(Plant Cell Rep．12491-495(1993))描述了含玉米遍在蛋白啟動子和第一內(nèi)含子的載體(pAHC25)，當其通過粒子轟擊引入時在許多單子葉植物細胞懸浮物中有高活性。遍在蛋白啟動子完全適于本發(fā)明DNA分子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達，尤其是單子葉植物。合適的載體是通過引入合適的遍在蛋白啟動子和／或內(nèi)含子序列而加以修飾的pAHC25衍生物或本申請中所述的任一個轉(zhuǎn)化載體。
根特異性表達本發(fā)明核苷酸序列表達的優(yōu)選模式是根表達。根表達對于控制土壤傳播的真菌病原體尤其有用。合適的根啟動子是de Framond所述的啟動子(FEBS290103-106(1991))，在公開的專利申請EP0452269中也有描述。該啟動子被轉(zhuǎn)移入諸如pCGN1761ENX之類的合適載體中，以便插入核苷酸序列并隨后將完整的啟動子-基因-終止子盒轉(zhuǎn)移入目的轉(zhuǎn)化載體中。
創(chuàng)傷誘導型啟動子創(chuàng)傷誘導型啟動子尤其適用于本發(fā)明DNA分子的表達，因為它們一般不僅在創(chuàng)傷誘發(fā)部位有活性，在植物病原體感染部位也有活性。許多這樣的啟動子已被描述(如Xu等，植物分子生物學22573-588(1993)，Logemann等，植物細胞1151-158(1989)，Rohrmeier & Lehle，植物分子生物學22783-792(1993)，F(xiàn)irek等，植物分子生物學22129-142(1993)，Warner等，植物雜志3191-201(1993))并均適用于本發(fā)明。Logemann等(見上文)描述了雙子葉馬鈴薯wun1基因的5’上游序列。Xu等(見上文)顯示了來自雙子葉馬鈴薯(pin2)的創(chuàng)傷誘導型啟動子在單子葉稻中是有活性的。此外，Rohrmeier & Lehle(見上文)描述了可被創(chuàng)傷誘導并可通過標準技術(shù)用于分離同源啟動子的玉米Wip1 cDNA的克隆。同樣地，F(xiàn)irek等(見上文)和Warner等(見上文)已描述了來自單子葉植物Asparagusofficimalis的創(chuàng)傷誘導型基因，它可表達于局部傷口和病原體侵入位點。用本領(lǐng)域眾所周知的克隆技術(shù)，可將這些啟動子轉(zhuǎn)移入合適載體中，與本發(fā)明的DNA分子融合，并用于在植物病原體感染位置表達這些基因。
髓優(yōu)選表達專利申請WO93／07278(Ciba-Geigy)描述了優(yōu)選表達于髓細胞的玉米trpA基因的分離，并給出了從轉(zhuǎn)錄起點延伸至-1726位的啟動子基因序列。用標準分子生物學技術(shù)可將該啟動子或其部分轉(zhuǎn)移入諸如pCGN1761之類的載體中，在其中它可置換35S啟動子并被用于以髓優(yōu)選方式驅(qū)動本發(fā)明DNA分子的表達。事實上，含髓優(yōu)選啟動子或其部分的片段可被轉(zhuǎn)移入任何載體中并被修飾以便在轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用。
花粉特異性表達專利申請WO93／07278(Ciba-Geigy)進一步描述了表達于花粉細胞中的玉米鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)基因的分離。該基因序列和啟動子從轉(zhuǎn)錄起點延伸長達1400bp。用標準分子生物學技術(shù)可將該啟動子或其部分轉(zhuǎn)移入諸如pCGN1761之類的載體中，在其中它可置換35S啟動子并被用于驅(qū)動本發(fā)明DNA分子的表達。事實上，含花粉特異性啟動子或其部分的片段可被轉(zhuǎn)移入任何載體中并被修飾以便在轉(zhuǎn)基因植物中應(yīng)用。
葉特異性表達編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因已被Hudspeth & Grula(植物分子生物學12579-589(1989))描述。該基因的啟動子可通過標準分子生物學技術(shù)被用于在轉(zhuǎn)基因植物中以葉特異性方式驅(qū)動任何基因的表達。
葉綠體定向表達Chen & Jagendorf(生物化學雜志2682363-2367(1993))已描述了成功應(yīng)用葉綠體轉(zhuǎn)運肽輸入異源轉(zhuǎn)基因。所用的這種肽是來自Nicotiana plumbaginifolia的rbcS基因的轉(zhuǎn)運肽(Poulsen等，分子與普通遺傳學205193-200(1986))。用限制性酶DraⅠ和SphⅠ，或Tsp509I和SphⅠ可從質(zhì)粒prbcS-8B(Poulsen等，見上文)中切出編碼該轉(zhuǎn)運肽的DNA序列并與任一上述構(gòu)建體一起使用。DraⅠ-SphⅠ片段從相對于起始rbcS ATG的-58位點延伸至，并包括緊接于輸入切割位點之后的成熟肽的第一個氨基酸(也是一甲硫氨酸)，而TspS09Ⅰ-SphⅠ片段從相對于起始rbcS ATG的-8位點延伸至，并包括成熟肽的第一個氨基酸。這樣，這些片段可恰當?shù)夭迦肴魏嗡x表達盒的多接頭處，產(chǎn)生與所選啟動子(如35S、PR-1a、肌動蛋白、遍在蛋白等)非翻譯前導序列融合的轉(zhuǎn)錄融合體，同時使本發(fā)明DNA分子的插入能正確融合于轉(zhuǎn)運肽的下游。此類構(gòu)建在本領(lǐng)域是常規(guī)性的。例如，DraⅠ末端是平端，而5’Tsp509Ⅰ位點可用T4聚合酶處理補平，或可與接頭或銜接子序列連接從而促進它與所選啟動子的融合。3’SphⅠ位點可同樣保持，或可與接頭或銜接子序列連接以促進其插入所選載體中，從而為隨后插入本發(fā)明DNA分子提供合適的限制性位點。理想的狀態(tài)是保持SphⅠ的ATG并包含本發(fā)明DNA分子的第一個ATG。Chen & Jagendorf(見上文)為葉綠體輸入的理想切割提供了共有序列，在每個例子中甲硫氨酸都優(yōu)選位于成熟蛋白質(zhì)的第一位。隨后的位置可有更多的變動，可能氨基酸不是如此關(guān)鍵。任何情況下都可用Bartlett等(在Edelmann等(編輯)葉綠體分子生物學中的方法，Elsevier，pp1081-1091(1982)中)和Wasmann等(分子與普通遺傳學205446-453(1986))所述方法體外評估融合構(gòu)建體的輸入效率。一般地說，最好的方法可能是用氨基末端無修飾的本發(fā)明DNA分子建立融合體，且只有當這種融合體不能高效輸入葉綠體時才引入修飾，這種情況下可按提供的文獻進行修飾(Chen & Jagendorf，見上文；Wasman等，見上文；Ko&Ko，生物化學雜志26713910-13916(1992))。
為利用由其他來源(單子葉植物和雙子葉植物)或其他基因的其他GS2葉綠體轉(zhuǎn)運肽編碼序列，可進行類似的操作。此外，可遵從類似的流程以達到定向于如線粒體之類其他亞細胞區(qū)室的目的。
序列表<110>Novartis<120>控制疾病的基因<130>S-30431／A<140>CGC1989<141>1998-03-17<150>US 09／042763<151>1998-03-17<160>42<170>PatentIn Ver．2．0<210>1<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述保守的氨基酸序列<400>1Glu Leu Met Xaa Xaa Gly Xaa Ile Ser Leu Leu Leu Xaa1 510<210>2<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述保守的氨基酸序列<400>2Xaa Thr Xaa Pro Leu Xaa Xaa Xaa Val Xaa Gln Met Gly Ser1 5 10<210>3<211>1868<212>DNA<213>Triticum sp．<220><221>CDS<222>(176)．．(1777)<220><221>misc_feature<222>(365)．．(403)<223>SEQ ID NO1所示氨基酸序列的位置<220><221>misc_feature<222>(1352)．．(1393)<223>SEQ ID NO2所示氨基酸序列的位置<400>3cacgcccaca cttcgccaac acacaacgta cctgcgtacg tacgctttcc atttcctttc 60ttgctccggc cggccggcca cgtagaatag atacccggcc aggtaggtac ctcgttggct 120cagacgaccg gcggctgggt ctccggacaa ggaaagaggt tgcgctcggg gaccg atg 178Met1gcg gac gac gac gag tac ccc cca gcg agg acg ctg ccg gag acg ccg 226Ala Asp Asp Asp Glu Tyr Pro Pro Ala Arg Thr Leu Pro Glu Thr Pro5 10 15tcc tgg gcg gtg gcc ctc gtc ttc gcc gtc atg atc atc gtg tcc gtc 274Ser Trp Ala 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1．編碼Mlo蛋白質(zhì)的DNA分子，其中所說的Mlo蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所列至少一種序列，并且所說的Mlo蛋白質(zhì)賦予植物對真菌病原體的抗性。
2．權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說的DNA分子與SEQ IDNO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所列的任一種核苷酸序列相同或基本類似，或者編碼與SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ IDNO8中所列Mlo蛋白質(zhì)相同或基本相似的Mlo蛋白質(zhì)。
3．權(quán)利要求1的DNA分子，其中所說的DNA分子與SEQ IDNO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或SEQ IDNO17中所列的任一種核苷酸序列相同或基本類似，或者編碼與SEQID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ IDNO18中所列Mlo蛋白質(zhì)相同或基本類似的Mlo蛋白質(zhì)。
4．權(quán)利要求1-3中任一項的DNA分子，其中所說的DNA分子不是來源于大麥。
5．權(quán)利要求1-4中任一項的DNA分子，其中所說的DNA被修飾以至內(nèi)源蛋白質(zhì)的活性喪失。
6．權(quán)利要求5的DNA分子，其中所述DNA修飾導致相應(yīng)蛋白質(zhì)氨基酸序列中有以下改變之一、全部或各種組合-色氨酸(163)改變?yōu)榫彼?脯氨酸(396)后移碼-色氨酸(160)后移碼-甲硫氨酸(1)改變?yōu)楫惲涟彼?甘氨酸(227)改變?yōu)樘於彼?甲硫氨酸(1)改變?yōu)槔i氨酸-精氨酸(11)改變?yōu)樯彼?丟失苯丙氨酸(183)、蘇氨酸(184)-纈氨酸(31)改變?yōu)楣劝彼?絲氨酸(32)改變?yōu)楸奖彼?亮氨酸(271)改變?yōu)榻M氨酸。
7．與權(quán)利要求1-6中任一項DNA分子反義的DNA分子。
8．至少包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所列序列之一的蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)是Mlo蛋白質(zhì)并賦予植物對真菌病原體的抗性。
9．權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO3、SEQ ID NO5或SEQ ID NO7中所列的任一種序列相同或基本相似的核苷酸序列編碼，或者與SEQ ID NO4、SEQ ID NO6或SEQ IDNO8中所列的任一種蛋白質(zhì)相同或基本相似。
10．權(quán)利要求8的蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)由與SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或SEQ ID NO17中所列的任一種序列相同或基本相似的核苷酸序列編碼，或者與SEQ IDNO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16或SEQ IDNO18中所列的任一種蛋白質(zhì)相同或基本相似。
11．權(quán)利要求8-10中任一項的蛋白質(zhì)，其中所說的蛋白質(zhì)不是來源于大麥。
12．含權(quán)利要求1-7中任一項的DNA分子的表達盒。
13．含包括權(quán)利要求12之DNA分子的表達盒的載體。
14．包括含權(quán)利要求1-7中任一項之DNA分子的表達盒或其部分的細胞，其中該表達盒中的所說DNA分子在所說細胞中是可表達的。
15．權(quán)利要求14的細胞，其中所說的DNA分子被穩(wěn)定整合入所說細胞的基因組中。
16．權(quán)利要求14或15中任一項的細胞，其中所說的細胞是植物細胞。
17．包括含權(quán)利要求1-7中任一項之DNA分子的表達盒或其部分的植物，其中該表達盒中的所說DNA分子在所說植物中是可表達的。
18．權(quán)利要求17的植物，其中所說的DNA分子被穩(wěn)定整合入該植物的基因組中。
19．包括含權(quán)利要求1-7中任一項之分離DNA分子的植物的農(nóng)產(chǎn)品，其中所說的農(nóng)產(chǎn)品具有改善的植物檢疫特性。
20．制備抗真菌病原體的植物的方法，包括以下步驟a)在所說的植物中以“有義”方向表達權(quán)利要求1-6中任一項的DNA分子；或b)在所說的植物中以“反義”方向表達權(quán)利要求1-6中任一項的DNA分子；或c)在所說植物中表達能特異切割由相應(yīng)于權(quán)利要求1-6中任一項之DNA分子的內(nèi)源基因所編碼的信使RNA轉(zhuǎn)錄物的核酶；或d)在植物中表達特異于權(quán)利要求1-6中任一項之DNA分子所編碼的蛋白質(zhì)或其一部分的aptamer；或e)在植物中表達權(quán)利要求1-6中任一項的DNA分子的突變或截短形式；或f)在植物中通過同源重組修飾相應(yīng)于權(quán)利要求1-6中任一項之DNA分子的基因的至少一個染色體拷貝。
21．用權(quán)利要求20的方法制備的抗真菌病原體的植物。
22．權(quán)利要求21的植物，其中所說的真菌病原體可感染活的表皮細胞。
23．權(quán)利要求21的植物，其中所說的真菌病原體來自白粉菌目。
24．權(quán)利要求21的植物，其中所說的真菌病原體來自白粉菌屬。
25．權(quán)利要求21的植物，其中所說的真菌病原體是禾白粉菌。
26．用權(quán)利要求20的方法獲得的具改善植物檢疫特性的農(nóng)產(chǎn)品。
27．一種分離編碼Mlo蛋白質(zhì)之DNA分子的方法，包括以下步驟a)將編碼SEQ ID NO1中至少6個氨基酸的簡并寡核苷酸和互補于編碼SEQ ID NO2中至少6個氨基酸的序列的簡并寡核苷酸與提取自植物的DNA，在允許所說簡并寡核苷酸與所述DNA雜交的條件下混合；b)擴增所說植物DNA的DNA片段，其中所說的DNA片段在其左和右末端處含可與步驟a)中所說簡并寡核苷酸退火的核苷酸序列；和c)獲得含步驟b)之DNA片段的全長cDNA克隆。
28．誘變權(quán)利要求1之DNA分子的方法，其中所說的DNA分子已被切割成預期大小的雙鏈隨機片段，該方法包括以下步驟a)向所得雙鏈隨機片段群中添加一或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中所說寡核苷酸包含與雙鏈模板多核苷酸相同的區(qū)域和異源的區(qū)域；b)將所得雙鏈隨機片段和寡核苷酸的混合物變性成單鏈片段；c)在導致所說的單鏈片段在所說的相同區(qū)域退火而形成退火片段配對的條件下，將所得單鏈片段群與聚合酶保溫，其中所說的相同區(qū)域足以使配對中的一成員引發(fā)另一成員的復制，從而形成經(jīng)誘變的雙鏈多核苷酸；和d)再重復第二和第三步驟至少兩個循環(huán)，其中下一循環(huán)中的第二步驟產(chǎn)生的混合物包括來自前一循環(huán)第三步驟的經(jīng)誘變雙鏈多核苷酸，并且該下一循環(huán)形成了進一步誘變的雙鏈多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明描述了所編碼蛋白質(zhì)控制植物對真菌病原體抗性的基因。本發(fā)明還描述了抗真菌病原體的轉(zhuǎn)基因植物及抗真菌病原體植物的制備方法。本發(fā)明進一步公開了分離編碼控制植物對真菌病原體的抗性之其他蛋白質(zhì)的基因的方法。
文檔編號C07K14/415GK1293711SQ99804041
公開日2001年5月2日 申請日期1999年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月17日
發(fā)明者J·M·薩爾米羅, L·J·威斯羅, L·J·斯塔拉, C·M·克萊默 申請人:諾瓦提斯公司